Góp phần nghiên cứu kháng sinh được sinh tổng hợp bởi streptomyces 21

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG
SINH ĐƯỢC TỔNG HỢP BỞI
STREPTOMYCES 21.123

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



HÀ NỘI – 2014


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG



GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG
SINH ĐƯỢC TỔNG HỢP BỞI
STREPTOMYCES 21.123

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn
: Ds
.Tạ Thu Lan


Nơi thực hiện
:
Bộ môn Vi sinh - Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nội




HÀ NỘI - 2014



LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến DS. Tạ Thu Lan - người
đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình
thực hiện bài khóa luận này.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên giảng dạy và công
tác tại Bộ môn Vi sinh – Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều
kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm tại đây.
Cũng nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn
thể thầy cô giáo trong trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt những kiến
thức cần thiết, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, những người thân

luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Do điều kiện và thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản
thân có hạn, khóa luận khó tránh khỏi những thiếu sót. Tôi mong nhận được
được những góp ý của thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 05/05/2014
Sinh viên
NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1. TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về kháng sinh 2

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 2

1.1.2 Phân loại kháng sinh 2

1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 3

1.1.4 Các ứng dụng của kháng sinh 3

1.1.5 Kháng sinh actinomycin D 4

1.2 Đại cương về xạ khuẩn 5

1.2.1 Lớp xạ khuẩn 5

1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 7

1.3 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 8

1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn sinh 11

1.4.1 Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên 11

1.4.2 Đột biến cải tạo giống xạ khuẩn sinh kháng sinh 11

1.4.3 Bảo quản giống xạ khuẩn 12

1.5 Chiết, tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 13

1.5.1 Chiết xuất 13

1.5.2 Trao đổi ion tách kháng sinh 13

1.5.3 Tinh chế 14

1.6 Phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại, phổ khối 14



1.6.1 Phổ tử ngoại 14

1.6.2 Phổ hồng ngoại 14

1.6.3 Phổ khổi 15

1.7 Các nghiên cứu liên quan 16

1.7.1 Sản xuất kháng sinh actinomycin D từ Streptomyces 21.123 16

1.7.2 Nghiên cứu phát triển actinomycin D từ Streptomyces parvulus 16

1.7.3 Phát triển các điều kiện tối ưu cho tổng hợp actinomycin D của
Sreptomyces parvulus 17

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 17

2.1.1 Vi sinh vật 17

2.1.2 Môi trường 18

2.1.3 Hóa chất và sinh phẩm 18

2.1.4 Thiết bị 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy và giữ giống trong ống nghiệm 20

2.3.2 Phương pháp cải tạo giống 21

2.3.3 Phương pháp lên men trên máy lắc. 22

2.3.4 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 23

2.3.5 Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ 24

2.3.6 Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay chân không 25

2.3.7 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký 25



2.3.8 Nghiên cứu cấu trúc phân tử kháng sinh bằng phổ hồng ngoại (IR),
phổ khối (MS), phổ tử ngoại (UV) và đo nhiệt độ nóng chảy. 27

Chương 3. KẾT QUẢ 27

3.1 Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh 27

3.1.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 21.123 27

3.1.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 28

3.1.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 29

3.2 Kết quả chọn lọc biến chủng tổng hợp kháng sinh tốt nhất trong môi
trường dịch thể 31

3.3 Chiết xuất và tinh chế kháng sinh từ dịch lọc 31

3.3.1 Chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ 31

3.3.2 Kết quả chạy sắc ký lớp mỏng 32

3.3.3 Kết quả chạy sắc ký cột 33

3.4 Kết quả nhiệt độ nóng chảy và biện giải sơ bộ phổ các thành phần
trong hỗn hợp kháng sinh thu được 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC




DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Đường kính trung bình
AND Acid 2’ – deoxyribonucleic
B. subtilis Bacillus subtilis
ĐB Đột biến
Dd Dung dịch
DM Dung môi
DMHC Dung môi hữu cơ
g Gram
Gr(-) Gram âm
Gr(+) Gram dương
HTKS Hoạt tính kháng sinh
IR Hồng ngoại- Infrared

