Nghiên cứu phân lập một số hợp chất và độc tính của loài dây thìa canh lá to ( gymnema latifolium wall ex wight) thu hái ở hòa bình

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGUYỄN THỊ KIM CHI


NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ
HỢP CHẤT VÀ ĐỘC TÍNH CỦA LOÀI
DÂY THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA
LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT) THU
HÁI Ở HOÀ BÌNH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ KIM CHI

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ
HỢP CHẤT VÀ ĐỘC TÍNH CỦA LOÀI
DÂY THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA
LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT) THU
HÁI Ở HOÀ BÌNH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Phạm Hà Thanh Tùng
DS. Đoàn Thị Ái Nghĩa

Nơi thực hiện:
Bộ môn Thực Vật – Trường Đại học Dược Hà Nội
Bộ môn Dược lý – Trường Đại học Dược Hà Nội


HÀ NỘI – 2014


LỜI CẢM ƠN
Em xin được bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn sâu sắc nhất tới:
ThS Phạm Hà Thanh Tùng - Bộ môn Thực vật, Trường Đại học
Dược Hà Nội và DS Đoàn Thị Ái Nghĩa - Bộ môn Dược liệu - Dược cổ
truyền, Trường Đại học Y Dược Huế. Thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn, tận
tình dạy bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học
và hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đỗ Nguyệt Quế và ThS
Nguyễn Thu Hằng - Bộ môn dược lý, Trường Đại học Dược Hà Nội đã
hướng dẫn và giúp đỡ để em trong quá trình thực hiện khoá luận.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, các chị kĩ thuật viên
Bộ môn Thực vật đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn
thành tốt quá trình làm thực nghiệm tại bộ môn.
Lời sau cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, các anh
chị và bạn bè đã luôn ở bên cạnh ủng hộ, động viên em trong suốt quá học
tập, nghiên cứu và hoàn thành đề tài này.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2014
Sinh viên
Nguyễn Thị Kim Chi
MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT 2
1.1.1. Về thực vật 2
1.1.2. Về đa dạng di truyền 4
1.1.3. Về thành phần hoá học 5
1.1.4. Về tác dụng sinh học 6
1.1.5. Về độc tính 7
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8
1.2.1. Về phân lập một số hợp chất 8
1.2.2. Về nghiên cứu độc tính bán trường diễn 9
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…….12
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT, DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 12
2.1.1. Nguyên vật liệu 12
2.1.2. Động vật thí nghiệm 12
2.1.3. Dung môi, hoá chất 12
2.1.4. Máy móc - thiết bị 13
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 13
2.2.1. Nghiên cứu phân lập một số chất tinh khiết 13
2.2.2. Xác định độc tính bán trường diễn 13
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu phân lập một số hợp chất 13
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu về độc tính bán trường diễn 15
2
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 18
3.4. PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT 18

3.4.1. Quá trình chiết xuất 18
3.4.2. Quá trình phân lập 19
3.4.3. Xác định cấu trúc các chất phân lập được 20
3.5. ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN 24
3.5.1. Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến sự tăng trưởng thể
trọng của chuột cống trắng 24
3.5.2. Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến các chỉ số huyết
học của chuột cống trắng 25
3.5.3. Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến các chỉ số sinh hoá
của chuột cống trắng 26
3.5.4. Kết quả về mô bệnh học 27
3.6. BÀN LUẬN 29
3.3.1. Về phương pháp nghiên cứu 29
3.3.2. Về phân lập các chất 30
3.3.3. Về độc tính bán trường diễn 32
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT


Độ dịch chuyển hoá học
13
C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Carbon-13 Nuclear
Magnetic Resonance Spectroscopy)
1
H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Magnetic
Resonance Spectroscopy)
ALAT Alanine aminotransferase

AST Aspartat aminotrasferase
CDCl3 Cloroform
d Double – đỉnh đôi
DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
ĐTĐ Đái tháo đường
EA Ethyl acetat
ITS Internal Transcribed Spacer
s Singlet – đỉnh đơn
SKC Sắc kí cột
SKLM Sắc ký lớp mỏng
TMS Tetramethyl silan
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất GLHE9 và chất
tham khảo
21

Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất GLHE7 và chất
tham khảo
23

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến
khối lượng cơ thể của chuột cống trắng
25

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến
các chỉ số huyết học của chuột cống trắng
25

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến
các chỉ số sinh hóa của chuột cống trắng

26

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thì canh lá to đến
khối lượng tim, gan, thận, lách/100g chuột cống
trắng
27


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái Gymnema latifolium Wall.
ex Wight
3

Hình 1.2

Đoạn nucleotide đặc trưng phân biệt hai loài
Gymnema latifolium và Gymnema sylvestre
5

Hình 1.3 Định tính gymnemagenin trong phân đoạn
ethylacetat trong mẫu Gymnema latifolium
Wall. ex Wight
6

Hình 2.1 Quy trình thử độc tính bán trường diễn của
dịch chiết Dây thìa canh lá to (Gymnema
latifolium Wall. ex Wight)
16

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ Dây thìa
canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex
Wight)
18

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập phân đoạn E1 từ Dây thìa canh
lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight)
19

Hình 3.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất GLHE9 22

Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất GLHE7 24

Hình 3.5 Hình ảnh vi thể gan, thận lô thử và lô chứng
của chuột thí nghiệm
28

Hình 3.6 Các định hướng nghiên cứu tác dụng của
lupeol
31



1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.) đã được nền
y học cổ truyền Ấn Độ Ayurveda sử dụng từ hơn 2.000 năm để điều trị đái
tháo đường [29], [32]. Dựa trên kinh nghiệm này, nhiều nghiên cứu liên quan
đến Dây thìa canh đã được thực hiện và một số sản phẩm từ dược liệu này đã
được phát triển sử dụng trong hỗ trợ điều trị đái tháo đường.

Dựa trên nguyên lý các loài thực vật ở cùng cấp phân loại bậc chi có khả
năng có các hoạt chất và hoạt tính sinh học tương đồng, Dây thìa canh lá to
(Gymnema latifolium Wall. ex Wight) thu hái ở huyện Cao Phong, tỉnh Hoà
Bình đã được các nhà khoa học nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết trong
quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu sàng lọc các dược liệu có tác dụng điều
trị đái tháo đường ở Việt Nam năm 2010 [7]. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy
Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) có tác dụng hạ
đường huyết cao hơn Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex
Schult.) [7]. Do đó, nghiên cứu đã lựa chọn Dây thìa canh lá to là một trong
ba cây thuốc có triển vọng ứng dụng điều trị đái tháo đường ở Việt Nam.
Tuy nhiên, cho đến nay ở Việt Nam cũng như trên thế giới chưa có một
công bố nào về thành phần các chất hoá học và độc tính bán trường diễn của
Dây thìa canh lá to. Do vậy, nhằm góp phần đi sâu nghiên cứu về dược liệu
tiềm năng này, đề tài “Nghiên cứu phân lập một số hợp chất và độc tính của
loài Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium) thu hái ở Hoà Bình” được thực
hiện với mục tiêu:
 Phân lập một số hợp chất trong thành phần hoá học của Dây thìa
canh lá to (Gymnema latifolium) thu hái ở Hoà Bình.
 Xác định độc tính bán trường diễn của dịch chiết lá Dây thìa canh lá
to (Gymnema latifolium) thu hái ở Hoà Bình.
2
TỔNG QUAN
1.1. LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT
1.1.1. Về thực vật
1.1.1.1. Vị trí phân loại
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009 [27], Dây thìa
canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) có vị trí phân loại như sau:
+ Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
+ Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
+ Phân Lớp Hoa Môi (Lamiidae)

