Xác định sibutramin trong thực phẩm giảm béo bằng HPLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



DƯƠNG THỊ MINH HẰNG

XÁC ĐỊNH SIBUTRAMIN TRONG
THỰC PHẨM GIẢM BÉO BẰNG HPLC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ




HÀ NỘI – 2014



BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DƯƠNG THỊ MINH HẰNG

XÁC ĐỊNH SIBUTRAMIN TRONG
THỰC PHẨM GIẢM BÉO BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. TS. Lê Đình Chi
2. TS. Lê Thị Hồng Hảo
Nơi thực hiện:
Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ
Sinh Thực Phẩm Quốc Gia


HÀ NỘI – 2014


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới:
TS. Lê Đình Chi
TS. Lê Thị Hồng Hảo
ThS. Cao Công Khánh
là những người thầy đã dìu dắt tôi từ những ngày đầu làm nghiên cứu khoa
học và cũng là những người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.

Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, các anh chị trong Viện Kiểm
Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia, 48B Tăng Bạt Hổ - Hà Nội
đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua.

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo
và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội – những người đã dạy bảo
và giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường.

Xin chân thành cảm ơn các thành viên trong Nhóm Tải Báo đã hướng
dẫn và giúp tôi tìm tài liệu để hoàn thành khóa luận này.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh
chị em đã dành cho tôi sự giúp đỡ và động viên quý báu trong suốt thời gian
qua
Hà Nội, ngày 25 tháng 4 năm 2014
Sinh viên

Dương Thị Minh Hằng


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU- TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Vài nét chung về chất giảm béo 2
1.2. Tổng quan về sibutramin 2
1.2.1. Cấu trúc- tính chất lý hóa 2
1.2.2. Tính chất dược động học, tác dụng dược lý 3
1.2.3. Một số phương pháp phân tích sibutramin 5
1.3. Tổng quan về HPLC 8
1.3.1. Khái niệm chung 8
1.3.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký 8
1.3.3. Thiết bị sắc ký lỏng 10
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (NGUYÊN
LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU) 14

2.1. Đối tượng nghiên cứu 14
2.2. Nguyên vật liệu - thiết bị 15
2.2.1. Nguyên vật liệu 15
2.2.2.Thiết bị 15
2.3. Nội dung nghiên cứu 16
2.4. Phương pháp nghiên cứu 16
2.4.1. Khảo sát các điều kiện phân tích sibutramin bằng HPLC 16
2.4.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 18
2.4.3. Thẩm định quy trình 19


2.5. Phương pháp xử lý số liệu 19
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20
3.1. Thực nghiệm và kết quả 20
3.1.1. Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích sibutramin 20
3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu để chiết sibutramin trong thực phẩm
giảm béo 24
3.1.3. Thẩm định phương pháp 28
3.1.4. Kết quả áp dụng phương pháp xác định sibutramin trong một số sản
phẩm 36
3.2. Bàn luận 37
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38
4.1. Kết luận 38
4.2. Kiến nghị 39



DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU- TỪ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt
AOAC
Association of Official
Analytical Community
Hiệp hội cộng đồng phân tích
chính thức
ESI
Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử
FDA
Food and Drug Adminstration Cục quản lý thực phẩm và
dược phẩm Hoa Kỳ
GC-MS
Gas Chromatography Mass
Spectrometry
Sắc ký khí khối phổ
HPLC
High Performance Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HPTLC
High Performance Thin Layer
Chromatography
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng
cao
KN ATVSTP
Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh
thực phẩm
LC-MS/MS
Liquid Chromatography tandem
Mass Spectrometry

Sắc ký lỏng ghép khối phổ
hai lần
LOD
Limit of Detection Giới hạn phát hiện
LOQ
Limit of Quantification Giới hạn định lượng
R(%)
Recovery Hiệu suất thu hồi
SD
Standard Deviation Độ lệch chuẩn


DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng Trang
Bảng 1.1
Tóm tắt các quy trình phân tích sibutramin đã được
công bố
5
Bảng 2.1 Danh mục các mẫu phân tích 14
Bảng 2.2 Danh mục các pha động khảo sát 17
Bảng 3.1 Gradient hệ pha động 1 21
Bảng 3.2 Gradient hệ pha động 2, 3 và 4 22
Bảng 3.3
Kết quả định lượng sibutramin trong nang cứng NC07
theo dung môi dùng để chiết mẫu
25
Bảng 3.4
Kết quả định lượng sibutramin trong nang mềm NM07
theo dung môi dùng để chiết mẫu

27
Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống 30
Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ tuyến tính 30
Bảng 3.7
Độ lệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường
chuẩn
31
Bảng 3.8 Độ thu hồi của phương pháp với viên nang mềm 32
Bảng 3.9 Độ thu hồi của phương pháp với viên nang cứng 33
Bảng 3.10 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang cứng 34
Bảng 3.11 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang mềm 34
Bảng 3.12
Kết quả phân tích sibutramin trong các thực phẩm
chức năng giảm béo.
36



DANH MỤC CÁC HÌNH

Tên hình Trang
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của sibutramin 3
Hình 1.2 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 10
Hình 3.1
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin với pha
động 1
21
Hình 3.2
Sắc ký đồ dung dịch xác định độ phân giải với pha
động 1

21
Hình 3.3
Sắc ký đồ dung dịch xác định độ phân giảivới hệ
pha động 2
22
Hình 3.4
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin với hệ pha
động 3
23
Hình 3.5
Sắc ký đồ dung dịch xác định độ phân giải với hệ
pha động 3
23
Hình 3.6
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin với hệ pha
động 4
23
Hình 3.7
Sắc ký đồ dung dịch xác định độ phân giải với hệ
pha động 4
24
Hình 3.8 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin 100 µg/mL . 25
Hình 3.9
Sắc ký đồ dung dịch mẫu nang cứng chiết bằng
methanol.
25
Hình 3.10 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin 100 µg/mL 26
Hình 3.11
Sắc ký đồ mẫu nang mềm chiết bằng dung môi
methanol

26
Hình 3.12 Sắc ký đồ dung dịch đánh giá độ phân giải. 28
Hình 3.13 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin 200 µg/mL 29



Hình 3.14
Sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức năng không
chứa sibutramin.
29
Hình 3.15
Sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức năng không
chứa sibutramin được thêm chuẩn sibutramin.
29
Hình 3.16 Đường chuẩn của sibutramin 31
Hình 3.17
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin 0,5 µg/mL

35
Hình 3.18 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin 0,2 µg/mL 35




1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Béo phì là một vấn đề sức khỏe trên toàn thế giới, nó có thể tác động
không tốt đến chất lượng cuộc sống. Báo cáo gần đây nhất của WHO đã chỉ ra
rằng khoảng 1,5 tỉ người trưởng thành có độ tuổi trên 20 được xếp vào lớp
thừa cân; trong số đó hơn 200 triệu nam giới và gần 300 triệu phụ nữ đã béo

phì. Theo ước tính đến năm 2015 sẽ có khoảng 2,3 tỉ người thừa cân và trên
700 triệu người béo phì. Một số liệu khác cho thấy gần 43 triệu trẻ em dưới 5
tuổi đã bị thừa cân vào năm 2010 [25]. Chính vì thế nhu cầu giảm béo cũng
theo đó mà tăng lên. Phương pháp điều trị giảm béo chính là ăn kiêng kết hợp
hoạt động thể lực, và thuốc điều trị béo phì cũng được sử dụng để tăng cường
tác dụng. Thực phẩm chức năng giảm béo tự nhiên ra đời như một lựa chọn
thay thế cho thuốc giảm béo tổng hợp và trở thành biện pháp tốt hơn bởi lẽ
theo một cách tổng quát thì chúng an toàn hơn. Song tác dụng của những sản
phẩm đó lại thấp hơn những tác nhân giảm béo tổng hợp, do vậy để tăng hiệu
quả, chúng thường được cho thêm những chất hóa học giảm béo hiệu quả
khác một cách bất hợp pháp, trong đó có sibutramin là chất đã bị cấm sử dụng
[4], [12], [16]. Do đó việc phát hiện được sibutramin có mặt trái phép trong
thực phẩm chức năng giúp giảm béo là một yêu cầu thực tiễn trong kiểm soát
tính an toàn của loại sản phẩm này. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn kể trên, đề
tài “Xác định sibutramin trong thực phẩm giảm béo bằng HPLC” được tiến
hành nhằm:
- Xây dựng phương pháp phát hiện sibutramin có mặt trái phép trong thực
phẩm chức năng giúp giảm béo.
- Ứng dụng phương pháp đã xây dựng vào kiểm tra sibutramin trong một số
mẫu thực phẩm giảm béo thiên nhiên.