KS Kháng sinh
MT Môi trường
MS Phổ khối- Mass spectrometry
P. mirabilis

Proteus mirabilis
s Độ lệch thực nghiệm có hiệu chỉnh
SKLM Sắc ký lớp mỏng
SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên
STH Sinh tổng hợp
S. Streptomyces
UV Tử ngoại- Ultraviolet
VSV


Vi sinh vật




DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Bảng 2.2: Các loại dung môi sử dụng
Bàng 3.1 Kết quả SLNN chủng Streptomyces 21.123
Bảng 3.2 Kết quả đột biến lần 1
Bảng 3.3 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh lần 2
Bảng 3.4 Kết quả lên men chọn biến chủng lên men chìm tốt nhất
Bảng 3.5 Kết quả chọn dung môi
Bảng 3.6 Kết quả SKLM trên B.subtilis
Bảng 3.7 Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1

Bảng 3.8 Kết quả SKLM các phân đoạn có hoạt tính KS lần 1
Bảng 3.9 Kết quả thử hoạt tính KS các phân đoạn chạy cột lần 2
Bảng 3.10 Kết quả SKLM các phân đoạn có hoạt tính KS lần 2
Bảng 3.11 Khảng sinh tinh khiết thu được
Bảng 3.12 Kết quả phổ UV

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1: Khuẩn lạc xạ khuẩn
Hình 2: Sơ đồ phân loại xạ khuẩn
Hình P1: Cơ chế tác dụng kháng sinh
Hình P2: Khuẩn lạc xạ khuẩn ĐB1
Hình P3: Thử hoạt tính KS bằng phương pháp khổi thạch (VSV kiếm định
B.subtilis)
Hình P4: Thử hoạt tính dịch chiết DMHC bằng phương pháp khoanh giấy lọc
(VSV kiếm định B.subtilis)
Hình P5: Thử hoạt tính dịch lên men KS bằng phương pháp giếng thạch
(VSV kiếm định B.subtilis)
Hình P6: Các phân đoạn sắc ký cột
Hình P7: Chạy sắc ký trên bản mỏng Silicagel
Hình P8: Chạy sắc ký cột lần 2
Hình P9: Kết quả đo phổ UV-VIS chất 1
Hình P10: Kết quả đo phổ UV-VIS chất 2
Hình P11: Kết quả đo phổ IR chất 1
Hình P12: Kết quả đo phổ IR chất 2
Hình P13: Kết quả đo phổ MS chất 1
Hình P14: Kết quả đo phổ MS chất 2
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự ra đời của các loại thuốc kháng khuẩn và kháng sinh là một trong

những thành tựu vĩ đại của y học, mở ra một kỷ nguyên mới trong việc phòng
và chữa các bệnh nhiễm trùng. Tuy nhiên, cùng với sự biến đổi của vi khuẩn
kháng lại tác dụng của thuốc và việc lạm dụng kháng sinh làm cho các kháng
sinh "kho vũ khí chống lại vi khuẩn" đang dần dần vô tác dụng do vi khuẩn đã
quá "quen" với thuốc.
Viện Y học Mỹ gọi tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn là thảm họa đối
với môi trường và sức khỏe cộng đồng. WHO coi sự gia tăng kháng thuốc là
viễn cảnh đen tối của nhân loại khi kháng sinh không còn tác dụng. Tổng
Giám đốc Tổ chức WHO, bà Margaret Chan đã đưa ra lời cảnh báo về khả
năng con người quay trở lại thời kỳ trước khi kháng sinh được phát triển nếu
không có một hành động toàn cầu giải quyết vấn đề kháng thuốc đang ngày
càng trầm trọng. Bà cho biết: "Kho vũ khí điều trị bệnh của con người đang
dần cạn kiệt. Tốc độ mất đi những loại thuốc thiết yếu đó nhanh hơn tốc độ
phát triển các loại thuốc thay thế rất nhiều. Trên thực tế, hệ thống nghiên cứu
và phát triển các loại thuốc kháng sinh mới gần như đã ngừng lại".
Nhằm góp phần nghiên cứu và phát hiện thêm những chất kháng sinh
mới, chúng tôi tiến hành lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu kháng sinh
được sinh tổng hợp bởi Streptomyces 21.123” làm khóa luận tốt nghiệp với
các mục tiêu sau:
 Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp
kháng sinh với chủng Streptomyces 21.123.
 Nghiên cứu điều kiện chiết, tách, tinh chế kháng sinh để thu kháng sinh
tinh khiết.
 Nghiên cứu một vài đặc tính của kháng sinh: nhiệt độ nóng chảy, phổ
tử ngoại, phổ hồng ngoại, phổ khổi.
2