+ Bộ Long Đởm (Gentianales)
+ Họ Trúc Đào (Apocynaceae)
+ Phân Họ Thiên lý (Asclepiadoideae)
+ Chi Gymnema R.Br.
+ Loài Gymnema latifolium Wall. ex Wight
Ở Ấn Độ, Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) còn
được biết đến với các tên đồng nghĩa khác là Gymnema khandalense và
Gymnema kollimalayanum [20].
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của loài
Thân leo tới 6 m. Thân có lỗ vỏ, các nhánh có nhiều lông tơ. Cuống lá
1,5-4 cm, có lông tơ dày đặc; phiến lá 8-13×5-8 cm, lông dày đặc, càng xa
trục càng dày đặc, gốc tròn, ngọn nhọn, gân bên 6-7 cặp. Cụm hoa xim dạng
đầu thành từng đôi ở mấu, có lông dày đặc. Một cụm mang rất nhiều hoa, mùi
thơm. Cuống cụm hoa 1-1,5 cm, cuống hoa 3-8 mm. Đài hình trứng, phủ lông
măng. Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài. Ống hoa có 5 cặp
gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, khoảng 1,2 ×1,2 mm, phủ
lông dày đặc hướng trục, ngắn hơn so với ống tràng [12].
3

(b) Dạng sống; (c) Cụm hoa; (d) Mặt trên lá; (e) Mặt dưới lá; (f) Cụm
hoa xim; (g) Lá bắc của cụm hoa; (h) Một hoa nguyên vẹn; (i) Đài; (j) Tràng;
(k) Trụ nhị nhụy; (l) Thể truyền phấn; (m) Bộ nhụy; (n) Quả
Hình 1.1. Đặc điểm hình thái Gymnema latifolium Wall. ex Wight [12]
4
Trụ nhị nhụy dạng hình trụ, phần phụ nhị dạng màng ngắn hơn so với
đầu núm nhụy. Khối phấn hình thuôn. Đầu núm nhụy hình nón, đỉnh phân đôi.
Quả đại hình mác nhọn, mũi cong, 4,5-5,5×1,5-2 cm, có lông dày đặc.
Hạt hình trứng thuôn, dài khoảng 1,1 cm×5 mm, mép dạng màng; mào lông
dài 3 cm [12].
Phân bố: Đảo Andaman và Nicobar, Bangladesh, Trung Quốc (Quảng

Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Ấn Độ (Arunachal Pradesh, Assam, Kerala,
Maharashtra, Tamil Nadu), Myanmar, Thailand [20], Việt Nam (Cúc Phương,
Hoà Bình, Thái Nguyên) [12].
1.1.2. Về đa dạng di truyền
Năm 2012, Phạm Hà Thanh Tùng [12] đã công bố nghiên cứu xác định
sự khác biệt di truyền sử dụng chỉ thị phân tử RAPD của 26 mẫu thuộc 5 loài
trong chi Gymnema R.Br., trong đó có 4 mẫu Gymnema latifolium Wall. ex
Wight. Kết quả cho thấy, 3 mẫu ở miền Bắc Việt Nam (Hoà Bình, Thái
Nguyên và Tuyên Quang) cùng nằm trong cùng một nhóm di truyền, trong
khi đó 1 mẫu ở gần khu vực miền Trung Việt Nam không cùng nhóm này.
Kết quả cho thấy sự khác biệt của các mẫu theo sự phân bố địa lý.
Năm 2013, Vũ Thị Thanh Thuý [10] đã giải trình tự thành công đoạn
gen ITS của 8 mẫu trong chi Gymnema R.Br Kết quả đã xác định sự tương
đồng di truyền của 2 mẫu Gymnema latifolium Wall. ex Wight. là 0.99 và đã
phát hiện đoạn trình tự CGGCCCAAA ở vị trí nucleotid 56 trên vùng khảo
sát ITS1+5.8S+ITS2 hoàn toàn khác biệt và là đặc trưng cho loài Gymnema
latifolium Wall. ex Wight so với trình tự gen đã công bố trên ngân hàng gen
thế giới Genbank (Hình 1.2). Kết quả chứng minh khả năng nghiên cứu sự đa
dạng di truyền của các mẫu sử dụng đoạn trình tự gen ITS và là cơ sở của việc
công bố trình tự gen của các mẫu nghiên cứu trên ngân hàng gen thế giới.

5

Hình 1.2. Đoạn nuleotide đặc trưng phân biệt hai loài Gymnema latifolium
và Gymnema sylvestre [10]
1.1.3. Về thành phần hoá học
Thử nghiệm ban đầu đã xác định các nhóm chất có trong Dây thìa canh
lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) thu hái tại Hòa Bình có thành
phần chính gồm: saponin, flavonoid, tanin, sterol, chất béo acid amin, đường
khử và coumarin [3], [11].

