KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tình hình kháng kháng sinh của các chủng tụ cầu vàng phân lập được tại Bệnh viện Da Liễu Trung Ương

1
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý
đào tạo đại học trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho em trong suốt thời gian học tập.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS-Lê Văn Hưng – Phó trưởng
Khoa Kỹ thuật Y học Trường Đại học Y Hà Nội, người thầy đã hết lòng
hướng dẫn em trên con đường học tập và nghiên cứu khoa học.
Em xin gửi lời cảm ơn tới ban Giám đốc Bệnh viện Da liễu Trung
Ương cùng tập thể cán bộ nhân viên của khoa xét nghiệm bệnh viện Da Liễu
Trung Ương đã tạo những điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành đề tài nghiên
cứu này.
Cuối cùng, em vô cùng biết ơn, chia sẻ niềm vui cùng cha mẹ, các anh
chị trong gia đình đã nuôi dưỡng và dành cho em những tình yêu thương sâu
sắc nhất, giúp em có điều kiện học tập và hoàn thành khóa luận.
Hà Nội, ngày 30 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Cao Thị Thu Quế
2
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đã tham gia nghiên cứu và hoàn thành khóa luận
này một cách nghiêm túc.
Các số liệu của khóa luận được lấy trung thực, chính xác và kết quả
chưa được công bố bởi bất kỳ tác giả nào. Các bài trích dẫn đều được lấy từ
các tài liệu đã được công nhận. Nếu có gì sai sót, tôi xin hoàn toàn chịu
trách nhiệm.
Hà Nội, ngày 30 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Cao Thị Thu Quế
3
MỤC LỤC

4
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tụ cầu (Staphylococcus) là một trong những vi khuẩn gây bệnh được
ghi nhận sớm nhất, vào đầu những năm 1880. Tụ cầu vàng (Staphylococcus
Aureus) do Robert Koch phát hiện năm 1878 sau khi thực hiện phân lập từ mủ
ung nhọt. Năm 1880 Louis Pasteur cũng đã thực hiện phân lập và nghiên cứu
về vi khuẩn này [1]. Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên và là một loại vi
khuẩn thường ký sinh trên da, lỗ mũi và đường hô hấp trên của người. Trong
đó nhiều loài là những tụ cầu cộng sinh và một vài loài là những vi khuẩn gây
bệnh giới hạn.
Theo nhiều nghiên cứu ở Việt Nam, trong các vi khuẩn Gram dương,
tụ cầu vàng là loài vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và kháng lại kháng
sinh mạnh nhất [2]. Tụ cầu vàng gây nhiều bệnh nhiễm khuẩn ở cộng đồng
cũng như trong bệnh viện (nhiễm khuẩn bệnh viện), đặc biệt là những bệnh
cấp tính, nặng và có thể dẫn tới tử vong nếu không được phát hiện sớm và
điều trị tích cực như nhiễm khuẩn huyết, ngộ độc thức ăn, viêm màng não mủ,
viêm nội tâm mạc…
Trên thế giới thường xuyên có những điều tra về tỷ lệ nhiễm và tình
hình kháng kháng sinh của tụ cầu vàng và ở Việt Nam cũng có khá nhiều
công trình nghiên cứu về vấn đề này [3], [4], [5], [6], [7]. Tuy nhiên tùy theo
khu vực địa lý, khí hậu, từng bệnh viện, từng giai đoạn mà tỷ lệ nhiễm tụ cầu
vàng có thể khác nhau. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu gần đây của cá tác giả
trong và ngoài nước đã cho thấy tỷ lệ vi khuẩn tụ cầu vàng kháng kháng sinh
ngày càng tăng, từ 40% - 90% đối với một số kháng sinh thường dùng [8].
Chúng bắt đầu kháng với một số kháng sinh mới và có tính chất đa đề kháng
gây ra khá nhiều khó khăn trong công tác điều trị nhất là trong tình trạng
người dân sử dụng kháng sinh không theo chỉ định của bác sĩ, kháng sinh
được bán tràn lan, không có sự kiểm soát chất lượng chặt chẽ ở Việt Nam.
5
Trong chuyên ngành da liễu, có rất nhiều bệnh như siscosis, loét, sẩn…được

