Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 3 oxim isatin hướng ức chế histon deacetylase

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI





TRẦN THỊ LAN PHƯƠNG


TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID
HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-
OXIM-ISATIN HƯỚNG ỨC CHẾ
HISTON DEACETYLASE


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ








HÀ NỘI-2013

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


TRẦN THỊ LAN PHƯƠNG


TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID
HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-
OXIM-ISATIN HƯỚNG ỨC CHẾ
HISTON DEACETYLASE

Người hướng dẫn: 1. TS. Phan Thị Phương Dung
2. DS. Nguyễn Thị Mơ
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội




HÀ NỘI-2013

LỜI CẢM ƠN
Những dòng đầu tiên của khóa luận, tôi xin được dành để gửi lời cảm ơn tới thầy cô
và các bạn, những người đã đồng hành và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình hoàn thành
khóa luận.
Trước hết, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc và chân thành tới những người thầy,
người cô đáng kính của tôi tại bộ môn Hóa Dược, trường Đại Học Dược Hà Nội: PGS. TS.
Nguyễn Hải Nam, TS. Phan Thị Phương Dung và DS. Nguyễn Thị Mơ. Các thầy cô đã
luôn ở bên cạnh chỉ bảo, hướng dẫn tận tình, giúp tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp.
Bên cạnh đó, tôi cũng mong được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo cũng như các
anh chị kỹ thuật viên tại bộ môn Hóa Dược, trường đại học Dược Hà Nội. Mọi người thật
sự đã giúp đỡ rất nhiều, tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi cùng nhóm thực nghiệm trong
quá trình nghiên cứu khoa học và thực hiện đề tài tốt nghiệp tại bộ môn.
Ngoài ra không thể không kể tới sự đồng hành của các anh chị và các bạn trong
nhóm thực nghiệm. Sự chia sẻ và động viên của mọi người là nguồn động lực rất lớn của
tôi trong suốt thời gian thực nghiệm khoa học.
Và cuối cùng tôi muốn gửi sự biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè và người thân
của tôi, những người đã luôn ở bên giúp đỡ tôi trong mọi hoàn cảnh.
Hà Nội, ngày 15 tháng 04 năm 2013
Sinh viên
Trần Thị Lan Phương

Trang
MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ
1
Chương 1: TỔNG QUAN
2
1.1. ENZYM HISTON DEACETYLASE
2
1.1.1. Định nghĩa và vai trò của HDAC trong cơ thể
2
1.1.2. Phân loại các HDAC
3
1.1.3. Cấu tạo của HDAC
4
1.1.4. HDAC và ung thư
5
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC
6

1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC
6
1.2.2. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC
10
1.2.3. Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế HDAC
12
Chương 2: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
17
2.1. NGUYÊN LIỆU
17
2.2. TRANG THIẾT BỊ
17
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
18
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
19
2.4.1. Nghiên cứu docking các chất
19
2.4.2. Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết
20
2.4.3. Khẳng định cấu trúc
20
2.4.4. Thử hoạt tính sinh học
20


Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
23
3.1. SƠ BỘ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ DOCKING

23
3.2. TỔNG HỢP HÓA HỌC
24
3.2.1. Tổng hợp các ester trung gian 1a-d
25
3.2.1.2. Tổng hợp các acid hydroxamic 2a-d
27
3.3. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT
29
3.4. KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC
30
3.2.3.1. Phổ khối (MS)
30
3.2.3.2. Phổ hồng ngoại (IR)
32
3.2.3.3. Phổ cộng hưởng từ (NMR)
33
3.5. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC
36
3.6. BÀN LUẬN
37
3.4.1. Hóa học
37
3.4.2. Hoạt tính sinh học
38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
43
PHỤ LỤC

47












DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AML
Acute myeloid leukemia (bệnh bạch cầu cấp dòng tủy)
AML-ETO
Protein gây tăng sinh
APL
Acute promyelocytic leukemia (ung thư bạch cầu)
APAF1
Apoptoic protease activating factor (yếu tố hoạt hóa protease)
CHAP
Cyclic hydroxamic-containing peptid (các dẫn xuất của acid tetrapeptid
hydroxamic vòng)
CD
Receptor gây chết nội tại
CBHA
m-carboxycinnamic acid bis-hydroxamid