Sản phẩm thuỷ phân phân đoạn ethyl acetat của Dây thìa canh lá to
(Gymnema latifolium Wall. ex Wight) có pic sắc ký tương ứng với
gymnemagenin trên sắc ký đồ (Hình 1.3) [12].
Cho đến nay, chưa xác định được tài liệu nào trên thế giới và ở Việt Nam
công bố về các hợp chất được phân lập từ Dây thìa canh lá to (Gymnema
latifolium Wall. ex Wight).


6


Hình 1.3: Định tính gymnemagenin trong các phân đoạn ethyl acetat trong
mẫu Gymnema latifolium Wall. ex Wight [12]
1.1.4. Về tác dụng sinh học
Theo Trần Văn Ơn, Phùng Thanh Hương và cộng sự [7], dịch chiết lá
Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) ở Việt Nam có tác
dụng hạ đường huyết trên cả chuột bình thường (24,07 %) tác dụng cao nhất
thể hiện sau 4 giờ, kéo dài đến 5 giờ và trên chuột gây tăng đường huyết bởi
Streptozotocin (36,31%) sau 10 ngày cho uống dịch chiết. Liều dùng thích
hợp lá dây thìa canh là cắn toàn phần được pha thành hỗn dịch trong nước cất
với tỉ lệ 1:1, với liều 0,5ml/25g, tương ứng với 10g lá khô/kg thể trọng.
Kết quả thử nghiệm cho thấy tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết lá
Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) mạnh hơn Dây thìa
canh (Gymnema sylvestre (Retz) R.Br. ex Schult.). Kết quả này đã được
chuyển giao cho Công ty Dược Khoa (DK-Pharma) của Trường Đại học
Dược Hà Nội, là nơi duy nhất ở Việt Nam trồng trọt Dây thìa canh lá to theo
quy trình hướng dẫn “Thực hành tốt Trồng trọt cây thuốc” (GAP- WHO).
Công ty đã cho ra đời sản phẩm Trà tiểu đường DK-Betics, phần cốt lõi là
cây thuốc Dây thìa canh và Dây thìa canh lá to.

7
Ngoài các công bố trên, hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam
chưa có một công bố chính thức nào về tác dụng sinh học của Dây thìa canh
lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight).
1.1.5. Về độc tính
Độc tính cấp của Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz) R.Br. ex
Schult.) đã được xác định là LD
50
= 250,00 (209,21-298,75) g/kg [7].
Tham khảo một nghiên cứu [24] về độc tính bán trường diễn của dịch
chiết Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz) R.Br. ex Schult.) trong 52
tuần với liều tỷ lệ từ 0,01; 0,1; 1% cao chiết với tổng lượng thức ăn định mức
hàng ngày trên cả chuột đực và chuột cái Wista, so với lô chứng âm. Trọng
lượng cơ thể, lượng thức ăn tiêu thụ được theo dõi hàng tuần cho tới 12 tuần.
Sau đó chu kì được theo dõi dài hơn, nghiên cứu giữa kì vào tuần thứ 26 và
lần cuối cùng vào tuần 52. Động vật thí nghiệm được xét nghiệm về huyết
học, sinh hoá và bệnh học.
Kết quả cho thấy, không có chuột chết trong khoảng thời gian 52 tuần,
không có hiện tượng thay đổi về cân nặng, khả năng ăn uống, huyết học, sinh
hóa và bệnh học. Kết luận: không có độc tính trên chuột dùng dịch chiết lá GS
đến mức liều 1% trong 52 tuần.
Độc tính cấp của Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex
Wight) đã được nghiên cứu và xác định không phát hiện thấy LD
50
[7]. Ở Việt
Nam, chưa có bất cứ nghiên cứu nào về độc tính bán trường diễn của các loài
trong chi Gymnema R.Br.

