Khảo sát khả năng sinh protease của tế bào bacillus subtilis natto được cố định trong gel alginate

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI










NGUYỄN THỊ NHUNG


KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH
PROTEASE CỦA TẾ BÀO
Bacillus subtilis natto ĐƢỢC CỐ ĐỊNH
TRONG GEL ALGINATE


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ



HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NHUNG



KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH
PROTEASE CỦA TẾ BÀO
Bacillus subtilis natto ĐƢỢC CỐ ĐỊNH
TRONG GEL ALGINATE


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ



Ngƣời hƣớng dẫn:
1.

ThS. Kiều Thị Hồng
Nơi thực hiện:
1.

Bộ môn Công nghiệp Dược



HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến
cô giáo ThS. Kiều Thị Hồng và TS. Đàm Thanh Xuân, giảng viên Bộ môn Công
nghiệp Dược, những người thầy đã luôn quan tâm, trực tiếp tận tình hướng dẫn tôi
thực hiện khóa luận này.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới DS. Lê Ngọc Khánh, ThS.
Nguyễn Khắc Tiệp đã cho tôi nhiều ý kiến đóng góp quý báu và giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ
môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi thực hiện khóa luận.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo
trường Đại học Dược Hà Nội đã dìu dắt, dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và tất cả những người thân, bạn bè đã
động viên, khích lệ, ủng hộ nhiệt thành và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập
và nghiên cứu vừa qua.

Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Thị Nhung



MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto: 2
1.1.1. Phân loại khoa học: 2
1.1.2. Nguồn gốc: 2
1.1.3. Đặc điểm hình thái: 2
1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng: 3
1.1.5. Đặc điểm sinh lý: 3
1.1.6. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto: 4
1.2. Alginate: 4
1.2.1. Cấu trúc của alginate: 4
1.2.2. Tính chất của alginate: 5
1.2.3. Ứng dụng của alginate: 7
1.3. Phương pháp cố định (bất động) tế bào: 7
1.3.1. Lịch sử phát triển: 7
1.3.2. Các phương pháp bất động tế bào: 9
1.3.3. Ứng dụng của phương pháp bất động tế bào: 12
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị: 14
2.1.1. Chủng vi sinh vật sử dụng: 14

2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng: 14
2.1.3. Môi trường sử dụng: 14
2.1.4. Máy móc và dụng cụ: 15
2.2. Nội dung nghiên cứu: 16
2.2.1. Khảo sát thông số của quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto
trong gel alginate: 16
2.2.2. Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi
trường canh thang và chứa sữa đậu nành. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt.
16

2.3. Phương pháp nghiên cứu: 17
2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy chủng Bacillus subtilis natto: 17
2.3.2. Phương pháp làm sữa đậu nành: 18
2.3.3. Phương pháp cố định tế bào trong hạt Calci alginate: 18
2.3.4. Phương pháp phá hạt: 18
2.3.5. Phương pháp thử hoạt tính enzyme protease: 18
2.3.6. Phương pháp xác định số lượng tế bào: 19
2.3.7. Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm: 20
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22
3.1. Khảo sát thông số quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto trong gel
alginate: 22
3.2. Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi
trường canh thang và chứa sữa đậu nành. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt: 25
3.2.1. Định tính enzyme protease có trong dịch nuôi cấy hạt alginate cố định B.
subtilis natto: 25
3.2.2. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt: 32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35
Kết luận: 35
Kiến nghị: 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN
Acid deoxyribo nucleic
B. cereus
Bacillus cereus
B. subtilis natto
Bacillus subtilis natto
cfu
Colony - forming units (Đơn vị khuẩn lạc hình
thành)
h
Giờ
L. acidophilus

Lactobacillus acidophilus
L. casei
Lactobacillus casei
L. delbrueckii
Lactobacillus delbrueckii
L. helveticus
Lactobacillus helveticus
L. plantarum
Lactobacillus plantarum
L. rhamnosus
Lactobacillus rhamnosus
NCBI
National center for Biotechnology Information
(Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh
học)
s
Độ lệch chuẩn
S. cerevisiae
Sacharomyces cerevisiae
TB
Trung bình
VSV
Vi sinh vật
Z. mobilis
Zymomonas mobilis

