Xây dựng phương pháp định lượng cefepim trong thuốc bằng sắc ký lỏng hiệu năng

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


LÊ THỊ HUYỀN TRANG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG CEFEPIM TRONG THUỐC
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



HÀ NỘI – 2014





BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




LÊ THỊ HUYỀN TRANG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG CEFEPIM TRONG THUỐC
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ





Người hướng dẫn:
Ths. Phạm Lê Minh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất
Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2014







LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện đề tài, tôi xin chân thành cảm ơn những
người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất tới
ThS. Phạm Lê Minh, người trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian, tâm

huyết, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô giáo và các kỹ thuật viên
ở bộ môn Hóa phân tích đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian tôi
làm thực nghiệm tại bộ môn.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động
viên, khích lệ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện
đề tài này.

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2014
Sinh viên
Lê Thị Huyền Trang



MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CEFEPIME 3
1.1.1 Công thức cấu tạo của cefepim 3
1.1.2 Tính chất lý hóa 3
1.1.3 Dược lý 4
1.1.4 Dược động học 5
1.1.5 Chỉ định 5
1.1.6 Tác dụng không mong muốn, chống chỉ định 6
1.1.7 Liều lượng, cách dùng 6
1.1.8 Một số chế phẩm 7
1.2 . MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFEPIM 8
1.3 . SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 9
1.3.1 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao 9
1.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký 9

1.3.3 Cấu tạo của hệ thống HPLC 9
1.3.4 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký 12
1.3.5 Ứng dụng của HPLC 15

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 18
2.1.1 Nguyên vật liệu 18
2.1.2 Thiết bị 18
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng cefepim trong chế phẩm 18
2.2.2 Ứng dụng định lượng cefepim trong chế phẩm 21


2.2.3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả 22

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 23
3.1. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFEPIM BẰNG
HPLC 23
3.1.1. Chuẩn bị mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu trắng, pha động 23
3.1.2. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 23
3.1.3. Tiến hành định lượng 26
3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 26
3.2.1 Tính chọn lọc – Độ đặc hiệu 26
3.2.2 Độ thích hợp của hệ thống 30
3.2.3 Khoảng tuyến tính 31
3.2.3 Độ chính xác 33
3.2.4 Độ đúng 34
3.3. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CEFEPIM TRONG CHẾ PHẨM 37
3.4. BÀN LUẬN 38

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40
4.1. KẾT LUẬN 40
4.2. KIẾN NGHỊ 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO



DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatogtaphy).
mg Miligam
ml Mililit
PA Tinh khiết phân tích (Pure Analysis)
RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
USP 32 Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopoeia)
UV- Vis Tử ngoại- Khả kiến (Ultraviolet - Visible)
WHO Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization )


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng
Tên bảng
Trang
1.1
Một số chế phẩm có chứa cefepim
7
1.2
Một số phương pháp định lượng cefepim bằng HPLC

8
1.3
Một số phương pháp định lượng cefepim bằng quang phổ
UV
8
3.1
Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký
31
3.2
Cách pha dung dịch chuẩn và kết quả khảo sát độ tuyến tính
32
3.3
Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp
34
3.4
Cách pha các dung dịch khảo sát độ đúng
35
3.5
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
36
3.6
Kết quả định lượng cefepim trong chế phẩm
37




DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình

Tên hình
Trang
1.1
Công thức cấu tạo của cefepim
3
3.1
Phổ hấp thụ tử ngoại của cefepim
24
3.2
Sắc ký đồ mẫu trắng
27
3.3
Sắc ký đồ mẫu cefepim chuẩn 0,5 mg/ml
27
3.4
Sắc ký đồ mẫu cefepim thử 0,5 mg/ml
28
3.5
Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn của cefepim
28
3.6
Độ tinh khiết của pic sắc ký của cefepim
29
3.7
Chồng phổ cefepim của dung dịch chuẩn và thử
30
3.8
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ
với diện tích pic của cefepim
33