DMF
Dimethyl formamid
DMSO
Dimethyl sulfoxid
DMSO-d6
Dimethyl sulfoxid đã được deuteri hóa
FBS
Fetal bovine serum (huyết thanh bào thai bò)
HDAC
Enzym histon deacetylase
HDACi
Histon deacetylase inhibitor (Chất ức chế enzyme histon
deacetylase)
HAT
Enzym histon acetyltransferase
IC
50

Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào
IHCM1
Intercellular adhesion molecule 1(phân tử kết dính gian bào)
IR
Phương pháp phổ hồng ngoại
MeOH
Methanol
MHC
Major histocompality complex (phức hợp tương thích mô chính)
MS
Phương pháp phổ khối
MTT

3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid
NMR
Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân
PLRF
The Promyelocytic leukemia zinc finger (bệnh lơ-xê-mi cấp tiền tủy
bào)
RA
Retinoic acid
RAR
Retinoic acid receptor alpha (receptor của acid retinoic)
ROS
Reactive oxygen species (gốc oxy tự do hoạt động)


SAHA
Acid suberoylanilid hydroxamic
TLC
Phương pháp sắc ký lớp mỏng
TSA
Trichostatin
VEGF
Vascular endothelial growth factor (yếu tố gây phát triển màng
trong mao mạch)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng
Tên bảng
Trang
3.1
Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy của các acid hydxamic
28
3.2
Số liệu phân tích phổ khối của các acid hydroxamic
29
3.3
Số liệu phân tích phổ IR của các acid hydroxamic
30

3.4
Số liệu phân tích phổ
1
H-NMR của các acid hydroxamic
31
3.5
Số liệu phân tích phổ
13
C-NMR của các acid hydroxamic
32
3.6
Kết quả thử hoạt tính sinh học
34

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình
Tên hình
Trang
1.1
Cấu trúc histon trong nucleosome
2
1.2
Vai trò cân bằng của HDAC và HAT với sự phiên mã
3
1.3
Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC
5
1.4
Vai trò của sinh học của HDAC trong sinh lý tế bào ung thư
6
1.5 Công thức cấu tạo của Trichostatin (TSA) 7
1.6

Công thức cấu tạo của suberoylanilid hydroxamic acid (SAHA)
7
1.7 Công thức cấu tạo của acid valproic
8
1.8 Công thức cấu tạo của depsipeptid FK228

9
1.9 Công thức cấu tạo của MS275
9
1.10 Cấu trúc chung của một số dãy chất nghiên cứu đã công bố
13
1.11
Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC dẫn chất
acid hydroxamic
14
1.12
Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC dẫn chất
acid hydroxamic
16
3.1
Kết quả docking và dự đoán năng lượng liên kết của chất 5d với
HDAC 8
22
3.2
Công thức tổng quát N
1
-hydroxy-N
8
-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-
yl)octandiamid và dẫn chất
38
3.3
Công thức tổng quát chất dãy chất acid hydroxamic mang khung
benzothiazol
38

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ


Sơ đồ
Tên sơ đồ
Trang
3.1
Quy trình tổng hợp chung
23
3.2
Quy trình tổng hợp hợp chất trung gian 1a-d
24
3.3
Quy trình tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic 2a-d
26


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ thời kỳ đầu thế kỷ XX trở về trước, việc nghiên cứu, phát triển
thuốc mới hầu hết dựa trên kinh nghiệm. Gần đây những thành tựu trong lĩnh
vực di truyền học phân tử đã mở ra triển vọng cho việc tìm kiếm, phát hiện
mục tiêu phân tử thuốc. Nghiên cứu chi tiết các bản đồ gen cho phép xác định
được nhiều enzym, protein, thụ thể khác nhau có khả năng sử dụng như các
mục tiêu phân tử cho phát triển thuốc mới trong tương lai.