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1 Đại cương về kháng sinh
1.1.1 Định nghĩa kháng sinh

Kháng sinh là những hóa chất nguồn gốc vi sinh vật (nấm hoặc vi khuẩn)
hay các nguồn khác có hoạt tính sinh học cao, có khả năng ức chế, thậm chí
tiêu diệt một số vi khuẩn hay vi sinh thể khác ở nồng độ thấp. Các chất này
được điều chế bằng cách chiết xuất, bán tổng hợp hay tổng hợp[2,9].
1.1.2 Phân loại kháng sinh
Có nhiều cách phân loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo tính nhạy cảm
của vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng…
Phân loại dựa trên nguồn gốc:
 Kháng sinh nguồn gốc sinh vật gồm có: Các β-lactam (penicillin,
cephalosporin, imipinem, monobactam), các aminosid, các phenicol,
các tetracyclin, các macrolid và chất tương tự, các rifamycin và
polypeptid.
 Kháng sinh bán tổng hợp như: ampicillin.
 Kháng sinh tổng hợp như: sulfamid, metronidazol, các quinolon, các
nitrofuran và nitroimidazol, dẫn chất của oxyquinolein,
chloramphenicol.
Phân loại dựa vào cấu trúc hóa học: [9,16]
 Các kháng sinh β-lactam (penicillin, cephalosporin…)
 Các kháng sinh chloramphenicol (chloramphenicol…)
 Các kháng sinh aminoglycoside (streptomycin, gentamycin…)
 Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin, minocyclin…)
 Các kháng sinh polypeptide (polymycin, bacitracin…)
3

 Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin )
 Các kháng sinh lincosamid (clindamycin, lincomycin…)
 Các kháng sinh ansamycin (rifammycin, rifampicin)
 Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B…)
 Các kháng sinh nhóm antracyclin (daunorubicin…)
 Các kháng sinh nhóm actinomycin (actinomycin D )

 Các kháng sinh nhóm quinolon (ciprofloxacin, ofloxacin…)
 Các kháng sinh sulfonamid (sulfamethazol…)
1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
khác nhau của tế bào VSV gây bệnh bằng cách gắn vào các vị trí chính xác
hay các phân tử đích của tế bào VSV, làm biến đổi các phản ứng đó[17].
Mỗi nhóm KS tác dụng lên các đích khác nhau ở vi khuẩn. Có 6 kiểu chủ
yếu [17]. (Hình P1- Phụ lục):
 Ức chế tổng hợp vách tế bào: penicillin, vancomycin…
 Tác dụng lên màng sinh chất: polymycin, amphotericin…
 Tác dụng lên sự tổng hợp ADN: rifampicin, antracyclin…
 Tác dụng lên sự tổng hợp protein: chloramphenicol, lincosamid…
 Tác dụng lên sự tổng hợp acid folic: sulfamethoxazol, trimethoprim…
1.1.4 Các ứng dụng của kháng sinh[11]
 Trong lĩnh vực y học: Hiện nay, kháng sinh đươc sử dụng rất rộng rãi
đóng vai trò quan trong lĩnh vực y học nhất là các bệnh nhiễm khuẩn vi
nấm của con người. Ngoài ra, kháng sinh hiện cũng đang được quan
tâm nghiên cứu nhằm sử dụng trong điều trị ung thư như actinomycin
D, daunorubicin…[5]
4

