Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần dầu hạt của cây tía tô trắng thu hái tại xã mường vi, huyện bát xát, tỉnh lào cai

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




LƯƠNG THỊ KIM CHI


NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ THÀNH PHẦN DẦU HẠT CỦA CÂY
TÍA TÔ TRẮNG THU HÁI TẠI XÃ
MƯỜNG VI, HUYỆN BÁT XÁT,
TỈNH LÀO CAI


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ





HÀ NỘI – 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



LƯƠNG THỊ KIM CHI

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ THÀNH PHẦN DẦU HẠT CỦA CÂY
TÍA TÔ TRẮNG THU HÁI TẠI XÃ
MƯỜNG VI, HUYỆN BÁT XÁT,
TỈNH LÀO CAI


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ




Người hướng dẫn:
ThS. Phạm Hà Thanh Tùng

Nơi thực hiện:
Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội





HÀ NỘI – 2015
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được nhiều sự
hướng dẫn và giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và gia đình.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến ThS. Phạm
Hà Thanh Tùng – Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy PGS.TS. Trần Văn Ơn,
ThS. Nghiêm Đức Trọng – Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, đã

giúp đỡ tôi trong quá trình thu mẫu và phân tích mẫu.
Khóa luận không thể được hoàn thành nếu không có sự giúp đỡ quý báu
của PGS.TS. Panee Sirisaard – Khoa Dược, Đại học Chiang Mai, Thái Lan và
ông Thanach Sathapanachai – Công ty Jingabell Biotech Co. LTD, Thái Lan
trong hoạt động hợp tác nghiên cứu thành phần dầu hạt Tía tô trắng.
Tôi gửi lời tri ân đặc biệt tới anh Vàng Văn Sưởng cùng bà con dân tộc
Giáy xã Mường Vi, huyện Bát Xát, tỉnh Lào Cai đã giúp đỡ tôi nhiệt tình trong
quá trình thu mẫu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới sinh viên Đoàn Thị Phương – Đại học Dược
Hà Nội đã luôn sẵn sàng hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện.
Tôi cũng xin gửi lời cám ơn tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên và
các bạn nghiên cứu khoa học – Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội,
đã luôn giúp đỡ, và tạo điều kiện thuận lợi để cho tôi có thể hoàn thành tốt quá
trình làm thực nghiệm trên bộ môn.
Và cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới ông bà, bố mẹ và các bạn đã
luôn ủng hộ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và trong thời gian
nghiên cứu đề tài.
Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015
SINH VIÊN


Lương Thị Kim Chi



MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2

1.1. Cây Tía tô 2
1.1.1. Vị trí phân loại Tía tô 2
1.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố của loài Perilla frutescens L. Britton. 2
1.1.3. Đặc điểm sinh thái 4
1.1.4. Bộ phận dùng 4
1.2. Phương pháp Mã vạch DNA (DNA Barcoding) và trình tự di truyền đoạn
DNA ribosom nhân vùng ITS1-5.8S-ITS2 của cây Tía tô 5
1.2.1. Phương pháp mã vạch DNA (DNA Barcoding) 5
1.2.2. Trình tự di truyền đoạn DNA ribosom nhân vùng ITS1-5.8S-ITS2 của
cây Tía tô 6
1.3. Thành phần dầu hạt Tía tô 7
1.3.1. Các acid béo 7
1.3.2. Vitamin E 9
1.3.3. Các hợp chất phenolic 10
1.4. Tác dụng sinh học của hạt Tía tô 10
1.4.1. Tác dụng trên hệ hô hấp 11
1.4.2. Tác dụng trên hệ tim mạch 11
1.4.3. Tác dụng chống viêm 11
1.4.4. Tác dụng trên não bộ 12
1.4.5. Các tác dụng khác 12
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. Nguyên liệu và thiết bị 13
2.1.1. Mẫu nghiên cứu 13

2.1.2. Dung môi, hóa chất 13


2.1.3. Máy móc, thiết bị 14
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 14
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái 14

2.2.2. Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu 15
2.2.3. Nghiên cứu trình tự di truyền 15
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19
3.1. Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học 19
3.2. Đặc điểm vi phẫu 21
3.2.1. Vi phẫu thân 21
3.2.2. Vi phẫu lá 23
3.3. Trình tự di truyền đoạn DNA ribosome nhân vùng ITS1-5.8S-ITS2 24
3.3.1. Tách chiết DNA 24
3.3.2. Xác định trình tự rDNA vùng ITS1-5.8S-ITS2 25
3.3.3. So sánh trình tự gen với các trình tự gen của Perilla frutescens đã công
bố trên Genbank 25
3.4. Hàm lượng các thành phần trong dầu hạt Tía tô P1 27
3.4.1. Các acid béo 27
3.4.2. Hàm lượng Omega 3,6,9 29
3.4.3. Thành phần Vitamin E 29
3.5. Bàn luận 30
3.5.1. Về thực vật 30
3.5.2. Về trình tự đoạn rDNA vùng ITS1-5.8S-ITS2 31
3.5.3. Về thành phần dầu hạt Tía tô P1 32
KẾT LUẬN 39
KIẾN NGHỊ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO 40




DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt
:

Tên đầy đủ (Giải thích)
P.
:
Perilla
AA
:
Arachidonic acid
ALA
:
α-linolenic acid
AOAC
:
Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các
nhà Hóa phân tích)
BLAST

Basic local aligning search tool
BOLD : Barcode of Life Database (Cơ sở dữ liệu về Mã vạch cuộc
sống)
bp
:
base pairs (cặp base)
DHA
:
Docosahexanoic acid
DNA
:
Deoxyribonucleic acid
dNTP : Deoxynucleotide triphosphates
EPA

:
Eicosapentaenoic acid
FAPAS
:
Food Analysis Performance Assessment Scheme (Hệ thống
đánh giá, phân tích thực phẩm)
GC
:
Gas chromatography (Sắc ký khí)
GLC
:
Gas Liquid Chromatography (Sắc ký khí lỏng)
HDL
:
High-density lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng cao)
HPLC
:
High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu
năng cao)
IL-1β
:
Interleukin-1β
ITS
:
Internal transcribed spacer (Vùng phiên mã nội)
LDL
:
Low-density lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng thấp)

LGC
:
Laboratory of the Government Chemist (Phòng thí nghiệm
của các nhà khoa học chính phủ)
PCR
:
Polymerase chain reaction (Phản ứng khuếch đại gen)
rDNA : Ribosomal DNA (DNA ribosom)
TLC/FID
:
Thin Layer Chromatography with Flame Ionization
Detection (Sắc ký lớp mỏng với detector ion hóa ngọn lửa)
TNF α
:
Tumor necrosis factor α (Yếu tố hoại tử khối u alpha)
w/w
:
Weight/weight (Khối lượng/Khối lượng)



DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1: Kết quả định lượng các thành phần trong dầu hạt Tía tô P1 28
Bảng 3.2. Hàm lượng Omega-3,6,9 trong dầu hạt Tía tô P1 29
Bảng 3.3. Thành phần vitamin E trong dầu hạt Tía tô P1 30
Bảng 3.4: Bảng so sánh tỷ lệ thành phần các acid béo bão hòa và không bão
hòa của cây Tía tô P1 với một số mẫu dầu thực vật trên thế giới 33
Bảng 3.5. Bảng so sánh hàm lượng một số chỉ tiêu quan trọng trong các mẫu
dầu thực vật khác nhau 37

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc của vùng rDNA - ITS và các mồi thường sử dụng 6
Hình 1.2: Cấu tạo của triacylglycerol 8
Hình 1.3: Công thức cấu tạo của các acid béo no, đơn không no, đa không no
chính trong dầu hạt Tía tô. 8
Hình 3.1: Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng mẫu P1 19
Hình 3.2: Phân tích hoa mẫu P1 20
Hình 3.3: Chi tiết vi phẫu thân mẫu P1 22
Hình 3.4: Chi tiết vi phẫu lá mẫu P1 23
Hình 3.5: Điện di sản phẩm DNA toàn phần và sản phẩm PCR 24
Hình 3.6: Sắc ký đồ trình tự DNA theo chiều 5’-3’ mẫu P1 với cặp mồi ITS1-
ITS4 25
Hình 3.7: Kết quả gióng hàng trình tự rADN của mẫu P1 với ngân hàng gen
sử dụng công cụ Blast. 26
Hình 3.8: Quả (“Hạt”) của Tía tô: (a) Trung Quốc, (b)Thái Lan, (c) P1 và (d)
mẫu “Tô tử” ở chợ Lãn Ông. 31
Hình 3.9: Dầu hạt Tía tô Okinawa Perilla oil (Aman Prana, Đức) với nhãn giá
trị dinh dưỡng 35


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tía tô (Perilla frutescens L. Britton), họ Bạc hà (Lamiaceae), là cây cỏ
mọc quanh năm, đã được sử dụng lâu đời trên thế giới cũng như ở Việt Nam.
Trong loài P. frutescens L. Britton, có hai thứ chính thường gặp được phân

biệt dựa vào đặc điểm hình thái và cách sử dụng là P. frutescens var.crispa
(Thunb.) W. Deane là một loại rau gia vị và là vị thuốc trong y học cổ truyền
Trung Hoa và P. frutescens var. frutescens là một cây cho hạt để ép lấy dầu
[25, 26, 29].
Các nghiên cứu dịch tễ học cũng như thực tiễn đã chỉ ra lợi ích của dầu
hạt Tía tô đối với sức khỏe con người như làm giảm nồng độ cholesterol,
triglyceride, lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL) [28, 32], giảm cục máu đông giúp
giảm nguy cơ tai biến, nhồi máu cơ tim [21, 28]; giảm triệu chứng dị ứng quá
mẫn, giảm hen suyễn; giảm đau chống viêm; kích thích chức năng miễn dịch
[21]; tham gia vào quá trình hình thành và phát triển trí não ở trẻ [8].
Ở Việt Nam, hiện nay việc khai thác Tía tô để lấy lá làm rau gia vị là
rất phổ biến tuy nhiên việc lấy hạt theo hướng khai thác dầu còn hạn chế.
Trong quá trình khảo sát thực địa, hạt của một loại Tía tô trắng được phát hiện
sử dụng phổ biến bởi đồng bào dân tộc Giáy ở xã Mường Vi, huyện Bát Xát,
tỉnh Lào Cai để làm lương thực. Các đặc điểm mô tả sơ bộ của mẫu cây này
cho thấy sự tương đồng cao với các đặc điểm của loài P. frutescens var.
frutescens. Nhận thấy tiềm năng khai thác cây Tía tô trắng này theo hướng lấy
dầu hạt, chúng tôi đã thực hiện đề tài này với 3 mục tiêu chính là:
• Mô tả đặc điểm thực vật của cây Tía tô trắng.
• Xác định trình tự di truyền đoạn DNA ribosom nhân vùng ITS1-5.8S-
ITS2 của cây Tía tô trắng.
• Xác định thành phần dầu hạt của cây Tía tô trắng.
2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Cây Tía tô
1.1.1. Vị trí phân loại Tía tô
Tía tô (Perilla frutescens L. Britton) thuộc chi Tía tô (Perilla L.), họ
Bạc hà (Lamiaceae), bộ Hoa môi (Lamiales), phân lớp Hoa môi (Lamiidae),
lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) [2, 5].