Một trong những ví dụ điển hình là việc tìm ra vai trò của enzym histon
deacetylase trong sinh lý bệnh ung thư. Quá trình phiên mã hoặc biểu hiện bất
thường do những gen mã hóa histon deacetylase hay những phần gắn chúng
bị đột biến là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến quá trình tấn công
và phát triển của ung thư. Các chất ức chế histon deacetylase có thể phục hồi
lại sự biểu hiện gen, ức chế sự phát triển và sống sót của tế bào ung thư. Một
loạt các chất ức chế histon deacetylase đã được nghiên cứu phát triển. Trong
đó acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) là một ví dụ điển hình. Với tên
thương mại là Vorinostat (Zolinza
®
) loại thuốc này đã được Cục quản lý dược
phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp phép trong điều trị u lympho tế bào T
dưới da. Nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược cũng đã tham gia nghiên
cứu thiết kế và công bố nhiều dãy chất với định hướng ức chế histon
deacetylase và cho những kết quả bước đầu khả quan. Tiếp tục hướng đi đó,
chúng tôi đã thực hiện đề tài “Tổng hợp một số acid hydroxamic mang
khung 3-oxim isatin hướng ức chế histon deacetylase” với 2 mục tiêu sau
đây:
* Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)
heptanamid và một số dẫn chất.
* Bước đầu thử tác dụng ức chế HDAC và đánh giá độc tính trên tế
bào ung thư đại tràng SW620 của các dẫn chất tổng hợp được.

2

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. ENZYM HISTON DEACETYLASE
1.1.1. ĐỊNH NGHĨA VÀ VAI TRÒ CỦA HISTON DEACETYLASE
TRONG CƠ THỂ

Mỗi loài sinh vật eukaryote đều có bộ nhiễm sắc thể đặc trưng về số
lượng, hình thái và cấu trúc. Đơn vị cấu trúc cơ bản của nhiễm sắc thể là các
nucleosom. Một nucleosom điển hình được hình thành do một chuỗi ADN
khoảng 146 cặp nucleotid quấn quanh một lõi protein gồm 8 phân tử histon
(2 H2A, 2 H2B, 2 H3 và 2 H4) [14] (xem hình 1.1).

Hình 1.1: Cấu trúc của histon trong nucleosom
Phân tử histon là một protein tích điện dương nên tương tác mạnh với
phần phosphat mang điện âm trên phân tử ADN tạo nên cấu trúc nucleosom
và các cấu trúc bậc cao hơn của nhiễm sắc thể, quy định quá trình biểu thị
gen. Việc tích điện dương của histon mạnh hay yếu chịu ảnh hưởng của quá
trình acetyl hóa đầu amin ở phần đuôi của histon. Dưới tác dụng của enzym
histon deacetylase (HDAC), gốc acetyl được tách khỏi ε-N-acetyl lysine
amino acid ở phần đuôi protein histon và chuyển tới coenzym A, làm tăng

3

điện tích dương trên histon, ức chế phiên mã. Trong khi đó enzym histon
acetyltranferase (HAT) có tác dụng ngược lại [14] (xem hình 1.2).

Hình 1.2: Vai trò của cân bằng động giữa HDAC và HAT đối với sự phiên mã
1.1.2. PHÂN LOẠI HDAC
Hiện nay người ta đã biết 18 HDAC khác nhau, được chia làm 4 nhóm
dựa trên chức năng và sự tương đồng với HDAC nấm men [13].

* Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8. Các enzym này chỉ có
trong nhân tế bào.
* Nhóm IIa: HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9. Nhóm IIb: HDAC6,
HDAC10.
Các enzym này có khả năng di chuyển giữa bào tương và nhân, trừ

HDAC6 chỉ có ở tế bào chất.
* Nhóm III: các protein điều hòa chuỗi thông tin 2 (sir2 hay sirtuins) [14]
- Chất đồng đẳng của Sir2 trong Saccharomyces cerevisiae.
- Sirtuins trong động vật có vú (sirt1, sirt2, sirt3, sirt4, sirt5, sirt6, sirt7)
* Nhóm IV: HDAC 11, có ở trong nhân của nhiều tế bào, tuy nhiên
phức hợp HDAC11 với HDAC6 lại nằm trong bào tương, chủ yếu có ở tim,
cơ trơn, thận, não.