2
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Vài nét chung về chất giảm béo
Những chất giảm béo sử dụng đầu tiên gồm có nhóm các chất cường
adrenalin (phentermin, benzphetamin, phendimetrazin, mazindol,
diethylpropion, phenylpropanolamin) và nhóm chất cường serotonin
(fenfluramin, dexfenfluramin).

Tuy nhiên, phenylpropanolamin - một tác
nhân thuộc nhóm cường adrenalin đã bị cấm lưu hành tại thị trường Mỹ vào
tháng 10 năm 2000 do báo cáo tăng nguy cơ biến cố mạch máu não như xuất
huyết đột quỵ khi nó được sử dụng như một chất giảm cân ở phụ nữ [14].
Cũng như vậy, các chất cường serotonin mặc dù cũng có hiệu quả trong việc
hỗ trợ giảm cân nhưng chúng cũng đã bị cấm lưu hành trên thị trường Mỹ từ
tháng 9 năm 1997 do các báo cáo về thay đổi van tim và tăng huyết áp động
mạch phổi [15]. Sibutramin (thuộc nhóm chất ức chế tái thu hồi serotonin-
noradrenalin) chính thức được lưu hành tại Mỹ từ tháng 2 năm 1998, sau đó
nó đã được sử dụng cho điều trị béo phì trong khoảng 40 quốc gia trên thế
giới.
Sibutramin đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc điều trị béo
phì. Các dữ liệu lâm sàng trong một và hai năm đã chứng minh rằng
sibutramin, cùng với một chế độ ăn uống ít calo, đã gây ra tác dụng giảm cân
ban đầu và bền vững [21]. Tuy nhiên sibutramin lại có những tác dụng phụ
trầm trọng liên quan đến các nguy cơ tim mạch như tăng nhịp tim, tăng huyết
áp thậm chí là nhồi máu cơ tim [24], do đó nó đã bị cấm lưu hành trên nhiều
thị trường như thị trường châu Âu [12], Mỹ [16] và cả thị trường Việt Nam
[4].
1.2. Tổng quan về sibutramin
1.2.1. Cấu trúc- tính chất lý hóa
- Công thức phân tử: C
17
H
26
ClN (Khối lượng phân tử: 297,5)

3
- Công thức cấu tạo:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của sibutramin [5]
- Tên khoa học: (+/-)-1-(p-chlorophenyl)-α-isobutyl-N,N-dimethyl-
cyclobutan-methylamin [5].
- Dạng thường dùng: Sibutramin hydroclorid monohydrat.
- Độ tan: Độ tan của sibutramin (C
17
H
26
ClN) trong nước (pH 7,4) là 0,04
mg/mL, của sibutramin hydrochlorid monohydrat là 5,2 mg/mL.
Sibutramin base tan nhiều hơn trong alcol, độ tan tăng dần theo độ dài
mạch C từ methanol đến octhanol [5].
- Nhiệt độ nóng chảy: Sibutramin base có nhiệt độ nóng chảy là 55.15
o
C và
enthalpy là 60,75 J/mol; Sibutramin hydroclorid monohydrat có nhiệt độ
nóng chảy ở 119
0
C [5].
- Sibutramin base hấp thụ ánh sáng trong vùng UV-VIS. Cực đại hấp thụ tại
bước sóng 225nm [23].
1.2.2. Tính chất dược động học, tác dụng dược lý
Dược động học [13].
- Hấp thu: Sibutramin hấp thu tốt qua đường tiêu hóa (77%). Thời gian để
thuốc đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương là 1 giờ và thời gian bán thải là 1,1
giờ.
- Phân bố: phân bố nhanh chóng và rộng rãi đến các mô.