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Năm 1929, Alexander Fleming đã phát hiện ra khả năng kháng khuẩn
của nấm Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu, sử dụng kháng sinh.
Cùng với sự phát triển khoa học kỹ thuật và nhu cầu trong thực tế nhiều dòng
kháng sinh mạnh, có phổ tác dụng rộng xuất hiện như cephalosporin,
macrolid, quinolon, Kháng sinh được xem như là vũ khí quan trọng nhất để
đối phó với các bệnh do vi khuẩn gây ra. Nhờ kháng sinh mà hàng loạt căn
bệnh từng đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe và tính mạng loài người như
nhiễm khuẩn như lao, viêm phổi, viêm màng não, lậu, giang mai… được điều
trị và khống chế có hiệu quả.
Tuy nhiên theo thống kê của WHO, vấn đề kháng thuốc hiện nay có xu
hướng gia tăng và đặc biệt nổi trội ở các nước đang phát triển. Việt Nam là
một trong những quốc gia có tình trạng kháng kháng sinh cao nhất trên thế
giới. Để phục vụ nhu cầu điều trị, chăm sóc sức khỏe người dân, trên thị
trường dược phẩm Việt Nam lưu hành rất nhiều kháng sinh mới ra đời như
cephalosporin thế hệ 3, thế hệ 4, Trong đó, cefepim là một kháng sinh
cephalosporin thế hệ 4 có phổ tác dụng rộng, hiệu quả trên nhiều vi khuẩn,
được sử dụng điều trị các nhiễm khuẩn nặng nên việc đảm bảo chất lượng
thuốc rất được quan tâm. Hiện nay, chưa có chuyên luận kiểm tra các chế
phẩm chứa cefepim trong Dược điển Việt Nam. Một vài phương pháp định
lượng cefepim trong chế phẩm được công bố nhưng việc áp dụng vào điều
kiện kiểm nghiệm ở Việt Nam gặp nhiều khó khăn.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định
lượng cefepim trong thuốc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với mục tiêu:
1. Xây dựng phương pháp định lượng cefepim trong thuốc bằng sắc
ký lỏng hiệu năng cao.

2. Thẩm định phương pháp xây dựng.
2

3. Áp dụng định lượng một số chế phẩm có chứa cefepim đang lưu
hành ở Việt Nam.















3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ CEFEPIM
1.1.1. Công thức cấu tạo

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của cefepim
 Công thức phân tử: C
19
H

25
ClN
6
O
5
S
2
.HCl.H
2
O
 Khối lượng phân tử: 571,50
 Tên khoa học: 1-[[(6R,7R)-7-[(2- (2- Aminothiazol -4- yl)
glyoxylamido]- 2- carboxy- 8- oxo-5- thia- 1- azabicyclo[4.2.0]oct- 2-
ene- 3- yl] methyl]- 1- methyl pyrrolidinium chlorid, 7
2
–( Z) - (O-
methyloxime), monohydrochlorid, monohydrat [13], [17].

1.1.2. Tính chất lý hóa
 Tính chất vật lý
Bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà.
Tan tốt trong nước, methyl alcol. Không tan trong dicloromethan.
Điện tử Π ở Δ
3
cùng với nhân thơm làm cefepim hấp thụ UV.
Bảo quản tránh ánh sáng [1], [2], [13], [17].
 Tính chất hóa học
Cefepim có khung không bền với sự thủy phân bởi kiềm, alcol, amin.
Cefepim không bền trong dung dịch.
Cefepim có tính acid: do có nhóm –COOH.

4

Tạo sản phẩm có màu với H
2
SO
4
, HCHO/ H
2
SO
4
đặc [1], [2].

1.1.3. Dược lý
Cefepim là thuốc kháng sinh bán tổng hợp nhóm cephalosporin thế hệ
IV có phổ tác dụng rộng hơn các cephalosporin thế hệ III.
Thuốc được dùng theo đường tiêm (do bị phá hủy bởi dịch dạ dày và
hấp thu qua đường tiêu hóa hạn chế).
Thuốc có tác dụng kháng khuẩn do ức chế tổng hợp mucopeptid ở
thành tế bào vi khuẩn.
Các vi khuẩn nhạy cảm invitro với thuốc: Enterobacteriaceae,
Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Moraxella (branhamella)
catarrhalis, Neisseria onorrhoeae, các chủng Staphylococcus (trừ
Staphylococcus aureus kháng methicilin) và các chủng Streptococcus.
Cefepim không bị beta lactamase của các vi khuẩn Gram âm thủy phân
và có thể có tác dụng lên một số chủng Enterobacteriaceae và P. aeruginosa
kháng cefotaxim hay ceftazidin.
Cefepim có tác dụng lên các vi khuẩn Gram dương (ví dụ
Staphylococcus) mạnh hơn ceftazidin và có tác dụng tương tự như ceftriaxon.
Thuốc có tác dụng yếu lên vi khuẩn kỵ khí, nhất là Bacteroides
fragilis.