4

Nhóm I, II và IV được coi như những HDAC “cổ điển”. Các HDAC
này và các sirtuins có cơ chế xúc tác khác nhau. Các HDAC “cổ điển” là các
enzym phụ thuộc Zn
2+
, chúng có chứa một túi xúc tác với một ion Zn
2+
ở đáy
túi và có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelat với Zn
2+
như các acid
hydroxamic, thiol Những hợp chất này không có tác dụng chống sirtuins vì
sirtuins có cơ chế hoạt động phụ thuộc NAD
+
như một cofactor thiết yếu [7].
Thuật ngữ “các chất ức chế HDAC” thường được sử dụng cho những chất có
mục tiêu phân tử là các HDAC “cổ điển”.
1.1.3. CẤU TẠO CỦA HDAC
Cho tới nay, bằng phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X
người ta xác định được cấu trúc 3D của hầu hết các HDAC và các trung tâm
xúc tác phản ứng deacetyl của chúng [25]. Theo đó, cấu trúc HDAC gồm các

phần cơ bản sau:
- Ion Zn
2+
là coenzym của HDAC nằm ở trung tâm xúc tác. Đây là
thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon bằng liên kết
phối trí. Thông thường các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn
2+
thì
tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào càng mạnh.
- Kênh enzym là nơi chứa đựng các cơ chất và tham gia liên kết Van
der Walls với cơ chất. Kênh này có cấu trúc dạng túi. Nó được cấu tạo bởi các
acid amin thân dầu đặc biệt là các acid amin có nhân thơm như: Phe, Tyr, Pro,
His. Nó có cấu trúc khá linh động có thể thay đổi kích thước để phù hợp với
cơ chất và tham gia phản ứng deacetyl.
- Ngoài ra ở HDAC8 người ta còn tìm thấy có bốn ion K
+
trong đó mỗi
tiểu phân gồm 2 ion. Các ion này đều tham gia 6 liên kết phối trí. Ion thứ nhất
cách ion Zn
2+
khoảng 0,7nm và liên kết với 6 acid amin. Ion thứ 2 nằm xa hơn
liên kết với 4 acid amin và 2 phân tử nước (xem hình 1.3).


5

Hình1.3: Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC8
1.1.4. HDAC VÀ UNG THƯ
Những nghiên cứu trên phạm vi rộng đã chỉ ra rằng sự ức chế phiên mã
không thích hợp của HDAC là cơ chế phổ biến tạo ra các protein gây ung thư
[19, 22]. Cụ thể, mối tương quan giữa hoạt động của HDAC và sự tạo thành
khối u thể hiện rõ nhất trong bệnh ung thư bạch cầu tiền tủy bào cấp tính
(APL). Sự biến đổi trong cấu trúc chất nhiễm sắc có thể tác động lên quá trình
biệt hóa các tế bào bình thường, kết quả dẫn tới sự hình thành khối u. Ngoài
ra trong các tế bào ung thư người ta còn thấy sự hoạt động quá mức của
HDAC như ung thư cổ tử cung (HDAC2) [16], ung thư dạ dày (HDAC1, 2)
[10, 23,24]]; ung thư phổi (HDAC1, 3) [30, 34], ung thư đại tràng (HDAC1,
3, 6) [10, 30].
Các nghiên cứu có ý nghĩa thống kê đã chỉ ra rằng các HDAC liên quan
đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung
thư như chu trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết tế bào theo chương trình, kể cả
sự di chuyển, sự xâm lấn và sự tạo mạch [9, 12, 19, 22]. Vai trò của các
HDAC trong quá trình sinh học của tế bào ung thư được tóm tắt như hình 1.4.

6



Hình 1.4: Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào ung thư

1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC
1

.2.1. PHÂN LOẠI CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC
Từ những phát hiện đầu tiên về tác dụng ức chế HDAC của natri
butyrat [9] đã có những đề tài rất đáng lưu ý trong việc nghiên cứu tìm kiếm
các chất ức chế HDAC có tác dụng kháng tế bào ung thư. Ngày nay có
khoảng 15 chất ức chế HDAC đang được thử nghiệm trên lâm sàng để điều trị
ung thư và được chia làm 4 nhóm dựa theo cấu trúc – tác dụng [12].
- Các hydroxamat: TSA, SAHA, CBHA.
- Các peptid vòng: depsipeptid, CHAPs.
- Các acid béo mạch ngắn: butyrat, phenylbutyrat, valproic acid.
- Các benzamid: N-acetyldinalin, MS-275.
Mỗi nhóm nêu trên đều có những hạn chế nhất định như:
- Các hydroxamat bị chuyển hóa nhanh và ức chế không chọn lọc lên
các loại enzym HDAC.
- Các benzamid và acid béo có hiệu lực kém.
- Các peptid vòng khó tổng hợp vì cấu trúc phức tạp.