1.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố của loài Perilla frutescens L. Britton.
Cây cỏ mọc thẳng đứng, cao 50-150 cm. Thân vuông, màu xanh hay
tím nhạt, có lông đa bào thưa hoặc dày đặc. Lá hình trứng rộng hay gần tròn,
cỡ 5-15 x 3-10 cm, chóp lá nhọn, gốc tù, tròn hay hình nêm, mép xẻ răng cưa
to và sâu, 2 mặt màu xanh hay tím nhạt, có lông đa bào dày; gân bên 7-8 đôi;
cuống lá dài 2-5 cm. Cụm hoa dạng chùm ở đỉnh cành, dài 5-20 cm, mỗi đốt 2
hoa mọc đối. Lá bắc hình trứng, dài hơn hoa, có lông đa bào dài. Hoa lưỡng
tính, mọc thẳng hoặc vòng, có cuống dài 1-3 mm. Đài hình chuông, cỡ 3-4 x
2-2,5 mm, có lông đa bào và điểm tuyến ở phía ngoài, có vòng lông ở họng, 2
môi: môi trên 3 thùy ngắn; môi dưới 2 thùy nhọn và dài hơn môi trên, đài quả
đồng trưởng cỡ 7-10 x 3,5-4,5 mm. Tràng hoa màu tím nhạt, dài 5-6 mm, có
lông ở phía ngoài, có vòng lông ở họng, 2 môi: môi trên 2 thùy xẻ nông; môi
dưới 3 thùy với thùy giữa lớn, không có khuyết ở đỉnh. Nhị 4, thụt trong ống
tràng, 2 nhị dưới dài hơn 2 nhị trên; bao phấn 2 ô song song. Bầu nhẵn; vòi
nhụy xẻ 2 thùy ở đỉnh. Đĩa mật có thùy trước cao hơn các thùy khác. Quả
hạch nhỏ, gần hình cầu, đường kính 1-1,5 mm, có gân mạng lưới, màu nâu
đậm hoặc vàng nâu [5, 12].
Trên thế giới, Tía tô phân bố ở Ấn Độ, Butan, Myanmar, Trung Quốc,
Triều Tiên, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Indonesia [5,
12].
3

Theo Thực vật chí Trung Quốc, loài Perilla frutescens L. Britton gồm 3
thứ được phân loại theo khóa sau:
1a. Lá có răng cưa sâu, hẹp, màu tím
…. var. crispa
1b. Lá có răng cưa thô, đôi khi có màu xanh, ít nhất là
ở mặt trên

2a. Đài quả tới 1,1cm, đế và thân có lông dài,

mềm, dày; lá hình trứng rộng tới cầu, 7-13x4,5-10cm,
mặt trên có lông nhiều, mặt dưới có lông mịn; quả hạch
màu nâu xám, kích thước đường kính khoảng 1,5mm
….var. frutescens
2b. Đài quả 4-5,5mm, đế và thân có lông dài
thẳng mềm, lá hình trứng, 4,5-7,5x2,8-5 cm, có lông tơ
mịn, quả hạch màu vàng nâu, đường kính 1-1,5mm
[12].
…var. purpurascens
Theo Thực vật chí Việt Nam, ở Việt Nam, đã xác định có 3 thứ:
• Thứ chuẩn: Perilla frutescens L. Britton (tương ứng với thứ Perilla
frutescens var. frutescens trong Thực vật chí Trung Quốc)
Thứ chuẩn có đặc điểm như mô tả ở trên.
Thứ này phân bố chủ yếu ở độ cao 1.300-1.600 m trên dãy Hoàng Liên
Sơn [4]; và một số tỉnh thành như Lào Cai (Sa Pa), Lạng Sơn (Bắc Sơn), Hòa
Bình (Mai Châu, Pà Cò) [5].
• Perilla frutescens var. acuta (Thunb.) Kudo - Tía tô nhọn (tương ứng
với thứ Perilla frutescens var. purpurascens trong thực vật chí Trung Quốc).
Tên đồng nghĩa: Perilla ocymoides L. var. purpurascens Hayata,
Ocimum acutum Thunb, Perilla cavaleriei Levl.
Khác với thứ chuẩn đã mô tả trên bởi cây có lông tơ và lông đa bào
thưa hơn, lá có kích thước nhỏ hơn (4-7 x 2,5-5 cm), mép xẻ răng cưa nông
và đài quả có kích thước nhỏ hơn (cỡ 4-5 mm).
4