Cefepim được dùng theo đường tiêm để điều trị nhiễm khuẩn đường
niệu nặng có biến chứng (kể cả trường hợp có viêm bể thận kèm theo) do các
chủng E.coli hoặc Klebsiella pneumoniae hoặc Proteus mirabilis nhạy cảm
với thuốc.
Nhiễm khuẩn nặng ở da và cấu trúc của da do các chủng
Staphylococcus aureus nhạy cảm với methicilin và do các chủng
Staphylococcus pyogenes nhạy cảm với cefepim.
5

Cefepim dùng điều trị viêm phổi nặng, viêm phổi có kèm theo nhiễm
khuẩn huyết do các chủng Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae,
Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp. nhạy cảm với thuốc [1], [13].

1.1.4. Dược động học
 Hấp thu: Sau khi tiêm bắp, cefepim được hấp thu nhanh và hoàn toàn,
nồng độ đỉnh trong huyết thanh tùy thuộc vào liều và xuất hiện sau khi tiêm
30 phút. Khoảng 16% liều được gắn vào protein huyết tương không phụ thuộc
vào nồng độ thuốc trong huyết tương.
 Phân bố: Cefepim thâm nhập vào phần lớn các mô và các dịch (nước
tiểu, mật, dịch màng bụng, dịch phế quản). Thể tích phân bố đo ở giai đoạn ổn
định là khoảng 18 lít.
 Chuyển hóa - thải trừ: Trong cơ thể, cefepim rất ít bị chuyển hóa (chỉ
7% liều). Thời gian bán thải khoảng 2 giờ. Khoảng 80% liều tiêm đào thải
theo nước tiểu qua lọc cầu thận, 85% liều thải dưới dạng không đổi trong
nước tiểu. Thời gian bán thải của thuốc kéo dài một cách đáng kể ở người suy
thận, bởi vậy với những người bệnh này cần giảm liều theo mức lọc cầu thận
[1], [13].

1.1.5. Chỉ định
 Nhiễm khuẩn nặng đường niệu có biến chứng (kể cả có viêm bể thận

kèm theo).
 Viêm phổi nặng có kèm theo nhiễm khuẩn huyết do các chủng nhạy
cảm với thuốc.
 Nhiễm khuẩn nặng ở da và cấu trúc của da do các chủng
Staphylococcus aureus nhạy cảm với methicilin và do các chủng
Staphylococcus pyogenes nhạy cảm với cefepim [1], [13].
6

1.1.6. Tác dụng không mong muốn, chống chỉ định
1.1.6.1. Tác dụng không mong muốn
 Thường gặp ADR>1/100: Ỉa chảy, phát ban.
 Ít gặp 1/1000<ADR< 1/100: Sốt, nhức đầu, buồn nôn, nôn, mày đay,
mẩn ngứa, tăng bạch cầu ưa acid, giảm bạch cầu hạt, viêm tắc tĩnh mạch (nếu
tiêm tĩnh mạch), bệnh nấm Candida ở miệng, tăng các enzym gan .
 Hiếm gặp ADR<1/1000: Phản ứng phản vệ, phù, chóng mặt, giảm bạch
cầu trung tính, hạ huyết áp, dãn mạch, đau khớp [1], [13].

1.1.6.2. Chống chỉ định
 Người bệnh dị ứng với kháng sinh nhóm cephalosporin [1], [13].

1.1.7. Liều lượng, cách dùng
1.1.7.1. Cách dùng
 Tiêm tĩnh mạch chậm 3 - 5 phút hoặc truyền tĩnh mạch, hoặc tiêm bắp
sâu và liều lượng cefepim tùy theo mức độ nặng nhẹ từng trường hợp.
 Truyền tĩnh mạch ngắt quãng: Pha bằng dung dịch natri clorid 0,9%,
dextrose 5%, Ringer lactat và dextrose 5% có nồng độ thuốc tương ứng là 10,
20 hay 40 mg/ml. Ngoài ra, pha với dịch truyền tĩnh mạch để có dung dịch có
nồng độ thuốc tương ứng vào khoảng 100 hay 160 mg/ml. Liều thuốc cần
dùng sẽ được tính và cho vào dịch truyền tĩnh mạch. Thực hiện việc truyền
tĩnh mạch ngắt quãng trong khoảng xấp xỉ 30 phút.

