Bước đầu chế tạo và đánh giá hoạt tính enzyme laccase trong phức hệ nano chitosan

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI







NGUYỄN NGỌC HÀ




BƯỚC ĐẦU CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ
HOẠT TÍNH ENZYME LACCASE TRONG
PHỨC HỆ NANO CHITOSAN



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014


BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI








NGUYỄN NGỌC HÀ





BƯỚC ĐẦU CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ
HOẠT TÍNH ENZYME LACCASE TRONG
PHỨC HỆ NANO CHITOSAN


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Lê Quang Huấn
2. TS. Đỗ Hồng Quảng
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa sinh
2. Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam




HÀ NỘI - 2014

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin phép được gửi lời cảm
ơn chân thành nhất tới :
PGS.TS Lê Quang Huấn
TS. Đỗ Hồng Quảng
Những người Thầy đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, dìu dắt, giúp đỡ và
đặc biệt đã luôn truyền nhiệt huyết cho em trong suốt quá trình thực hiện
khóa luận.
Em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới anh Phạm Văn Phúc, chị
Nguyễn Hải Vân, Ths. Lê Thị Thuỳ Dương và các anh, chị đang công tác
tại Phòng Công nghệ tế bào động vật và Phòng Công nghệ tái tạo môi trường
- Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
đã hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện giúp em hoàn thành khoá luận tốt nghiệp
này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo, các chị kỹ thuật

viên - bộ môn Hóa sinh - trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận
lợi giúp em hoàn thành đề tài.
Cuối cùng xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên, cổ
vũ giúp em hoàn thành chương trình đại học và khóa luận tốt nghiệp.

Sinh viên


Nguyễn Ngọc Hà




MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Phần 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Laccase 3
1.1.1. Giới thiệu về Laccase 3
1.1.2. Nguồn thu laccase 3
1.1.3. Cấu trúc laccase 5
1.1.5. Đặc tính của laccase 9
1.1.6. Ứng dụng của laccase 10
1.1.7. Phương pháp xác định hoạt tính laccse 11
1.1.8. Các phương pháp tách chiết, tinh sạch enzyme 12
1.2. Chitosan và nano chitosan 14
1.2.1. Nguồn gốc và cấu trúc chitosan 14

1.2.2. Tính chất lý hoá của chitosan 14
1.2.3. Tính chất sinh học của chitosan 15
1.2.4. Tiểu phân nano chitosan 15
1.2.5. Các phương pháp chế tạo hạt nano chitosan 16
Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. Vật liệu, hoá chất, thiết bị 22
2.1.1. Vật liệu 22
2.1.2. Hoá chất 22
2.1.3. Thiết bị, máy móc 22
2.2. Nội dung nghiên cứu 23
2.3. Phương pháp nghiên cứu 25
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy nấm thu dịch enzyme 25
2.3.2. Phương pháp tinh sạch enzyme laccase 25
2.3.3. Phương pháp xác định tính chất enzyme laccase 26
2.3.4. Phương pháp tạo hạt nano chitosan 28
2.3.5. Phương pháp cố định enzyme laccase lên hạt nano chitosan 30
2.3.6. Phương pháp phân tích đặc điểm của nano chitosan 31
2.3.7. Phương pháp kiểm tra hiệu quả cố định enzyme laccase lên nano
chitosan 31
Phần 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33
3.1. Kết quả tách chiết, tinh sạch enzyme laccase 33
3.1.1. Nuôi cấy thu dịch enzyme 33
3.1.2 Tinh sạch protein bằng cột sắc ký lọc gel Sephadex G-75 33
3.1.3. Tinh sạch protein qua cột sắc ký trao đổi ion 35
3.2. Kết quả tạo phức hệ nano chitosan - enzyme laccase 37
3.2.1. Kết quả tạo tiểu phân nano chitosan 37
3.2.2. Kết quả cố định enzyme laccase lên tiểu phân nano chitosan 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT









2,4-D
2,4,- dichlorophenoxyacetic

2,4,5-T
2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid

ABTS
2,2'-azino-bis(3-ethybenzthiazoline-6-sulphonic acid

DMP
Dimethylphenol

DDT
Dichloro diphenyl trichloroethane

HAA
3-hydroxyanthranillic acid

HBT
1-hydroxybenzo-trialzone

HCH
Hexachlorocyclohexane

HPI
N-hydroxyphtaimide

PAH
Polycyclic aromatic hydrocarbon

PCB
Polychlorinated biphenyl

PDA
Potato dextrose agar

SDS
Sodium dodecyl sulfate

TNT
Trinitrotoluen

VLA
Violuric acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng
Nội dung
Trang
Bảng 2.1
Thành phần của một bảng gel polyacrylamid
28
Bảng 3.1
Tóm tắt quá trình tinh sạch laccase từ chủng
Cerrena sp FBV25
34
Bảng 3.2
Kết quả do hoạt độ nano chitosan - laccase và
laccase
41