7

Sau đây chúng tôi xin đề cập cụ thể hơn về các dẫn chất này:
1.2.1.1. Các hydroxamat
Trichostatin A (TSA) là dẫn chất hydroxamat tự nhiên đầu tiên được
phát hiện có tác dụng ức chế HDAC. Do việc sản xuất TSA rất tốn kém và
hiệu suất thấp (phải trải qua 20 giai đoạn với hiệu suất chỉ là 2) nên ngày nay
TSA chỉ được dùng chủ yếu làm chất đối chiếu trong việc tìm kiếm các
HDACi mới [21] (xem hình 1.5).


Hình 1.5: Công thức cấu tạo của trichostatin (TSA)
Acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) có cấu trúc tương tự TSA và
là chất ức chế HDAC nhóm I và II ở nồng độ nanomol. Cả SAHA và TSA đều

không ức chế HDAC nhóm III [20] (xem hình 1.6).

Hình 1.6: Công thức cấu tạo của acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA)
M-carboxycinnamic acid bishydroxamid (CBHA) là chất ức chế HDAC
mạnh khác. Nó là cơ sở cấu trúc của nhiều dẫn chất khác bao gồm LAQ824 và
một dẫn chất sulfonamid PXD-101, cả hai chất này đều ức chế HDAC nhóm I
và II ở nồng độ nanomol [19, 21, 27].
Các HDACi có chứa nhóm hydroxamat đã được xác nhận là chúng
tương tác với vị trí xúc tác của HDAC, ngăn không cho cơ chất tiếp xúc với

8

ion Zn
2+
tại vị trí của nó. Nhược điểm của các hydroxamat là bị chuyển hóa
nhanh, ức chế không chọn lọc trên các HDAC [28].
1.2.1.2. Các acid béo mạch ngắn
Nhóm các acid béo mạch ngắn như phenylbutyrat cùng các dẫn chất và
các acid valproic (xem hình 1.7) có tác dụng ức chế HDAC tương đối yếu, ở
khoảng nồng độ micromol. Gần đây, một hợp chất có cấu trúc ghép giữa
phenylbutyrat và TSA (BL1521) đã được ghi nhận là có tác dụng ức chế ở
nồng độ micromol thấp [30].

Hình 1.7: Công thức cấu tạo của acid valproic
1.2.1.3. Các peptid vòng
Nhóm các peptid vòng là nhóm có cấu trúc phức tạp nhất trong số các
HDACi, bao gồm: depsipeptid tự nhiên (FK228), apicidin và các phần tử khác
thuộc nhóm các CHAPs (các dẫn xuất của acid tetrapeptid hydroxamic vòng).
Trong khi hầu hết các hợp chất này là sản phẩm của vi khuẩn hoặc nấm, thì
apicidin và depsipeptide là sản phẩm kết hợp giữa acid hydroxamic và peptid

vòng. Tất cả các chất này đều có tác dụng ức chế HDAC mạnh ở mức nồng độ
nanomol [9] (xem hình 1.8).

9


Hình 1.8. Công thức cấu tạo của depsipeptid FK228
Các tetrepeptid vòng có chứa các nhóm chức năng trifluoroethyl và
pentafluoroethyl ceton, liên kết với kẽm đã được tổng hợp và là những chất ức
chế HDAC mạnh [11].
1.2.1.4. Các benzamid
Nhóm HDACi thứ tư bao gồm các tác nhân trong cấu trúc có chứa
nhóm chức benzamid. Nhóm này ức chế các HDAC bằng cách xâm nhập vào
vị trí xúc tác và liên kết với ion kẽm hoạt động. Các chất thuộc nhóm này
gồm: MS-275 (có khả năng ức chế HDAC ở mức nồng độ micromol) (xem
hình 1.9) và CI-994 (N-acetyldinalin) có tác dụng ức chế HDAC theo cơ chế
chưa được xác định, giá trị IC
50
từ 2 đến 10 micromol. Người ta chưa nhận
thấy tác dụng bất lợi nào của chất này [17].