8
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.2.1. Về phân lập một số hợp chất
1.2.1.1. Chiết xuất
* Phương pháp ngâm lạnh
Sau khi chuẩn bị dược liệu, dung môi được đổ cho ngập dược liệu trong
bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định (quy định riêng cho từng
loại dược liệu), tại nhiệt dộ phòng, rút lấy dịch chiết (lọc hoặc gạn) và rửa
dược liệu bằng một lượng dung môi thích hợp. Để tăng cường hiệu quả chiết
xuất, có thể tiến hành khuấy trộn bằng cánh khuấy hoặc rút dịch chiết ở dưới
rồi lại đổ lên trên (tuần hoàn cưỡng bức dung môi) [5].
* Phương pháp ngấm kiệt đơn giản
Sau khi chuẩn bị dược liệu và dung môi trong bình ngấm kiệt. Sau một
khoảng thời gian xác định (tuỳ từng loại dược liệu), rút nhỏ giọt dịch chiết ở
phía dưới, đồng thời bổ sung thêm dung môi ở phía trên bằng cách cho dung
môi chảy rất chậm và liên tục qua lớp dược liệu nằm yên (không được khuấy
trộn). Lớp dung môi trong bình chiết thường được để ngập bề mặt dược liệu
khoảng 3-4 cm [5].
1.2.1.2. Phân lập và xác định cấu trúc hoá học
Quá trình phân lập sử dụng phương pháp sắc ký cột với các cơ chế cột
hấp phụ và cột lọc qua gel. Sắc ký lớp mỏng được sử dụng để lựa chọn dung
môi, theo dõi quá trình rửa giải.
* Sắc ký cột hấp phụ:
Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các cấu tử trong
hỗn hợp với hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất lỏng chảy qua,
pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn được nhồi trong cột thủy tinh. Nhờ vậy
mà có thể triển khai dung môi liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau có độ
phân cực thay đổi từ yếu đến mạnh [2], [17].
9

* Sắc ký lọc qua gel
Sắc ký lọc qua gel là phương pháp phân tách các phân tử trong dung
dịch dựa trên kích thước của chúng thông qua sự trao đổi lặp đi lặp lại các
phân tử chất tan giữa dung môi pha động và cùng dung môi đó được pha tĩnh
giữ trong các lỗ xốp của gel. Khoảng kích thước lỗ của gel xác định khoảng
kích thước phân tử được phân tách qua quá trình sắc ký [2], [6], [17].
* Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích trong đó dung dịch chất
phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ,
theo một chiều nhất định. Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển
dịch với tốc độ khác nhau tuỳ theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại
ở những vị trí khác nhau [2], [6], [17].
* Xác định cấu trúc hoá học
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các dữ liệu phổ:
phổ hồng ngoại (UV), phổ tử ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng
hưởng từ hạt nhân (NMR) một chiều (
1
H-NMR và
13
C-NMR, DEPT) và hai
chiều (NOESY, COSY, HMQC, HSQC, HMBC). Khoảng nửa thế kỉ trước,
phổ
1
H-NMR và
13
C-NMR được sử dụng chủ yếu để có thể xác định các hợp
chất hoá học từ dược liệu. Tuy nhiên, sự phát triển của phổ cộng hưởng từ hai
chiều đã cung cấp nhiều thông tin phổ hơn, chỉ ra sự tương tác lẫn nhau giữa
các proton và carbon trong cấu trúc giúp xác định cấu trúc các chất chính xác
và đầy đủ hơn [17].