Thứ này thường phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Đồng Văn, thị
xã Hà Giang), Lạng Sơn (Bắc Sơn), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Nội, Ninh
Bình (Chợ Ghềnh). Trên thế giới, loài này còn được tìm thấy ở Trung Quốc,
Nhật Bản [5].
• Perilla frutescens var. crispa (Benth.) Deane ex Bailey – Tía tô rúm

(tương tự thứ Perilla frutescens var. crispa trong thực vật chí Trung Quốc)
Tên đồng nghĩa: Perilla ocymoides L. var. crispa Benth, Ocimum
crispum Thunb., Perilla frutescens var. crispa (Thunb.) Hand Mazz,
Dentidia nankinensis Lour., Plectranthus nankinensis Spreng., Perilla
nankinensis (lour) Decne.
Khác với thứ chuẩn đã mô tả ở trên bởi thân gần như nhẵn hay chỉ có
lông rải rác ở phần non; lá màu tím, xẻ răng cưa sâu, rúm và thường biến thái
hơn; đài quả cũng có kích thước nhỏ hơn.
Thứ này được phân bố rộng rãi hầu khắp các tỉnh, thành phố ở nước ta.
Trên thế giới, chúng còn được trồng ở Trung Quốc, Nhật Bản [5].
1.1.3. Đặc điểm sinh thái
Cây trồng bằng hạt và được gieo trồng vào tháng 5 [26]. Mùa hoa vào
tháng 7-9, mùa quả vào tháng 10-12. Cây ưa sáng và ẩm, thích hợp với đất
thịt và đất phù sa [5].
1.1.4. Bộ phận dùng
Hạt cây Tía tô chứa dầu béo, dùng để rang ăn. Ngọn và lá non dùng
làm rau gia vị và làm thuốc. Cây có tinh dầu. Toàn cây được dùng làm thuốc
[5, 25].
5

1.2. Phương pháp Mã vạch DNA (DNA Barcoding) và trình tự di truyền
đoạn DNA ribosom nhân vùng ITS1-5.8S-ITS2 của cây Tía tô
1.2.1. Phương pháp mã vạch DNA (DNA Barcoding)
Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario,
Canada đã đề xuất "Mã vạch DNA" (DNA Barcoding) như là một cách để xác
định loài. Phương pháp mã vạch sử dụng một đoạn trình tự gen rất ngắn lấy
từ một vị trí chuẩn của hệ gen. Cách dùng giống như cách một máy quét ở
siêu thị phân biệt được các sản phẩm bằng cách phân biệt các mã vạch màu
đen đặc trưng cho từng sản phẩm. Trong công nghệ mã vạch, có thể hai mẫu
trông rất giống nhau và không phân biệt được bằng mắt thường, nhưng

phương pháp mã vạch DNA có thể phân biệt được [36].
Phương pháp DNA barcoding gồm 4 phần cơ bản:
• Mẫu: Các viện bảo tàng, phòng tiêu bản, vườn thú, hồ, mô đông lạnh,
ngân hàng giống, các mẫu thu hái được,…
• Phân tích trong phòng thí nghiệm: Các phòng thí nghiệm sinh học phân
tử làm theo các quy trình chuẩn để tạo ra trình tự mã vạch DNA. Các dữ liệu
này sau đó được đặt trong một cơ sở dữ liệu để phân tích tiếp.
• Cơ sở dữ liệu: Một trong những phần quan trọng nhất của sáng kiến Mã
vạch là việc xây dựng một thư viện tham khảo chung để xác định các loài
chưa biết dựa trên các loài đã biết. Hiện nay, trên thế giới, có hai cơ sở dữ liệu
mã vạch chính là: Ngân hàng gen (Genbank) và Barcode of Life Database
(BOLD).
• Phân tích dữ liệu: Mẫu vật được xác định bằng cách tìm các báo cáo
tham khảo trùng hợp nhất trong cơ sở dữ liệu. Từ đó so sánh, đối chiếu đoạn
DNA được mã hóa của mẫu chưa biết với đoạn trình tự đã biết trong cơ sở dữ
liệu [37].
6

Một mã vạch ADN điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau: (1)
chuẩn hóa – tính đặc hiệu cao, chứa những thông tin quan trọng của loài; (2)
tối giản– có độ dài thích hợp để thuận tiện cho việc tách chiết và giải trình tự
DNA; (3) có khả năng mở rộng – có khả năng phân biệt nhiều loài [3, 19, 20]
1.2.2. Trình tự di truyền đoạn DNA ribosom nhân vùng ITS1-5.8S-ITS2
của cây Tía tô
Khoảng hơn một thập kỷ trở lại đây, trình tự di truyền đoạn DNA
ribosom nhân vùng phiên mã nội (rDNA – ITS) là đoạn gen phổ biến trên
DNA được sử dụng trong các nghiên cứu tiến hóa về phân loại các nhóm thực
vật. Cấu trúc của rDNA - ITS gồm 3 tiểu phần: tiểu đơn vị 5.8S – trình tự có
tính bảo tồn cao trong tiến hóa và 2 vùng phiên mã nội ITS1 và ITS2. Độ dài
trình tự tiểu phần 5.8S gần như không khác nhau (163-164 bp), trong khi đó

độ dài vùng phiên mã nội ITS có sự khác nhau: ITS1 (187bp đến 298 bp) và
ITS2 (187 bp đến 252 bp). Toàn bộ vùng ITS ở thực vật có hoa có độ dài dưới
700 bp [14, 15].