các bác sĩ điều trị nghĩ nhiều đến căn nguyên do tụ cầu vàng. Vì vậy, việc
nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh của các chủng tụ cầu vàng có ý nghĩa
quan trọng giúp cho bác sĩ điều trị có hiệu quả, rút ngắn thời gian nằm viện,
giảm chi phí đồng thời khoanh vùng được các chủng đa đề kháng.
Chính vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Tình hình kháng kháng sinh của các chủng tụ cầu vàng phân lập
được tại Bệnh viện Da Liễu Trung Ương”
Với mục tiêu sau:
1. Xác định tỷ lệ nhiễm tụ cầu vàng ở các bệnh nhân đến khám và điều trị
tại Bệnh viện Da Liễu Trung Ương từ tháng 10/2014 đến tháng 3/2015.
2. Xác định sự kháng kháng sinh của các chủng tụ cầu vàng phân lập
được.
6
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Lịch sử phát hiện tụ cầu vàng (Staphylococcus Aureus)
Có thể nói tụ cầu khuẩn là một trong những vi khuẩn nổi tiếng nhất
được các nhà vi khuẩn học lừng danh quan tâm nghiên cứu, tỷ lệ gây bệnh rất
cao, có khả năng gây nhiều bệnh nặng cũng như đề kháng kháng sinh rất
mạnh.
Ngày 9 tháng 4 năm 1880, bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã
trình bày tại hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học
trong đó ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) và trình bày
tương đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong
lâm sàng. Đến năm 1881 Ogston đã thành công trong việc gây bệnh thực
nghiệm, đây là tiền đề cho những nghiên cứu về S.aureus sau này [9].
Đến năm 1926 Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối
tương quan giữa sự hiện diện hoạt động men coagulase huyết tương của vi
khuẩn với khả năng gây bệnh của nó. Tuy nhiên mãi đến năm 1948 phát hiện
này mới được chấp nhận rộng rãi.

1.2. Tình hình kháng kháng sinh của tụ cầu vàng hiện nay
1.2.1. Tình hình kháng kháng sinh của tụ cầu vàng trên thế giới
Từ những năm 1940, người ta đã thấy những chủng S. aureus kháng
penicillin sau khi kháng sinh này được đưa vào sử dụng. Sự kháng methicillin
và các kháng sinh khác thuộc nhóm beta-lactam cũng bắt đầu xuất hiện. Báo
cáo của WHO (1997) cho biết tỷ lệ S. aureus kháng methicillin (MRSA) thay
đổi theo từng khu vực. Báo cáo cho thấy rằng các kháng sinh methicillin,
amikacin, gentamicin, flouroquinolones có tỷ lệ kháng cao ở Trung Quốc từ
71,7% - 84,2%, ở Việt Nam tỷ lệ kháng các kháng sinh thay đổi từ 8,9% -
30,3% [10].
7
Tác giả Maple và cộng sự đã nghiên cứu sự kháng thuốc của 106
chủng S. aureus kháng methicillin từ 21 nước trên thế giới và đã công bố rằng
sự đề kháng lại gentamycin, amikacin hoặc erythromycin được ghi nhận trên
90% các chủng. Mức độ đề kháng các kháng sinh như sau: clindamycin 60%,
chloramphenicol 39%, tetracycline 86%, ciprofloxacin 17%, nhưng tất cả
chủng này đều nhạy với vancomycin [11].
1.2.2. Tình hình kháng kháng sinh của tụ cầu vàng ở Việt Nam
Ở nước ta, trong chương trình “Nghiên cứu thử nghiệm tính nhạy cảm
kháng sinh” (ASTS) của Bộ Y tế trong những năm vừa qua cho thấy tỷ lệ tụ
cầu, nhất là tụ cầu vàng kháng lại một số kháng sinh khá cao, thậm chí rất cao
với một số loại kháng sinh. Theo ASTS của Bộ Y tế thì tụ cầu vàng đã kháng
lại methicillin lên tới 41,7%. Tại Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Chợ Rẫy,
kết quả nghiên cứu tụ cầu kháng lại methicillin là 50% [12]. Một nghiên cứu
tương đối rộng ở 3 tỉnh (Đà Nẵng, Cần Thơ, TP. Hồ Chí Minh) của Phạm
Hồng Vân và Phạm Thái Bình cho thấy tụ cầu vàng đã kháng lại hầu hết các
loại kháng sinh thông dụng (gentamycin là 42%, erythromycin là 63%,
azithromycin là 68%, ciprofloxacin là 39%, cefuroxime là 38%, amoxicillin-
acid clavuanic là 30% và chloramphenicol là 38%), với methicillin là 47%
[13]. Tuy vậy, theo các tác giả thì có 2 loại kháng sinh là vancomycin và