 Tiêm bắp: Pha cefepim với dung môi thích hợp (v.d nước cất pha tiêm,
dung dịch natri clorid 0,9%, dung dịch glucose 5%, lidocain hydroclorid 0,5%
hoặc 1%) để tạo dung dịch có nồng độ thuốc xấp xỉ 280 mg/ml.

1.1.7.2. Liều dùng
7

 Ðiều trị nhiễm khuẩn nặng đường niệu có biến chứng (kể cả có viêm bể
thận kèm theo), nhiễm khuẩn nặng ở da và cấu trúc da: Người bệnh >12 tuổi,
tiêm tĩnh mạch 2g/lần, ngày 2 lần cách nhau 12 giờ, trong 10 ngày.
 Ðiều trị viêm phổi nặng (kể cả có nhiễm khuẩn huyết kèm theo):
2g/lần, ngày 2 lần cách nhau 12 giờ, dùng trong 7 - 10 ngày.
 Liều lượng ở người suy thận: Người bị suy thận (độ thanh thải creatinin
< 60 ml/phút), dùng liều ban đầu bằng liều cho người có chức năng thận bình
thường. Tính toán liều duy trì theo độ thanh thải creatinin của người bệnh
[1],[13].

1.7.1. Chế phẩm
Bảng 1.1. Một số chế phẩm có chứa cefepim
STT
Biệt dược
Thành phần
dược chất
Dạng bào
chế
Nhà sản xuất
1
Cefepim
Cefepim
Bột pha

tiêm
Công ty CPDP
Euvipharm
2
Cepas
Cefepim
Bột pha
tiêm
Samrudh
Pharmaceuticals PVT.
Ltd, Ấn Độ.

3
Maxipime
Cefepim
Bột pha
tiêm
Bristol – Myers
Squibb, USA
4
Scud- XP
Cefepim +
Tazobactam
Bột pha
tiêm
Zuventus Healthcare
Ltd., India
5
Magnova
Cefepim

+Tazobactam
Bột pha
tiêm
Lupin laboratories
Ltd., India

8

1.8. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFEPIM
1.8.1. Phương pháp định lượng cefepim bằng HPLC
Bảng 1.2: Một số phương pháp định lượng cefepim bằng HPLC

Tài
liệu
Cột sắc ký
Pha động
Thể tích
tiêm
Detector
Tốc độ
dòng
[9]
C18 (4,6 х
250 mm,
25 µm)
Acetonitril: nước
(10:90, v/v)
10 µl
212 nm
1ml/ph

[16]
C18 (4,6 х
250 mm, 5
µm)
Đệm phosphat pH
6,2: Acetonitril
(94:6, v/v)
20 µl
210nm
1ml/ph
[17]
C18 (3,9
mm х 30
cm, 5 µm)
Natri
pentanesulfonat:
acetonitril (94:6, v/v)
10 µl
254 nm
2ml/ph

1.8.2. Phương pháp khác định lượng cefepim

Bảng 1.3: Một số phương pháp định lượng cefepim bằng Quang phổ
UV.

Tài
liệu
Nhà nghiên
cứu

Thiết bị
Dung môi, tác
nhân
Bước sóng
[13]
Patel Chahana
A, Patel Harsha
U., Patel
Chhaganbhai C
Máy quang
phổ
Shimadzu
UV-1800 ,
cuvet thạch
anh 1cm

Hòa tan bằng
nước , tác nhân
là HCl 0.1 M,
NaOH 0.1M

268,8 nm
[14]
Mehul Patel,
Jagdish
Kakadiya,
Nehal Shah
Máy quang
phổ
Shimadzu

UV-1800 ,
cuvet thạch
anh 1cm
Hòa tan và pha
loãng với
methanol
295 nm và
288,8 nm
tương ứng
với cefepim
và
moxifloxacin
9


[11]
Chafle D. M


Chất tạo phức
màu đỏ với
1,10
phenonthroline
trong sự có mặt
của sắt nitrat
515 nm

1.3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.3.1. Khái niệm :
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở

của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di
chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp
phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [4].