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Tên hình
Nội dung
Trang
Hình 1.1
Cấu trúc không gian ba chiều của laccase
6
Hình 1.2
Trung tâm hoạt động của laccase
7
Hình 1.3
Cơ chế xúc tác của laccase
8
Hình 1.4
Phản ứng deacetyl hoá chitin tạo thành chitosan
15
Hình 1.5
Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp tạo liên kết ngang nhũ
tương
18
Hình 1.6
Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp giọt tụ
19

Hình 1.7
Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ
tương
20
Hình 1.8
Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp tạo gel ion
21
Hình 1.9
Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp mixen đảo
22
Hình 2.1
Sơ đồ nội dung nghiên cứu
25
Hình 2.2
Sơ đồ phản ứng depolymer hoá chitosan phân tử lượng
cao
30
Hình 3.1

Hàm lương protein và hoạt tính các phân đoạn sau khi
qua cột sắc ký lọc gel
35
Hình 3.2
Điện di đồ sản phẩm tinh sạch laccase từ chủng
Cerrena sp.FBV25 qua cột sắc ký lọc gel G-75 trên gel
polyacrymide
36
Hình 3.3
Hàm lương protein và hoạt tính các phân đoạn sau khi
qua cột trao đổi ion

37
Hình 3.4
Điện di đồ sản phẩm tinh sạch laccase từ chủng
Cerrena sp.FBV25 trên gel polyacrymide
38
Hình 3.5
Hình ảnh SEM mẫu nano chitosan
39
Hình 3.6
Kết quả đo phân bố size nano chitosan
39
Hình 3.7
Kết quả đo thế zeta nano chitosan
40
Hình 3.8
Hình ản phản ứng màu của laccace với ABTS
42
!
1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Laccase là một polyphenol enzyme thuộc nhóm enzyme oxidase có bốn
nguyên tử đồng trong phân tử. Laccse có khả năng xúc tác phản ứng oxy hoá
của nhiều cơ chất khác nhau với chất nhận điện tử cuối cùng là oxy. Được
tìm ra lần đầu tiên từ năm 1883 [15], enzyme laccase đã thu hút đ ược rất
nhiều sự chú ý của các nhà nghiên cứu trong thập kỉ qua bởi đặ c tính sinh học
tự nhiên củ a nó. Trong công nghệ sinh học nano, laccase được ứng dụng như
những chất cảm biến sinh học gắn với các tiểu phân nano dùng cho kiểm
nghiệm miễn dịch, xác định glucose, amin thơm và các hợp chất phenolic
[12, 26]. Đặc biệt, laccase cũng được báo cáo là có khả năng ức chế virus

HIV-1 [14] và các dòng tế bào Hep G2 là dòng tế bào ung thư gan và MCF-7
là dòng tế bào ung thư vú [13].
Cùng với đó, các chất mang gắn thuốc với kích cỡ nano đang được
nghiên cứu ứng dụng mạnh mẽ trong y học để chẩn đoán và điều trị bệnh, đặc
biệt là với bệnh ung thư. Các hạt nano có kích cỡ rất nhỏ có thể đi qua các
hàng rào sinh học của cơ thể, mang thuốc đến đúng tế bào bệnh giúp nâng
cao hiệu quả điều trị. Hơn nữa, khi enzyme được cố định lên các hệ nano, các
hạt nano còn có tác dụng bảo vệ hoạ t tính enzyme. Vì thế, tiềm năng ứng
dụng của enzyme laccase cùng với công nghệ nano trong điều trị bệnh là rất
lớn. Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay chưa có nghiên cứu nào báo cáo về việc
cố định enzyme laccase lên các hạt nano.
Chitosan là sản phẩm deacetyl hoá của chitin, thành phần chính của vỏ
tôm cua. Chitosan có nhiều đặc tính sinh học của một chất mang gắn thuốc lý
tưởng như tính hoà hợ p sinh học, tính phân huỷ sinh học, độc tính thấp, giá
thành thấp [9, 38]. Các tiểu phân nano chitosan cũng thể hiện những tính chất
lý tưởng cho việc cố định enzyme như từ tính, và diện tích bề mặt lớn, bảo vệ
!
2
enzyme khỏi sự phân huỷ hoá học, tránh sự xáo trộn các ion kim loại của
enzyme. Chính vì thế, chúng tôi lựa chọn chitosan để tiến hành nghiên cứu
chất mang gắn enzyme laccase cho đề tài: "Bước đầu chế tạo và đánh giá
hoạt tính enzyme laccase trong phức hệ nano chitosan", với mục đích bước
đầu nghiên cứu phát triển một loại thuốc chữa ung thư.
Đề tài gồm có ba mục tiêu chính:
− Tinh sạch enzyme laccase để thu được enzyme laccase có độ tinh sạch
cao, dùng để cố định lên nano chitosan.
− Chế tạo và đánh giá một số tính chất của tiểu phân nano chitosan.
− Bước đầu cố định enzyme laccase lên nano chitosan và đánh giá hiệu
suất.

!
3
Phần 1: TỔNG QUAN

1.1. Laccase
1.1.1. Giới thiệu về Laccase
Laccase (p-benzenediol: oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2) là một
polyphenol enzyme thuộc nhóm enzyme oxidase. Trong phân tử có chứa 4
nguyên tử đồng có khả năng oxy hoá cơ chất sử dụng phân tử oxy làm chất
nhận điện tử. Laccase có phổ cơ chất khá đa dạng bao gồm: diphenol,
polyphenol, các dẫn xuất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol,
polychlorinated biphenyl (PBC), dioxin và cả hợp chất vô cơ như iod. Các
loại laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau thì khác nhau về khối lượng
phân tử, tính chất glycosyl hoá và các tính chất động học [21].

Trong những năm gần đây, laccase được đặt biệt quan tâm bởi tiềm năng
ứng dụng mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm, xử lý ô
nhiễm môi trường [35], công nghiệp hoá dược [32], công nghệ sinh học và
nano [8, 12, 26]. Trong ngành Dược, laccase được ứng dụng trong tổng hợp
các hợp chất hoá dược như thuốc mê, thuốc an thần, kháng sinh [32]. Ngoài
ra, laccase cũng được nghiên cứu phát triển như những chất cảm biến sinh
học dùng trong chẩn đoán và điều trị bệnh [19].
1.1.2. Nguồn thu laccase
1.1.2.1. Laccase trong tự nhiên
Laccase được phân bố rộng rãi trong tự nhiên trong các loạ i thực vật,
nấm và vi khuẩn. Laccase từ thực vật được phát hiện lầ n đầu tiên ở Rhus
vernicifera (ở cây sơn mài Nhật Bản) vào năm 1883 [15]. Sau đó, laccase
được nghiên cứu ở rất nhiều các loại thực vật khác như ở Ficus racemosa L
(cây sung), Weeping willow (cây thuỷ dương), Nicotiani tabacum (cây thuốc
lá) và Prunus persica (cây đào). Laccase thực vật đóng vai trò trong sự hình
!
4
thành thân gỗ, có vai trò polymer hoá các monolignol hình thành các dimer
và trimer trong quá trình lignin hoá. Tuy vậy, laccase có nguồn gốc từ thực
vật ít được nghiên cứu vì phần lớn chúng có thế oxy hoá khử thấp.
Ngoài các nguồn laccase từ thực vật, sinh tổng hợp laccase trong vi
khuẩn cũng được khảo sát trong các nghiên cứu gần đây. Các loài vi khuẩn đã
được phát hiện là nguồn sinh tổng hợp laccase như Azospirillum lipoferum,
Bacillus subtilis [5]. Tuy nhiên, laccase trong vi khuẩn thường thu được hoạt
tính rất thấp và khó có khả năng ứng dụng trong thực tiễn sản xuất.
So với laccase tổng hợp từ thực vật, vi khuẩn hay côn trùng, laccase có
nguồn gốc từ nấm biểu hiện nhiều ưu thế hơn cả, do có tính ổn định hơn, tính
không đặc hiệu cơ chất và khả năng oxi hoá các hợp chất phenol đa dạng
[10]. Laccase trong nấm là các enzyme ngoại bào có chứa nhiều nguyên tử
đồng xúc tác các phản ứng oxy hoá, tham gia chủ yếu vào quá trình phân giải

lignin. Laccase đã được phát hiện trong các loài nấm từ các họ Ascomyces,
Deuteromyces, Basidomyces, và trong các chi Botrytis cinerea, Chaetomium
thmophilum, Coptius, cinereus, Neurospora crassa, Phlebia radiatre,
Pleurotus otreatus, Pycnoporus cinnabarius, Trametes versicolor [17].
1.1.2.2. Laccase tái tổ hợp
Do khả năng xúc tác oxy hoá được nhiều loại cơ chất mà điển hình là
các hợp chất có chứa vòng phenol nên laccase có rất nhiều ứng dụng trong
công nghệ sinh học. Tuy nhiên, laccase được tổng hợp từ các chủng tự nhiên
thường với lượng rất ít và yêu cầu các chất cảm ứng với giá thành cao [19].
Do vậy, rất nhiều nhóm nghiên cứ u trên thế giới đã nghiên cứu biểu hiện gen
mã hoá laccase nhằm tạo ra một lượng enzyme đủ lớn với giá thành hạ đáp
ứng nhu cầu ứng dụng của laccase trong các lĩnh vực công nghiệp.
Tuỳ vào hệ thống biểu hiện sử dụng, hoạt tính và các đặc tính của
laccase tái tổ hợp không hoàn toàn giống với chủng gốc và không giống nhau
!
5
ngay cả khi cùng nguồn gen.
Các hệ thống vật chủ đã được sử dụng để biểu hiện thành công laccase
từ nấm cho đến thời điểm này chủ yếu là nấm men: S. cerevisiae, P. pastoris,
P. methalonica, Yarrowia lipolytica, K. lactis và nấm mốc, điển hình như: A.
oryzae, A. niger, A. sojae, T. reseei, Pycnoporus cinabarinus [19].
1.1.3. Cấu trúc laccase
Laccase được cấu tạo từ các glycoprotein, với phần carbohydrat góp
phần tạ o nên mức độ ổn định của enzyme [24]. Trong nấm thường xảy ra quá
trình glycosyl hoá với mứ c độ dao động khác nhau, laccase từ Coriolopsis
fulvocinnerea có mức độ glycosyl hoá lên đến 32% [31] và laccase từ
Pleurotus pulmonarius có mức độ glycosyl hoá tới 45% [33].
Một loài sinh vật có thể có nhiều dạ ng isozyme của laccase, các dạng
isozyme này khác nhau về trình tự acid amin và một số tính chất về động học
xúc tác. Tuy vậy, tất cả các laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc

tác với 4 nguyên tử đồng thuộc 3 loại khác nhau nằm ở các vị trí khác nhau
của enzyme. Bốn nguyên tử đồng này được chia thành 3 nhóm: loại 1 (T1),
loại 2 (T2), loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế
điện tử. Các nguyên tử đồ ng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo
thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện
tử hấp thụ điện tử và có thể được hoạ t hoá khi liên kết với anion mạnh [34].
Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phần (vùng) chính A, B, C
có khối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần đều có vai trò trong quá trình
xúc tác của laccase. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và
vùng C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên
tử đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và vùng C.


!
6












Hình 1.1: Cấu trúc không gian ba chiều của laccase
Trung tâm đồng một nguyên tử chỉ chứa một nguyên tử đồng T1, liên
kết với một đoạn peptid có hai gốc histidin và một gố c cystein. Liên kết giữa

nguyên tử đ ồng T1 với nguyên tử lưu huỳnh của cystein là liên kết đồng hoá
trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600 nm, tạo cho laccase có màu xanh
nước biển đặc trưng. Trung tâm đồng ba nguyên tử có nguyên tử đồng T2 và
cặp nguyên tử đồng T3. Nguyên tử đồng T2 liên kết với hai gốc histidin bảo
thủ trong khi các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidin bảo thủ
[17].
1.1.4. Cơ chế xúc tác của laccase
Laccase là enzyme oxy hoá khử có khả năng oxy hoá diphenol và các
hợp chất có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử. Trung tâm
nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hoá cơ chất.
Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1
(Cu
2+
) trở thành dạng Cu
+
, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng
!
7
đều ở trạng thái khử (Cu
+
). Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển
đồng thời bố n điện tử từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đ ồng T2/T3
qua cầu tripeptit bảo thủ His-Cys-His. Phân tử oxy sau đó oxy hoá laccase
dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử thành
nước [20].

Hình 1.2. Trung tâm hoạt động của laccase
Tất cả các ion đồng đều đóng vai trò quan trọng trong cơ chế xúc tác của
laccase. Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản
ứng oxy hoá cơ chất. T1 nhận điện tử đầu tiên từ cơ chất, sau đó điện tử này
được vận chuyển qua bộ ba acid amin (His-Cys-His) đến vị trí T2/T3. Phân
tử oxy sau đó nhận điện tử và bị khử thành nước [15].
Trong công nghệ tổng hợp các hợp chất hay trong các công nghệ khác,
thì cơ chế xúc tác có thể xảy ra theo một trong các cơ chế ở hình 1.3. Cơ chế
đơn giản nhất có thể diễn ra khi các cơ chất bị oxy hoá trực tiếp bởi trung tâm
hoạt đ ộ ng do bốn nguyên tử đồ ng đảm nhiệm. Tuy nhiên, các phần tử cơ chất
!
8
thường có cấu tạo phức tạp hoặc có thế khử quá lớn. Vì vậy chúng không thể
tiếp cận được trung tâm phản ứng của phân tử laccase. Trong trường hợp này
cần một hợp chất hoá học trung gian gọi là mediator (hình 1.3b). Hợp chất
hoá học này có thể tiếp xúc với trung tâm phản ứng của laccase và bị laccase
oxy hoá thành dạng gốc tự do. Sau đó chất trung gian ở dạng oxy hoá nhận
một điện tử của cơ chất và trở thành chất khử, tiếp tục tham gia vào chu kỳ
xúc tác. Ngược lại, laccase sau khi nhận mộ t điện tử từ chất trung gian thì trở
thành dạng khử, và sau đó bị oxy hoá thành dạng oxy hoá và tiếp tục tham gia
vào chu kỳ xúc tác tiếp theo. Các chất trung gian thường dùng cho laccase là:
3-hydroxyanthranillic acid (HAA), 2,2'-azino-bis(3-ethybenzthiazoline-6-
sulphonic acid) (ABTS), 1-hydroxybenzo-trialzone (HBT), N-

hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid (VLA) [22] v.v. Sự tham gia của chất
trung gian một lần nữa làm cho laccase có khả năng tham gia xúc tác với
nhiều chất hơn, tức là làm tăng tính không đặc hiệu cơ chất [4].
Sự phù hợp giữa cơ chất và laccase phụ thuộc vào hai yếu tố. Thứ nhất
là sự tiếp cận giữa cơ chất và nguyên tử đồng T1. Điều này phụ thuộc rất lớn
vào tính chất và vị trí của các nhóm chức trên vòng phenol của cơ chất. Sự
phù hợp này cũng phụ thuộc vào sự khác nhau giữa thế oxy hoá-khử giữa cơ
chất và enzyme. Đạ i lượng này lại phụ thuộc vào cấu trúc hoá học và các
nhóm thế. Thế oxy hoá khử của laccase dao động trong khoảng 0,4 - 0,8 V
[2].
Cũng như các enzyme khác, laccase cũng có những chất ức chế. Những
chất ức chế này liên quan trực tiếp đến liên kết hoá học của các nguyên tử
đồng. Các chất ức chế của laccase thường là các ion nhỏ như azide, cyanide,
flouride. Các ion này sẽ gắn vào trung tâm chứa 3 nguyên tử đồng và chặn
các dòng điện tử đi đến các nguyên tử này. Các hợp chất khác như acid béo,
L-cystein v.v. cũng được coi là các chất ức chế nhưng với nồng độ cao hơn
!
9
các ion kể trên.
a.




b.
Hình 1.3: Cơ chế xúc tác của laccase
a. Cơ chế xúc tác khi không có sự tham gia của chất trung gian
b. Cơ chế xúc tác khi có sự tham gia của chất trung gian
1.1.5. Đặc tính của laccase
Laccase có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 40 - 60 kDa, tuy

vậy nhiều laccase có khối lượng phân tử lớn như laccase từ các loại nấm
Ascomycetes như M. indicum và Podospra anserina có khối lượng phân tử
100 kDa.
Giá trị pH hoạt động tối thích của laccase nằm trong vùng acid và phụ
thuộc nhiều vào cơ chất. Khi sử dụng ABTS là cơ chất thì pH tối ưu cho
laccase thường là 3. Tuy nhiên, đối với quá trình oxi hoá các hợp chất phenol
như DMP, guanial và syringaldazine, giá trị pH tối ưu cho hoạt động của
enzyme cao hơn, từ 4.0 - 7.0.
Độ bề n pH của các laccase khác nhau khá nhiều, đa phần các laccase
!
10
bền ở pH 6. Độ bền pH của laccase từ T. versicolor nằm trong dải pH từ 2.5 -
7 sau một giờ ủ còn trên 50% [1].
Khoảng nhiệ t độ hoạt động tối thích của các laccase thường trong
khoảng 25 - 30
0
C tuỳ vào từng loại cơ chất xúc tác và các loại laccase khác
nhau. Với cơ chất là ABTS laccase thường hoạt động trong khoảng 27 - 30
0
C
[18], với cơ chất là DMP laccase hoạt động ở 25 - 30
0
C [18].
Nhiệt độ hoạt động tối thích của các laccase thay đổi trong khoảng 25 -
80
0
C, một vài loại enzyme có nhiệt độ hoạ t động tối thích dưới 35
0
C. Nhiệt
độ hoạt động tối thích của laccase từ P. ostreatus nằm trong khoảng 25 -

35
0
C [18].
1.1.6. Ứng dụng của laccase
Phương pháp oxy hoá sinh học nhờ enzyme được xem là phương pháp
khả thi có thể thay thế các phương pháp oxy hoá hoá học do chúng rất thân
thiện với môi trường, có tính đặc hiệu và hiệu suất cao. Laccase là một trong
các enzyme oxy hoá được ứng dụng khá phổ biến trong các ngành công
nghiệp do chúng có phổ cơ chất rộng và sử dụng chất nhận điện tử cuối cùng
là oxy phân tử chứ không phải cần các chất nhận điện tử khác như NAD(P)
+
.
Laccase được sử dụng trong một số ngành công nghiệp giấy để phân huỷ
lignin trong bột gỗ; tẩy trắng trong công nghiệp dệt nhuộm; xử lý các hợp
chất polyphenol và loại bỏ oxy không mong muốn trong một số ngành công
nghiệp thực phẩm; hoá mỹ phẩm, dược phẩm v.v. Một số ứng dụng cụ thể
của laccase được trình bày sau đây:
- Ứng dụng trong xử lý sinh học: Laccase rất hữu hiệu trong việc tham
gia xúc tác phân huỷ các chất độc thông qua quá trình oxy hoá, đặc biệt là các
chất phức tạp, không tan. Laccase có thể tham gia phân huỷ các hợp chất
phenol là chất thải của quá trình sản xuất như các hợp chất PAH, PCB từ
ngành công nghiệp dầu mỏ, thuốc nổ TNT (trinitrotoluen) trong ngành khai
!
11
khoáng, quân sự, thuốc trừ sâu DDT (dichlorodephenyltrichloroethane), HCH
(hexachlorocyclohexane), thuốc diệt cỏ (2,4-D,2,4,5-T) v.v. dùng trong nông
nghiệp [35].
- Ứng dụng trong ngành dược: Có nhiều dược phẩm được nghiên cứu
tạo ra từ laccase như các chất kháng khuẩn, giải độc. Laccase có thể được sử
dụng trong tổng hợp các hợp chất hoá dược như thuốc mê, thuốc an thần,

thuốc chống viêm, kháng sinh, v.v., bao gồm triazolo(benzo)cycloalkyl
thiadiazines, vinblastine, mitomycin, penicillin X dimer, cephalosporins [32].
Ngoài ra, laccase cũng được báo cáo là có khả năng ức chế sự sao mã ngược
của virus HIV-1 [14], ức chế sự nhân lên của các dòng tế bào Hep G2 và
MCF-7 là các dòng tế bào ung thư gan và ung thư vú [13].
- Ứng dụng trong công nghệ nano: Trong y học, vật liệu nano được ứng
dụng rộng rãi như một vật liệu mang chất cảm biến sinh học và vật liệu sinh
học. Enzyme laccase đã được nghiên cứu sử dụng như những chất cảm biến
sinh học. Một số cảm biến sinh học có chứa laccase đã được phát triển cho
kiểm nghiệm miễn dịch, để xác định glucose, amin thơm và các hợ p chất
phenolic [12,11,26].
1.1.7. Phương pháp xác định hoạt tính laccse
Nguyên tắc: Dựa trên sự oxy hoá ABTS củ a enzyme laccase tạo thành hợp
chất hấp thụ ở bước sóng 420 nm, ở điều kiện thí nghiệm [13].
Định nghĩa: Một đơn vị hoạt đ ộ laccase là lượng enzyme cần thiết để tạo
thành 1 µM sản phẩm từ ABTS trong thời gian 1 phút, ở điều kiện thí
nghiệm.
Công thức tính:
:

ε
τ
××
×××−
=
2
10)(
6
E
fpuo

V
DVAA
U
!
12
Trong đó:
U: Hoạt tính enzyme (U/l)
ε: Hệ số hấp thụ ánh sáng của sản phẩm ở bước sóng 420 nm
ε = 36.000 (M
-1
cm
-1
)
τ: thời gian phản ứng (phút)
V
pu
: Tổng thể tích phản ứng (1 ml)
V
E
: Thể tích enzyme (0,2 ml)

A
τ
: Giá trị hấp thụ quang đo được tại thờ i đ iể m τ
A
o
: Giá trị hấp thụ quang đo được tại thờ i đ iể m τ = 0
D
f
: Độ pha loãng

1.1.8. Các phương pháp tách chiết, tinh sạch enzyme
1.1.8.1. Các phương pháp tách chiết enzyme:
Các phương pháp cơ học đ ược ứng dụng nhiều để tách enzyme khỏi tế
bào và các thành phần khác gồm hai phương pháp:
− Phương pháp ly tâm: Ly tâm là quá trình tách vật rắn ra khỏi dung
dịch. Phần lớn các enzyme ngoại bào là các enzyme hoà tan, như vậy
sau khi tiến hành ly tâm, dung dịch tách ra khỏi phần chất rắn là dịch
enzyme thô. Enzyme nội bào nằm trong tế bào sinh vật, muốn thu nhân
enzyme nội bào, ta phải tiế n hành mộ t giai đoạn phá vỡ tế bào.
− Phương pháp lọc: Trong công nghệ enzyme, sau khi phá vỡ thành tế
bào sinh vật hay sau khi lên men, ngườ i ta thường sử dụng quá trình lọc
để thu nhận dung dịch enzyme nộ i bào, enzyme ngoài bào hoà tan.
Dịch chiết enzyme ở bước này thu được thường chứ a nhiều protein và các
chất không mong muốn. Vì thế, chúng ta cần phải tinh sạch enzyme.
1.1.8.2. Các phương pháp tinh sạch enzyme:
− Phương pháp diêm tích: Trong nghiên cứu và trong sản xuất, người ta
dùng dung dịch amonium sunfat để kết tinh enzyme, dung dịch
!
13
amonium sunfat để kết tinh enzyme đ òi hỏi độ tinh sạch phải rất cao là
khó, vì vậy phương pháp này ít được phổ biến.
− Phương pháp điện di: Phương pháp điện di chỉ được ứng dụ ng nhiều
trong phòng thí nghiệm. Người ta cũng đã tiến hành áp dụng thử
phương pháp này theo quy mô công nghiệp nhưng cho đến nay vẫn
chưa được phát triển rộng rãi.
− Phương pháp sắc ký:
- Sắc ký lọc gel: Theo phương pháp này, các loại gel được
nạp vào trong cột dùng để tách enzyme. Các loại gel đư ợ c sử dụng rộng
rãi trong phương pháp sắ c ký cột là: polycryamide, ararose, vinyl
polymer, dextran Trong lọc gel, các phân tử được tách ra dựa theo

kích thước và hình dáng của chúng.
- Sắc ký trao đổi ion. Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa
trên sự tích điện của phân tử protein. Phương pháp này được sử dụng
rộng rãi trong sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp. Tính chất
tích đ iện của protein chịu ả nh hưởng rấ t nhiều bởi giá trị pH. Từ đó,
người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation.
- Sắc ký kỵ nước: Phương pháp này dựa trên sự tương tác của
vùng kỵ nước của phân tử protein với nhóm kỵ nước trên chất nền, sự
hấp phụ xảy ra ở nồ ng độ muối cao và quá trình phân đoạn với muối.
Phương pháp này đặc biệt thích hợp đối với những
enzyme đã đ ược làm cô đặc trước đó bằng phương pháo kết tủa với
muối amonium sulfate
- Sắc ký ái lực: Phương pháp này dựa trên khả năng giữ enzyme
bằng những chất nền không hoà tan, được nhồi vào trong cột sắc ký.


!
14
1.2. Chitosan và nano chitosan
1.2.1. Nguồn gốc và cấu trúc chitosan
Chitosan là dẫn xuất deacetyl hoá của chitin, trong đó nhóm -NH
2
thay
thế nhóm -NHCOCH
3
ở vị trí C
2
của chitin. Đơn vị cấu tạo phân tử chitosan
là β-D-glucosamin bởi liên kết α-(1-4)-glycoside [3].

Hình 1.4: Phản ứng deacetyl hoá chitin tạo thành chitosan
Chitin là một polysacrit tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (chỉ
đứng thứ hai sau cellulose), nó tậ p trung nhiều trong vỏ các loài hải sản như
tôm, cua, mai mự c, tảo biển và các loài bọ cánh cứng, sinh khối nấm mốc.
1.2.2. Tính chất lý hoá của chitosan
− Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức: -OH, -NH
2
, -NHCOCH
3

có nghĩa chúng vừa là alcol, vừa là amine, vừa là amide. Phản ứng hoá học có
thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N
− Chitosan ở thể rắn tồn tại dưới 2 dạ ng: dạng tinh thể và dạng vô định
!
15
hình. Chitosan không tan trong nước, kiềm đặc và loãng, không tan trong
cồn, aceton và các dung môi hữu cơ khác. Chitosan tan trong dung dịch acid
loãng tạo dung dịch keo trong suốt. Độ nhớt của chitosan trong dung dịch

acid loãng liên quan đến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của
chitosan (đây cũng là tính chất chung của tất cả các dung dịch polyme).
− Do chitosan có nhóm -NH
2
linh động nên có khả năng tạo phức với ion
kim loại [30], tạo liên kết với các axit hữu cơ, anhydrit hữu cơ [28].
1.2.3. Tính chất sinh học của chitosan
− Chitosan có độc tính thấp, có thể sử dụng an toàn trên người theo đường
uống, đường tiêm, bôi ngoài da và ghép mô [9].
− Chitosan là một hợp chất cao phân tử có tính hoà hợp sinh học với cơ
thể [38].
− Chitosan có tính phân huỷ sinh học và hoà hợp sinh học không những
với động vật mà còn cả đối với mô thực vật [9].
Do có những tính chất sinh học kể trên, chitosan đáp ứng được các tiêu chuẩn
của một chất mang polyme. Tác giả Zhang Y, Hou C., Chen A. (1997) đã
nhận xét, chitosan là một chất mang thuốc tuyệt vờ i.
1.2.4. Tiểu phân nano chitosan
Tiểu phân nano (nanoparticle) là các tiểu phân phân tán cấu tạo đa phân
tử có kích thước từ 1nm đến 1.000 nm, với một cấu trúc thiết kế thích hợp, nó
có vai trò như một phương tiện vận chuyển chuyên biệt, đảm bảo chuyển giao
hoạt chất đến đích sinh học (biological target), theo một đư ờ ng dẫn thuốc phù
hợp vào cơ thể người. Dạng bào chế này thường được gọi là thuốc điều trị tại
đích (drug targeting) và các tiểu phân phân tán được gọi là tiểu phân vận
chuyển (vector). Nhìn chung, thuốc điều trị tại đích là một giá mang nano
(nanocarrier) cấu tạo đặc biệt giúp chuyển giao hoạt chất đến đích sinh học
[1].
!
16
Tiểu phân nano chitosan là một loại tiểu phân nano polymer, các tiểu
phân nano polymer được phát triển như một dạng bào chế cải tiế n nhằm thay

thế các liposome kém bền trong thử nghiệm in vivo cũng như trong thời gian
bảo quản [1].
Nano chitosan có kích thước siêu nhỏ (10-1000nm) nên dễ dàng đi qua
màng tế bào, có thể đưa vào cơ thể qua nhiều đường khác nhau như dùng
ngoài da, dùng qua đường miệng, qua mũi. Nano chitosan có diện tích và
điện tích về mặt cực lớn nên được ứ ng dụng nhiều trong sinh y học như mang
thuốc, vaccine, vector chuyển gen, chống khuẩn, thuốc điều trị ung thư. Khi
sử dụng nano chitosan làm chất dẫ n thuốc, thuốc điều trị đư ợc bảo vệ bởi
những hạt nano chitosan khỏi sự phân huỷ sinh học. Do kích thướ c rất nhỏ,
những hạt này có tác dụng thấm sâu vào cơ thể, đưa thuốc đến đúng mụ c tiêu,
nâng cao hiệu quả điều trị [36].
Hạt chitosan là một hệ thống phân phối thuốc có tiềm năng lớn. Trên thế
giới, hầu hết những công trình nghiên cứu gần đây đều nhằm mục đích chế
tạo ra những chất mang nano để dẫn truyền thuốc, protein, gen và phát triển
vector chitosan hướng đích thuố c trên những tế bào ung thư. Mộ t số công
trình tiêu biểu là điều chế hạt chitosan gắn với acid polyacrylic để điều khiển
và kéo dài thời gian phóng thích thuốc; điề u chế nano chitosan với
cholesterol để dẫn thuốc đến mắt; biế n tính với N-trimethyl mang protein làm
hệ thống dẫn truyền đường mũi; tạo phứ c với acid deoxycholic để dẫn truyền
gen [25].
1.2.5. Các phương pháp chế tạo hạt nano chitosan
Theo S.A. Agnihotri (2004), có 5 phương pháp chủ yếu tạo hạt nano
chitosan là: Phương pháp trùng hợp nhũ tương (emulsion cross-linking),
phương pháp giọt tụ/kết tủa (coacervation/precipitation), phương pháp hợp
nhất giọt nhũ tương (emulsion-droplet coalescence), phương pháp tạo gel ion