linezolid tụ cầu vàng chưa thấy đề kháng (còn nhạy cảm 100%).
Rõ ràng là tụ cầu đã kháng lại nhiều kháng sinh thông dụng và cả kháng
sinh thế hệ mới, trong khi chúng gây nhiều bệnh thậm chí trọng bệnh. Vì vậy,
để lựa chọn kháng sinh điều trị có hiệu quả cao thì cần nuôi cấy, phân lập
chúng do khoa xét nghiệm vi sinh thực hiện, trên cơ sở đó sẽ thực hiện kỹ
thuật kháng sinh đồ. Đây là một phương pháp rất có ích, giúp bác sĩ điều trị
lựa chọn kháng sinh và vi khuẩn nhạy cảm nhất để điều trị.
8
1.3. Đặc điểm sinh học của tụ cầu vàng
1.3.1. Hình dạng và kích thước
Tụ cầu là những cầu khuẩn, có đường kính từ 0,8- 1,0 và đứng thành
hình chùm nho, đôi khi đứng thành cặp, bộ bốn và các chuỗi ngắn ( ba hoặc
bốn tế bào), bắt màu Gram dương, không có lông, không nha bào, không di
động, sắp xếp theo mọi hướng và thường không có vỏ hoặc ít thành hình nang
trong điều kiện phòng thí nghiệm [14], [15].
1.3.2. Nuôi cấy
Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển được được ở nhiệt độ
10- 45 và nồng độ muối cao tới 10%. Thích hợp ở điều kiện hiếu và kị khí.
- Trên môi trường thạch thường, tụ cầu vàng tạo thành khuẩn lạc S, đường
kính 1- 2 mm, nhẵn. Sau 24h ở 37, khuẩn lạc thường có màu vàng chanh.
- Trên môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, tạo tan máu
hoàn toàn. Tụ cầu vàng tiết ra 5 loại dung huyết tố (hemolysin).
- Trên môi trường canh thang: tụ cầu vàng làm đục môi trường, để lâu nó có
thể lắng cặn.
1.3.3. Khả năng đề kháng
Tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn các
vi khuẩn không có nha bào khác. Nó bị diệt ở 80 trong một giờ (các vi khuẩn
khác thường bị diệt ở 60 trong 30 phút) [16]. Khả năng đề kháng với nhiệt độ
thường phụ thuộc vào khả năng thích ứng nhiệt độ tối đa (45) mà vi khuẩn có
thể phát triển. Tụ cầu vàng cũng có thể gây bệnh sau một thời gian dài tồn tại

ở môi trường [17], [18].
1.3.4. Sự kháng kháng sinh
Sự kháng lại kháng sinh của tụ cầu vàng là một đặc điểm rất đáng lưu
ý. Đa số tụ cầu kháng lại Penicillin G do vi khuẩn này sản xuất được men
penicillinase nhờ gen của R-plasmid. Một số còn kháng lại được Methicillin
gọi là Methicillin Resistanse S. aureus (viết tắt là MRSA), do nó tạo ra được
9
các protein gắn vào các vị tri tác động của kháng sinh. Hiện nay một số rất ít
tụ cầu vàng còn đề kháng được với Cephalosporin các thế hệ. Kháng sinh
được dùng trong các trường hợp này là Vancomycin [19], [20].
1.3.5. Tính chất sinh vật hóa học
Tụ cầu có hệ thống enzyme phong phú, những enzym được dùng
trong chẩn đoán là:
- Coagulase có khả năng làm đông huyết tương người và động vật khi đã
được chống đông. Đây là tiêu chuẩn quan trọng nhất để phân biệt tụ cầu
vàng với các tụ cầu khác. Coagulase có ở tất cả các chủng tụ cầu vàng. Hoạt
động của Coagulase giống như thrombokianase tạo thành một “áo
fibrinogen” trong huyết tương. Coagulase có 2 loại: một loại tiết ra môi
trường gọi là coagulase tự do và một loại bám vào vách tế bào gọi là
coagulase cố định [21].
- Catalase dương tính: enzym này là xúc tác gây phân giải Catalase có ở tất
cả các tụ cầu mà không có ở liên cầu.
- Lên men đường manitol.
- Desoxyribonuclease là enzym phân giải AND.
- Phosphatase.
1.3.6. Sự phân bố
Tụ cầu vàng có rải rác trong tự nhiên như trong đất, nước, không khí, đặc biệt
người là nguồn chứa chính của tụ cầu vàng, chủ yếu là ở vùng mũi họng (30%),
nách, âm đạo, mụn nước trên da, các vùng trầy xước và tầng sinh môn [22].
Tỷ lệ mang vi khuẩn cao hơn ở các nhân viên y tế, bệnh nhân lọc máu,

có bệnh tiểu đường, nghiện hút, nhiễm HIV, mắc bệnh ở da mãn tính. Khoảng
sau hai tuần nằm viện tỷ lệ này lên đến 30% -50% và thường nhiễm chủng
kháng thuốc [23].
1.4. Phân loại tụ cầu vàng
1.4.1. Phân loại khoa học
Giới: Eubacteria
Ngành: Firmicutes
10
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Staphylococcus
Loài: Staphylococcus aureus
Tên khoa học: Staphylococcus aureus
1.4.2. Phân loại theo kháng nguyên
Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharid, acid
teichoic của vách. Nhưng dựa vào kháng nguyên việc định loại rất khó khăn. Sau
đây là một số kháng nguyên trên bề mặt tế bào được quan tâm nghiên cứu:
- Acid teichoic: là kháng nguyên ngưng kết chủ yếu của tụ cầu và làm tăng
tác dụng hoạt hóa bổ thể. Đây còn là chất bám dính của tụ cầu vào niêm
mạc mũi. Acid này gắn vào polysaccharid vách tụ cầu vàng. Đây là thành
phần đặc hiệu của kháng nguyên O.
- Protein A: là những protein bao quanh bề mặt vách tụ cầu vàng và là một
tiêu chuẩn để xác định tụ cầu vàng. 100% các chủng tụ cầu vàng có
protein này. Sở dĩ kháng nguyên này mang tên protein A vì protein này
gắn được phần Fc của IgG. Điều này dẫn tới làm mất tác dụng của IgG,
chủ yếu là mất đi opsonin hóa (opsoninsation), nên làm giảm thực bào.
- Vỏ polysaccharid: một số ít chủng S. aureus có vỏ và có thể quan sát được
bằng phương pháp nhuộm vỏ. Lớp vỏ này bao gồm nhiều tính đặc hiệu
kháng nguyên và có thể chứng mình được bằng phương pháp huyết thanh
học.

- Kháng nguyên adherin (yếu tố bám)
- Giống như nhiều vi khuẩn khác, tụ cầu có protein bề mặt đặc hiệu, có tác
dụng bám vào receptor đặc hiệu tế bào. Adherin có thể là các protein: laminin,
fibrinogen, collagen.
1.4.3. Phân loại bằng phage (phage typing)
Các phương pháp phân loại dựa trên kháng nguyên của tụ cầu là rất khó
khăn, vì vậy việc phân loại tụ vàng chủ yếu dựa trên phage. Sự ký sinh của
11
phage trên vi khuẩn mang tính đặc hiệu rất cao. Do vậy phương pháp này rất
có ý nghĩa trong phân loại vi khuẩn.
Căn cứ vào sự nhạy cảm của phage, người ta chia tụ cầu thành typ
phage. Những bộ phage cho phép xếp loại phần lớn các chủng tụ cầu thành
bốn nhóm phage chính.Định typ phage tụ cầu để xác định các nhóm tụ cầu
khác nhau.Đây là phương pháp được sử dụng nhiều trong phân loại S. aureus,
vì đây là vi khuẩn gây nhiễm trùng nhiều nhất trên người [1], [8].
1.5. Khả năng gây bệnh của tụ cầu vàng
Tụ cầu vàng thường ký sinh ở mũi họng và có thể cả ở da.Vi khuẩn này
gây bệnh cho người bị suy giảm đề kháng hoặc chúng có nhiều yếu tố độc
lực. Tụ cầu vàng là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có khả năng gây
nhiều loại bệnh khác nhau.
1.5.1. Nhiễm khuẩn ngoài da
Do tụ cầu vàng ký sinh ở da và niêm mạc mũi nên nó có thể xâm nhập
qua các lỗ chân lông, chân tóc hoặc các tuyến dưới da. Sau đó gây nên các
nhiễm khuẩn sinh mủ: mụn nhọt, đầu đinh, các ổ áp xe, Eczema, hậu bối…Mức
độ các nhiễm khuẩn này phụ thuộc và sự đề kháng của cơ thể và độc lực của vi
khuẩn. Nhiễm tụ cầu vàng ngoài da thường gặp ở trẻ em và người suy giảm
miễn dịch.Hậu bối và đinh râu có thể gây nên các biến chứng nguy hiểm.
Triệu chứng: trên da hình thành những khu vực thường là màu đỏ, đau
và xưng lên, chứa đầy mủ, xung quanh khu vực bị áp xe có thể cảm thấy ấm
khi chạm vào [24].

1.5.2. Nhiễm khuẩn huyết
Tụ cầu vàng là vi khuẩn thường gây nhiễm khuẩn huyết nhất. Do chúng
gây nên nhiều loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là các nhiễm khuẩn ngoài da, từ đấy
vi khuẩn xâm nhập vào máu gây nên nhiễm khuẩn huyết. Đây là một nhiễm
trùng rất nặng. Từ nhiễm khuẩn huyết, tụ cầu vàng đi tới các cơ quan khác
nhau và gây nên các ổ áp xe (gan, phổi, não, tủy xương…) hoặc viêm nội tâm
12
mạc. Có thể gây nên các viêm tắc tĩnh mạch. Một số nhiễm trùng khu trú này
trở thành viêm mạn tính như viêm xương [24].
1.5.3. Viêm phổi
S. aureus có thể xâm nhập vào nhu mô phổi qua hai đường: hít vào
đường hô hấp trên hoặc lây lan qua đường máu. Thường sau khi mắc bệnh
cúm hoặc ở người suy giảm miễn dịch, tụ cầu vàng theo dịch tiết đường hô
hấp trên bị hít vào phổi. Tuy đây là bệnh ít gặp nhưng đó lại là bệnh nhiễm
khuẩn nghiêm trọng. Vi khuẩn tạo vỏ bọc dễ xâm nhập vào máu gây nhiêm
khuẩn huyết. Viêm phổi thường gồm nhiều ổ, tâm ổ là phế quản hoặc tiểu phế
quản viêm hoại tử, xuất huyết. Các ổ viêm này vỡ ra tạo ra các ổ áp xe. Ở
những ca nặng, thành phế nang thường bị phá hủy, không khí vào phế nang bị
phá hủy nhưng không thoát ra được, tạo ra các túi khí thành mỏng. Các yếu tố
gây nguy cơ mắc bệnh là điều kiện sống kém, sử dụng kháng sinh bừa bãi,
bệnh nhân nằm viện lâu ngày làm giảm sức đề kháng của cơ thể tạo điều kiện
thuận lời cho vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào đường hô hấp, đồng thời làm
giảm chức năng miễn dịch của cơ thể.
Triệu chứng: phổ biến là sốt cao, mạch nhanh, thở nhanh, ho, ít gặp ho
ra máu. Có thể suy hô hấp, sôc nhiễm khuẩn, nhiễm độc hệ thống, khó thở,
hoại tử và hình thành ổ áp xe. Hai biến chứng hay gặp nhất là tràn dịch màng
phổi và tràn mủ màng phổi [25], [26].
1.5.4. Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp
Ngộ độc thức ăn tụ cầu có thể do ăn uống phải độc tố ruột của tụ cầu,
hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng.

Nguyên nhân là sau một thời gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ
rộng, dẫn đến các vi khuẩn chí bình thường của đường ruột nhạy cảm kháng
sinh bị tiêu diệt và tạo điều kiện thuận lợi cho tụ cầu vàng (kháng kháng sinh)
tăng trường về số lượng
13
Triệu chứng của ngộ độc thức ăn do tụ cầu thường rất cấp tính. Sau khi
ăn phải thức ăn nhiễm độc tố tụ cầu từ 2 đến 8 giờ, bệnh nhân nôn và đi ngoài
dữ dội, phân lẫn nước, càng về sau phân và chất nôn chủ yếu là nước. Do mất
nhiều nước và điện giải có thể dẫn tới shock. Ngộ độc thức ăn do tụ cầu vàng
là một trong những ngộ độc thức ăn rất thường gặp ở Việt Nam [27].
1.5.5. Nhiễm khuẩn bệnh viện do tụ cầu
Rất thường gặp, nhất là đối với nhiễm trùng vết mổ, vết bỏng, liên quan
đến việc sử dụng các thiết bị tĩnh mạch…từ đó dẫn đến nhiễm khuẩn
huyết.Các chủng tụ cầu này có khả năng kháng kháng sinh rất mạnh và phải
dùng tới vancomycin để điều trị [28]. Tỷ lệ tử vong của bệnh này rất cao.
1.6. Miễn dịch
Miễn dịch thu được với tụ cầu nói chung là thấp. Hàng rào tế bào tự
nhiên, trong đó tế bào thực bào đóng vai trò quan trọng nhất.
- Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào có xảy ra với việc tiết ra các
lymphokin và hoạt hóa đại thực bào. Tuy vậy nhưng đã không làm tăng được
sự diệt khuẩn
- Miễn dịch dịch thể cũng xuất hiện để chống lại các yếu tố độc lực (độc
tố và enzym). Nhưng nó không có vai trò bảo vệ ý nghĩa. Vì tụ cầu ít tiếp xúc
với kháng thể hoặc tế bào sản xuất kháng thể. Do vi khuẩn này thường ẩn trú
trong các ổ áp xe, trong các cục fibrin và trong các tế bào bạch cầu. Như vậy
miễn dịch tích cực chống nhiễm tụ cầu ít có vai trò bảo vệ.
1.7. Chẩn đoán vi khuẩn học
Bệnh phẩm là máu, mủ, vết loét, chợt trên da… tùy theo loại bệnh của
tụ cầu.
Thạch máu là môi trường thích hợp để phân lập.Tụ cầu phát triển rất tốt

trên môi trường này. Có thể sử dụng môi trường lựa chọn chứa 7,5% NaCl,
đường manitol và có thể cả kháng sinh chống vi khuẩn Gram âm, khi bệnh
phẩm có chứa nhiều loại vi khuẩn [11], [13].
• Cụ thể:
14
- Nuôi cấy phân lập: Khuẩn lạc S và màu vàng nhẹ.
- Nhuộm Gram: Cầu khuẩn Gram dương, đứng thành hình chùm nho.
Các tính chất sinh vật hóa học:
- Coagulase dương tính.
- Manitol dương tính.
- Phosphatase dương tính.
- Catalase dương tính.
1.8. Nguyên tắc phòng bệnh và điều trị
1.8.1. Phòng bệnh
Phòng bệnh nhiễm khuẩn tụ cầu chủ yếu là vệ sinh môi trường, quần áo
và thân thể vì tụ cầu có rất nhiều ở những nơi này.Đặc biệt là vệ sinh môi
trường bệnh viện.
1.8.2. Điều trị
Kháng sinh trị liệu là biện pháp chủ yếu.Vấn đề khó khăn là tụ cầu rất
kháng thuốc, nên cần phải làm kháng sinh đồ để chọn lọc thuốc thích
hợp.Dùng vacxin gây miễn dịch chống tụ cầu vàng cũng là một biện pháp cần
thiết ở những bệnh nhân dùng kháng sinh ít kết quả.Đây là những vacxin chết
và có thể được bào chế từ chủng tụ cầu vàng phân lập được ở chính bệnh
nhân đó (gọi là vacxin tự liệu), hoặcdùng các chủng tụ cầu vàng mẫu, là
những chủng thường gặp (gọi là vacxin trị liệu).
CHƯƠNG 2
ĐỒI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các bệnh nhân được bác sĩ lâm sàng nghi ngờ nhiễm tụ cầu vàng đến khám và
điều trị tại Bệnh viện Da Liễu Trung Ương từ tháng 10/2014 đến tháng

3/2015.
2.1.1. Tiến hành lựa chọn bệnh nhân
Những bệnh nhân có chỉ định tìm vi khuẩn gây bệnh.
15
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân
- Các bệnh nhân đang dùng thuốc kháng sinh hoặc dừng thuốc dưới 3
ngày.
- Các bệnh nhân bị hội chứng suy giảm miễn dịch.
- Các bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Môi trường nuôi cấy phân lập
- Môi trường thạch máu/ thạch thường.
- Môi trường canh thang glucose 2-5%
- Môi trường schapman
2.2.2. Môi trường xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh
Môi trường Mueller – Hinton
2.2.3. Dụng cụ, trang thiết bị
- Ống nghiệm vô trùng
- Tăm bông vô trùng
- Pipep vô trùng
- Que cấy chuẩn
- Lam kính
- Đèn cồn
- Thước đo vòng ức chế của kháng sinh với vi khuẩn
- Các máy móc thiết bị:
• Kính hiển vi với vật kính dầu
• Máy cấy máu tự động
• Tủ ấm nuôi cấy vi khuẩn
2.2.4. Hóa chất và sinh phẩm
- Nước muối sinh lý 0,9%

- Thuốc thử oxidase
- Dung dịch H2O2 3%
- Các khoanh giấy xác định: bacitracin, optochin, khoanh X,V…
- Bộ thuốc nhuộm Gram
- Các khoanh giấy kháng sinh (Sản xuất bởi hãng OXOID)
- Chủng khuẩn kiểm tra kháng sinh đồ: Staphylococcus aureus ATCC
25923
16
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang
2.3.2. Kỹ thuật nuôi cấy, phân lập xác định tụ cầu vàng
2.3.2.1. Quy trình phân lập
Chuẩn bị đủ dụng cụ và hoá chất, môi trường.
Lấy bệnh phẩm đúng kỹ thuật theo từng bệnh:
- Giải thích cho bệnh nhân về mục đích, ý nghĩa của việc lấy bệnh phẩm
làm xét nghiệm.
- Đối với bệnh phẩm trên da:
+ Nếu là các vết loét, chợt: Dùng que tăm bông lau nhẹ các vết loét bằng
NaCl 0,9%, thấm khô bằng bông sạch vô khuẩn, sau đó dùng một tăm bông
khác tỳ trên vết loét và lăn nhẹ tăm bông để lấy bệnh phẩm.
+ Nếu là các mụn nước, bọng nước: Dùng kim chọc vỡ bọng nước rồi
dùng tăm bông lấy dịch trên nền hoặc trần bọng nước.
+ Cho tăm bông có bệnh phẩm vào ống nghiệm.
Nuôi cấy bệnh phẩm vào môi trường thạch máu:
- Hòa tan bệnh phẩm trên tăm bông trong môi trường nước muối sinh lý
vô khuẩn.
- Dùng que cấy lấy dịch vừa pha cấy phân vùng trên thạch máu/thạch
thường hoặc canh thang, schapman.
- Để tủ ấm 37

0
C, CO
2
trong 18 - 24h.
Lấy khuẩn lạc nghi ngờ nhuộm soi hình thể.
Kỹ thuật nhuộm gram:
- Lấy bệnh phẩm phết lên lam kính thành vòng tròn, đường kính khoảng
1cm, dàn đều, cố định tiêu bản.
- Phủ kín vết bệnh phẩm bằng dung dịch tím gentian, để 1 phút.
- Rửa nước.
- Phủ dung dịch Lugol 30 giây.
- Rửa nước.
17
- Tẩy màu vết bệnh phẩm bằng cồn Aceton ( tẩy màu cho đến khi vết
bệnh phẩm chỉ còn là màu tím nhạt ).
- Rửa nước.
- Phủ dung dịch Fuchsin lên vết bệnh phẩm, để 1 phút.
- Rửa nước và để khô tự nhiên.
Sau đó soi dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu với độ phóng đại 1000X.
2.3.2.2. Các tiêu chuẩn chẩn đoán xác định tụ cầu vàng
- Hình thể và tính chất bắt màu: Cầu khuẩn hình chùm nho, bắt màu gram
dương.
Hình 3.1: Hình thể và tính chất bắt màu của tụ cầu vàng
- Hình thái khuẩn lạc và tính chất tan máu trên môi trường thạch máu : dạng
S, kích thước khoảng 1 – 2mm, nhẵn, tan máu hoàn toàn, có màu vàng.
18
Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc và tính chất tan máu trên môi trường thạch máu
- Phản ứng catalase dương tính:
Nhỏ 1 giọt hydroxyl peroxide lên khuẩn lạc vi khuẩn đặt lên lam kính
Staphylococci : có men catalase gây hiện tượng sủi bọt

Streptococci: không có men catalase không gây sủi bọt.
Hình 3.3: Phản ứng calalase (+)(trái), (-)(phải)
- Lên men đường mannit: Nuôi cấy tụ cầu vào môi trường schapman, sau 24-
48 giờ tụ cầu gây bệnh sẽ làm cho màu của môi trường chuyển từ màu hồng
cánh sen sang màu vàng.
19
Hình 3.4: Phản ứng lên men đường mannit
- Phản ứng đông huyết tương:
*Tiến hành trên lam kính (xác định men coagulase liên kết): men do vi khuẩn
tiết ra trên bề mặt vi khuẩn.
+ Hoà đều vi khuẩn vào một giọt nước muối sinh lý trên lam kính
+ Nhỏ tiếp một giọt huyết tương thỏ, lắc đều.
+ Kết quả: Trong vòng 5 giây, nếu thấy vi khuẩn tụ lại thành các hạt nhỏ trên
mặt hỗn dịch là coagulase liên kết dương tính. Nếu không có hiện tượng gì là
âm tính.
Hình 3.5: Phản ứng đông huyết tương
* Tiến hành trên ống nghiệm (xác định coagulase tự do): men do vi khuẩn
giải phóng vào môi trường.
+ Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ mỗi ống 0,5 mL huyết tương thỏ đã pha loãng
1/2 trong nước muối sinh lý.
20
+ Dùng que lấy vi khuẩn tụ cầu mẫu có coagulase (+) vào ống 1 , ống 2 để
nguyên, ống 3 cấy tụ cầu cần xác định.
+ Để tủ ấm 37
0
C, đọc kết quả sau 6 giờ.
+ Kết quả:
*Ống 1 huyết tương đông lại không đổ ra khỏi ống được .
*Ống 2 huyết tương không đông.
*Ống 3 huyết tương đông là coagulase (+); không đông là coagulase (-).

Nếu kết quả đọc quá muộn thì có thể trở thành âm tính giả, vì nhiều tụ cầu tiết
men fibrinolysin làm lỏng huyết tương trước đó đã đông.
Hình 3.6: Phản ứng đông huyết tương
2.3.4. Kháng sinh đồ: Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán
- Các bước tiến hành:
• Môi trường làm kháng sinh đồ: thạch Mueler – Hinton (đủ dinh dưỡng
cho vi khuẩn phát triển nhưng không cản trở tác dụng của kháng sinh),
độ dày 4,0±0,5mm.
• Lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc thuần đã phân lập, xác định là tác nhân gây
bệnh, pha thành huyền dịch có mật độ nhất định, cấy dàn đều trên mặt
21
thạch Mueler – Hinton, độ đục của huyền dịch vi khuẩn sẽ được so sánh
với độ đục chuẩn 0,5 McFarland (10
8
vk/ml), để qua đêm ở nhiệt độ
phòng đến khi khô mặt thạch.
• Dùng kẹp mũi nhọn lấy các khoanh giấy kháng sinh phù hợp đặt nhẹ
nhàng, hơi ấn nhẹ lên mặt thạch đã cấy vi khuẩn, khoảng cách giữa các
khoanh giấy khoảng 1,5 – 2,0cm, cách thành khoảng 1,5cm.
• Đặt tủ ấm 18 – 24h.
22
- Đọc kết quả
Trước hết kiểm tra mật độ khuẩn lạc: nơi không có kháng sinh hoặc
nồng độ kháng sinh thấp không đủ ức chế được vi khuẩn, chúng sẽ mọc thành
những khuẩn lạc dày sát nhau; nhưng không được dày quá - thành các thảm
hoặc thưa quá - còn khe hở giữa các khuẩn lạc. Vì mật độ vi khuẩn quá dày sẽ
thu nhỏ đường kính vùng ức chế và ngược lại quá thưa sễ mở rộng đường
kính vùng ức chế so với chuẩn, điều này sẽ làm sai lệch kết quả.
Dùng thước đo đường kính vùng ức chế tính ra mm.
Đo và nhận định kết quả các chủng mẫu bằng cách so vào bảng giới

hạn dành cho chủng mẫu (Bảng 2.1) để kiểm tra chất lượng xét nghiệm bao
gồm nhiều yếu tố kỹ thuật; ví dụ: hoạt tính của khoanh giấy kháng sinh, nếu
đạt yêu cầu mới đọc kết quả của các chủng phân lập được.
Đo đường kính vùng ức chế ở các vùng phân lập được từ người bệnh so vào
bảng giới hạn đường kính vùng ức chế xếp loại độ nhạy cảm của vi khuẩn với
kháng sinh (CLSI, 2010) để xếp loại “đề kháng – resistan – R” hoặc “trung
gian – intermediate – I” hoặc “nhạy cảm – susceptible – S” cho mỗi khoanh ở
các đĩa kháng sinh đồ đã chuẩn bị sẵn.
- Nhận định kết quả:
Dựa vào kết quả thu được chọn kháng sinh có kết quả S để điều trị; đưa
ra lựa chọn hàng đầu cho mỗi người bệnh (tùy theo thể trạng người bệnh, vị
trí ổ nhiễm khuẩn, các thông số dược động học của mỗi kháng sinh, đường
đưa vào cơ thể, khả năng sẵn có, giá thành…)
23
Bảng 2.1. Các loại kháng sinh và giới hạn đường kính vòng vô khuẩn
xếp loại mức độ nhạy cảm của S. aureus.
STT Kháng sinh
Nồng độ
(µg)
Kí
hiệu
Đường kính vòng vô
khuẩn
S I R
1 Penicillin 10 P
≤ 28
-
≥ 29
2 Oxacillin 1
OX

≤ 10
11 -12
≥ 13
3 Ampicillin 10
AM
≤ 28
-
≥ 29
4 Methicillin 5
Me
≤ 9
10 - 13
≥ 14
5 Cefotaxime 30
CTX
≤ 14
15 - 22
≥ 23
6 Cefuroxime 30
CXM
≤ 14
15 - 17
≥ 18
7 Ceftriaxone 30
CRO
≤ 13
14 - 20
≥ 21
8 Imipenem 10
IMP

≤ 13
14 - 15
≥ 16
9 Azithromycin 15
AZT
≤ 13
14 - 17
≥ 18
10
Tetracyclin 30 TE
≤ 14
15 - 18
≥ 19
11 Ciprofloxacin 5 CIP ≤ 15 16 -20 ≥ 21
12
Clindamycin 2
CM
≤ 14
15 - 20
≥ 21
24
2.4. Địa điểm nghiên cứu
Khoa xét nghiệm Bệnh viện Da Liễu Trung Ương, 15A - Phương Mai - Đống
Đa - Hà Nội.
2.5. Y đức trong nghiên cứu
- Tư vấn cho bệnh nhân: Lấy bệnh phẩm và thông tin chỉ để phục vụ
cho mục đích chẩn đoán, định hướng điều trị và theo hướng có lợi cho bệnh
nhân.
- Được sự đồng ý hợp tác của bệnh nhân trước khi tiến hành lấy thông
tin của bệnh nhân phục vụ cho công tác nghiên cứu.

- Được sự đồng ý của hội đồng đạo đức
- Tuyệt đối giữ bí mật các thông tin bệnh nhân cung cấp cũng như các
thông tin về bệnh của bệnh nhân như tên, tuổi, số điện thoại, địa chỉ, nghề
nghiệp
2.6. Xử lý số liệu
- Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0.
- So sánh bằng phương pháp thống kê y học:
• Test χ2 khi so sánh các tỷ lệ.
• Ý nghĩa thống kê ở mức p < 0,05.
25
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tỷ lệ nhiễm tụ cầu vàng trên những bệnh nhân đến khám tại Bệnh
viện Da Liễu Trung Ương từ tháng 10 năm 2014 đến tháng 3 năm 2015
và các yếu tố liên quan.
3.1.1. Tỷ lệ nhiễm tụ cầu vàng xác định bởi kỹ thuật nuôi cấy phân lập
Trong tổng số 1563 bệnh nhân có chỉ định làm xét nghiệm tìm vi khuẩn
gây bệnh, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy phân lập, kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp và
các tiêu chuẩn chẩn đoán vi khuẩn tụ cầu vàng trong phòng xét nghiệm,
chúng tôi đã xác định được 82 bệnh nhân có kết quả dương tính với tụ cầu
vàng.
Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ nhiễm tụ cầu vàng
Nhận xét:
- Tỷ lệ bệnh nhân dương tính với tụ cầu vàng là 5,25%.
- Tỷ lệ bệnh nhân âm tính với tụ cầu vàng là 94,75%.