Hình 1.1: Cấu trúc của vùng rDNA - ITS và các mồi thường sử dụng
Có 4 lý do để ITS ngày càng trở nên phổ biến: (i) Tính sẵn có của một
số bộ mồi PCR phổ biến (hoặc tương tự) áp dụng với một lượng lớn của các
nhóm loài. (ii) cấu trúc đa sao chép tạo điều kiện khuếch đại PCR thậm chí từ
mẫu tiêu bản. (iii) Các kích thước vừa phải của ITS (dưới 700 bp) thường cho
7

phép khuếch đại và giải trình tự mà không cần nội mồi, ngoại lệ với nhiều
nhóm thực vật hạt trần. (iv) Do mức độ của sự biến đổi, ITS thường cung cấp
đủ các marker phân tử thích hợp cho các nghiên cứu tiến hóa ở cấp độ loài,
như nguồn gốc của các loài đa bội, lai tạo, biến đổi gen, và cuối cùng, suy
luận phát sinh loài [15, 22].
Với cây Tía tô, trên thế giới có rất nhiều công bố về trình tự đoạn DNA
ribosom nhân vùng phiên mã nội (rDNA – ITS1-5.8S-ITS2). Các đoạn trình
tự này đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới Genbank [38]. Đây là cơ
sở của việc nghiên cứu xác định đoạn trình tự của mẫu nghiên cứu ở Việt
Nam và so sánh với các trình tự đã so sánh trên thế giới.

1.3. Thành phần dầu hạt Tía tô
Dầu thu được từ hạt thường có màu vàng nhẹ, trong suốt và có mùi
thơm, tan nhẹ trong ethanol [8, 9]. Thành phần dầu chiếm khoảng 35-45%
khối lượng hạt. Dầu trong hạt Tía tô có thành phần chủ yếu là triacylglycerol
được cấu tạo bởi glycerol và các acid béo. Acid béo trong dầu hạt Tía tô chủ
yếu là acid béo không no, và một phần acid béo no[8]. Ngoài ra, dầu hạt Tía
tô còn chứa các polyphenol, flavone khác nhau (rosemarinic acid, luteolin,
chrysoeriol, quercetin, catcehin, apegenin và shishonin) [8], và các hợp chất

khác như là acid caffeic, monoterpen alkaloids, ascorbic acid, beta-caroten,
citral, dillapiol, elemicin, limonene, myristicin, protocatechuic acid,
perillaldehyd, xanthin oxidase, các vitamin và muối khoáng [9].
1.3.1. Các acid béo
Các acid béo trong dầu gồm acid béo no, đơn không no hoặc đa không
no, trong đó, acid béo không no thường có tỷ lệ lớn hơn 90% [11]. Các acid
béo không no có hàm lượng cao nhất và được nhắc tới nhiều nhất trong dầu
hạt Tía tô là các acid béo omega như omega-3, omega-6, omega-9. Acid béo
8

omega-3 chủ yếu trong dầu là acid α-linolenic [ALA, 18:3, n-3], omega-6 chủ
yếu là acid linoleic [18:2, n-6], omega-9 chủ yếu là acid oleic [18:1] [8].
Năm 2006, Siriamornpun S. và cộng sự đã nghiên cứu về thành phần
các chất trong dầu hạt Tía tô thu hái được tại Maehongsorn, Chiang Mai và
một mẫu thu mua trên thị trường (Thái Lan). Dầu được chiết từ hạt Tía tô
bằng dung môi hữu cơ. Thành phần của dầu được định tính bằng Iatroscan
(TLC/FID). Hàm lượng các acid béo được phân tích bằng phương pháp GLC
chuẩn. Hàm lượng lipid trong hạt khoảng 34-36%, trong đó triacylglycerol là
thành phần chủ yếu (97%), và một phần nhỏ là phytosterol (3%). Acid béo
chiếm hàm lượng lớn nhất là acid α-linolenic (acid béo omega-3) (55-60%).
Hai acid béo chiếm tỉ lệ đáng kể khác là acid linoleic (acid béo omega-6) (18-
22%) và acid oleic (acid béo omega-9) (11-13%) [30].

Hình 1.2:
Cấu tạo của triacylglycerol
Trong đó RCO-, R’CO-, R”CO- là các gốc acyl của các acid béo.