 Trong chăn nuôi: dùng kháng sinh trong thú y để chữa bệnh cho động
vật: griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò…. Kháng
sinh còn được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia
cầm, giảm chi phí thức ăn, tăng sản lượng trứng ở gà vịt: monenzin…
 Trong trồng trọt: kháng sinh được sử dụng để diệt nấm, vi khuẩn, virus
gây bệnh cho cây trồng:
 Validamycin: diệt nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa.
 Blastixidin S: chống bệnh vàng lụi gây ra bởi Piricularia oryzae.
 Griseofulvin: chống các bệnh do Botrytis gây ra (bệnh rỉ sắt ở lúa

mỳ).
 Herbicidin A và B: là kháng sinh diệt cỏ do S. saganonensis.
 Trichotexin: diệt nấm gây bệnh cho bông.
 Trong công nghiệp thực phẩm: bảo quản thực phẩm nhờ tác dụng tiêu
diệt VSV (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc): subitilin (do B.subtilis tạo ra)
bảo quản thực phẩm đóng hộp; nisin- được coi là hóa chất lý tưởng để
bảo quản thực phẩm đóng hộp, không được dùng trong y học.
1.1.5 Kháng sinh actinomycin D
Cấu trúc:

5

Phân tử khối: 1255,43 g/mol.
Cơ chế tác dụng: Actinomycin D ức chế tăng sinh tế bào bằng cách tạo
phức bền vững với ADN từ đó ngăn cản sự sao chép và phiên mã ADN.
Actinomycin gây gián đoạn mạnh chu kỳ phát triển tế bào ở giai đoạn phân
bào S và giai đoạn giáp phân, cũng như thuốc có tác dụng trên các giai đoạn
khác nhau của chu kỳ phát triển tế bào. Actinomycin D cũng có tác dụng ức
chế miễn dịch.[20]
Ứng dụng: Actinomycin D là một loại kháng sinh đặc biệt, có tác dụng
kháng ung thư theo cơ chế kìm hãm u ác tính phát triển. Dùng điều trị một số
bệnh ung thư như sarcom xương, u bào thai thân, ung thư tinh hoàn, u hắc tố.
Dùng đơn độc hoặc phối hợp với các thuốc khác trong phác đồ hóa trị
liệu.[17]
1.2 Đại cương về xạ khuẩn
1.2.1 Lớp xạ khuẩn[11,15]
Xạ khuẩn (Actinomyces) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố
rộng rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gram dương, có tỷ lệ G+C trên 55%.
Trong mỗi gam đất nói chung thường chứa hàng triệu xạ khuẩn. Đại đa số các
xạ khuẩn là các VSV hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi dạng phân nhánh. Do

có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ
khuẩn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu rất nhiều.
Trong số hơn 16.000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khoảng
55-60% là do xạ khuẩn tạo ra. Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều
loại enzyme (amylase, cellulose, protease…), cũng như các hợp chất khác.
Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Số lượng đơn vị sinh khuẩn lạc
(CFU- colony-forming unit) xạ khuẩn trong 1g đất thường đạt tới hàng triệu.
Trên môi trường đặc đa số xạ khuẩn có hai loại khuẩn ty: khuẩn ty cơ chất
6

(substrate mycelium) và khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium). Nhiều loại chỉ
có khuẩn ty cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có khuẩn
ty khí sinh.
Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn: khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt, không
trơn ướt mà thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp
gấp tỏa ra theo hình phóng xạ.
Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3– 1,0μm đến 2-
3μm, đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Màu sắc khuẩn ty xạ
khuẩn hết sức phong phú: da cam, đen, đỏ, nâu, trắng, vàng, xám… (Hình 1)

Hình 1: Khuẩn lạc xạ khuẩn
7

1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces[4,7,15]

Hình 2: Sơ đồ phân loại xạ khuẩn
Streptomyces là một chi thuộc bộ Actinomycetales, với hệ sợi sinh dưỡng
phân nhánh nhiều lần, ít khi đứt đoạn, đường kính 0,5 - 2,0 μm.
Khuẩn ty khí sinh ở giai đoạn trưởng thành tạo chuỗi từ ba đến nhiều bào
tử. Một số ít loài hình thành chuỗi bào tử ngắn trên khuẩn ty cơ chất. Bào tử

không có khả năng di động. Các khuẩn lạc ban đầu thường trơn nhẵn nhưng
sau đó khuẩn ty khí sinh sẽ phát triển rất mạnh mẽ, sinh nhiều loại sắc tố khác
nhau cũng như sắc tố có khả năng khuếch tán ra môi trường. Nhiều chủng sản
sinh ra một hoặc nhiều chất kháng sinh.
Hiếu khí, Gram dương, không nhuộm kháng acid-cồn, hóa dị dưỡng hữu
cơ, catalase dương tính. Thường có khả năng khử nitrat thành nitrit, phân hủy
adenin, esculin, casein, gelatin, hypoxanthin, tinh bột và L-tyrosin. Có khả
năng sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ làm nguồn carbon. Nhiệt độ sinh trưởng
tối thích là 25-35
o
C, pH tối thích là 6,5-8,0[5].
8