1.2.2. Về nghiên cứu độc tính bán trường diễn
Nghiên cứu về độc tính của thuốc đóng vai trò vô cùng quan trọng để
đảm bảo tính an toàn của thuốc, thuốc dù tác dụng mạnh đến mấy mà không
an toàn thì cũng sẽ không được sử dụng [1].
10
Độc tính bán trường diễn là một trong các nội dung về nghiên cứu độc
tính gồm có: độc tính cấp; độc tính trường diễn (độc tính bán cấp, độc tính
độc tính bán trường diễn, độc tính trường diễn); độc tính tại chỗ và độc tính
chuyên biệt (độc tính sinh biến chủng, độc tính ung thư, độc tính trên sinh sản
và phát triển) [1].
Một số qui định về thử nghiệm độc tính bán trường diễn [1], [9]:
- Thời gian: phụ thuộc vào thời gian dùng thuốc cho người, thường gấp
4 lần thời gian dùng thuốc cho người.
- Động vật thí nghiệm: thỏ, chuột cống trắng; giống đực hay cái tùy thí
nghiệm; số lượng mỗi lô, thường với thỏ là 6 và với chuột là 10.
- Đường dùng thuốc: đường dùng dự kiến dùng cho người, ngoài ra có
thể thêm một đường dùng khác.
- Liều dùng: thường tính từ liều thể hiện tác dụng trên động vật thí
nghiệm hoặc có thể lấy liều dùng của người làm cơ sở, rồi dùng phép
ngoại suy tính ra liều của động vật thí nghiệm.
- Các thời điểm theo dõi: trước khi bắt đầu thí nghiệm; trong khi dùng
thuốc, ngay sau khi dùng thuốc; sau khi ngừng thuốc một thời gian để
theo dõi sự hồi phục; xét nghiệm đại thể và vi thể các cơ quan thì tiến
hành lúc: ngay khi con vật chết, con vật còn hấp hối nhưng triển vọng
sẽ chết, sau khi kết thúc thí nghiệm.
- Các thông số quan sát sẽ tuỳ thuộc đề tài. Một số các chỉ tiêu :
o Biểu hiện chung: hành vi, lông, cân nặng, mức ăn uống…
o Các thông số huyết học: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, tỷ lệ
huyết sắc tố, thời gian máu đông, máu chảy…
o Các thông số thuộc chức năng gan: ALT và AST, bilirubin,

cholesterol…
11
o Các thông số thuộc chức năng thận: creatinin huyết, ure
huyết…
o Xét nghiệm đại thể và vi thể: gan, thận, lách, tim…
















12
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ HOÁ CHẤT, DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên vật liệu
Đối tượng nghiên cứu là lá của cây Dây thìa canh lá to (Gymnema
latifolium Wall. ex Wight) thu hái ở Hòa Bình.
Cây đã được giám định tên khoa học và lưu giữ mẫu tại bộ môn Thực vật
– Trường Đại học Dược Hà Nội (Mã hiệu tiêu bản HNIP/18068/14).
2.1.2. Động vật thí nghiệm

Chuột cống trắng chủng Wistar, cả 2 giống, khỏe mạnh, cân nặng từ
200-220g, do Học viện Quân y cung cấp. Động vật được nuôi ổn định trong
điều kiện phòng thí nghiệm 3 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu.
Thức ăn: Thức ăn viên tổng hợp do Viện vệ sinh dịch tễ trung ương cung
cấp chứa tỷ lệ thích hợp protein, carbonhydrat, mỡ, chất khoáng, vitamin, chất
xơ.
Nước uống: Nước máy sinh hoạt.
2.1.3. Dung môi, hoá chất.
Dung môi: methanol, ethanol 70, n-butanol, n-hexan, ethyl acetat,
chloroform, aceton, nước cất Thuốc thử: dung dịch H
2
SO
4
10%/Ethanol
tuyệt đối
Chất nhồi cột sắc kí: silicagel pha thường (silicagel 60; 0,040 – 0,063
mm (230 – 400 mesh ASTM); Merck), pha đảo (YMC, 30 - 50m, Fuji
Silysia Chemical Ltd.), Sephadex LH 20.
Bản sắc kí lớp mỏng pha thường (TLC - silicagel 60 F
254
, 250 µm,
Merck), pha đảo RP
18
(Merck, RP C - 18 F
254
)
Các hoá chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của
Dược Điển Việt Nam IV.