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của các acid béo no, đơn không no, đa không
no chính trong dầu hạt Tía tô.
9

Các phương pháp chiết tách dầu từ hạt Tía tô là phương pháp ép [31,
35] và phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ [11, 30]. Tuy nhiên, phương
pháp chiết bằng dung môi thường được làm trong phòng thí nghiệm với quy
mô nhỏ. Khi sản xuất tạo ra sản phẩm trên thị trường, phương pháp ép thường
được sử dụng, để tránh sự có mặt của các dung môi độc hại trong dầu [31].
Phương pháp phân tích thành phần các acid béo trong dầu mỡ động
thực vật được áp dụng phổ biến nhất hiện nay là phương pháp Sắc ký khí dịch
chiết thủy phân chất béo dựa trên các quy trình chuẩn như AOAC [6], LGC,
FAPAS [10, 18, 30].
Ngoài ra, có một số phương pháp khác được thực hiện trong một số
nghiên cứu về hàm lượng omega-3 trong thực phẩm. Năm 2011, Ian Acworth
và cộng sự đã nghiên cứu ra quy trình định lượng các acid béo omega-3,
omega-6 trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC pha đảo và phát hiện
bằng detector aerosol tích điện [7].
1.3.2. Vitamin E
Vitamin E được biết tới là một chất chống oxy hóa tốt có cấu tạo gồm 4
dạng cấu hình (α, β, δ, γ) của 2 nhóm Tocopherol và Tocotrienol. Kết quả
nghiên cứu gần đây cho thấy, α-Tocotrienol có tác dụng chống lại các tác
nhân oxy hóa tự do gấp 3 lần so với α-Tocopherol trong thử nghiệm in vitro.
Các Tocotrienol cũng được báo cáo là ức chế quá trình tổng hợp cholesterol,
làm giảm nồng độ cholesterol huyết tương trong các thí nghiệm trên động vật,
và ngăn chặn sự di căn của tế bào ung thư, trong đó, tác dụng của cấu hình γ,
δ, được chứng minh là có hiệu lực tốt hơn cấu hình α [17].
Cũng giống như các dầu thực vật khác, vitamin E trong dầu hạt Tía tô
thường tồn tại ở dạng đồng phân chính là γ-tocopherol. Trong nghiên cứu của
Ozan Nazim Ciftci và cộng sự (2012), tổng hàm lượng của vitamin E là 734
mg/kg, hàm lượng của đồng phân γ-tocopherol là 691 mg/kg (chiếm 94,1%
10

tổng hàm lượng vitamin E). Phân tích hàm lượng vitamin E được thực hiện
bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector huỳnh
quang [10].
1.3.3. Các hợp chất phenolic
Hạt Tía tô không chỉ là nguồn cung cấp giàu omega-3 mà nó còn chứa
các hợp chất phenolic có tác dụng chống oxi hóa như acid rosmarinic,
luteolin, chrysoeriol, quercetin, catcehin và apigenin. Trong đó luteolin là hợp
chất phenolic có tác dụng chống oxy hóa và kháng khuẩn mạnh hơn các hợp
chất phenolic còn lại [33].
1.4. Tác dụng sinh học của hạt Tía tô
Các acid béo không no như omega-3 (ví dụ như acid α-linolenic),
omega-6 (ví dụ như acid linoleic) là các acid béo thiết yếu, bởi vì chúng
không được tự tổng hợp trong cơ người mà phải bổ sung từ bên ngoài để đáp
ứng nhu cầu của cơ thể. Acid béo omega-9 (ví dụ acid oleic) là acid béo thiết
yếu có điều kiện, tức là nó có thể được cơ thể tổng hợp từ các acid béo khác
[8].
Vai trò và tầm quan trọng của các acid béo omega là khác nhau. Vấn đề
cần quan tâm khi lựa chọn các loại dầu là hàm lượng omega-3, omega-6 và sự
cân bằng giữa omega-3: omega-6, trong đó thành phần omega-3 là quan trọng
nhất . Bởi vì, khi omega-6 trong chế độ ăn được đưa vào cơ thể, chúng sẽ đi
vào bên trong màng tế bào, và chuyển hóa thành các hợp chất gây đông máu
bất thường và làm gia tăng phản ứng viêm. Trong khi các acid béo omega-3
lại có tác dụng gần như ngược lại. Các acid béo omega-3 có tác dụng cải thiện
sức khỏe tim mạch, hỗ trợ điều trị một số loại ung thư, tăng cường hệ thống
miễn dịch, cũng như là giảm phản ứng gây viêm, dị ứng [8, 27]. Các nghiên
cứu của Simopoulos A.P. (2002) cũng chỉ ra rằng trong chế độ ăn hiện tại, tỷ
lệ omega-6: omega-3 thường là 15:1-16:1. Sự mất cân bằng đã làm gia tăng
11

phát sinh các bệnh bao gồm các bệnh tim mạch, ung thư, viêm và tự miễn.

Khi gia tăng tỷ lệ omega-3 (tức là giảm tỷ lệ omega-6:omega-3) thì tạo ra các
tác dụng ngược lại. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng trong chế độ ăn, tỷ lệ omega-
6: omega-3 cần được cân bằng trong khoảng 4:1 đến 1:1 [27].
1.4.1. Tác dụng trên hệ hô hấp
Năm 2000, Okamoto và cộng sự đã nghiên cứu về sự ảnh hưởng của
dầu hạt Tía tô (giàu omega-3) trên bệnh nhân hen phế quản về chức năng hô
hấp của phổi và sự tạo thành leukotrien B4 (LTB4) và LTC4 bởi bạch cầu.
Kết quả cho thấy dầu hạt Tía tô có tác dụng điều trị bệnh hen vì làm giảm
hoạt động của LTB4 và LTC4 sinh ra bởi bạch cầu và cải thiện chức năng hô
hấp [21].
1.4.2. Tác dụng trên hệ tim mạch
Năm 1999, Ezaki và cộng sự đã làm thử nghiệm lâm sàng về ảnh
hưởng của việc sử dụng dầu hạt Tía tô giàu omega-3 trên 20 người cao tuổi ở
Nhật Bản trong vòng 3 tháng để đánh giá yếu tố nguy cơ trên bệnh mạch vành
và nồng độ acid béo trong huyết tương. Kết quả cho thấy nồng độ acid α-
linolenic (ALA, acid béo omega-3) trong huyết tương tăng từ 0.8% đến 1.6%,
nồng độ acid eicosapentaenoic (EPA) và acid docosahexanoic (DHA) tăng
tương ứng là 2.5-3.6% và 5.3-6.4% [21]. Sự gia tăng các chất ALA, EPA và
DHA trong huyết tương có thể ngăn ngừa các bệnh mạch vành và giảm cục
máu đông [21, 23].
1.4.3. Tác dụng chống viêm
Dầu hạt Tía tô giàu acid α-linolenic (ALA), làm giảm hoạt động của
AA trên màng tế bào, ức chế sự chuyển hóa của AA, giảm sản sinh cytokines
IL-1β và TNFα bởi các đơn bào được kích thích in vitro, tương tự như trong
các bệnh viêm [8, 27].
12

1.4.4. Tác dụng trên não bộ
Liều cao omega-3 trong dầu Tía tô được sử dụng cho nhóm thí nghiệm
có tác dụng ngăn chặn hoàn toàn nhiễm độc thần kinh gây ra bởi dopamine.

Bởi vì Parkinson’s là một bệnh gây ra bởi sự gián đoạn của hệ dopamin, nên
tác dụng bảo vệ này có thể đưa ra một cam kết cho các nghiên cứu trong
tương lai trong việc ngăn chặn căn bệnh Parkinson này [8, 21].
1.4.5. Các tác dụng khác
Năm 2001, Hiroyo Yamamoto và Tomohiko Ogawa đã làm nghiên cứu
về tác dụng kháng khuẩn của các hợp chất polyphenol trong dầu hạt Tía tô
trên các vi khuẩn gây bệnh ở răng miệng. Kết quả cho thấy, dịch chiết ethyl
acetat của hạt Tía tô có tác dụng kháng khuẩn mạnh với các vi khuẩn
streptococci ở miệng và các chủng vi khuẩn P. gingivalis. Trong các hợp chất
polyphenol, luteolin thể hiện tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất so với các hợp
chất polyphenol còn lại [33].

13

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Mẫu nghiên cứu
Nghiên cứu đặc điểm thực vật: phần trên mặt đất của cây Tía tô trắng
P1 được thu hái tại thôn Cửa Cải, xã Mường Vi, huyện Bát Xát, tỉnh Lào Cai,
ngày 19/10/2014, đã được giám định tên khoa học và lưu giữ mẫu tại Phòng
Tiêu bản, Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội (Mã số tiêu bản:
HNIP/18129/15).
Nghiên cứu trình tự di truyền đoạn DNA ribosom vùng ITS1-5.8S-
ITS2: lá của Tía tô trắng P1.
Nghiên cứu thành phần dầu hạt: dầu ép từ hạt Tía tô trắng P1.
2.1.2. Dung môi, hóa chất
2.1.2.1. Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu
Dung dịch Javen, dung dịch acid acetic, xanh methylen, đỏ carmin (Son
phèn), nước cất làm tiêu bản, glycerin.
2.1.2.2. Nghiên cứu trình tự rDNA – ITS1-5.8S-ITS2

• Nitơ lỏng
• Bộ kit chiết tách DNA thực vật GeneJET – số lô 00209197 (Thermo
Scientific).
• Bộ kit tinh sạch DNA GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific).
• Bộ kit giải trình tự DNA BigDye ® Terminator v3.1 Cycle Sequencing
Kits (Applied Biosystems).
• Dung dịch đệm TAE 1x: pha từ dung dịch gốc TAE 10x có thành phần
như sau: 48.4 g Tris base (Sigma); 11.4 mL glacial acetic acid (17.4M)
(Sigma); 3.7g EDTA disodium salt (Sigma), pha trong nước khử ion vừa đủ
1L.
14