4
- Chuyển hóa: Khi dùng đường uống sibutramin bị chuyển hóa đáng kể khi
qua gan lần đầu. Sibutramin được chuyển hóa bởi cytochrom P450 CYP3A4
thành hai amin (gọi là chất chuyển hóa có hoạt tính 1 và 2) với chu kỳ bán rã
tương ứng là 14 và 16 giờ. Nồng độ đỉnh trong huyết tương của chất chuyển
hóa có hoạt tính 1 và 2 đạt được sau 3-4 giờ.
- Thải trừ: Các chất chuyển hóa thải trừ chủ yếu qua nước tiểu.
Tác dụng dược lý:
- Sibutramin đã được đánh giá như một thuốc chống trầm cảm tiềm tàng do
các cơ chế đã được chứng minh là tác động đó cũng tương tự như các thuốc
chống trầm cảm ba vòng, chẳng hạn như amitriptylin. Tuy nhiên, sibutramin
không có tác dụng phụ của thuốc chống trầm cảm ba vòng bao gồm cả buồn
ngủ, tác dụng kháng acetylcholin thế đứng [21].
- Sibutramin là một chất ức chế tái thu hồi serotonin - noradrenalin, thúc đẩy
giảm cân ở người béo phì. Nó làm giảm cảm giác thèm ăn, cho cảm giác no
và gây ra sự sinh nhiệt [21].
- Trong cơ thể, sibutramin chuyển hóa nhanh chóng thành các chất chuyển
hóa desmethyl: M1 (mono-desmethyl sibutramin) và M2 (di-desmethyl
sibutramin) và sibutramin tác động dược lý chủ yếu thông qua 2 chất chuyển
hóa này để gây ra tác dụng giảm cân [11], [8].
- Thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh sibutramin có hiệu quả như một chất
giảm cân với liều lượng khác nhau, từ 10 đến 20 mg/ngày [21].
- Tác dụng không mong muốn:
Sibutramin đồng thời cũng kích thích quá mức hệ thần kinh trung ương
và ảnh hưởng một vài khía cạnh như bồn chồn, khô miệng, đau đầu, tê liệt và
những dị cảm (cảm giác khác thường như bị châm chích, kiến bò) có thể xảy
ra. Hơn thế nữa nó còn liên quan đến tăng nguy cơ tim mạch như tăng áp lực

máu, nhịp tim và thường tăng nguy cơ đau tim cũng như đột quỵ [20]. Do



5
những nguy cơ này sibutramin đã bị cấm lưu hành trên thị trường châu Âu từ
ngày 21/1/2010 [12].Từ tháng 8 năm 2010, Mỹ đã thêm một chống chỉ định
mới cho các bệnh nhân trên 65 tuổi do các tác dụng phụ thực tế qua các
nghiên cứu lâm sàng của sibutramin [17]. Tại Việt Nam, các chế phẩm chứa
sibutramin đã bị rút số đăng ký lưu hành từ tháng 4/2011 [4].
1.2.3. Một số phương pháp phân tích sibutramin
Đã có rất nhiều nghiên cứu được công bố đưa ra phương pháp xác định
sibutramin sử dụng nhiều kỹ thuật phân tích khác nhau như: GC-MS [22], [9];
HPLC [23], [7], [6], [26]; HPTLC [7]; LC-MS/MS [10]; IR [18].
Bảng 1.1. Tóm tắt các quy trình phân tích sibutramin đã được công bố
Kỹ
thuật
phân
tích
Mẫu
phân tích

Điều kiện phân tích
Điều kiện
xử lý mẫu
Tài
liệu
tham
khảo
HPLC

Viên
nang
(Reductil,
10 mg, 15
mg,
Abbott
lab,
Brazil)
-Cột Phenyl Hypersil C18 (250 x 4,6
mm, 5 μm)
-Pha động: acetonitril - amoni
dihydrophosphat 50 mM, pH 6,0 (35 :
65)
-Tốc độ dòng: 1 mL/phút
-Nhiệt độ cột: 30
o
C
-Detector PDA: 225 nm
-Thể tích tiêm mẫu: 20µL
Chiết bằng
methanol-
nước
(65:35)
trước khi
tiêm sắc ký
[23]
HPLC
Viên
nang
giảm béo

thiên
nhiên
-Cột ACE Phenyl
(150 × 4,6 mm, 5 µm)
-Pha động: acetonitril - nước - acid
formic 0,19 M, pH 3,0 (45 : 55 : 0,78)
-Tốc độ dòng: 1 mL/phút
Chiết bằng
acetonitril -
nước (1:1)
và pha loãng
trước khi
[7]



6
-Nhiệt độ cột: 25
o
C
-Detector huỳnh quang (Kích thích
225 nm, bức xạ 316 nm)
-Thể tích tiêm mẫu: 5µL
tiêm sắc ký
HPLC
Viên
nang
cứng
giảm béo
-Cột CN Nucleosil 100-5 CN (125 x

4,6 mm, 5 µm)
-Pha động: acetonitril - kali
dihydrophosphat 0,025M, pH 4,0 (35 :
65)
-Tốc độ dòng: 2,5 mL/phút
-Nhiệt độ cột: 25
o
C
-Detector PDA: 225 nm
-Thể tích tiêm mẫu: 20µL
Chiết bằng
methanol
trước khi
tiêm sắc ký

[6]
HPLC
Viên
nang
cứng
giảm béo
-Cột Thermo C
18
(250×4,6 mm, 5 µm)
-Pha động: acetonitril – acid
phosphoric 0,02M, pH 3,0 (tỷ lệ theo
gradient)
-Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút
-Nhiệt độ cột: 30
0

C
-Detector PDA: 222 nm
-Thể tích tiêm mẫu: 20 µL
Chiết bằng
methanol,
rung siêu
âm ở 60
0
C,
pha loãng,
lọc thô.

[26]
HPTLC
viên nang
giảm béo
thiên
nhiên
-Bản mỏng: Silica gel 60 F
254
(8mm ×
20mm)
-Pha động: n-hexan - aceton - amoniac
(10 : 1 : 0,1)
-Quét sắc đồ ở 225 nm, tốc độ 10
mm/giây
-Hiện vết: Phun thuốc thử Dragendoft
Chiết bằng
acetonitril -
nước (1 : 1)

sử dụng máy
lắc xoáy.
[7]
GC-MS Viên nén, -Thiết bị : sắc ký khí HP-6890, Mẫu được [9]



7
viên
nang, trà
túi

detector HP 5973
-Cột: HP-5-MS (30m×0,25mm, bề
dày phase : 0,25mm)
-Chương trình nhiệt độ : bắt đầu ở
110
o
C, tăng 10
o
C/phút đến 280
o
C và
duy trì trong 3 phút
-Khí mang: Heli với tốc độ 0,6
ml/phút
-Phổ được thu thập trong khoảng m/z
từ 40 - 400

hòa trong

nước, kiềm
hóa bằng
Natri
carbonat đến
pH 10. Chiết
bằng methyl
chlorid, sau
khi tách các
lớp, làm khô
bằng natri
sulphat khan
rồi phân tích
bằng GC-
MS.
LC-
MS/MS
Huyết
tương
-Cột Waters Xterra MS C
18
(50×2,1
mm, 3,5 µm)
-Pha động: acetonitril - acid
trifluoroacetic 0,1% (55:45, v/v).
-Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút
-Nhiệt độ cột: 20
0
C
-Thể tích tiêm: 5 µL
-Detector: Sử dụng kỹ thuật ESI (ion

hóa tia điện) để ion hóa chất phân tích
và phân tích khối phổ 2 lần MS/MS.

Mẫu được
chiết bằng
tert-butyl
ether, thêm
vào chất
chuẩn nội
propranolol
hydroclorid
rồi phân tích
bằng HPLC-
ESI/MS/MS
[10]

Trong các kỹ thuật phân tích đã được ứng dụng để phân tích sibutramin,
HPLC là kỹ thuật phổ biến nhất, dễ áp dụng do điều kiện thiết bị sẵn có. Vì



8
vậy, trong nghiên cứu này, HPLC được lựa chọn làm kỹ thuật để xây dựng
quy trình phân tích sibutramin trong thực phẩm chức năng giảm béo.
1.3. Tổng quan về HPLC
1.3.1. Khái niệm chung
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography –
HPLC) là kỹ thuật tách sắc ký trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha
động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tùy thuộc vào
ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với

tốc độ khác nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau. Thành phần pha động đưa
chất phân tích ra khỏi cột được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp
lý [1].
1.3.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký
Thời gian lưu:
Khoảng thời gian từ lúc bơm mẫu vào cột đến khi pic đến detector là
thời gian lưu t
R
.
Thời gian chết: thời gian t
M
của chất không lưu giữ (tốc độ di chuyển của nó
bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phần tử pha động).
Thời gian lưu hiệu chỉnh: t
R’
= t
R
- t
M
Hệ số phân bố K:
K =
M
S
C
C

C
S
, C
M

: nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh, pha động
K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Các chất trong
hỗn hợp có hệ số K khác nhau càng nhiều, khả năng tách diễn ra càng dễ dàng
hơn.
Hệ số dung lượng k’:



9
k’ =
M
S
MM
SS
V
V
K
VC
VC
.
.
.

=
M
MR
t
tt 

Trong đó: V

S
, V
M
tương ứng là thể tích của pha tĩnh, pha động.
k’ phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất 2 pha vào hệ số V
S
/V
M

Thông thường chọn k’ = 1-5.
Hệ số chọn lọc α:
Hệ số chọn lọc α đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B:
α =
 
 
M
A
R
M
B
R
A
B
A
B
tt
tt
k
k
K

K



'
'

Trong đó:
K
B
, K
A
lần lượt là hệ số phân bố của chất B, A (A là chất ra trước).
k’
A
,

k’
B
tương ứng là hệ số dung lượng của chất A, B.
(t
R
)
A
, (t
R
)
B
tương ứng là thời gian lưu của chất A, B.
Hai chất A và B chỉ có thể tách được khỏi nhau nếu  > 1. Trong phân tích

sắc ký, thường lựa chọn điều kiện phân tích để có được α = 1,05 - 2. Nếu α
quá lớn, thời gian phân tích kéo dài.
Số đĩa lý thuyết:
Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký
2
2/1
2
55,516
















W
t
W
t
H
L

N
RR

Trong đó:
L: chiều dài của cột được chia thành N đĩa lý thuyết;
H: chiều cao của đĩa lý thuyết;
W: chiều rộng của pic sắc ký;
W
1/2
: chiều rộng pic ứng với một nửa chiều cao của pic.
Độ phân giải của cột:
Độ phân giải (R
S
) của cột đánh giá khả năng tách định lượng hai chất trong



10
hỗn hợp trên cột sắc ký:
R
S
=
   
 
   
 
BA
A
R
B

R
BA
A
R
B
R
WW
tt
WW
tt
,
2/1
,
2/1
.18,1
.
2
1






Trong đó:
W
A
, W
B
tương ứng là chiều rộng pic sắc ký của chất A, B;

W
1/2,A
, W
1/2,B
tương ứng là chiều rộng pic sắc ký của chất A, B ứng với một
nửa chiều cao của pic.
1.3.3. Thiết bị sắc ký lỏng [1], [2]





Buồng cột

Hình 1.2. Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao [1].
a. Hệ thống cung cấp pha động:
- Nguốn cấp pha động: pha động trong sắc ký lỏng thường là 2 dung môi
hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp, được chứa
trong bình thủy tinh hoặc thép không rỉ.
- Bộ phận loại khí (degasser): trước khi sử dụng cần lọc (màng lọc 0,45 µm)
và đuổi khí hòa tan trong pha động để tránh việc khí hòa tan có thể làm biến
dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền. Có thể loại khí hòa tan
bằng cách: chạy siêu âm, sục khí trơ….
Hệ thống cấp
dung môi
Bơm Bộ phận tiêm mẫu
Cột sắc ký
Detector
Hệ thống thu
nhận và xửa lý

số liệu (máy
ghi, máy tính)



11
- Bộ phận trộn pha động (mixer): trộn các dung môi ở áp suất thấp hoặc áp
suất cao
 Chương trình dung môi ở áp suất thấp: mỗi bình chứa dung môi có một
van riêng lấy lượng dung môi xác định đưa vào bình hòa trộn, sau đó
chỉ dùng một bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu.
 Chương trình dung môi ở áp suất cao: Mỗi dung môi có một bơm riêng,
việc hòa trộn được thực hiện ở áp suất cao.
- Bơm: về mặt kết cấu có 3 loại thường gặp: Bơm đẩy một pittong, bơm làm
đầy nhanh và bơm kép đẩy kéo.
b. Bộ phận tiêm mẫu:
- Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu
cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu. Vòng
chứa mẫu có dung tích khác nhau: thường dùng loại 0,50÷20 µL. Có vòng
chứa mẫu lớn hơn.
- Ngoài ra, đôi khi người ta tiêm mẫu bằng bơm tiêm qua tấm đệm ở đầu cột.
Khi tiêm phải dừng dòng và áp suất trong cột không cao. Cách tiêm này có độ
lặp lại thấp, sai số lớn hơn so với khi dùng van tiêm.
- Hiện nay hay dùng van tiêm mẫu vì có ưu điểm là sẽ dễ dàng tự động hóa,
cột không bị tắc hay bị làm bẩn bởi các mảnh của vách ngăn, thể tích đưa vào
cột hằng định nên độ lặp lại cao.
c. Cột sắc ký
- Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ,
thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30 cm, đường kính trong 4-10 mm.
Cột nhồi thường có hạt cỡ 5-10 µm. Ưu điểm của cột có cột nhồi có hạt cỡ