13

2.1.4. Máy móc - thiết bị
Cân phân tích hiện số SARTORIUS TE3102S, độ chính xác 0,0001 g.
bếp điện, tủ sấy SHEELLAB, máy cô quay Buchi, bình chiết, máy lọc hút
chân không, máy xay dược liệu
Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance AM500 FT-NMR
tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với chất
chuẩn nội là tetramethyl silan (TMS).
Các dụng cụ thủy tinh: cột sắc ký, cốc có mỏ nhiều thể tích, ống nghiệm,
đũa thủy tinh, ống sinh hàn, bình gạn, bình chạy sắc ký
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nghiên cứu phân lập một số chất tinh khiết
- Tiến hành chiết xuất và tách phân đoạn các chất theo độ phân cực.
- Phân lập các chất dựa trên phương pháp sắc kí cột với các cơ chế cột
hấp phụ, cột lọc qua gel. SKLM được theo dõi trong quá trình rửa giải.
2.2.2. Xác định độc tính bán trường diễn
- Tiến hành chiết xuất lấy dịch chiết toàn phần của cây Dây thìa canh lá
to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight), cô lấy cắn, phân tán trong
nước tạo hỗn dịch 1:2.
- Thử độc tính bán trường diễn với liều nhắc lại trong 28 ngày trên chuột
cống trắng.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu phân lập một số hợp chất
2.3.1.1. Phương pháp chiết xuất
* Tạo dịch chiết toàn phần
Lá của cây Dây thìa canh lá to được rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy ở
nhiệt độ 50ºC - 60ºC, sau đó xay thành bột thô. Bột dược liệu được chiết bằng
methanol tuyệt đối, phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng, thời gian 7 ngày/đợt
14
x 3 đợt, thu được dịch chiết toàn phần. Cất thu hồi dung môi methanol ở 50ºC
thu được cắn toàn phần.

* Chiết xuất các phân đoạn
Nguyên lý: Chiết xuất các chất được phân tán trong các dung môi khác
nhau dựa trên độ phân cực và độ tan khác nhau của các chất trong các dung
môi đó [17].
Tiến hành: Phân tán cắn toàn phần trong nước, rồi tiến hành chiết phân
đoạn lần lượt với các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần: n-hexan,
ethyl acetat, n-butanol. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm lần lượt thu
được các cắn n- hexan, ethyl acetat, n-butanol. Dịch nước còn lại đem cô cách
thuỷ thu được cắn nước.
* Chiết pha rắn
Nguyên lý: Chiết pha rắn được tiến hành trên cột sắc ký thủy tinh có
kích cỡ khác nhau tùy thuộc vào lượng mẫu đem chiết (thường áp dụng với
lượng cao chiết lớn trên 10g). Pha tĩnh hay sử dụng là silicagel pha thường
(silicagel 60, 0,040 - 0,063 mm (230-400 mesh ASTM), Merck). Dịch chiết
cao dược liệu được tẩm với lượng vừa đủ silicagel rồi thực hiện cất loại dung
môi thu được bột khô tơi. Lượng bột khô này được đưa lên cột sắc ký, sau đó
rửa giải bằng các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần.
Tiến hành
- Cắn phân đoạn được hòa tan vào lượng methanol tối thiểu, sau đó tẩm
với silicagel pha thường, tỷ lệ khối lượng 1:1. Khối silicagel ẩm này
được quay cất thu hồi dung môi đến thể chất tơi mịn. Bột khô thu được
dùng để chiết pha rắn trong bước tiếp theo.
- Chuẩn bị cột: cột sắc ký được rửa sạch, tráng bằng methanol, để khô tự
nhiên. Lót bông ở đáy cột và cố định chắc chắn trên giá. Cho silicagel
pha thường lên cột sao cho bề dày lớp silicagel khoảng 30 cm, hoạt hoá
15
cột, sau đó đưa lượng chất đã tẩm silicagel nói trên lên cột, gõ nhẹ để
bột phân bố đều.
- Triển khai cột với hệ dung môi rửa giải lần lượt là n-hexan 100%, n-
hexan: ethylacetat với các tỷ lệ 40:1, 20:1, 10:1 và ethylacetat 100%

(1,5 lít cho mỗi hệ). Hứng các phân đoạn, cô quay cất thu hồi dung môi
thu được các cắn dạng cao đặc.
2.3.1.2. Phương pháp phân lập
Sắc kí cột hấp phụ: Sắc ký cột được tiến hành trên cột silicagel pha
thường (0,040 - 0,063 mm, Merck), silicagel pha đảo YMC (30 - 50

m,
FuJisilisa Chemical Ltd.).
Sắc kí lọc qua gel: sử dụng chất sắc kí là Sephadex LH-20.
Sắc kí lớp mỏng: dùng để lựa chọn dung môi, định hướng các hợp chất
cần phân lập và theo dõi quá trình phân lập, được thực hiện trên bản mỏng
tráng sẵn DC - Alufolien 60G F254 (Merck), RP18 (Merck). Sắc ký đồ được
quan sát dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 366nm và
dùng thuốc thử là dung dịch H
2
SO
4
10%/ethanol.
2.3.1.3. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
Chất tinh khiết thu được đem đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR một
chiều (
1
H-NMR,
13
C-NMR, DEPT) trên máy Bruker Avance AM500 FT-
NMR tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với
chất chuẩn nội là tetramethyl silan (TMS), sau đó so sánh với tài liệu tham
khảo để xác định tên, công thức hoá học của hợp chất.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu về độc tính bán trường diễn
2.3.2.1. Chuẩn bị cao lỏng

Nguyên liệu: lá dược liệu được xay tới bột thô, sấy ở 45
0
C tới hàm ẩm
< 5%. Dược liệu được thấm ẩm bằng dung môi ethanol 40
0
và đậy kín trong 2
giờ.
16
Chiết xuất dược liệu: lót một lớp bông thấm nước lên trên ống thoát
dịch chiết để bột dược liệu không gây tắc ống và lẫn vào dịch chiết. Sau đó
đặt giấy lọc đã cắt vừa vặn vào đáy bình. Cho từ từ bột dược liệu đã được
thấm ẩm vào bình, vừa cho vừa san đều và nén nhẹ. Đổ dung môi vào bình
chiết cho tới khi có vài giọt chảy ra thì đóng khóa lại. Tiếp tục đổ dung môi
đến khi cách mặt dược liệu 3-4cm, ngâm lạnh trong 48 giờ. Hết thời gian
ngâm lạnh, mở khóa cho dịch chiết chảy ra với tốc độ là 20 giọt/phút. Chú ý
cho thêm dung môi đảm bảo ngập mặt dược liệu từ 2-3cm.
- Dịch chiết thu được đem cô đến cắn, phân tán trong nước tạo hỗn dịch
1:2.
2.3.2.2. Thử độc tính bán trường diễn.
Bố trí thí nghiệm: Chuột cống trắng cả 2 giống được chia ngẫu nhiên
thành 3 lô, cho uống thuốc thử hoặc nước vào một giờ nhất định liên tục trong
28 ngày, căn cứ vào liều tác dụng trên người 10g dược liệu khô/kg thể trọng:
- Lô chứng (n=10): uống nước với thể tích 1ml/100g chuột.
- Lô thử liều 1 (n=10): uống dịch chiết nước cao Dây thìa canh lá to
với liều 1,4 g/kg chuột (tính theo dươc liệu khô).
- Lô thử liều 2: gấp 3 liều 1 (n=10): uống dịch chiết nước cao Dây thìa
canh lá to với liều 4,2 g/kg chuột (tính theo dược liệu khô).

Hình 2.1. Quy trình thử độc tính bán trường diễn của dịch chiết
17

Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight)
Thông số đánh giá
- Tình trạng toàn thân: Biểu hiện của động vật thực nghiệm: tình
trạng da, lông, mắt, sự tiết dịch, phân, nước tiểu…, hoạt động tự
nhiên, hành vi, sự tiêu thụ thức ăn, nước uống (theo dõi hàng
ngày). Sự thay đổi khối lượng cơ (cân hàng tuần).
- Huyết học: Các thông số: số lượng hồng cầu, nồng độ
hemoglobin, tỷ lệ hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, lượng
huyết sắc tố trung bình, nồng độ huyết sắc tố, số lượng tiểu cầu, số
lượng bạch cầu và tỷ lệ % tế bào lympho.
- Về sinh hoá: Các thông số: Hoạt độ AST, hoạt độ ALT,
cholesterol toàn phần, protein toàn phần, creatinin huyết thanh.
- Về mô bệnh học: Đại thể các cơ quan: quan sát cảm quan các cơ
quan tim, gan, thận, lách. Cân ngay khối lượng các cơ quan và tính
tỷ lệ so với khối lượng toàn bộ cơ thể.
- Tiêu bản vi thể gan, thận (lấy ngẫu nhiên 30% động vật mỗi lô)
Xử lí số liệu: Phương pháp hậu kiểm ANOVA, số liệu được trình bày
dưới dạng M ± SD (M: giá trị trung bình của từng lô, SD: Độ lệch chuẩn).