Thành tế bào chứa L-DAP, không chứa acid mycolic. Thành phần acid
béo gồm phần lớn acid bão hòa. Thành phần menaquinon chính là MK-9(H
6
),
MK-9(H
8
). Thành phần phospholipid chính là diphosphatidylglycerol,
phosphatidylethanolamin, phosphatidylinositol và phosphatidylinositol
mannosid. Có nhiều trong đất, phân compot. Rất ít loài gây bệnh cho người và
động vật, một số loài gây bệnh ở thực vật. Streptomyces là chi có khả năng
tạo thành nhiều loại kháng sinh thuộc nhiều nhóm: Aminosid,
chloramphenicol, tetracyclin, macrolid, lincosamid…[18].
Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4
loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh,
sắc tố melanoid.
1.3 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
Khái niệm lên men ái khí: là quá trình phân giải, chuyển hóa hydratcacbon

trong điều kiện ái khí. Hiểu theo nghĩa rộng, lên men ái khí bao gồm tất cả
những quá trình lên men chuyển hóa các nguồn carbon sinh tổng hợp các sản
phẩm sơ cấp và thứ cấp, trong đó có lên men sản xuất các kháng sinh, một số
vitamin là những sản phẩm có ứng dụng quan trọng trong Y Dược học[4].
Tất cả các quá trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh là các quá trình lên
men ái khí. Kháng sinh là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo thành gần vào
lúc kết thúc quá trình sinh trưởng của VSV, thường vào gần hoặc vào chính
pha cân bằng. Có 2 phương pháp:
Lên men bề mặt
VSV được nuôi cấy trên môi trường dịch thể (có thể là dung dịch đường
phối hợp với một số nguyên tố vi lượng) hoặc môi trường bán rắn (cám, bột
ngô ). Trong sản xuất protein đơn bào (SCP) từ tảo, phương pháp này đã
9

được sử dụng phổ biến. VSV hấp thu các chất dinh dưỡng của môi trường và
sử dụng oxy không khí để hô hấp bề mặt. Như vậy yêu cầu bề mặt môi trường
phải đủ rộng và lớp môi trường không được qúa sâu (5-10cm) đồng thời phải
giữ độ ẩm môi trường khoảng 60% (có trường hợp 90-100%) để tránh khô bề
mặt môi trường. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, dễ thực hiện và
đầu tư trang thiết bị thấp, nhưng nhược điểm là cần một mặt bằng lớn, hiệu
suất thấp, khó tự động, cơ giới hóa, chi phí cho một đơn vị sản phẩm cao
[8,9].
Do nhược điểm đó nên ngày nay, phương pháp này không được ứng dụng
trong công nghiệp sản xuất kháng sinh mà chỉ áp dụng trong nghiên cứu cải
tạo giống trong phòng thí nghiệm.
Lên men chìm:
VSV được nuôi cấy trong môi trường dịch thể, phát triển trong cả không
gian ba chiều. Giống dùng trong lên men phải là tế bào dinh dưỡng đang ở
giai đoạn phát triển mạnh và có khả năng đồng hóa vật chất cao. Vì vậy, trước
khi lên men phải tiến hành cải tạo giống. Tỷ lệ giống cấy vào môi trường lên

men từ 1 đến 10% tính theo thể tích dịch nuôi. Quá trình lên men làm thay đổi
các điều kiện ban đầu của môi trường: thay đổi pH, nồng độ các thành phần
trong môi trường, các sản phẩm trao đổi chất, tạo bọt trên bề mặt. Để đảm bảo
điều kiện tối ưu cho sự phát triển của VSV trong quá trình lên men người ta
đã đưa ra một số biện pháp: dung đệm để ổn định pH, thêm các chất phá bọt
(mỡ cá voi, dầu thực vật…). Trong lên men sinh tổng hợp kháng sinh, lên
men chìm là phương pháp được áp dụng nhiều, có thể lên men trên máy lắc
(lên men dịch thể) hoặc lên men trong bình lên men. Ưu điểm của lên men
chìm là môi trường dinh dưỡng sử dụng một cách triệt để, hiệu suất lên men
cao, tiết kiệm mặt bằng sản xuất, dễ cơ giới hóa và tự động hóa, chi phí cho
10