• Gel agarose 1%: 0,5g agarose pha trong 50mL đệm TAE 1x, đung
trong lò vi sóng đến tan hoàn toàn tạo dung dịch trong suốt (khoảng 2 phút).
Để nguội đến khoảng 60˚C, thêm 2 µL ethidium bromide (EB): 10 mg/mL
(Sigma) rồi đổ ra khay đã có lược để tạo giếng. Để thạch nguội ở nhiệt độ
phòng.
• Thang DNA 100 bp chuẩn (Ladder 100bp) (Thermo Scientific)
• Cặp mồi: ITS1-ITS4 (Intergrated DNA Technologies) :
Mồi xuôi: ITS1 (5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)
Mồi ngược: ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)
2.1.3. Máy móc, thiết bị
2.1.3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật và vi phẫu
• Kính lúp soi nổi Leica EZ4, kính hiển vi Leica CME.
• Máy ảnh kỹ thuật số Canon, thước kẻ, đĩa petri, kim mũi mác, dao,…
2.1.3.2. Nghiên cứu đặc điểm di truyền
• Thiết bị bảo quản mẫu: tủ lạnh sâu -22˚C (Biomedical Freezer – Sanyo)
• Dụng cụ tách chiết DNA từ mẫu: chày, cối, kéo, máy votex IKA, máy
ly tâm để bàn tốc độ cao Eppendorf 5415R, tủ lạnh sâu, ống eppendorf (2,0
mL, 1,5 mL), bể ổn định nhiệt Memmert WNB10, micropipette (1000, 100,

20, 10)
• Dụng cụ điện di: Máy điện di Consort EV222, máy soi chụp ảnh DNA
UVP Gel-docIt, lò vi sóng Saiko.
• Dụng cụ PCR: Máy PCR Eppendorf Mastercycler Pro S.
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái
Mô tả đặc điểm hình thái của các mẫu nghiên cứu theo phương pháp
mô tả phân tích [1]. Phân tích hoa và quan sát trên kính lúp soi nổi Leica Z24.
15

Tên khoa học được xác định dựa trên khóa phân loại và mô tả trong các
tài liệu trong nước (Thực vật chí Việt Nam, tập 2) và tài liệu nước ngoài
(Thực vật chí Trung Quốc).
2.2.2. Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu
Tiến hành làm vi phẫu thân và lá của mẫu nghiên cứu theo phương
pháp nhuộm kép [1]. Soi vi phẫu trên kính kính hiển vi Leica CME.
2.2.3. Nghiên cứu trình tự di truyền
2.2.3.1. Tách chiết DNA toàn phần
Quy trình tách chiết DNA sử dụng bộ kit chiết tách DNA thực vật
GeneJET (Thermo Scientific) gồm các bước sau:
#1. Lấy 1 lá bánh tẻ còn tươi của mẫu P1, loại bỏ phần gân, cắt và nghiền
mẫu trong nitơ lỏng bằng cối chày.
#2. Chuyển mẫu đã nghiền vào ống eppendorf 1,5mL có chứa 350 µL Lysis
Buffer A. Votex mẫu 1 phút để trộn đều hỗn hợp đảm bảo tất cả các bột lá
được tiếp xúc đều Lysis Buffer A.
#3. Thêm 50 µL Lysis Buffer B và 20 µL RNase A. Lắc nhẹ
#4. Ủ ở 65˚C trong 10 phút, thỉnh thoảng lắc ống trong lúc ủ
#5. Thêm 130 µL Precipitation Solution và lắc đảo ống 2-3 lần. Ủ trong đá 5
phút.
#6. Ly tâm với tốc độ 13.200 vòng/phút trong 8 phút.

Thu dịch nổi và chuyển sang ống eppendorf 1,5 mL mới. Thêm 400 µL Plant
DNA Binding Solution và 400 µL ethanol 96% và trộn đều.
#7. Chuyển hỗn hợp trên vào một ống spin column được cung cấp sẵn. Ly
tâm với tốc độ vòng 8000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch.
#8. Thêm 500 µL Wash Buffer I đã được thêm ethanol 96% vào ống spin
column. Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch nổi.
Column chuyển sang, đặt trong ống eppendorf mới.
16

#9. Thêm 500 µL Wash Buffer II đã được thêm ethanol 96%. Ly tâm với tốc
độ 13.200 vòng/phút trong 6 phút. Loại bỏ ống eppendorf chứa dịch nổi.
Colunm chứa DNA được chuyển sang đặt trong eppendorf mới.
#10. Thêm 100 µL Elution Buffer để hòa tan DNA, ủ trong 5 phút ở nhiệt độ
phòng. Sau đó ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại column,
thu ống eppendorf có chứa DNA đã được hòa tan.
#11. Kiểm tra quá trình chiết DNA trên bản gel agarose 1%.
#12. Bảo quản DNA ở nhiệt độ -20˚C để thực hiện các bước tiếp theo.
2.2.3.2. Khuếch đại DNA (PCR)
Phản ứng PCR được thực hiện với hỗn hợp phản ứng được trình bày
trong bảng dưới đây.
Bảng 2.1. Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR
Thành phần
Thể tích (µL)/ 1
phản ứng
Thể tích (µL)/ mẫu
thí nghiệm
Nước khử ion vô trùng
5,10
25,5
Dung dịch đệm cho Taq DNA

polymerase (10x)
1,00 5,00
dNTP (2.5 mM)
0,30
1,50
Mồi xuôi (10 pmol/µL)
0,70
3,50
Mồi ngược (10 pmol/µL)
0,70
3,50
Taq DNA-polymerase (5U/µL)
0,25
1,25
DNA khuôn
2,00
10,00
Tổng thể tích
10,00
50,00

Tiến hành PCR với các cặp mồi ITS1- ITS4.
Dung dịch đệm sử dụng là Dream Taq Buffer (chứa 20 mm MgCl
2
)