1.3.2. Nguyên tắc
Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất vào hai pha không trộn lẫn
nhưng luôn tiếp xúc với nhau, trong đó pha động là chất lỏng được đẩy qua
pha tĩnh trong cột nhờ bơm cao áp. Dung dịch chất cần phân tích được đưa
vào hệ thống nhờ van tiêm mẫu, được pha động kéo tới cột nhờ áp lực của
bơm. Tại cột xảy ra quá trình phân bố và tách các chất. Những chất có ái lực
thấp với pha tĩnh được rửa giải ra trước, chất có ái lực cao với pha tĩnh rửa
giải ra sau. Sau khi ra khỏi cột, các chất được detector phát hiện và ghi lại
dưới dạng pic [3], [4].

1.3.3. Cấu tạo máy HPLC [3], [4], [7]
1.3.3.1. Hệ thống bơm
Bơm là một trong những bộ phận quan trọng của hệ thống sắc ký, có
chức năng đưa pha động qua cột dưới áp suất cao và ở một tốc độ hằng định.
10

Có 2 loại bơm:
 Bơm áp suất không đổi: Ít sử dụng HPLC.
 Bơm tốc độ dòng hằng định: Thường sử dụng cho HPLC.
Bơm cần có các đặc tính sau:
 Bơm pha động dưới áp suất cao, tốc độ dòng không đổi.
 Bên trong bơm không bị ăn mòn bởi bất cứ dung môi nào.
 Phải cung cấp một khoảng tốc độ dòng và thay đổi tốc độ dòng
dễ dàng.
 Có thể chuyển dễ dàng từ pha động này sang pha động khác.
 Có thể tháo ráp dễ dàng để sửa chữa.

 Sự chảy dung môi không tạo ra các xung (pulse).

1.3.3.2. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi
Bình chứa dung môi thường làm bằng thủy tinh đôi khi bằng thép
không gỉ. Dung môi cần lọc qua màng lọc 0,45 µm và đuổi khí hòa tan trong
dung môi (thường sử dụng máy siêu âm).
Phương pháp rửa giải thông thường chỉ cần 1 bình dung môi. Phương
pháp rửa giải gradient cần nhiều bình chứa các dung môi khác nhau.

1.3.3.3. Hệ tiêm mẫu
Có nhiều phương pháp tiêm mẫu: Phương pháp phổ biến dùng van tiêm
có vòng chứa mẫu có dung tích xác định, chính xác, có thể thay đổi vòng
chứa mẫu với các dung tích khác nhau.
Một số máy HPLC có hệ tiêm mẫu tự động có thể lập trình điều khiển
thể tích mẫu, số lần tiêm, chu kỳ rửa vòng chứa mẫu.

1.3.3.4. Cột sắc ký
11

Quá trình tách các chất diễn ra ở cột. Cột thường được làm bằng các
chất trơ về mặt hóa học, chịu được áp suất cao, hiện nay thông dụng nhất là
thép không gỉ. Ở quy mô phân tích, chiều dài cột khoảng 10-30 cm, đường
kính trong từ 4-10 mm.
Chất mang (pha tĩnh) được nhồi trong cột. Các tiểu phân pha tĩnh được
chế tạo từ nhiều vật liệu khác nhau: silca (silic dioxyd), nhôm oxyd, polyme
xốp, và hiện nay thường dùng các tiểu phân có kích thước 3- 10 µm. Tùy
từng loại pha tĩnh khác nhau có các loại sắc ký khác nhau: sắc ký hấp phụ, sắc
ký trao đổi ion, sắc ký phân bố,
Pha động có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp các dung môi. Ái lực của
một chất với pha tĩnh hay thời gian lưu của nó trên cột phụ thuộc vào độ phân

cực của pha động. Người ta có thể thay đổi độ phân cực của pha động bằng
cách thay đổi tỷ lệ các dung môi trong hỗn hợp.
Tùy thuộc vào pha động và pha tĩnh, ta chia sắc ký phân bố thành sắc
ký pha thuận và sắc ký pha đảo.