một đơn vị sản xuất thấp, có thể triển khai trên quy mô lớn, nhược điểm là đòi
hỏi phải có trang thiết bị chuyên dùng (thiết bị chịu áp lực, điều kiện vô trùng
tuyệt đối) do đó chi phí đầu tư lớn [3,4,11].
Lên men chìm chia thành 4 kiểu chính:
- Lên men mẻ (lên men gián đoạn, lên men chu kỳ…)
Lên men trong dịch thể, vi sinh vật sinh trưởng trong một hệ thống đóng,
do đó đối với vi khuẩn nói chung, đường cong sinh trưởng gồm 4 pha (pha
lag/tiềm phát; pha log/sinh trưởng; pha cân bằng; và pha suy tàn). Kháng sinh
là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp và thường được bắt đầu tổng hợp từ cuối
pha logarit kéo dài trong pha ổn định, hoặc có thể được sinh tổng hợp muộn
hơn. Trong suốt thời gian lên men không tác động hay bổ sung gì vào môi
trường lên men, trừ việc cung cấp oxy (dưới dạng khí nén), chất phá bọt (nếu
cần), chất điều chỉnh pH. Người ta tiến hành phân tích mẫu dịch lên men mới
lấy để đánh giá các tham số chính. Ngày nay, người ta thường đặt các điện
cực theo dõi.
Trong công nghiệp, quá trình lên men kết thúc phụ thuộc vào việc sinh
tổng hợp hoạt chất dừng lại ở pha nào trong chu kỳ sinh trưởng của VSV hoặc
khi việc sinh tổng hợp hoạt chất đã bị chậm lại, nếu tiếp tục lên men sẽ không

mang lại hiệu quả kinh tế.
- Lên men có bổ sung:
Lên men có bổ sung là biến tướng phát triển của lên men mẻ đóng kín.
Trong khi lên men, do nồng độ cao của một số chất (glucose, các hợp chất
nitơ…) ức chế việc tạo ra sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Bởi vậy khi bắt đầu
lên men, các thành phần đó được đưa vào với một nồng độ thấp, và được bổ
sung vào hệ thống trong suốt quá trình lên men.

11

- Lên men liên tục:
Quá trình lên men môi trường dinh dưỡng được bổ sung liên tục vào bình
lên men, đồng thời lúc đó lấy ra đồng thể tích dịch lên men. Quá trình này
xem như một hệ mở.
- Lên men bán liên tục:
Trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng và rút
bớt dịch lên men không xảy ra liên tục mà định kỳ sau những khoảng thời
gian xác định.
1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn sinh
1.4.1 Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên
Các VSV có đột biến tự nhiên theo tần số khác nhau. VSV thuần chủng
được phân lập từ các nguồn tự nhiên (bùn, đất, nước, mô thực vật ) thường
có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp. Do đó, để thu được các
chủng có HTKS cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo , chọn giống bằng
các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích
hợp. Có cá thể có thể có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn 20-30% so với những
cá thể khác. Chúng ta phải chọn cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống
để nghiên cứu tiếp[12,15].
Tuyển chọn những biến chủng ngẫu nhiên do tác động của những điều kiện
ngoại cảnh nhằm lấy những dạng chủng phát triển và sinh tổng hợp tốt nhất

trên cơ sở kế thừa thế hệ trước.
1.4.2 Đột biến cải tạo giống xạ khuẩn sinh kháng sinh
Có 3 nhóm tác nhân gây đột biến:[11,14,15]
 Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO
2
), dimethylsulphat,
hydroxylamin, nitrozo sualnidin…
12