Hình 1.9: Công thức cấu tạo của MS-275

10

1.2.2. CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACi)
Tác dụng chống ung thư của các HDACi bắt nguồn từ khả năng tác
động lên nhiều giai đoạn chu trình tế bào đã bị biến đổi ở các tế bào ung thư.
Hơn thế nữa các HDACi tác dụng chọn lọc trên tế bào ác tính có thể do
HDACi làm tăng sinh yếu tố ROS (reactive oxygen species) – gốc tự do oxy

hóa [12, 13].
Các HDACi tác động tới tế bào ung thư theo ba cơ chế chủ yếu dưới
đây [12, 13, 18]:
- HDACi ức chế chu trình tế bào, hoạt hóa các chương trình biệt hóa.
- HDACi thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình (sau khi phát hiện
được các sai lệch về gen trong khi kiểm tra giai đoạn G2, tế bào ung thư được
đưa vào chu trình gây chết tế bào aptosis).
- HDACi ức chế sự tạo mạch.
1.2.2.1. Các chất HDACi gây ra sự biệt hóa
Khi là tác nhân riêng lẻ, các HDACi có thể ức chế chu trình tế bào
khiến cho nhiều loại tế bào ung thư bạch cầu và u rắn khác nhau phải thể hiện
đặc tính biệt hóa và ngừng tăng sinh. Phân tích các số liệu về chu trình tế bào
của các tế bào ung thư đã được điều trị với HDACi cho thấy các tế bào thường
dừng ở pha G1 nhưng đôi khi tích tụ đến pha G2 của chu trình.
Sự biệt hóa của tế bào tủy phụ thuộc vào sự hoạt hóa phiên mã của
RARα và protein gây ung thư PLZF-RARα làm ngắt quãng chương trình biệt
hóa bình thường. HDACi có thể kết hợp với RA để tạo ra sự biệt hóa tế bào
APL kháng hóa trị liệu PLZF-RARα cả in vivo và in vitro [16]. Tuy nhiên
HDACi cũng có thể gây ra sự biệt hóa ở rất nhiều loại tế bào khác, và các hiện
tượng phân tử có liên quan tới sự biệt hóa của các loại tế bào khác đó vẫn
chưa được sáng tỏ [9].


11

1.2.2.2. Các chất HDACi thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình
Quá trình điều trị các tế bào ung thư với HDACi có thể dẫn đến sự gây
chết tế bào theo chương trình với mục đích kiểm soát số lượng tế bào bất
thường trong quá trình phát triển [9]. Người ta đã xác định hai con đường chết
nội bào với chức năng riêng biệt nhưng có mối liên hệ phân tử với nhau.

HDACi đã được ghi nhận là hoạt hóa cả chu trình gây chết receptor và gây
chết tế bào nội sinh. Ví dụ apicidin và CBHA có thể kích thích sự biểu hiện
của CD95 và phối tử CD95 (CD95L) và việc ức chế sự phát tín hiệu của
CD95 sẽ kháng lại sự gây chết tế bào do apicidin gây ra [19].
1.2.2.3. HDACi ức chế sự tạo mạch
Ngoài việc trực tiếp tác động lên sự tồn tại và phát triển của khối u,
HDACi còn có thể có các hoạt động khác gián tiếp ảnh hưởng lên sự phát
triển của khối u. HDACi có thể hoạt hóa phiên mã các protein MHC (major
histo-compatibility complex) nhóm I và II, các phân tử đồng kích thích CD40,
CD80 và CD86, phân tử kết dính gian bào ICAM1 và interferon loại I và II,
nhằm làm tăng mạnh sự nhận biết và hoạt hóa các tế bào miễn dịch. Thêm vào
đó, sự tồn tại và phát triển của các khối u rắn phát triển rộng và nhanh cần
cung cấp oxy và chất dinh dưỡng một cách liên tục để duy trì hệ mạch của
khối u. TSA có thể ức chế sự gây giảm oxy huyết của yếu tố gây phát triển
màng trong mao mạch (VEGF) và triệt tiêu sự hình thành mạch cả in vivo và
in vitro. Sự kích thích đáp ứng miễn dịch chính và sự ức chế hình thành mạch khối
u có thể ngăn chặn sự phát triển của các khối u lớn và ngăn cản sự di căn [11].