1.3.3.5. Bộ phận phát hiện (Detector)
Detector là bộ phận phát hiện và đo các tín hiệu sinh ra khi có chất ra
khỏi cột, các tín hiệu này được ghi dưới dạng pic trên sắc ký đồ.
Tùy vào bản chất của chất cần phân tách để lựa chọn detector phù hợp.
Một số detector thường dùng hiện nay thuộc nhóm quang học và điện hóa:
Detector UV- Vis, Detector huỳnh quang, Detector đo dòng, Detector tán xạ
bay hơi, Detector đo chỉ số khúc xạ, Detector đo độ dẫn điện,

1.3.3.6. Bộ phận lưu trữ dữ liệu
Bộ phận tiếp nhận, lưu trữ các tín hiệu phát ra từ detector và in các sắc
ký đồ hoàn chỉnh. Hiện nay bộ phận lưu trữ dữ liệu của máy HPLC thường là
12

các máy vi tính hiện đại, có chức năng ghi nhận, lưu trữ, biên tập, xử lý thông
tin.
1.3.4. Một số thông số đặc trưng của HPLC [3], [4], [7]
1.3.4.1. Thời gian lưu (t
R
)
Thời gian lưu là thời gian cần thiết để một chất di chuyển từ nơi tiêm
mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc ký đồ tính từ lúc tiêm đến
lúc xuất hiện đỉnh của pic.
Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính trên sắc ký đồ của một chất
tan. Trong những điều kiện sắc ký nhất định, thời gian lưu của một chất tan là
hằng số.

Thời gian lưu phụ thuộc :
 Bản chất của pha tĩnh.
 Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
 Cấu tạo, bản chất của phân tử chất tan.
 Trong một số trường hợp t
R
phụ thuộc vào pH pha động.

1.3.4.2. Thể tích lưu (V
R
)
Thể tích lưu của một chất tan là thể tích của lượng pha động bị đẩy ra
khỏi cột từ lúc bắt đầu tiêm mẫu thử đến khi xuất hiện đỉnh của chất tan trên
sắc ký đồ.
V
R
= t
R
х F (1.1)
Trong đó t
R
: Thời gian lưu.
F: Lưu lượng của pha động.

1.3.4.3. Hệ số phân bố (K)
13

Hệ số phân bố là tỷ lệ nồng độ chất tan trong pha tĩnh và nồng độ chất
tan trong pha động.
K =





(1.2)
Trong đó K: Hệ số phân bố.
C
s
: Nồng độ chất tan trong pha tĩnh.
C
m
: Nồng độ chất tan trong pha động.
Trong sắc ký phân bố, khi tiến hành tách hỗn hợp 2 chất tan A, B.
K
A
= K
B
: Quá trình sắc ký không tách được A, B.
K
A
≠ K
B
: A, B phân bố khác nhau trong pha tĩnh và pha động, nên sẽ
tách khỏi nhau trong quá trình sắc ký. Hệ số phân bố khác nhau càng nhiều thì
khả năng tách hai chất chất càng lớn.

1.3.4.4. Hệ số dung lượng (k’)
 





 












Trong đó: Q
s
, Q
M
: Lượng chất tan trong pha tĩnh, pha động.
V
S,
V
M
: Thể tích của pha tĩnh, pha động.
K: Hệ số phân bố.
t
R,
t
0

: Thời gian lưu, thời gian lưu lý tưởng.
Trị số tối ưu 1≤ k’≤ 5.

1.3.4.5. Số đĩa lý thuyết
    





   







Trong đó N: Số đĩa lý thuyết.
t
R
: Thời gian lưu.
14

W: Chiều rộng của đỉnh tính theo đường nền.
W
1/2
: Chiều rộng của đỉnh ứng với ½ chiều cao.
Ngoài ra, số đĩa lý thuyết được tính theo công thức sau:
N=



(1.5)
Trong đó L: Chiều dài cột sắc ký.
H: Chiều cao của đĩa lý thuyết.
Số đĩa lý thuyết cho biết hiệu lực cột.