 Tác nhân vật lý: ánh sáng UV, tia X, tia α hay tia β. Tác nhân vật lý hay
được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Khả năng đột biến còn phụ
thuộc vào khoảng cách đột biến, thời gian và cường độ bức xạ.
 Tác nhân sinh học gây đột biến gen như phage Mu, transposon
Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian xử lý thích hợp
sẽ giết chết hầu hết các VSV. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến
gen, làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất, làm giảm khả năng tạo
kháng sinh (đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh
lên mạnh mẽ (đột biến dương)[9].
Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến
hành đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ
hợp định hướng các gen, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế
bào trần.
1.4.3 Bảo quản giống xạ khuẩn
Bảo quản giữ giống VSV rất cần thiết với mục đích cụ thể là: giữ giống
VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không
bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ[12,14,15].
Thông thường có 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV:
 Bảo quản trong lọ hoặc ống MT trong tủ lạnh, định kỳ cấy chuyền sang
ống (hoặc lọ) MT mới.
 Làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng).

 Đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh,
làm khô mẫu đông lạnh).
 Đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh
nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp).
13

Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là
nuôi cấy xạ khuẩn trên MT thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng
trong tủ lạnh 2
o
C và định kỳ 3-6 tháng cấy lại một lần.
1.5 Chiết, tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
Vai trò của chiết tách và tinh chế: Đây là giai đoạn có vai trò rất quan
trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình lên men thường kém bền vững,
hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường thấp. Do đó, cần tách riêng
kháng sinh khỏi các tạp chất và tinh chế sản phẩm đạt được các tiêu chuẩn
cần thiết theo quy định dùng điều trị. Công đoạn tinh chế sẽ quyết định tới giá
thành của sản phẩm[1,10].
1.5.1 Chiết xuất
Là một phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy
một chất hay một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu.
Nguyên tắc chiết dựa trên sự phân bố chất tan giữa hai pha không đồng tan
với nhau[6].
Với kháng sinh ngoại bào tồn tại trong dung dịch lên men người ta ứng
dụng phép chiết lỏng-lỏng.
Với kháng sinh nội bào: tiến hành chiết rắn-lỏng. Nguyên tắc của phương
pháp này là dựa vào sự khuyếch tán của kháng sinh vào dung môi chiết.
1.5.2 Trao đổi ion tách kháng sinh
Cơ sở của sắc ký trao đổi ion là sự cạnh tranh các nhóm tích điện trái dấu
trên chất trao đổi giữa các ion của chất cần tách với các ion khác

.
Tương tác
giữa các phân tử nhỏ và chất trao đổi phụ thuộc vào điện tích thực và lực ion
của môi trường. Khi nồng độ ion cạnh tranh thấp, các ion cần tách sẽ liên kết
với chất trao đổi; khi nồng độ ion cạnh tranh cao, các ion cần tách sẽ rời ra.
14

Các chất trao đổi có chứa nhóm acid hoặc base. Chất trao đổi ion base có
chứa nhóm tích điện dương và được gọi là anionit (nhựa trao đổi cation, vì
chúng gắn và trao đổi cation). Ngược lại, chất trao đổi acid có chứa nhóm tích
điện âm là cationit (nhựa trao đổi anion, vì chúng gắn và trao đổi
anion)[1,13].
Ví dụ: Kháng sinh Aminoglycosid.
1.5.3 Tinh chế[10]
Mục đích: thu lấy kháng sinh tinh khiết cho các nghiên cứu tiếp theo.
Ở đây ứng dụng quá trình tách bằng sắc ký cột tinh chế.
Sắc ký cột: là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố
khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành
màng phim mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt
nhỏ) được nhồi vào cột, pha động là DM thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh.
1.6 Phổ khối, phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại.
1.6.1 Phổ tử ngoại
Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn nên có khả năng làm thay đổi
mức năng lượng của các điện tử từ trạng thái cơ bản lên trạn thái kích thích.
Giữa cấu trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ hấp thụ
có mối quan hệ chặt chẽ (ví dụ: những phân tử càng có nhiều liên kết đôi thì
sự hấp thụ càng chuyển về bước sóng dài hơn, đặc biệt là các hệ liên hợp).
Các phân tử có đặc điểm: nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N,S,O có khả
năng hấp thụ năng lượng ánh sáng UV-VIS[10,11].
1.6.2 Phổ hồng ngoại

Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kỹ thuật
phân tích rất hiệu quả. Phương pháp này cung cấp thông tin về cấu trúc phân
tử nhanh, không đòi hỏi các phương pháp tính toán phức tạp.
15

Kỹ thuật này dựa trên hiệu ứng đơn giản là: các hợp chấp hoá học có khả
năng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại. Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng
ngoại, các phân tử của các hơp chất hoá học dao động với nhều vận tốc dao
động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại.
Các pic phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại tương ứng với các nhóm
chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hoá học. Bởi vậy phổ
hồng ngoại của một hợp chất hoá học coi như "dấu vân tay", có thể căn cứ
vào đó để nhận dạng chúng [2,10].
1.6.3 Phổ khối
Phương pháp khối phổ là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo
chính xác khối lượng phân tử chất đó. Chất nghiên cứu trước tiên được
chuyển thành trạng thái hơi sau đó được đưa vào nghiên cứu trong bộ phận
phân tích của máy khối phổ kế. Tuỳ theo loại điện tích của ion đem nghiên
cứu mà người ta phân biệt máy khối phổ ion dương hoặc ion âm. Loại máy
khối phổ làm việc với ion dương cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu
nên được dùng phổ biến hơn.[8]
Người ta có thể dùng phương pháp khối phổ để nghiên cứu tất cả các
nguyên tố hay hợp chất có thể biến thành dạng khí hay hơi.
Đối với hợp chất vô cơ, phương pháp phân tích khối phổ thường được
dùng để nghiên cứu thành phần đồng vị hoặc để xác định vết các chất nghiên
cứu.
Đối với hợp chất hữu cơ, phương pháp phân tích khối phổ thường được
dùng trong quá trình đồng nhất chất hoặc phân tích cấu trúc.
16

1.7 Các nghiên cứu liên quan
1.7.1 Sản xuất kháng sinh actinomycin D từ Streptomyces 21.123
Chủng giống Streptomyces 21.123 được phân lập từ đất tại phòng thí
nghiệm bộ môn Vi sinh và sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội đã được tác
giả Hoàng Thị Thùy Hương (2009) nghiên cứu và báo cáo trong hội nghị
khoa học trường cũng như trong luận văn thạc sỹ[8].
Kết quả nghiên cứu cho thấy, chủng giống Streptomyces 21.123 nuôi cấy trên
môi trường phân lập thích hợp có khả năng sinh kháng sinh, có thành phần
chính được biện luận cấu trúc là actinomycin D.
1.7.2 Nghiên cứu phát triển actinomycin D từ Streptomyces parvulus
Nghiên cứu gần đây cho thấy khởi đầu sự tổng hợp của actinomycin D
trong Streptomyces parvulus là do giải phóng từ sự ức chế dị hóa L-
glutamat. Trong những khám phá mới đây các tác giả nhận thấy S.parvulus
có khả năng duy trì mức độ cao của glutamat trong tế bào trong quá trình tổng
hợp actinomycin D. Các kết quả có vẻ mâu thuẫn, vì actinomycin D tổng hợp
không thể bắt đầu trước khi khởi phát từ ức chế dị hóa L-glutamat, nhưng
lượng lớn glutamat trong nội bào tế bào tương đối là cần thiết cho sự tổng
hợp của actinomycin D. Bằng cách sử dụng tiền chất khác nhau đã được đánh
dấu, D-[U-13C] fructose và 13C-15N L-glutamat và kỹ thuật cộng hưởng từ
hạt nhân, chúng tôi cho thấy rằng các nguyên tử carbon của glutamat trong tế
bào S. parvulus không có nguồn gốc từ nguồn glutamat mà là từ D-fructose dị
hóa. Trong tế bào dẫn xuất pyrimidin mới có nitơ và carbon được lấy từ
ngoại sinh L-glutamat thu thập như chất chuyển hóa chính. Một dẫn xuất
pyrimidin mới đã có tác động làm giảm đáng kể trong tế bào, bắt nguồn từ D-
fructose dị hóa được xác định trong các chất chiết xuất tế bào của S. parvulus
trong actinomycin D tổng hợp. Các dẫn xuất pyrimidin có thể phục vụ như là
một cửa hàng nitơ cho actinomycin D tổng hợp. Trong nghiên cứu này, nhóm