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT
Tên bảng
Trang
1
2.1. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
14
2
2.2. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
15
3
3.1. Số lượng tế bào cố định được trong hạt gel alginate và số
lượng tế bào trong dịch nuôi cấy ở điều kiện hiếu khí
23
4
3.2. Sơ bộ thử hoạt tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy
hạt calci alginate 3% trong môi trường canh thang tại 3 thời
điểm 24h, 48h, 72h
26
5
3.3. Sơ bộ thử hoạt tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy
hạt calci alginate 3% trong môi trường canh thang – sữa đậu
nành tại 3 thời điểm 24h, 48h, 72h
27
6
3.4. Sơ bộ thử hoạt tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy
hạt calci alginate 3% trong môi trường sữa đậu nành tại 3
thời điểm 24h, 48h, 72h

28
7
3.5. So sánh đường kính vòng phân giải casein của enzyme
protease trong dịch lên men của các môi trường khác nhau
theo thời gian nuôi cấy hạt gel cố định B. subtilis natto
29
8
3.6. Số lượng tế bào B. subtilis natto cố định được trong 1
gam hạt gel alginate ban đầu và hạt gel lưu giữ trong 1 tháng
33






DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

STT
Tên hình
Trang
1
1.1. Hình thái vi khuẩn và khuẩn lạc của Bacillus subtilis natto
3
2
1.2. Cấu trúc không gian của acid (M)
và acid (G)
5
3
1.3. Hình thể của block GGGG, MMMM, MGMG

5
4
1.4. Quá trình tạo gel của các phân tử calci alginate
6
5
1.5. Liên kết của ion Ca
2+
với alginate
7
6
1.6. Các phương pháp bất động tế bào cơ bản
11
7
3.1. Biến thiên đường kính vòng phân giải casein của enzyme
protease trong dịch lên men của các môi trường khác nhau
theo thời gian nuôi cấy hạt gel cố định B. subtilis natto
29



1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bất động tế bào là một công nghệ mới và tiên tiến, dù ra đời chưa lâu nhưng
nó đã thể hiện được nhiều ưu điểm vượt trội so với nhiều phương pháp sử dụng tế
bào tự do và so với cả kỹ thuật bất động enzyme – cơ sở của phương pháp bất động
tế bào. Sản xuất các chế phẩm sinh học bằng phương pháp bất động tế bào cho năng
suất tạo sản phẩm cao hơn, sản phẩm tinh khiết hơn và đặc biệt có thể sản xuất liên
tục trong một quá trình tự động hóa. Bất động tế bào đã thu hút được sự quan tâm

của nhiều nhà khoa học trên thế giới và ngày càng có nhiều sản phẩm sinh học được
sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào ở quy mô công nghiệp.
Vi khuẩn Bacillus subtilis natto là một trong các vi khuẩn có khả năng sinh
nhiều enzyme ngoại bào như: protease, amylase, cellulose… trong đó protease là
enzyme được sản xuất và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống con
người. Cố định tế bào B. subtilis natto có thể phát huy được các ưu điểm của
phương pháp bất động tế bào hướng tới mục tiêu sản xuất enzyme protease. Vì vậy,
khóa luận “Khảo sát khả năng sinh protease của tế bào Bacillus subtilis natto được
cố định trong gel alginate” được thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Khảo sát thông số quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto trong gel
alginate.
2. Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi
trường canh thang và chứa sữa đậu nành. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt.




2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto:
Tên khác: Bacillus subtilis subsp. natto; Bacillus var. natto
Bacillus subtilis natto là vi sinh vật thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis
được giáo sư Sawamura phân lập và định danh lần đầu tiên vào năm 1905 [29].
1.1.1. Phân loại khoa học:
B. subtillis natto là một vi khuẩn nhân thật (EurobacterEur) thuộc: Giới:
Bacteria; Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillales; Họ: Bacillaceae; Chi:
Bacillus; Loài: Bacillus subtilis [29]. Phân loại dưới loài: Bacillus subtilis natto
[29], [42].
Khi mới được phát hiện, Bacillus subtilis natto được coi như là một loài vi