nhỏ là chạy tốn ít dung môi và ít thời gian và số đĩa lý thuyết lớn.
- Để bảo vệ cột sắc ký, người ta sử dụng cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký
để loại các chất có mặt trong pha động và trong mẫu phân tích làm giảm tuổi



12
thọ cột. Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại nhưng kích
thước hạt lớn hơn.
- Sắc ký lỏng phân bố là kỹ thuật sử dụng phổ biến nhất hiện nay. Loại pha
tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silic dioxid (silica). Nhóm OH trên bề mặt
silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan.

Bề mặt silica Dẫn chất clorosilan Dẫn chất siloxan
Dựa vào gốc R’ của dẫn chất siloxan, người ta chia ra 2 nhóm:
- Pha tĩnh không phân cực có R’ là:
 Gốc octadecyl (C
18
)
 Gốc octyl (C
8
)
 Gốc phenyl propyl
- Pha tĩnh phân cực có R’ là:
 Cyano
 Amino
 Diol
Dựa vào độ phân cực tương đối của pha tĩnh và pha động đã hình thành hai
loại sắc ký phân bố là sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký phân bố pha đảo:
- Sắc ký phân bố pha thuận: thường dùng pha tĩnh lỏng phân cực như

triethylen glycol, nước. Còn pha động là dung môi ít phân cực hơn như hexan.
- Sắc kí phân bố pha đảo: pha tĩnh không phân cực như hydrocacbon (C
18

hoặc C
8
) còn pha động phân cực hơn pha tĩnh như nước, acetonitril.
d. Detector
Có nhiều detector được sử dụng trong HPLC và thường sử dụng 6 loại sau:



13
- Detector hấp thụ UV-VIS
- Detector huỳnh quang
- Detector chỉ số khúc xạ
- Detector tán xạ bay hơi
- Detector đo dòng
- Detector độ dẫn
Trong nghiên cứu này, để quy trình xây dựng được có khả năng ứng dụng
rộng, chúng tôi lựa chọn detector PDA, loại detector phổ biến trong cấu hình
tiêu chuẩn của thiết bị HPLC hiện tại. Về bản chất, đây là một detector UV-
Vis cho phép đồng thời ghi nhận tín hiệu hấp thụ đồng thời trên toàn dải phổ
UV gần và Vis. Dải bức xạ UV-Vis (thường các detector PDA có dải bước
sóng trong khoảng 190 – 800 nm) sau khi đi qua tế bào đo được đưa đến một
cách tử để phân thành các tia đơn sắc đi đến một mảng diod quang. Mỗi diod
quang đón nhận một phần dải bức xạ tương ứng với một khoảng bước sóng
hẹp. Như vậy, mỗi một diod có thể phát hiện một sự hấp thu ở một bước sóng
nhất định. Toàn bộ dãy diod được quét nhiều lần trong 1 giây bởi bộ phận vi
xử lý. Kết quả phổ có thể hiện trên màn hình máy tính hoặc được lưu trữ để in

ra dưới dạng bản phổ bằng máy in.
Ưu điểm của detector này là tạo được phổ UV của các chất phân tích trong
khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự tinh khiết của sản phẩm và định danh
được sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương ứng của đỉnh sắc ký với phổ của
một ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của chất chuẩn biết trước.
e. Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu
Bộ phận lưu trữ dữ liệu của các thiết bị HPLC hiện nay thường là các
máy vi tính hiện đại có khả năng ghi nhận, lưu giữ, biên tập, xử lý các thông
tin hết sức hiệu quả.