12

1.2.3. LIÊN QUAN GIỮA CẤU TRÚC VÀ TÁC DỤNG CỦA CÁC
CHẤT ỨC CHẾ HDAC MANG CẤU TRÚC ACID HYDROXAMIC
1.2.3.1. Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC mang cấu trúc acid
hydroxamic
Dựa trên nghiên cứu cấu trúc enzym đích HDAC, nhóm nghiên cứu tại
bộ môn Hóa Dược trường Đại Học Dược Hà Nội đã thiết kế và phát triển

hàng loạt các dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC [2, 3, 6] (xem
hình 1.10). Các nghiên cứu và thử nghiệm cho thấy kết quả khả quan về khả
năng ức chế HDAC cũng như độc tính in vitro trên một số dòng tế bào ung
thư.
Các kết quả này đã tạo nền tảng cho tác giả phát triển theo hướng
nghiên cứu trên trong việc thiết kế công thức, tổng hợp và thu được những kết
quả nhất định trong khóa luận này.
Dưới đây là cấu trúc chung của một số dãy chất nghiên cứu đã công bố:
O
OH
O
N
H
S
N
NH
R
1
n
( )
n = 3,5
O
OH
O
NH
S
N
NH
R
2

6
( )
R
3
O
H
H
O
O
OH
N
N
NH
( )
n
2
(
)
n
1
n
1
= 1 - 4
n
2
= 1 - 2
O
O
OH
NH

N
S
NH
(
)
6
Hình 1.10: Cấu trúc chung của một số dãy chất nghiên cứu đã công bố
Nói chung cấu trúc của các chất ức chế HDAC thường bao gồm 3 phần
chính [23]:
- Phần A (nhóm nhận diện bề mặt hay nhóm khóa hoạt động – capping
group): thường là vòng thơm hoặc peptid vòng, thường nằm trên bề mặt
enzym; phần này liên quan tới hiệu lực và tính đặc hiệu của HDACi (thường
là aryl hoặc phenyl)

13

- Phần B (cầu nối): thường là các hydrocacbon thân dầu, nằm trong
lòng mạch enzym (như amid-alkyl).
- Phần C (nhóm kết thúc): có thể gắn với Zn
2+
trên vị trí tác dụng của
các enzym HDAC (zinc-binding group-ZBG), có thể là acid hydroxamic, các
thiol, benzamid, mercapoceton.
Mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế HDAC
mang cấu trúc acid hydroxamic có thể xem ở hình 1.11. Nghiên cứu thiết kế
công thức cho các HDACi mới đều dựa trên việc thay đổi cấu trúc của 3 phần
này.

Hình 1.11: Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC
dẫn chất acid hydroxamic

1.2.3.2. Thiết kế công thức cho các HDACi mới
a. Thay đổi nhóm chức tạo chelat với Zn
2+

Khả năng tạo phức với ion Zn
2+
tại trung tâm hoạt động của HDAC
quyết định tính đặc hiệu và hiệu lực của các HDACi. Hiện nay đã biết một số

14

nhóm có thể liên kết với Zn
2+
bao gồm: acid hydroxamic, sulfanamid, nhóm
chức aminoanilin, thiol, acid carboxylic Trong đó, nhóm acid hydroxamic
tạo chelat bền vững với Zn
2+
nhất và hầu hết các dẫn chất của acid
hydroxamic đều ức chế HDAC ở nồng độ nM. Các hợp chất còn lại đã phần
ức chế HDAC với IC
50
ở mức μmol. Do đó acid hydroxamic vẫn là một nhóm
chức quan trọng trong nghiên cứu HDACi.
b. Thay đổi phần cầu nối
TSA và SAHA là hai điển hình cho phần cầu nối 5-6 carbon. Chúng thể
hiện tác dụng ức chế mạnh HDAC [20]. Hầu hết các nghiên cứu đều chỉ ra
rằng khoảng cách tốt nhất giữa nhóm acid hydroxamic và phần (A) là 5, 6, 7
nguyên tử carbon, với khả năng ức chế của dẫn chất theo mang cầu nối 6C lớn
hơn so với cầu nối 5C hay 7C và tác dụng tốt hơn rất nhiều so với cầu nối 3
hoặc 4C [2, 3, 6].