sinh vật mới. Từ kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B. natto và B. subtlilis của
Seki năm 1975 và Tamang năm 2002 [39], [41]; các khóa phân loại đã xếp B.
subtilis natto là một dòng thuộc loài B. subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác
là có khả năng lên men tạo sản phẩm Natto [29], [35].
Trong dòng B. subtilis natto còn có nhiều loại như B. subtilis natto B – 12
[43]; B. subtilis natto N – 77 [40];…
1.1.2. Nguồn gốc:
B. subtilis natto được giáo sư Sawamura phân lập từ Natto – món ăn truyền
thống của người Nhật. Vi khuẩn có nhiều trong rơm rạ, cỏ khô, phát triển rất tốt trên
đậu tương đã nấu chín, chúng cũng phát triển trên các loại ngũ cốc, các nguồn thực
phẩm có nguồn gốc động vật như cá, thịt [29], [35].
1.1.3. Đặc điểm hình thái:

3

B. subtilis natto là trực khuẩn hình que, Gram (+). Nội bào tử hình que có
kích thước dưới 1 . Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau tạo thành
chuỗi (Hình 1.1)
Khuẩn lạc khô, không màu, có kích thước lớn và hình dạng bất định. Bề mặt
hơi nhăn tạo thành lớp mịn, lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào
môi trường thạch [29].

Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc và vi khuẩn Bacillus subtilis natto [29]
1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng:
B. subtilis natto là vi sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn
hydrocarbon: đường đơn (glucose, fructose…); đường đôi (maltose, lactose,
saccharose…); polysaccharid (tinh bột…) [29], [27].
Nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn là acid amin và protein.
VSV có thể sử dụng dễ dàng acid glutamic, arginin… nhưng không sử dụng được
threonin, methionin, tryptophan, phenylalanin. VSV cũng cần có biotin để phát

triển, trong môi trường không có biotin các tế bào dinh dưỡng không thể phát triển,
bào tử cũng không nảy mầm được [27].
1.1.5. Đặc điểm sinh lý:

4

B. subtilis natto là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, sử dụng khí oxy làm chất nhận
điện tử khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Vi khuẩn có thể phát triển ở
nồng độ oxy lớn hơn 3%.
Vi khuẩn phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng. Nhiệt độ thích hợp cho B.
subtilis natto phát triển là 30 – 50
0
C, nhiệt độ tối thích là 37
0
C. Ở 55
0
C, vi khuẩn
ngừng phát triển và sự ly giải tế bào sinh dưỡng diễn ra. Nhiệt độ tối ưu cho sự nảy
mầm của bào tử là 40
0
C, bào tử vẫn có thể nảy mầm sau khi bảo quản ở 0
0
C.
B. subtilis natto phát triển ở pH trung tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu
cho sự sinh trưởng là 7,2 – 7,6. Ở pH 4,5 thì sự phát triển của vi khuẩn bị ức chế
[29], [27].
1.1.6. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto:
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B. subtilis natto có khả năng sinh
nhiều sản phẩm trao đổi chất: -PG A; levan (fructan); trong đó đặc biệt là nhóm
các enzyme ngoại bào: nhóm enzyme -transpeptidase, phytase, amylase, cellulose

và nhóm enzyme được nghiên cứu nhiều nhất là protease [24], [34].
1.2. Alginate:
Alginate là tên gọi chung của các muối của acid alginic. Acid alginic có
trong các loài tảo nâu, rong mơ (Sargassum), tồn tại chủ yếu ở dạng muối với các
loại ion kim loại như Ca
2+
, Ba
2+
, Mg
2+
, Na
+
.
1.2.1. Cấu trúc của alginate:
Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng cấu tạo từ hai gốc
uronic là acid (G) và acid (M) nối với
nhau bằng liên kết 1,4-glucosid. Tuy nhiên, hai monomer này không liên kết một
cách ngẫu nhiên mà tạo thành ba loại block: block homopolymeguluronic gồm các
gốc acid guluronic nối tiếp nhau GGGG, block homopolymemannuronic gồm các
gốc acid mannuronic nối tiếp nhau MMMM, và block liên hợp MGMG.

5


Hình 1.2. Cấu trúc không gian của acid (M) và acid
(G)
Tùy theo nguồn gốc của alginate mà độ dài trung bình của mạch phân tử, độ
dài của mỗi block và trình tự kết hợp của chúng với nhau có khác nhau. Điều này
làm cho tính chất của alginate biến đổi trong một dải rộng. [13]

Hình 1.3. Hình thể của block GGGG, MMMM, MGMG [45]
1.2.2. Tính chất của alginate:
- Độ hòa tan: Các muối kim loại hóa trị I (Na
+
, K
+
…), muối amoni và các
muối của các amin phân tử lượng thấp của acid alginic tan được trong nước. Còn
các muối của acid alginic với các kim loại đa hóa trị (Ca
2+
, Ba
2+
…) thì không tan
được (trừ muối Mg
2+
). Các muối alginate hòa tan được trong các dung môi thân
nước như alcol, ceton… và hòa tan dễ dàng hơn khi đun nóng [13].

6

- Độ nhớt: Natri alginate khi tan trong nước tạo thành dung dịch có độ nhớt
dao động trong khoảng từ 10-3.500 cps. Độ nhớt này tăng tỷ lệ thuận với khối
lượng phân tử trung bình của alginate, với nồng độ alginate sử dụng và giảm đi khi
tăng nhiệt độ. Độ nhớt của dung dịch alginate còn bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của
các ion kim loại có trong dung dịch [13].
- Độ ổn định: Alginate khô giống như các polysaccharid tự nhiên khác, rất
không bền với oxy, nhiệt độ và ion kim loại. Khi có mặt các tác nhân này alginate
sẽ bị rã ra. Độ ổn định của các muối aginate xếp theo thứ tự: Natri alginate > Amoni
alginate > Acid alginic, càng xếp cuối các muối càng kém ổn định. Ngoài ra thêm
một lượng nhất định ion Ca

2+
cũng có thể làm tăng độ ổn định của các dung dịch
alginate [13].
- Sự gel hóa: Dung dịch Natri alginate có khả năng tạo gel khi phản ứng với
các ion kim loại hóa trị II, III. Các gel này được hình thành ở các mức nhiệt độ nhỏ
hơn 100
0
C, chúng cũng không tan chảy khi đun nóng. Alginate có block G nhiều và
dài sẽ cho gel bền hơn. Module đàn hồi còn phụ thuộc vào loại ion liên kết ngang và
ái lực giữa các cation liên kết ngang. Ngoài ra, độ bền gel còn phụ thuộc vào các
yếu tố môi trường. Về ảnh hưởng của cấu trúc phân tử tới độ bền gel: đoạn M-block
thể hiện tính đàn hồi, còn đoạn G thể hiện mức độ cứng rắn của gel. Các đặc tính
này được quan tâm trong nhiều ứng dụng của alginate. [13], [23].

Hình 1.4. Quá trình tạo gel của các phân tử calci alginate [45]

7


Hình 1.5. Liên kết của ion Ca
2+
với alginate
1.2.3. Ứng dụng của alginate:
Sản lượng alginate trên toàn thế giới khoảng 32000-39000 tấn/năm, những
nước sản xuất alginate nhiều nhất là Scotlen, Nhật, Mỹ, Tây Ban Nha, Trung
Quốc… Ở Việt Nam, chúng ta có nguồn rong mơ khá phong phú thích hợp cho việc
sản xuất alginate thương phẩm đạt chất lượng và thực tế ở Nha Trang, Khánh Hòa
đã sản xuất được alginate thương phẩm đạt chất lượng [13].
Alginate được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp: dệt, thực
phẩm, dược phẩm – mỹ phẩm (vật liệu lấy khuôn răng, chế tạo chất cầm máu, thuốc

thải xạ, thuốc trị bệnh đau dạ dày, làm tá dược dính…)… [12]
1.3. Phƣơng pháp cố định (bất động) tế bào:
1.3.1. Lịch sử phát triển: [9]
Năm 1916, Nelson và Griffin tình cờ nhận thấy enzyme invertase của nấm
men khi hấp phụ trên than hoạt vẫn giữ nguyên hoạt tính cho phản ứng thủy phân
đường mía. Đây là phát hiện đầu tiên về bất động enzyme. Sau đó đã có rất nhiều
nghiên cứu và báo cáo về bất động enzyme trên thế giới.
Phương pháp cố định tế bào ngày nay bắt nguồn từ phương pháp cố định
enzyme. Nguyên lý của phương pháp cố định enzyme có thể được mô tả như
sau: "Enzyme đã tinh chế ở dạng tinh khiết được gắn hoặc gói trong những polymer
không hòa tan trong nước. Các hạt chứa enzyme sẽ được nhồi vào các cột hình trụ
có kích thước thích hợp, cho dung dịch cơ chất chảy qua cột, enzyme sẽ thực hiện
phản ứng phân cắt cơ chất thành sản phẩm tương ứng" [1].

8

Đặc điểm của enzyme cố định: Enzyme cố định có đặc điểm như sau: [44]
 Hoạt tính của enzyme cố định thường nhỏ hơn hoạt tính của enzyme tự do
cùng loại.
 Enzyme cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten nhưng có
một số sai khác nhất định: xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzyme và chất
mang hoặc xảy ra hiện tượng cản trở khuếch tán.
 Enzyme cố định thường có tính bền nhiệt hơn enzyme tự do.
 Enzyme cố định thường có pH tối ưu không trùng enzyme tự do cùng loại.
 Enzyme cố định có chất mang chắn nên được bảo vệ tốt hơn enzyme tự do.
 Enzyme cố định có thể tái sử dụng và dễ dàng tách ra khỏi cơ chất một cách
dễ dàng sau phản ứng và độ bền của enzyme cố định cao hơn enzyme tự do.
So với các enzyme ở dạng tự do, các enzyme được bất động có nhiều ưu
điểm nổi bật hơn: [32], [19]
 Cho phép sử dụng enzyme nhiều lần, từ đó giá thành sản xuất một đơn vị sản

phẩm rẻ đi nhiều lần.
 Có thể tiến hành quá trình liên tục, đồng thời có thể ngừng phản ứng khi cần
thiết bằng cách tách enzyme ra khỏi cơ chất.
 Enzyme không bị lẫn trong sản phẩm.
Mặc dù có những ưu điểm như trên nhưng bất động enzyme cũng gặp nhiều
khó khăn trong quá trình thực hiện: [32]
 Việc tách chiết, tinh chế enzyme ra khỏi tế bào gặp nhiều khó khăn, phức tạp
và tốn kém.
 Các enzyme thường bị giảm hoạt tính do chịu ảnh hưởng của các phản ứng
bất động enzyme lên cơ chất.
 Các enzyme thiếu ổn định khi tách khỏi tế bào.
Để khắc phục những nhược điểm trên, người ta tìm cách bất động toàn bộ tế
bào thay cho bất động enzyme. Khi đó, không cần phải tách chiết enzyme ra khỏi tế

9

bào nên tránh được việc làm giảm hoạt tính enzyme, cho phép sử dụng enzyme ở
trạng thái ổn định hơn, không phải tốn chi phí cho việc tinh chế mà vẫn tận dụng
được các ưu điểm của phương pháp bất động enzyme.
Nguyên tắc của bất động tế bào là giữ hoặc cố định tế bào ở những vị trí xác
định về mặt không gian mà không làm thay đổi hoạt tính của chúng. Các tế bào này
có thể sử dụng nhiều lần và liên tục [10].
1.3.2. Các phương pháp bất động tế bào: [18], [19]
Có thể chia phương pháp bất động tế bào ra làm 4 loại: liên kết với chất
mang, tạo liên kết ngang, bẫy và kết hợp các phương pháp trên. Mỗi phương pháp
có những ưu nhược điểm riêng, do đó khi sử dụng cần cân nhắc về mục đích bất
động, đặc điểm tế bào, dạng phản ứng, dạng thiết bị phản ứng và các vấn đề liên
quan khác.
 Phương pháp liên kết với chất mang:
Bản chất của phương pháp liên kết với chất mang là phương pháp liên kết

giữa các chất xúc tác sinh học (tế bào, enzyme…) với chất mang không tan trong
nước thông qua liên kết đồng hóa trị, liên kết ion, hấp phụ vật lý hoặc liên kết sinh
học đặc biệt. Đặc tính của vật liệu làm chất mang là có độ cứng cơ học, ổn định về
mặt sinh học và không gây độc với tế bào để có thể liên kết với các chất xúc tác
sinh học.
Các vật liệu thường sử dụng làm chất mang là: các polysaccharid không tan
trong nước (celluluse, dextran, dẫn chất của agarose…), các protein (gelatin,
albumin…), các polymer nhân tạo (dẫn xuất của polystyrene, polyurethane, nhựa
trao đổi ion…) và các vật liệu vô cơ (cát, thủy tinh, ceramic…) [18],[10].
Phương pháp liên kết với chất mang thường ít được sử dụng cho bất động tế
bào vì các chất mang thường là các chất độc với tế bào và việc tìm kiếm điều kiện
để bất động tế bào thường gặp khó khăn.

10

 Phương pháp tạo liên kết ngang:
Phương pháp tạo liên kết ngang không sử dụng chất mang để cố định tế bào
mà các tế bào được liên kết với nhau bằng các liên kết ngang tạo thành dạng pellet,
tác nhân tạo thành liên kết ngang thường là glutaraldehyd, các diisocyanat… trong
đó glutaraldehyd là tác nhân phổ biến nhất. Các nhóm amino của glutaraldehyd tạo
thành các liên kết ngang liên kết các tế bào. Các tác nhân nhóm diisocyanat như:
toluen diisocyanat, hexa methyl diisocyanat… lại tạo liên kết ngang bằng cách liên
kết nhóm urea với các nhóm amino. Enzyme aspertase của E. coli và Bacillus
coagulans cũng đã được bất động bằng phương pháp này với glutaraldehyd hoặc
toluen diisocyanat [18], [10], [28], [9].
 Phương pháp bẫy:
Dựa vào tính chất của vật liệu dùng để bẫy các tế bào vi khuẩn mà phương
pháp bẫy được phân chia thành 4 dạng, đó là: dạng lưới, dạng nang nhỏ
(microcapsule), dạng liposome và dạng màng.
 Dạng lưới:

Các chất xúc tác sinh học được bẫy trong các khuôn gel của nhiều loại
polymer khác nhau. Một vài polymer tự nhiên như: alginate, k-caragenenane, agar
là vật liệu gel tốt và rất được ưa dùng. Trong đó, gel Ca-alginate được sử dụng phổ
biến hơn cả do có nhiều ưu điểm như: dễ chuẩn bị, không độc với tế bào, độ bền cơ
học khá tốt, độ xốp thuận lợi cho việc khuếch tán của cơ chất và sản phẩm. Tuy
nhiên, gel Ca-alginate cũng có nhược điểm là: có thể bị nứt vỡ dưới những tác động
cơ học hoặc bị hòa tan dần khi có mặt các chất có khả năng tạo phức chelat với ion
Ca
2+
. Gần đây các nhà nghiên cứu nhận thấy gel Ca-pectat có thể là sự lựa chọn tốt
hơn Ca-alginate vì ít bị tác động của các ion chelat và các tác nhân hóa học hơn.
 Dạng nang nhỏ (microcapsule): Tế bào được gói trong các màng polymer
thẩm thấu nhân tạo tạo thành các nang nhỏ.

11

 Dạng lyposom: Các tế bào vi sinh vật được bẫy trong các màng chất lỏng
tạo thành từ hợp chất amphiphtalic.
 Dạng màng: Chất xúc tác sinh học được tách riêng khỏi môi trường bằng
các màng siêu lọc, màng lọc hoặc bằng các sợi rỗng.
Phương pháp bẫy được sử dụng phổ biến trong bất động tế bào. Tế bào nấm
men, vi khuẩn cũng như các tế bào động thực vật đều có thể được bất động bằng
phương pháp này [18], [10], [21].

Hình 1.6. Các phương pháp bất động tế bào cơ bản. [32]

12

1.3.3. Ứng dụng của phương pháp bất động tế bào:
 Sản xuất kháng sinh:

Kháng sinh là nhóm thuốc rất cần thiết cho cuộc sống con người và hầu hết
các kháng sinh thu được bằng con đường lên men vi sinh vật. Theo các phương
pháp truyền thống, các kháng sinh thường được sản xuất bằng phương pháp lên men
mẻ trong các bình lên men. Tuy nhiên, để nâng cao hiệu suất sản xuất kháng sinh
người ta đã tìm cách chuyển từ lên men mẻ sang lên men liên tục. Điều này khó có
thể thực hiện được với các tế bào tự do, khi đó bất động tế bào trở thành giải pháp
hiệu quả nhất. Nhiều kháng sinh đã được sản xuất trên quy mô công nghiệp từ các
nguyên liệu ban đầu được tạo ra từ phương pháp bất động tế bào như:
oxytetracyclin, penicillin, bacitracin, neomycin, candicidin, cephalosporin… [18].
 Sản xuất các acid hữu cơ:
Bên cạnh phương pháp tổng hợp hóa học thì hiện nay một số acid hữu cơ
cũng được sản xuất bằng bất động tế bào như: acid citric, acid lactic, acid acetic…
Ví dụ: Để sản xuất acid citric, hiện nay chủ yếu sử dụng các tế bào Yarrowia
lipolytica [38] hoặc Aspergillus niger cố định trên cơ chất khác nhau như alginate,
agarose, polyacrylamid hay cho hấp phụ lên cột bọt polyurethane hoặc bẫy vào các
sợi rỗng với chất mang sử dụng là cellulose xốp… Tiến hành theo phương pháp lên
men gián đoạn.
Để sản xuất acid lactic, hiện nay các nhà khoa học hay sử dụng các chủng
Lactobacillus như: L. helveticus [21], L. casei [22], [26], L. delbrueckii [25], [31],
L. plantarum [33], L. rhamnosus… hay chủng Lactococcus lactic [30], [37], được
cố định trên các chất mang khác nhau như: alginate, k-carrageenane… và tiến hành
theo phương pháp lên men mẻ, lên men liên tục…
Lên men bất động tế bào còn được ứng dụng để sản xuất một số acid hữu cơ
khác như: acid propionic, acid gluconic, acid fumaric, acid succinic…

13

 Sản xuất enzyme:
Vi sinh vật là nguồn tốt nhất để sản xuất enzyme, đặc biệt phương pháp bất
động tế bào là kỹ thuật thích hợp nhất để sản xuất các enzyme ngoại bào.

Trong số các enzyme thì enzyme thủy phân tinh bột là -amylase và
glucoamylase được quan tâm nghiên cứu nhiều. Chất mang hay sử dụng là
polyacrylamid, alginate, agar và các polymer khác. Ví dụ, để sản xuất -amylase sử
dụng tế bào B. cereus được bất động vào chất mang alginate, sau đó các hạt nhồi
vào thiết bị phản ứng tầng sôi để sản xuất liên tục -amylase, với cách làm này hiệu
suất phản ứng tăng gấp 24 lần so với lên men mẻ bằng tế bào tự do. Ngoài ra, có thể
sản xuất -amylase từ các tế bào biến đổi của E. coli bất động trong k-
carragenenane có bổ sung thêm glycin. Ngoài ra nhiều enzyme quan trọng khác
cũng được nghiên cứu sản xuất bằng phương pháp bất động như: invertase, lipase,
protease, cellulose, -galactadase, xylanase, L – aminoacylase… [20].
 Tổng hợp các alcol:
VSV được sử dụng phổ biến để sản xuất alcol bằng phương pháp bất động tế
bào là nấm men S. cerevisiae và Z. mobilis. Phương pháp sử dụng là phương pháp
bẫy trong gel alginate, các tế bào S. cerevisiae được giữ trong mạng lưới gel để
không bị khuếch tán vào môi trường, trong khi đó glucose vẫn xâm nhập được vào
trong gel để biến đổi thành ethanol và CO
2
đi ra ngoài. Ưu điểm của phương pháp
này là: hiệu suất lên men đạt được cao hơn, tế bào ít bị ảnh hưởng có hại của môi
trường và quá trình lên men diễn ra nhanh với dung dịch đường ở nồng độ cao [18].
Ở Việt Nam, kỹ thuật bất động đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu.
Trong đó phương pháp bất động tế bào chứa enzyme bằng phương pháp gói trong
khuôn gel (bẫy gel) calci alginate được sử dụng khá phổ biến để bất động tế bào
nấm men ứng dụng lên men sản xuất alcol [16]. Bộ môn Công nghiệp Dược cũng
đã có công trình nghiên cứu về bất động tế bào S. cerevisiae trên calci alginate để
sản xuất ethanol và được ứng dụng làm bài thực tập cho sinh viên dược [2].

14

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị:
2.1.1. Chủng vi sinh vật sử dụng:
Bacillus subtilis natto
Nguồn gốc: Nhật Bản
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng:
Bảng 2.1. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Hóa chất
Nguồn gốc
Hóa chất
Nguồn gốc
Pepton
Ấn Độ
CaCl
2
.2H
2
O
Trung Quốc
Cao thịt
Ấn Độ
Xanh methylen
Việt Nam
NaCl
Trung Quốc
Đậu tương
Việt Nam
Thạch bột
Việt Nam
Natri alginate
Ấn Độ

Casein
Trung Quốc
Natri citrate
Trung Quốc
2.1.3. Môi trường sử dụng:
a) Môi trường canh thang (MT 1):
Pepton 1,0g
Cao thịt 0,5g
NaCl 0,5g
Nước máy vđ 100ml
b) Môi trường canh thang – sữa đậu nành (MT 2):
Pepton 1,0g
Cao thịt 0,5g

15

NaCl 0,5g
Sữa đậu nành 20g
Nước máy vđ 100ml
c) Môi trường sữa đậu nành (MT 3):
Sữa đậu nành 20g
Nước máy vđ 100ml
d) Môi trường thạch thường:
Pepton 1,0g
Cao thịt 0,5g
NaCl 0,5g
Thạch bột 2,3g
Nước máy vđ 100ml
2.1.4. Máy móc và dụng cụ:
Bảng 2.2. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu

Tên thiết bị
Nguồn gốc (Hãng)
Tủ cấy vô trùng
Italia (UV Bioair)
Tủ ấm, tủ sấy
Đức (Memmert)
Nồi hấp tiệt trùng
Nhật (ALP)
Lò vi sóng
Hàn Quốc (Daewoo)
Tủ lạnh
Nhật (Toshiba)
Máy li tâm
Đức
Máy lắc
Đức (Bioshaker)
Cân phân tích
Đức (Satorius)

16

Cân kỹ thuật
Đức (Satorius)
Máy khuấy từ
Hàn Quốc (Wisd)
Máy làm sữa đậu nành
Hà Lan (Philips)
Các dụng cụ được sử dụng: Bình nón, cốc có mỏ, ống đong, cốc có chân, đĩa
petri nhựa (đường kính 8,8cm), đĩa petri thủy tinh (đường kính 9cm), ống nghiệm,
pipet bấm, đầu côn, ống li tâm, thước kẹp Palmer….

2.2. Nội dung nghiên cứu:
Nội dung nghiên cứu giải quyết 2 mục tiêu sau:
2.2.1. Khảo sát thông số của quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto trong
gel alginate:
+ Xác định số lượng tế bào cố định được trong hạt gel trước và sau khi nuôi
cấy ở điều kiện hiếu khí sau 24h.
+ Xác định số lượng tế bào có trong dịch nuôi cấy khi nuôi cấy hạt gel ở điều
kiện hiếu khí sau 24h.
2.2.2. Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi
trường canh thang và chứa sữa đậu nành. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt.
+ Khảo sát sự tồn tại của enzyme protease trong dịch nuôi cấy các hạt gel
alginate cố định B. subtilis natto với môi trường canh thang và môi trường chứa sữa
đậu nành.
+ Khảo sát sự tồn tại của enzyme protease trong dịch nuôi cấy hạt gel
alginate cố định B. subtilis natto ở các thời điểm khác nhau.
+ Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt: Xác định số lượng tế bào vi khuẩn B.
subtilis natto giữ lại được trong 1g hạt gel alginate 3% sau khi giữ trong môi trường
canh thang ở tủ lạnh sau thời gian 1 tháng.