14
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
(NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU)
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp xác định
hàm lượng của sibutramin.
Đối tượng mẫu phân tích là các thực phẩm chức năng dưới một số dạng
bào chế: viên nang cứng, viên nang mềm. Các mẫu phân tích được lấy từ viện
KN ATVSTP QG có nguồn gốc từ các công ty sản xuất khác nhau và được
mã hóa như bảng 2.1
Bảng 2.1 Danh mục các mẫu phân tích
Mẫu Tên sản phẩm Nhà sản xuất Hạn dùng
NC01 Pretty woman
Dược phẩm Jemo-Pharm
A/S
7/2014
NC02

Viên nang giảm béo Phục
Linh
Công ty Bách An- Trung
Quốc
31/8/2014
NC03 Viên nang thanh quả áo đình
Yunan Baian Medicinal
Science & Technology co.,
LTD
25/3/2015
NC04 Green Oake USA O&K trading 12/2014
NC05 Viên nang không nhãn mác Không rõ 23/6/2014
NC06 Viên nang không nhãn mác Không rõ 15/5/2014
NC07 Eva beauty Không rõ 1/9/2015
NM01 Doctor’s Choice Slim&slim Dramerico group LLC 21/12/2016

NM02 Viên nang không nhãn mác Không rõ Không rõ
NM03 Slim Fit Bacai Inc 12/2016
NM04 Beauty Arkopharma 4/2016
NM05 Viên nang mềm không nhãn Không rõ Không rõ



15
mác
NM06 Beauty slim NHK laboratories (USA) 6/2016
NM07 Viên nang không nhãn mác Không rõ 25/8/2014

2.2. Nguyên vật liệu - thiết bị
2.2.1. Nguyên vật liệu

- Chất đối chiếu sibutramin hydroclorid monohydrat (Sigma - Adrich) (Số
kiểm soát: MFCD04039806; hàm lượng: ≥98% (HPLC)).
- Chất đối chiếu furosemid (Số kiểm soát: MFCD00010549; hàm lượng:
99%).
- Chất đối chiếu phenolphthalein (Số kiểm soát: MFCD00070132; hàm lượng:
≥85% (TLC) ).
- Dung môi loại tinh khiết cho HPLC: methanol, acetonitril, tetrahydrofuran
(Merck)
- Dung môi loại tinh khiết phân tích: ethanol, aceton (Merck)
- Hóa chất tinh khiết phân tích: kali dihydrophosphat (Merck), amoni acetat
(Merck).
- Nước cất 2 lần
2.2.2.Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu (LC 20AD) trang bị
detector PDA.
- Cột sắc ký C
18
Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5 µm).
- Tiền cột C
18
Symmetry Waters (20 mm x 3,9 mm; 5 µm).
- Cân kỹ thuật XT1200c.
- Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác 0,0001 g và 0,00001 g.
- Máy đo pH: pH Meter 744.
- Máy lắc siêu âm Elma.



16
- Máy ly tâm Hermle Z383K

- Máy lắc Vortex IKA
- Dụng cụ thủy tinh các loại: Bình định mức 20 mL, 50 mL, cốc có mỏ, pipet
các loại, autopipet 1000 μL, 200 μL.
- Ống ly tâm 50 mL
- Phễu lọc, giấy lọc, màng lọc 0,45 µm, 0,2µm.
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát xây dựng điều kiện chạy máy HPLC để phân tích sibutramin.
- Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách chiết sibutramin trong thực
phẩm chức năng.
- Đánh giá quy trình phân tích và xử lý mẫu.
- Áp dụng quy trình phân tích và xử lý mẫu với một số sản phẩm trên thị

trường.

2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Khảo sát các điều kiện phân tích sibutramin bằng HPLC
Nghiên cứu phân tích sibutramin chúng tôi tiến hành là một nhánh trong
một đề tài lớn hơn nhằm xây dựng quy trình phân tích các chất có tác dụng
làm giảm cân có mặt trái phép vào thực phẩm chức năng. Trong số các chất
này có phenolphthalein (do tác dụng nhuận tràng) và furosemid (do tác dụng
lợi tiểu) là hai đối tượng cũng từng bị phát hiện có mặt trái phép trong thực
phẩm chức năng, đồng thời lại rất khó tách khỏi sibutramin bằng HPLC nếu
có mặt trong cùng nền mẫu (từ các kết quả nghiên cứu sơ bộ). Chính vì vậy,
trong khi xây dựng quy trình phân tích sibutramin trong nghiên cứu này,
chúng tôi đặt mục tiêu cần khảo sát các điều kiện sắc ký cho phép tách riêng
sibutramin khỏi phenolphthalein và furosemid để nâng cao hiệu quả ứng dụng
thực tế của quy trình.