1.3.4.6. Hệ số bất đối xứng (AF)
AF=


 (1.6)
Trong đó a: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép
đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
W: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
Yêu cầu 0,8 ≤AF≤ 1,5.

1.3.4.7. Độ phân giải (R
S
)









 











Độ phân giải R
S
liên quan đến hệ số dung lượng k’, độ chọn lọc α, số
đĩa lý thuyết N. Mối liên hệ thể hiện qua công thức:







  




 



Trong đó t
RA
, t
RB
: Thời gian lưu của hai pic liền kề nhau.
W
A
, W
B
: Chiều rộng đo ở đáy của hai pic.
15

W
1/2(A)
, W
1/2(B)
: Độ rộng đáy pic đo ở nửa chiều cao pic của
chất A, B.
R
S
= 1,5 hai pic tách khỏi nhau rõ ràng.
R
S
= 1,0 hai pic chưa tách hẳn, còn xen phủ nhau.
R
S
= 0,75 hai pic chưa tách hẳn.

1.3.5. Ứng dụng của HPLC [3], [7]
1.3.5.1. Định tính

Thời gian lưu của chất thử và chất chuẩn trong cùng điều kiện sắc ký
tương ứng với nhau.

1.3.5.2. Định lượng
Việc định lượng các chất bằng HPLC có thể dựa vào so sánh chiều cao
của đỉnh pic hoặc so sánh diện tích pic của chất cần xác định với một hay
nhiều mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ.
Một số phương pháp định lượng hay dùng:
 Phương pháp chuẩn ngoại: So sánh trực tiếp chiều cao hoặc diện tích
pic của mẫu thử với chiều cao hoặc diện tích pic của mẫu chuẩn đã biết nồng
độ trong cùng điều kiện sắc ký.
Yêu cầu: Mẫu chuẩn và mẫu thử làm trong cùng điều kiện sắc ký.
Nồng độ mẫu thử nằm trong khoảng tỷ lệ tuyến tính.
Phương pháp có 2 cách: Chuẩn ngoại 1 điểm, chuẩn ngoại nhiều điểm
Chuẩn ngoại 1 điểm: Tiến hành với mẫu thử và mẫu chuẩn có nồng độ
xấp xỉ nhau. Nồng độ mẫu thử tính theo công thức:










Trong đó S
T,
S
C

: Diện tích pic của chất thử, chất chuẩn.
C
T
, C
S
: Nồng độ chất thử, chất chuẩn.
16

Chuẩn ngoại nhiều điểm: Chuẩn bị một dãy chất chuẩn có nồng độ tăng
dần và nằm trong khoảng tuyến tính. Tiến hành sắc ký, ghi lại diện tích, chiều
cao pic. Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện mối quan hệ giữa
nồng độ và diện tích (hoặc chiều cao) pic. Dựa vào phương trình tính nồng độ
chất thử.
 Phương pháp chuẩn nội: Thêm một lượng bằng nhau một chất chuẩn
thứ hai (được gọi là chất chuẩn nội) vào trong cả mẫu thử và mẫu chuẩn, tiến
hành sắc ký trong cùng điều kiện.
Yêu cầu cần có của một chất chuẩn nội:
 Trong cùng điều kiện sắc ký, chất chuẩn nội phải được tách hoàn
toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu
thử.
 Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử.
 Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử.
 Có độ tinh khiết cao và dễ kiếm.
 Có nồng độ xấp xỉ nồng độ chất thử.
 Phương pháp thêm chuẩn
Áp dụng trong định lượng bằng HPLC khi có ảnh hưởng của các chất
hấp phụ.
Thêm chính xác các lượng chất chuẩn đã biết nồng độ vào cùng một
lượng mẫu thử, tiến hành sắc ký.
Xây dựng phương trình đường thẳng thể hiện mối tương quan giữa

nồng độ và diện tích (hoặc đường cao) pic. Nồng độ dung dịch thử là giao của
đường thẳng tuyến tính với trục hoành.
 Phương pháp chuẩn hóa diện tích: Hàm lượng phần trăm của một chất
trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic
của thành phần đó so với tổng diện tích pic của tất các thành phần.
17

Yêu cầu: Tất cả các thành phần được rửa giải và phát hiện, tất cả các
thành phần có đáp ứng như nhau với detector [2], [7], [4].