Trong HDACi nguyên mẫu,nhóm khóa hoạt động có thể liên kết với
phần cầu nối thông qua các nhóm cho hoặc nhận liên kết hydro như amid,
ceton. Đối với các HDACi có liên kết amid ở cầu nối, liên kết này có vai trò
quan trọng. Việc đảo chiều liên kết amid cũng làm thay đổi tác dụng của
HDACi, IC
50
giảm rõ rệt khi đổi chiều liên kết amid ở SAHA [8]. Tuy nhiên
việc thiếu hụt nhóm cho hoặc nhận liên kết hydro trong nửa liên kết tạo ra cơ
hội liên kết chặt chẽ hơn với các nhóm khác, dễ tổng hợp và thỏa mãn hơn về
dược động học [11].
Ngoài ra phần cầu nối chứa vòng thơm có thể ảnh hưởng tới tác dụng
ức chế chọn lọc HDAC, cũng như đến hiệu lực của HDAC. Nếu cầu nối là
mạch carbon béo mà thiếu nhóm nhận diện bề mặt như các acid béo mạch
ngắn thì hầu như không tương thích với túi enzym của HDAC nhóm IIb [8].



15

c. Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt
Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt nhằm khai thác sự khác biệt ở phần
miệng kênh enzym giữa các HDAC, từ đó có thể thiết kế công thức làm tăng
hoạt tính hoặc tăng khả năng ức chế chọn lọc. Nhóm nhận diện bề mặt chủ
yếu là các vòng, có thể là vòng thơm hoặc peptid vòng. Các nghiên cứu cho
thấy nhóm nhận diện bề mặt là vòng thơm thì tác dụng tốt hơn vòng no. Mặt
khác vòng lớn thường tốt hơn vòng nhỏ. Ví dụ khi thay nhóm phenyl của
SAHA bằng vòng indol thì IC
50
của dẫn chất indol nhỏ hơn SAHA nhiều lần [25].
Việc thay đổi phần A còn ảnh hưởng tới khả năng ức chế chọn lọc của

các HDACi, nhóm nhận diện bề mặt nhỏ thường tạo ra các HDACi không
chọn lọc, còn các vòng lớn như peptid vòng làm tăng khả năng ức chế chọn
lọc: SAHA và các acid hydroxamic có phần A nhỏ ức chế không chọn lọc
HDAC I và II, trong khi CHAP (các acid hydroxamic tổng hợp chứa peptid
vòng) chỉ ức chế chọn lọc một số HDAC nhóm I. Điều này có thể do HDAC
nhóm II có phần vành trên bề mặt miệng túi enzym được tạo thành từ hai
vòng xoắn có thể ngăn cản liên kết với phần peptid vòng của HDACi. Cấu
trúc càng cồng kềnh thì càng khó tương thích với các HDAC khác nhau mặc
dù chúng vẫn thể hiện tác dụng ức chế mạnh HDAC (CHAP có IC
50
tương
ứng với HDAC I và VI là 0,38 – 13nM) [8].
Tuy nhiên nhóm nhận diện bề mặt quá lớn cũng làm giảm tác dụng do
làm cho các HDACi khó thâm nhập vào vị trí xúc tác của HDAC. Nếu là
vòng thơm nhỏ, muốn thể hiện tác dụng ức chế không chọn lọc thì phải tăng
số lượng vòng thơm trong nhóm nhận diện bề mặt, tạo liên kết amid giữa các
vòng thơm với nhau sẽ làm tăng khả năng ức chế chọn lọc. Khi vòng thơm có
mặt các halogen cũng có thể làm tăng hoạt tính [9].
Tổng kết liên quan cấu trúc – tác dụng của một dãy các dẫn chất của
acid hydroxamic đã được nghiên cứu thể hiện trong hình 1.12: