Luận văn Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Nitơ (N) là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng không chỉ với cây trồng mà ngay cả đối
với vi sinh vật. Nguồn dự trữ N trong tự nhiên rất lớn chỉ tính riêng trong không khí N chiếm
khoảng 78,16% thể tích. Người ta ước tính trong bầu không khí bao trùm lên 1ha đất đai chứa
khoảng 8 triệu tấn N, lượng N này có thể cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng hàng chục triệu
năm nếu như cây trồng đồng hóa được chúng. Trong cơ thể các loại vi sinh vật chứa khoảng
4,1015 tỷ tấn N. Cây trồng cũng như các loại động vật và người không có khả năng đồng hóa
trực tiếp nguồn N
2
tự do từ không khí (Nester et al.,2004). Nhưng tất cả nguồn N trên cây
trồng đều không tự đồng hóa được mà phải nhờ vi sinh vật. Hàng năm cây trồng lấy đi từ đất
hàng trăm triệu tấn N. Bằng cách bón phân con người đã trả lại cho đất khoảng hơn 40%,
lượng thiếu hụt còn lại cơ bản được bổ xung bằng Nitơ do hoạt động sống của vi sinh vật. Vì
vậy việc nghiên cứu sử dụng loại đạm sinh học này được xem là một giải pháp quan trọng
trong nông nghiệp, đặc biệt trong sự phát triển để hướng tới một nền nông nghiệp sinh thái bền
vững Tuy nhiên tồn tại một số vi sinh vật có khả năng biến N
2
trong khí quyển thành NH
3
cung cấp đạm cho cây mà chỉ cần một lượng năng lượng rất ít (3-5kcal/M). Chúng được gọi
chung là các vi sinh vật cố định đạm.
Phân bón vi sinh (Nitragin) ra đời tại Đức năm 1896 do Noble Hiltner sản xuất là công
trình ứng dụng cơ chế cố định đạm sinh học đầu tiên và sau đó đã phát triển mạnh mẽ ra các
nước khác. Phân vi sinh có nhiều ưu điểm so với phân hóa học, ngoài tác dụng nâng cao năng
suất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi phí sản suất thì phân vi sinh còn
góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nông nghiệp bền vững. Ở Việt
Nam phân vi sinh đã được nghiên cứu từ những năm 1960. Tuy nhiên tình hình sản xuất phân
vi sinh ở nước ta vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp, do quy
mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn định. Do đó, nghiên cứu để hoàn

thiện và nâng cao chất lượng phân vi sinh là việc làm hết sức cần thiết. Trong đó, việc phân lập
và tuyển chọn các chủng vi sinh vật là khâu đầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế
phẩm [7].
Trong vài chục năm gần đây ngày càng gia tăng các nghiên cứu vi khuẩn có ích chúng
có thể nội sinh hay ngoại sinh có khả năng cố định N tự do hoặc phân giải các phosphate khó
tan làm tăng năng xuất cây trồng đồng thời hạn chế được những độc tính của đất khi sử dụng
phân bón hoá học…Đặc biệt là các nhóm vi khuẩn khu trú trong vùng rễ của cây trồng. Nhóm
vi sinh vật này gọi là PGPR “Plant Growth Promoting Rhizobacteria” và có những dòng thể
hiện ưu điểm mạnh như: Pseudomonas, Azospirillum, Burkhoderia, Bacillus, Enterobacter,
Rhizobium, Erwinia, Serratia, Alcaligenes, Arthobacter, Acinetobacter và Flavobacterium.
Nhóm vi khuẩn này có khả năng cố định N, tổng hợp nhiều chất kích thích sinh trưởng thực
vật IAA, GA
3
… góp phần nâng cao độ phì nhiêu của đất, kích thích tăng trưởng, tăng năng
suất cây trồng, hạn chế bón phân hóa học và phát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững
[38]
Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu, phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh trong rễ
lúa, rễ cây lạc, cây cà phê Tuy nhiên, những nghiên cứu về vi khuẩn cố định đạm nội sinh
trong rễ cây ngô còn rất ít. Đặc biệt, hiện nay chưa có một nghiên cứu nào về thành phần loài
của vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô trên địa bàn tỉnh Đăk Lăk.
2
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn
một số chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh
Đăk Lăk”.
2. Mục tiêu của đề tài
- Phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn cố định đạm trong rễ cây ngô ở
Đăk Lăk.
- Xây dựng qui trình nhân sinh khối một số chủnng vi khuẩn có hoạt tính cố định đạm
cao làm phân sinh học chuyên dụng cho cây ngô.
3. Ý nghĩa của đề tài

Ý nghĩa khoa học
Xác định được một số chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, sống nội sinh trong rễ
cây ngô.
Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng vi khuẩn sống nội sinh trong rễ
cây ngô có hoạt tính cố định đạm cao để sản xuất phân vi sinh có hiệu quả, nâng cao độ phì
nhiêu của đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng suất cây ngô và góp phần phát triển một
nền nông nghiệp sinh thái bền vững.
3
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây ngô
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại thực vật
Ngô có tên khoa học là Zea mays L (Zea: Từ Hi Lạp để chỉ cây ngũ cốc và từ Mays là
từ “Mahix” tên gọi cây ngô của người bản địa da đỏ [9]. Cũng có thể Mays là từ “Maya” tên
một bộ tộc da đỏ ở vùng Trung Mỹ - xuất xứ của cây ngô) [17].
Cây ngô thuộc: Ngành : Maopholiophyta
Lớp : Liliopsida
Bộ : Poales
Chi : Zea
Loài : Mays
Bộ nhiễm sắc thể (2n=20).
Có nhiều cách để người ta phân loại ngô, một trong các cách đó là dựa vào cấu trúc nội
nhũ của hạt và hình thái bên ngoài của hạt. Ngô được phân thành các loài phụ: Ngô đá rắn, ngô
răng ngựa, ngô nếp, ngô đường, ngô nổ, ngô bột, ngô nửa răng ngựa. Từ các loài phụ dựa vào
màu hạt và màu lõi ngô được phân chia thành các thứ. Ngoài ra ngô còn được phân loại theo
sinh thái học, nông học, thời gian sinh trưởng và thương phẩm. Có rất nhiều giả thuyết về
nguồn gốc của ngô tại châu Mỹ như ngô là sản phẩm thuần dưỡng trực tiếp từ cỏ ngô (Zea
mays ssp. parviglumis) một năm ở Trung Mỹ, có nguồn gốc từ khu vực thung lũng sông
Balsas ở miền nam Mexico. Cũng có giả thuyết khác cho rằng ngô sinh ra từ quá trình lai ghép
giữa ngô đã thuần hóa nhỏ (dạng thay đổi không đáng kể của ngô dại) với cỏ ngô thuộc đoạn

Luxuriantes. Song điều quan trọng nhất nó đã hình thành vô số loài phụ, các thứ và nguồn dị
hợp thể của cây ngô, các dạng cây và biến dạng của chúng đã tạo cho nhân loại một loài ngũ
cốc có giá trị đứng cạnh lúa mì và lúa nước .
1.1.2. Đặc điểm hình thái cây ngô [9].
Cơ quan sinh dưỡng của ngô gồm rễ, thân và lá làm nhiệm vụ duy trì đời sống cá thể.
Hình 1.1 Các bộ phận của cây ngô
Rễ ngô: Trong quá trình sinh trưởng phát triển, cây ngô có 3 loại rễ. Đó là: rễ mầm, rễ
đốt và rễ chân kiềng.
Thân ngô: Thân đặc, đường kính thân khoảng 2 – 4cm tùy thuộc vào giống, mùa
vụ và trình độ thâm canh, thân có nhiều lóng. Trong điều kiện bình thường ngô cao từ 1,8
– 2m, từ khi mọc đến khi cây có 6 – 7 lá thân phát triển chậm, từ lúc 8 – 9 lá đến nhú cờ, nở
hoa cây phát triển nhanh và đến khi hoa đực phơi màu, bắp phun râu cây vẫn tiếp tục lớn.
Sau khi thụ phấn thì thân ngừng phát triển.
4
Lá ngô: Gồm có lá mầm, lá thân, lá ngọn và lá bẹ. Lá được chia thành các bộ phận
như: bẹ lá, phiến lá và thìa lá. Phiến lá rộng và dài, mép lá gợn sóng, có nhiều lông tơ. Gân
lá song song. Lá mang bắp có chiều dài dài nhất.
Hoa ngô: Gồm hoa đực (bông cờ) và hoa cái. Bông cờ có nhiều nhánh, mỗi nhánh
có nhiều hoa xếp thành từng chùm, mỗi chùm có hai hoa, mỗi hoa có 3 nhị đực, mỗi nhị
đực có 1 bao phấn, một bao phấn có hai ô, một ô chứa từ 1000 – 2500 hạt phấn. Hoa cái
sinh ra từ nách lá gồm có lõi bắp có nhiều đốt ngắn có lá bao bi, mỗi hoa cái có một râu.
Hoa cái mọc từng đôi trên hoa tự. Mỗi chùm hoa có hai hàng hoa nhưng hoa thứ hai bị
thoái hóa chỉ một hoa hình thành hạt, một đôi chùm hoa cho hai hàng hạt nên hàng hạt ở
trên bắp luôn luôn chẵn.
Bắp ngô: Phát sinh từ mầm nách lá trên thân, số mầm nách lá trên cây
ngô nhiều, nhưng chỉ 1-3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp. Tuỳ thuộc vào giống, điều
kiện sinh thái, chăm bón, mật độ, mùa vụ… mà tỷ lệ cây 2-3 bắp, số hạt trên bắp, vị trí đóng
bắp, thời gian phun râu, trỗ cờ…có khác nhau.
Hạt ngô: Hạt được coi là cơ quan khởi đầu của cây. Thuộc loại quả dĩnh, gồm các bộ
phận chính là vỏ hạt, lớp alơron, phôi và nội nhũ, phía dưới của hạt có gốc hạt là phần dính liền

hạt với lõi ngô. Hạt ngô được hình thành gồm các giai đoạn: từ thụ phấn đến chín sữa là 10 –
15 ngày, từ chín sữa đến chín sáp là 15 – 20 ngày và từ chín sáp đến chín hoàn toàn là 10 – 15
ngày.
1.1.3. Yêu cầu sinh thái của cây ngô [17],[21]
1.1.3.1. Yêu cầu nhiệt độ
Ngô là cây trồng ưa khí hậu ẩm, nhiệt độ thích hợp vào khoảng 20
0
C - 28
0
C. Nhiệt
độ có thể ảnh hưởng đến thời gian sinh trưởng của cây ngô. Trong cả chu kỳ sống cũng
như trong từng thời kỳ sinh trưởng phát triển của cây ngô cần một lượng tích nhiệt nhất
định. Đủ lượng nhiệt cây mới sinh trưởng phát triển bình thường. Tùy vào từng giống
khác nhau mà cần một lượng nhiệt khác nhau. Giống càng chín muộn thì cần lượng tích
nhiệt càng cao.
1.1.3.2. Yêu cầu về ánh sáng
Ngô là cây có nguồn gốc nhiệt đới thuộc nhóm cây ngày ngắn. Ánh sáng là yếu tố
quan trọng cho sinh trưởng và phát triển của cây ngô, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tích
luỹ chất dinh dưỡng và ảnh hưởng đến độ dài của quá trình sinh trưởng. Trung bình cần 12
giờ chiếu sáng/ngày.
Nghiên cứu phản ứng của cây ngô với độ dài ngày cho thấy cây ngô hình thành các
kiểu hình thái khác nhau. D.Azit đã chỉ ra rằng: Các giống ngô ở châu Âu do kết quả chọn
lọc đã hoàn thành được chu kỳ ánh sáng trong điều kiện ngày dài, loại trừ được yêu cầu
ngày ngắn. Cuperman và Razumov cho rằng rút ngắn thời gian chiếu sáng ban ngày đến
12 giời sẽ thúc đẩy sự trổ cờ và hình thành bắp.
Ánh sáng ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây ngô ở hai mặt là số giờ chiếu sáng và
chất lượng ánh sáng. Những tia sáng dài đã kìm hãm sự sinh trưởng của cây ngô, các tia
sáng ngắn lại thúc đẩy sự phát triển. Nghiên cứu của Cuperman đã xác định thời gian
chiếu sáng và chất lượng ánh sáng đã gây ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của bắp và
bông cờ của cây ngô. Trong điều kiện chiếu sáng bằng ánh sáng trắng và xanh lam thì sự

phát triển của cây diễn ra nhanh nhất. Trong điều kiện chiếu sáng bằng ánh sáng đỏ thì sự
phát triển của bông cờ hầu như không bị ảnh hưởng nhưng sự hình thành của bắp chậm
lại. Ánh sáng lục kìm chế sự sinh trưởng và phát dục của bắp.
1.1.3.3. Yêu cầu về nước
5
Ngô là cây trồng cạn, bộ rễ ngô phát triển rất mạnh, hút nước khỏe và sử dụng tiết
kiệm nước. Cây ngô sinh trưởng nhanh tạo ra sinh khối lớn. Do vậy cây cần một lượng
nước rất lớn. Trung bình cây ngô trong một chu kỳ sống cần khoảng 200 lít nước để sinh
trưởng và phát triển. Ở các thời kì sinh trưởng khác nhau cây ngô yêu cầu lượng mưa và
lượng nước tưới khác nhau. Cây ngô không chịu được úng, độ ẩm của đất quá cao, lớn
hơn 80% có ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển của cây ngô, đặc biệt là từ lúc cây
mọc đến khi cây được 8 lá. Vào giai đoạn này chỉ cần ngập nước 1 – 2 ngày cây ngô cũng có
thể bị chết úng. Ẩm độ thích hợp khoảng 70%.
1.1.3.4. Yêu cầu về đất
Đất rất quan trọng trong sản xuất ngô, đất trồng ngô phải tơi xốp, nhiều mùn, hàm
lượng dinh dưỡng cao, dễ thoát nước, tầng canh tác dày, pH từ 6 – 7, thuận lợi cho việc
tưới nước vào mùa khô và tiêu nước vào mùa mưa. Hầu hết, ngô được trồng ở trên đất
cạn, không ngập nước, đất có thành phần cơ giới nhẹ, đất cát pha, trên các loại đất vụ
trước trồng các cây họ đậu, hoặc các cây phân xanh cải tạo đất.
1.1.3.5. Yêu cầu chế độ không khí trong đất
Để thu hoạch sản lượng ngô cao, ngoài việc cung cấp nước và dinh dưỡng còn phải chú
ý đến chế độ không khí ở trong đất. Chế độ không khí ảnh hưởng gián tiếp thông qua nhiều
khâu khác nhau như là vi sinh vật, quá trình biến đổi hóa học trong đất. Cây ngô đặc biệt là rễ
ngô phát triển tốt trong điều kiện háo khí, nếu đất chặt bí thiếu tơi xốp thì rễ ngô phát triển
kém, ăn nông, rễ ngắn ít lông hút, khả năng hút dinh dưỡng khoáng và nước kém. Dẫn đến tình
trạng cây ngô thiếu dinh dưỡng sẽ sinh trưởng, phát triển kém.
1.1.4. Vai trò các chất dinh dưỡng với cây ngô [17],[21]
1.1.4.1. Vai trò của đạm
Đạm là yếu tố dinh dưỡng quan trọng nhất, đóng vai trò tạo năng suất và chất
lượng của ngô, 66% đạm được tích luỹ trong hạt. Cây ngô hút đạm tăng dần từ khi cây có

3 – 4 lá tới trước trổ cờ. Ở nước ta, một số kết quả nghiên cứu cho thấy thời kỳ hút đạm
mạnh nhất là 6 – 12 lá và trước khi trổ cờ, nếu các giai đoạn này mà thiếu đạm thì năng
suất giảm rõ rệt.
Triệu chứng thiếu đạm ở ngô: cây thấp, lá nhỏ có màu vàng, các lá già có vệt xém
đỏ, cây sinh trưởng chậm, cằn cỗi, cờ ít, bắp nhỏ, năng suất thấp.
1.1.4.2. Vai trò của lân
Lân có vai trò quan trọng với cây ngô tuy nhiên khả năng hút lân ở giai đoạn cây
non lại rất yếu. Thời kỳ 3 – 4 lá, cây ngô hút không được nhiều lân, đó là thời kỳ khủng
hoảng lân của ngô, nếu thiếu lân trong giai đoạn này sẽ làm giảm năng suất nghiêm trọng.
Cây ngô hút nhiều lân nhất ( khoảng 62% tổng lượng lân yêu cầu) ở thời kỳ 6 – 12 lá sau
đó giảm đi ở các thời kỳ sau.
Triệu chứng thiếu lân của ngô biểu hiện bằng màu huyết dụ trên bẹ lá và gốc cây,
trái cong queo. Trường hợp thiếu nặng lá sẽ chuyển vàng và chết. Hiện tượng này xảy ra ở
lá già trước, sau đó chuyển sang lá non và phổ biến ở ngô vụ đông trong điều kiện thời tiết
khắc nghiệt.
1.1.4.3.Vai trò của kali
Kali có vai trò rất quan trọng tới sự sinh trưởng, phát triển và năng suất của ngô.
Kali tích luỹ nhiều ở thân, lá (khoảng 80%) và tích luỹ trong hạt ít hơn. Cây ngô hút kali
mạnh ngay từ giai đoạn sinh trưởng ban đầu. Từ khi cây mọc tới trổ cờ ngô đã hút khoảng
70% lượng kali cây cần.
6
Thiếu kali, protein và sắt sẽ tích tụ gây cản trở quá trình vận chuyển chất hữu cơ.
Thiếu kali là nguyên nhân rễ ngang phát triển mạnh, rễ ăn sâu kém phát triển, do đó cây
dễ đổ. Thiếu kali thể hiện ở các triệu chứng như chuyển nâu và khô dọc theo mép và chóp
lá, bắp nhỏ, nhiều hạt lép ở đầu bắp (bắp đuôi chuột) và năng suất thấp.
1.1.4.4.Vai trò các nguyên tố vi lượng
Đối với cây ngô, các chất vi lượng thường thiếu là kẽm và molypđen. Thiếu kẽm lá
có màu trắng (bệnh bạch tạng), giữa các gân lá có những dải màu vàng sáng, các lóng
ngắn lại. Hiện tượng thiếu kẽm thường xảy ra trên đất kiềm, nghèo mùn, đất giàu lân dễ
tiêu hay bón quá nhiều lân. Thiếu molypđen lá chuyển xanh nhạt, lá non teo lại và héo,

nặng hơn lá ngọn không bung ra được, có nhiều vết xém vàng.
1.1.5.Vai trò cây ngô trong nền kinh tế
Ngô làm lương thực cho con người: Ngô là cây lương thực nuôi sống gần 1/3 dân số
trên toàn thế giới, tất cả các nước trồng ngô nói chung đều ăn ngô ở mức độ khác nhau. Toàn
thế giới sử dụng 21% sản lượng ngô làm lương thực cho người. Các nước ở Trung Mỹ, Nam
Á và Châu Phi sử dụng ngô làm lương thực chính. Các nước Đông Nam Phi sử dụng 85% sản
lượng ngô làm lương thực cho người, Tây Trung Phi 80%, Bắc Phi 42%, Tây Á 27%, Nam Á
75%, Đông Nam Á và Thái Bình Dương 39%, Đông Á 30%, Trung Mỹ và các vùng Caribe
61% Nếu như ở Châu Âu khẩu phần ăn cơ bản là: bánh mỳ, khoai tây, sữa; Châu Á: cơm
(gạo), cá, rau xanh (canh) thì châu Mỹ La Tinh là bánh ngô, đậu đỗ và ớt. Vì vậy, trên phạm vi
thế giới, ngô vẫn còn là cây lương thực rất quan trọng, vì ngô rất phong
phú các chất dinh dưỡng hơn lúa mỳ và gạo. Ngô làm thức ăn gia súc: Ngô là thức ăn gia súc
quan trọng nhất hiện nay. Hầu như 70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp là từ ngô, điều đó phổ
biến trên toàn thế giới. Ngoài việc cung cấp chất tinh, cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua lí
tưởng cho đại gia súc. Những năm gần đây cây ngô còn là cây thực phẩm, người ta dùng bắp
ngô bao tử làm rau cao cấp. Sở dĩ, ngô rau được dùng vì nó sạch và có hàm lượng dinh dưỡng
cao. Các thể loại ngô nếp, ngô đường (ngô ngọt) được dùng làm thức ăn tươi (luộc, nướng)
hoặc đóng hộp làm thực phẩm xuất khẩu. Ngô là nguyên liệu chính cho các nhà máy thức ăn
gia súc tổng hợp, ngô còn là nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất rượu, tinh bột, bánh kẹo…
Người ta đã sản xuất ra các mặt hàng khác nhau cho các ngành công nghiệp lương thực - thực
phẩm, công nghiệp dược và công nghiệp nhẹ. Ngô cũng là hàng hoá xuất khẩu. Hàng năm
lượng ngô xuất khẩu khoảng 70 triệu tấn. Đó là nguồn lợi lớn của các nước xuất khẩu. Các
nước
xuất khẩu chính là Mỹ, Pháp, Argentina, Trung Quốc, Thái Lan. Các nước nhập chính là Nhật
Bản, Hàn Quốc, Liên Xô cũ, Châu Phi, Mexico… [9]. Ngô vừa là cây lương thực, vừa là cây
thức ăn cho gia súc. Chính vì vậy diện tích trồng ngô trên thế giới tăng không ngừng. Năm
1979 diện tích trồng ngô chỉ đạt khoảng 127 triệu ha với tổng sản lượng là 475,4 triệu tấn, đến
năm 2007 diện tích trồng ngô đạt 145,1 triệu ha với sản lượng 705,3 triệu tấn (theo số liệu
thống kê của FAO, 2008). Ở Việt Nam, cây ngô đã được trồng cách đây khoảng 300 năm và
được trồng trên những điều kiện sinh thái khác nhau của cả nước. ĐăkLak là vùng có sản

lượng bắp cao nhất nước đạt 622 nghìn tấn, kế đến là Sơn La, Đồng Nai với sản lượng lần lượt
là 506 và 305,3 nghìn tấn mỗi năm.
7
Nguồn: www.asiacreative.vn
Biểu đồ: 1.1 Sản lượng bắp của Việt Nam 2013
Hàm lượng chất dinh dưỡng của ngô tùy thuộc vào từng giống, đặc biệt là các giống
ngô nếp địa phương tuy năng suất không cao nhưng chất lượng của hạt ngô tốt phù hợp với thị
hiếu của người tiêu dùng.
1.2. Tổng quan về vi khuẩn cố định Nitơ (N )
1.2.1. Nitơ và quá trình cố định nitơ
Nitơ phân tử được cấu tạo từ 2 nguyên tử nitơ liên kết với nhau bằng liên kết III bền
vững N ≡ N. Nitơ trong khí quyển tồn tại dưới dạng khí N
2
và chiếm khoảng 79% thể tích
không khí. Mặc dù sống trong "đại dương nitơ" nhưng thực vật nói chung không có khả năng
đồng hóa trực tiếp được. N
2
là phân tử rất khó phản ứng với các phân tử khác để tạo thành hợp
chất. Liên kết N ≡ N có năng lượng liên kết rất lớn nên muốn xảy ra phản ứng giữa N
2
với các
nguyên tố khác thành các hợp chất vô cơ, trong kỹ thuật người ta phải dùng lượng năng lượng
rất cao. Trong khi đó nhóm vi khuẩn cố định nitơ có thể biến khí nitơ thành hợp chất đạm ở
các điều kiện bình thường về nhiệt độ và áp suất. Vậy cơ chế cố định của nó là như thế nào. Đó
là điều các nhà khoa học nghiên cứu trong lĩnh vực này hết sức quan tâm. Từ trước tới nay có
rất nhiều giả thiết về cơ chế của quá trình cố định đạm sinh học.
Đa số nhà nghiên cứu đều thống nhất cho rằng: Quá trình cố định nitơ sinh học là một
quá trình khử N
2
thành NH

3
dưới tác dụng của enzyme Nitrogenaza sinh ra bởi vi sinh vật
bằng phương trình:
Năm 1961 - 1962, người ta đã tách từ Clostridium pasteurrianum hai tiểu
phần hoạt hóa H
2
và N
2
. Sau này người ta tìm thấy ở Azotobacter có các tiểu phần, 1 phần
gồm protein và Fe, 1 thành phần gồm protein, Fe, Mo.
Nguồn H
2
để khử N
2
có thể là hydro phân tử (H
2
). Trong trường hợp này thì dưới tác
dụng của enzyme hydrogenase, điện tử được chuyền theo hệ thống.
8
Nguồn cho điện tử và hydro là acid pyruvic. Đáng chú ý là trong quá trình chuyền điện
tử có sự tham gia tích cực của feredocine (Fd). Fd là cầu nối giữa 2 hệ enzyme hydrogenase và
nitrogenase để cố định N2.
Sự cố định N
2
của vi khuẩn nốt sần có thể xảy ra theo sơ đồ phức tạp hơn. Trong các
nốt sần có một chất có bản chất hem rất giống với hemoglobin trong máu gọi là
leghemoglobin. Nó dễ liên kết với O
2
để biến thành oxyhemoglobin. Leghemoglobin chỉ được
tạo nên khi vi khuẩn sống cộng sinh với cây bộ đậu, còn khi nuôi cấy tinh khiết các Rhizobium

sẽ không tạo leghemoglobin và không cố định được N
2
.
Mối quan hệ giữa thực vật và vi khuẩn trong quá trình cố định nitơ cộng sinh có thể
biểu diễn bởi sơ đồ sau:
1.2.2. Vi khuẩn cố định N
Vi sinh vật cố định N có một vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn N
2
và cung
cấp một lượng N đáng kể cho cây trồng. Theo tính toán của các nhà khoa học, các nhóm vi
sinh vật cố định đạm BNF (Biological nitrogen fixation) có thể cung cấp tới 240 x 10
6
tấn
N/năm trên cả hành tinh, gấp 6 lần lượng N mà cả thế giới sản xuất bằng con đường hóa học.
Vi sinh vật cố định N là các nhóm vi sinh vật có khả năng chuyển hóa khí N
2
dồi dào
trong không khí (79%) thành dạng NH
4
+
cung cấp cho cây. Vi khuẩn cố định N gồm có hai
nhóm lớn:[7].
- Vi khuẩn cố định N tự do gồm:
+ Vi khuẩn cố định N tự do hiếu khí: Azotobacter và Beijerinskia sp.
+ Vi khuẩn cố định N kỵ khí: Vi khuẩn thuộc nhóm Clostridium.
9
- Vi khuẩn cố định N cộng sinh như cộng sinh với rễ cây họ đậu Rhizobium, cộng sinh
với rễ lúa Azoarcus,
1.2.2.1. Vi khuẩn cố định N tự do
1.2.2.2. Vi khuẩn cố định N tự do hiếu khí

Nhóm này gồm hai chi chính là Beijerinskia sp và Azotobacter sp.[7]
- Beijerinskia sp.
Được phân lập bởi Starkey (1939), là loại có đặc điểm giống với Azotobacter sp. Tế bào có
hình dạng thay đổi như hình cầu, hình que, hình bầu dục. Beijerinski là vi khuẩn gram âm,
không sinh bào tử. Có khả năng sống tốt trong môi trường axit ( pH=3). Vi khuẩn có khả năng
cố định được 16 - 20 mg N khi đồng hóa hết 1g dinh dưỡng Carbon. Ngoài khả năng cố định
N chúng còn có khả năng tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng cho cây trồng.
- Azotobacter sp.
Là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử có khả năng cố định N tự do. Khi chưa trưởng
thành tế bào thường có hình que, sinh sản bằng cách phân cắt, di chuyển nhờ tiêm mao. Khi
trưởng thành mất khả năng di chuyển, kích thước thu nhỏ thành dạng cầu được bao bọc bởi
một lớp nhầy.
Khuẩn lạc của Azotobacter có dạng cầu lồi, nhẵn bóng, có khi nhăn nheo. Các nòi phân
lập từ tự nhiên có khả năng cố định 10 - 15mg N khi tiêu thụ hết 1g dinh dưỡng Carbon. Một
số nòi tuyển chọn có khả năng cố định tới 30mg/1g dinh dưỡng Carbon.
Trong đất, Azotobacter tập trung ở vùng đất xung quanh rễ cây. Ngoài khả năng cung
cấp dinh dưỡng N cho cây nó còn có khả năng kích thích nảy mầm, kích thích sinh trưởng.
Trong đất, Azotobacter thường phổ biến các nòi sau:
+ Azotobacter chrococum: Kích thước tế bào 2,0 x 3,1 micromet, có khả năng di động
khi còn non. Khi già hình thành nang xác. Khuẩn lạc có màu nâu
hoặc đen khi về già, không khuếch tán ra môi trường.
+ Azotobacter beijerinckii: Có kích thước 2,4 x 4,6 micromet. Không có khả năng di
động và hình thành nang xác. Khuẩn lạc khi già có màu nâu sáng, sắc tố không khuếch tán ra
môi trưòng nuôi cấy.
+ Azotobacter vinelandii: Tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 micromet, có khả năng di
động và hình thành nang xác. Khuẩn lạc màu lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi
trường.
+ Azotobacter agilis: Tế bào có kích thước 2,8 x 3,3 micromet, có khả năng di động,
không hình thành nang xác, khuẩn lạc màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi
trường [7].

1.2.2.3. Vi khuẩn cố định N tự do kỵ khí Clostridium
Clostridium được phát hiện lần đầu tiên bởi Vinogradxki (1893). Vi khuẩn Clostridium
có kích thước 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 micromet, có thể đứng riêng rẽ hoặc kẹp đôi thành chuỗi
ngắn. Bào tử hình bầu dục, có khả năng chịu được nhiệt độ cao và khô hạn. Clostridium có
khả năng tích lũy được 10 - 15mg N phân tử khi đồng hóa hết 1g đường Carbon [7].
1.2.3. Vi khuẩn cố định N cộng sinh
1.2.3.1. Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ Đậu
Vi khuẩn cố định N cộng sinh với cây họ đậu còn gọi là vi khuẩn nốt sần. Chúng hình
thành các nốt sần với rễ cây họ đậu như cây đậu tương, lạc, điền thanh, muồng, cốt khí, trinh
10
nữ, chúng sử dụng dinh dưỡng carbon của cây và cố định N không khí để sử dụng và cung
cấp một phần cho cây chủ.
Gồm có: Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium và Sinorhizobium[11].
- Rhizobium
Năm 1868, nhà khoa học Hà Lan M.W.Beijrinck đã phân lập được loài vi khuẩn sống
cộng sinh trong nốt sần ở rễ một cây thuộc bộ đậu, ông đã đặt tên là Basilusradicicola.
Năm 1889, vi khuẩn này được xếp vào chi Rhizobium ( B.Frank, 1989). Trên môi
trường đặc, chúng có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy, khi còn non có khả năng di động nhờ tiêm
mao, khi tế bào già trở nên bất động.
Rhizobium thuộc loại hảo khí ưa pH trung tính hoặc kiềm ( pH từ 6,5 - 7,5), nhiệt độ
thích hợp 24 – 26
0
C. Chúng xâm nhiễm vào rễ cây bộ đậu thông qua lông hút, đôi khi qua vết
thương ở vỏ rễ. Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn, rễ tiết ra enzyme polyalacturonase phân huỷ
thành lông hút tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào rễ. Theo tính toán của các nhà khoa
học nhóm vi khuẩn này có khả năng cung cấp cho cây 80 -120kg N/ ha.
- Bradyrhizobium
Vi khuẩn hình que, kích thước trung bình 0,5 - 0,9 x 1,2 - 3,0 µm, thường chứa chất dự
trữ PHB. Trên môi trường đặc, khuẩn lạc của chúng có dạng trơn, bóng, nhầy, không màu.
Bradyrhizobium là vi khuẩn hiếu khí, tuy nhiên chúng có thể phát triển được ngay

trong trường hợp chỉ có một áp lực oxy rất thấp khoảng 0,001atm. Chúng phát triển thích hợp
ở pH= 6,5 - 7,5. Nhiệt độ phát triển thích hợp là 24 – 26
0
C, nhiệt độ 37
0
C sự phát triển của
chúng bị cản trở một cách rõ rệt.
- Azorhizobium
Azorhizobium Là một giống mới được đề nghị với một loài là Azorhizobium
caulinodans chính là các vi khuẩn cộng sinh ở rễ và thân của Sesbania rostrata
- Sinorhizobium
Gồm các vi khuẩn phát triển nhanh, cộng sinh ở nốt rễ cây đậu nành được phân lập từ
Trung Quốc. Giống Sinorhizobium gồm có 2 loài là Sinorhizobium fredii và Sinorhizobium
xinjiangensis.
1.2.3.2. Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây không thuộc họ đậu
- Vi khuẩn lam (Cyanobacteria): Một số vi khuẩn lam tự dưỡng đạm hay thanh tảo
sống chung với nhiều vi sinh vật chân hạch, từ các loại nấm cho đến các thực vật hạt kín [7].
- Azospirillum
Phát hiện năm 1974, là vi khuẩn Gram âm có dạng xoắn, sống tự do, đường kính 1µm,
dài 2,1 - 3,8µm chuyển động trong môi trường lỏng bởi một tiêm mao dài ở đầu ( polan
flagellum), trong môi trường đặc ở 30
0
C nhiều tiêm mao bên (lateral flagellum) ngắn hơn cũng
được thành lập.
Trong những năm gần đây người ta phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn này sống ở trong
vùng rễ, trong rễ cây, thân cây và lá các cây không thuộc họ đậu như lúa, bắp, mía, sorghum,
và một số loại cỏ.
Azospirillum giúp tăng năng suất lúa từ 32 - 81% ở điều kiện nhà lưới (Mirza và ctv,
2000; Malik và ctv, 2002). Nhưng ở điều kiện ngoài đồng vi khuẩn nầy chỉ làm tăng năng suất
lúa được 10 - 30% [11].

Azospirillum tăng sinh ở cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí với sự hiện diện hoặc
không có hợp chất nitơ trong môi trường, nhưng thích hợp là vi hiếu khí. Nhiệt độ tối hảo từ 35
- 37
0
C. Một số dòng Azospirillum là những vi sinh vật tự dưỡng không bắt buộc. Vi khuẩn
Azospirillum phát triển tốt trên muối của những acid hữu cơ như malate, succinate, hay
11
pyruvate. Fructore và những đường đôi khác cũng có thể được vi khuẩn sử dụng như là nguồn
carbon . Một số dòng Azospirillum cần biotin cho sự phát triển của chúng [7], [11].
Ngoài khả năng cố định nitơ chúng còn có khả năng khử nitrat, chống lại vi khuẩn gây
bệnh thối lá ở cây dâu tằm. Theo Eckert (2001) chi Azospirillum có 7 loài là: A. brasilense; A.
lipoferum ; A. amazonense; A. irakense; A. halopraeferens; A. largimobile và A.
doebereineae [35].
Một số báo cáo gần đây cho thấy vi khuẩn này có thể tiết ra những kích thích tố tăng
trưởng như: IAA (Indole - 3 - acetic acid), IBA (Indole - 3 - butyric acid), ABA (abscisic acid)
và cytokynins. Những kích thích tố đó làm tăng chiều dài rễ, tăng thể tích rễ và số lượng rễ. Từ
đó, chúng làm tăng khả năng hấp thu khoáng chất và nước, tăng khả năng sinh trưởng và phát
triển cũng như tăng năng suất của cây. Ngoài ra, chúng còn giúp cho cây chống chịu được điều
kiện khô hạn.
- Gluconacetobacter diazotrophicus [11].
Năm 1988, được Cavalcante V. A và Dobereiner J phân lập lần đầu tiên từ rễ và thân
cây mía trồng ở nhiều khu vực khác nhau trên khắp Brazil.
G. diazotrophicus là vi khuẩn Gram âm; ưa acid; vi hiếu khí bắt buộc; tế bào dạng que
thẳng tròn đầu ( 0,7 - 0,9µm đến khoảng 1 - 2µm) tồn tại ở dạng đơn, đôi hoặc chuỗi mà
không có nội bào tử; sử dụng đường (glucose, fructose, sucrose…) ở nồng độ khác nhau làm
nguồn C nhưng tăng trưởng tốt nhất là ở nồng độ sucrose 10% và pH = 5,5.
G. diazotrophicus có khả năng cố định đạm và sản xuất ra hormone thực vật ( auxin,
gibberellin), có thể hoà tan Zn và phosphorus nên G. diazotrophicus được xem là một loài vi
khuẩn đầy hứa hẹn, với khả năng cung cấp gần một nửa nitơ cố định được ở dạng hữu ích cho
cây [11].

- Herbaspirillum [11].
Herbaspirillum là các vi khuẩn hình que, Gram âm, rộng khoảng 0,5 - 0,6µm. Chúng
sinh trưởng tốt trong môi trường có dicarboxylic và tổng hợp nitơ trong một khoảng pH biến
thiên từ 5,3 - 8. Trong môi trường bán đặc vi khuẩn Herbaspirillum tạo thành một lớp màng
mỏng, trắng, mịn ( pellicle). Khi cấy chuyển lên môi trường đặc Nfb thì lớp màng này phát
triển thành khuẩn lạc nhỏ, ẩm, ánh xanh và trên môi trường đặc BMS thu được khuẩn lạc màu
trắng sữa.
Herbaspirillum có khả năng cố định đạm cộng sinh trong mô của những cây thân cỏ
như: Lúa, bắp, mía, sorghum, chuối và khóm. Ngoài ra chúng còn tạo ra những sản phẩm của
phytohormones như auxins và gibberillins rất tốt cho sự tăng trưởng của cây.
- Burkholderia [11].
Vi khuẩn Burkholderia thuộc vi khuẩn Gram âm, có hình dạng hình que, đường kính
khoảng 1µm, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu (Jesús et al, 2004).
Burkholderia sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, nhưng trong môi
trường ít khí oxy thì phát triển tốt nhất, chúng phát triển sâu trong môi trường nuôi cấy từ 1 -
4mm (Paulina et al, 2001). Trong môi trường nuôi cấy chúng tạo thành các khuẩn lạc màu
trắng hoặc hơi vàng, đường kính khoảng 2 - 4mm, tròn, phẳng hoặc dài (Jesús et al, 2004).
Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định đạm.Ví dụ như khi các vi
khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây luá sẽ cố định đạm khoảng 19% tổng lượng đạm
cần thiết cho nhu cầu của cây lúa. Năng suất của cây lúa có chủng loài Burkholderia
vietnamiensis tương đương với năng suất của cây lúa không chủng loài Burkholderia
vietnamiensis nhưng có bón phân đạm 25 - 30kg/ha (Van et al, 2000).
Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia kuruiensis
12
Vi khuẩn Burkholderia vietnamiensis và Burkholderia kuruiensis có dạng que ngắn,
một số có dạng que dài và tất cả đều có khả năng chuyển động nhờ chiêm mao (Lương Thị
Phương Thảo, 2010). Những đặc điểm trên cũng là những đặc điểm nổi bật của hình dạng
Pseudomonas cố định đạm. Đa số các dòng Burkholderia có khuẩn lạc màu trắng đục, dạng
tròn, có độ nổi mô, bìa nguyên, một số khuẩn lạc có màu vàng, bìa răng cưa, kích thước khuẩn
lạc từ 0.5–1.5 mm. (Nguyển Thị Minh Thư, 2010) Burkholderia vietnamiensis được tìm thấy

ở rễ bắp, lúa và cà phê (Estrada et al., 2001). Loài Burkholderia vietnamiensis được tìm thấy ở
rễ cây lúa trồng ở miền nam Việt Nam, thí nghiệm ở cây lúa chủng Burkholderia
vietnamiensis sau 14 ngày chúng giúp tăng khả năng đâm chồi 33%, rễ tăng 57% diện tích lá
tăng 30% năng xuất lúa tăng 13-22% (La Nguyễn Tường Vi, 2010). Tiến hành chủng vi khuẩn
Herpaspirillum seropedicae và giống vi khuẩn Burkholderia vào cây lúa, kết quả cho thấy vi
khuẩn có khả năng cố định đạm khoảng 19% tổng số đạm cần thiết cho cây (Vera et al., 2000).
Burkholderia cenocepacia
Burkholderia cenocepacia là một trong 9 loài của các phức Burkholderia cepacia đã
được đánh và khẳng định là một trong số những vi sinh vật đa năng trao đổi chất được biết
đến nhiều nhất, đang phát triển trên hơn 200 hợp chất hữu cơ, sửa chữa N
2
và mang nhiều
kháng sinh. Những ngiên cứu khảo sát khả năng cố định đạm của Burkholderia cho thấy khi
chúng sống cộng sinh trong cây bắp trồng ở Mexico cố định đạm tốt như ở cây mía trồng ở
Brazil và Nam Phi (Reis et al., 2004).
Pseudomonas[11],[22],[34],[35],[36]
Pseudomonas là một chi lớn có nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất nông nghiệp.
Trong vô số các ứng dụng đó thì khả năng cố định đạm của giống Pseudomonas đã được
khẳng định từ năm 1994 (Chan et al.,1994). Cố định đạm sinh học trên làm tăng đạm tổng số
lên 20 - 25% (Dobereiner, 1992).[32]
Theo nghiên cứu của Kapoor khi phối hợp chủng Azotobacter sp với các chủng phân
giải phosphat như Bacillus sp, Pseudomonas sp. Thí nghiệm làm tăng năng suất lúa, bông vải
lên 10-20% [32].
Sandhya V và cộng sự đã phân lập được Pseudomonas entomophila trên các loại cây
trồng tại các vùng đất khô cằn ở Ấn Độ qua nghiên cứu khảo nghiệm thì chủng này có khả
năng sản xuất các phytohormon (IAA, GA, cytokinin), phân giải Phosphat khó tan ngoài ra
chúng còn có tiềm năng lớn trong việc nghiên cứu kiểm soát sinh học để tạo ra thuốc trừ sâu
sinh học hiệu quả mà không gây ảnh hưởng đến môi trường [40].
1.3. Tình hình nghiên cứu ngoài nuớc.
Năm 1986 phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức được đặt tên là

Nitragen, đây là loại phân được chế tạo bởi vi khuẩn Rhizolium do Bijerink phân lập năm
1988. Từ đó đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm ứng dụng và mở rộng việc
sản xuất các loại phân bón vi sinh vật cố định N
2
mà thành phần còn được bổ sung phối hợp
thêm một số chủng vi sinh vật có ích khác ví dụ như xạ khuẩn cố định N sống tự do Frankia
spp, các vi khuẩn cố định N sống tự do Clostridium, Pasterium, Beijerinkiaindica
Hiệu quả của việc nhiễm chế phẩm Azotobacter sp cho đất và hạt giống, cây con đã
được chứng minh trên các thí nghiệm đồng ruộng. Theo nghiên cứu của Puneet (1998) cho
thấy việc nhiễm Azotobacter sp kích thích nẩy mầm của hạt, kích thích ra rễ và sinh trưởng,
năng suất lúa mì, ngô tăng 10-15% so với đối chứng [30].
Tổng kết các kết quả nghiên cứu của Nhật Bản, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Ấn Độ cho thấy
sử dụng chế phẩm Azotobacter có thể cung cấp cho cây trồng từ 30-60 kg N/ha/năm và tổng
13
lượng N do vi sinh vật tổng hợp trên hành tinh có thể đạt đến 240 triệu tấn/năm. Vi khuẩn cố
định N tự do Azotobacter còn có khả năng tổng hợp B1, giberellin, cytokinin kích thích tăng
trưởng cây trồng [33].
Fulchieri (1993) nghiên cứu sử dụng 3 chủng Azospirillum để xử lý hạt cho ngô. Kết
quả cho thấy đã làm tăng chiều cao cây, tăng sinh khối và tăng năng suất ngô lên 59% so với
đối chứng, các chủng này có thể cung cấp khoảng 60 kg N/ha [35].
Nghiên cứu của Puneet (1998) cũng cho thấy nếu bón phối hợp Azotobacter sp. với các
chủng phân giải P như Aspergillus niger sẽ làm tăng năng suất lúa mì tăng 17,7%, trong khi
Azotobacter chỉ tăng 9% . Kapoor cũng cho kết quả tương tự khi phối hợp chủng Azotobacter
sp với các chủng phân giải phosphat như Bacillus sp, Pseudomonas sp. Thí nghiệm làm tăng
năng suất lúa, bông vải lên 10-20% [35].
El-Komy (2005) nghiên cứu phối hợp hai chủng cố định N Azospirillum và phân giải
lân Bacillus megaterium xử lý cho lúa mì. Kết quả cho thấy hàm lượng N trong thân lúa mì
của các thí nghiệm có xử lý hai chủng này tăng 37-53%; hàm lượng P trong thân tăng 48,6%;
hàm lượng K tăng 10-14,3% so với đối chứng không xử lý. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy
xử lý phối hợp hai chủng có tác dụng cộng hưởng, tốt hơn xử lý đơn chủng [34].

Zemrany (2006) nghiên cứu sử dụng chủng A. lipoferum cho ngô. Kết quả cho thấy khi
sử dụng chủng này đã làm giảm 50% lượng N cho cây mà năng suất ngô vẫn đảm bảo [33].
Abbas Akbari và cộng sự (2007) đã phân lập và tuyển chọn được một số chủng
Azospirillum sp có khả năng sinh tổng hợp IAA kích thích sinh trưởng của cây lúa mì. Kết quả
là sự nhiễm các chủng Azospirillum ssp đã làm tăng đường kính gốc lúa, chiều dài rễ, trọng
lượng khô và số lượng lông rễ so với đối chứng [27].
Elazar Fallik and Yaacov Okon ( 1996) nghiên cứu sử dụng Azospirillum brasilense
kết hợp với than bùn cho Setaria italica và ngô. Kết quả cho thấy chiều dài thân, trọng lượng
khô, năng suất tăng đáng kể. Sinh khối vi khuẩn là 10
8
CFU/1g than bùn có hiệu quả gây
nhiễm hạt giống cao nhất [24].
Fabricio Cassa´n và cộng sự ( 2009) đã nghiên cứu phối hợp hai chủng Azospirillum
brasilense Az39 và Bradyrhizobium japonicum E109 xử lí cho ngô và đậu tương. Kết quả
cho thấy xử lí phối hợp hai chủng cho hiệu quả cao hơn so với xử lí đơn chủng. Tỉ lệ nảy mầm,
chiều cao cây, chiều dài rễ, trong lượng khô đều tăng so với đối chứng [25].
Andres D. Naiman và cộng sự ( 2009) đã nghiên cứu xử lý gây nhiễm vi khuẩn
Azospirillum brasilense và Pseudomonas fluorescens cho lúa mì. Kết quả cho thấy chiều cao
cây tăng 12%, đường kính gốc thân tăng 40%, năng suất tăng 16% [23 ].
1.4. Nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, phân vi sinh vật cố định đạm ở cây họ đậu và phân vi sinh vật phân giải
lân đã được nghiên cứu từ năm 1960. Đến năm 1987, phân Nitragin trên nền đất mang than
bùn mới được hoàn thiện. Đến 1991 đã có hơn 10 đơn vị trong cả nước tập trung nghiên cứu
phân vi sinh vật. Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều chủng vi sinh vật cố định đạm và
một số vi sinh vật phân giải lân.
Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững và ứng dụng CNSH vào
nông nghiệp, trong những năm gần đây Việt Nam có khá nhiều nghiên cứu về Azotobacter và
Azospirillum và các vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm khác làm phân sinh học.
14
Phạm Bích Hiên và cộng sự ( 2003) đã nghiên cứu 10 chủng Azotobacter của Việt

Nam và nhận thấy rằng ngoài khả năng cố định N chúng còn có khả năng sinh tổng hợp chất
kích thích sinh trưởng IAA. Nhiệt độ thích hợp của các chủng này là 25-30
0
C, pH thích nghi
rộng từ 5,5- 8,0 [10].
Nguyễn Hữu Hiệp, Renato đã phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh để sản xuất phân vi
sinh ở quy mô phòng thí nghiệm cho cây mía trồng tại tỉnh Sóc Trăng”. Cao Ngọc Điệp,
Nguyễn Văn Mít cũng nghiên cứu hiệu quả phân vi khuẩn Gluconacetorbacter
diazotrophycus và vi khuẩn Pseudomonas stusderi trên năng suất và trữ lượng đường trên cây
mía (Saccharum officinarumL.) trồng trên đất phù sa tỉnh Hậu Giang”. Trần Thanh Phong
(2012) cũng nghiên cứu đánh giá khả năng cố định đạm của vi khuẩn nội sinh đến năng suất
và chất lượng của trái khóm trồng tại Huyện Tân Phước, Tỉnh Tiền Giang” [12].
Phạm Ngọc Lan (1999) đã phân lập được 37 chủng Azotobacter trên đất gò đồi vùng
Thừa Thiên - Huế. Nhóm nghiên cứu cũng tuyển chọn được hai chủng có khả năng kháng
kháng sinh, tồn tại được ở pH kiềm ( pH = 8). Kết quả thử nghiệm gây nhiễm cây giống keo
tai tượng trong vườn ươm đã làm tăng tỷ lệ sống, sinh khối, chiều cao cây và hàm lượng N
trong lá cũng cao hơn so với đối chứng [14].
Nguyễn Thị Phương Chi (1999) nghiên cứu bón thử nghiệm chủng cố định N tự do
Azotobacter và chủng phân giải phosphate Archomobacter, Pseudomonas aeruginosa. Kết
quả cho thấy chế phẩm sinh học làm tăng sinh trưởng chiều cao mạ 7,47 - 16,93% và năng
suất lúa tăng từ 13,39 – 55,85% [3].
Lâm Minh Tú, Trần Văn Tuân (2003) nghiên cứu sản xuất một số phân bón đơn
chủng, đa chủng cho cây trồng. Các chủng sử dụng trong nghiên cứu là Azotobacter
bejerinski, Azotobacter vinelandii, Bacillus subtilis, Bacillus polymyxa. Thử nghiệm trên khoai
tây làm tăng năng suất từ 100 - 300% so với đối chứng [19].
Phạm Văn Toản (2003) sử dụng phân bón sinh học giảm được 20% phân bón vô cơ N,
P, K nhưng năng suất khoai tây vẫn tăng so với đối chứng 15-50%, cà chua tăng 12-34%, lạc
tăng 30% và giảm đáng kể bệnh héo xanh [18].
Nguyễn Ngọc Dũng, Hồ Thị Kim Anh (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng cố
định N trong rễ lúa đến sinh trưởng của mầm lúa CR 203. Nhóm tác giả đã phân lập được 78

chủng cộng sinh với rễ lúa. Các chủng này có đặc điểm của chi Azospirillum. Các chủng này
kích thích sự nảy mầm và rễ của lúa CR 203 [1].
Lăng Ngọc Dậu (2004) đã nghiên cứu khả năng tạo IAA của vi khuẩn Azospirillum
lipoferum, tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn này trên môi trường Nfb có bổ sung Tryptophan,
theo dõi tại những thời điểm khác nhau. Kết quả cho thấy tại thời điểm 10 ngày sau khi cấy ủ
khả năng tao IAA cao nhất [4].
Ngô Thanh Phong, Cao Ngọc Diệp (2012) đã nghiên cứu xác định mức độ cố định
đạm sinh học của Burkholderia sp. KG1 và Pseudomonas sp. BT1 trên cây lúa cao sản
OM2517 trồng ngoài đồng. Kết quả 2 chủng này có thể thay thế 25 - 50% N cho năng xuất cao
hơn đối chứng khi bón 100%N mà không nhiễm vi khuẩn.
Nguyễn Anh Dũng và cộng sự (2010), đã phân và xác định mức độ cố định đạm sinh
học của Azospirillum trên cây ngô trong bầu đất tại Đăk Nông. Kết quả chủng này có thể thay
thế 25 – 50% N cho năng xuất cao hơn đối chứng khi bón 100%N mà không nhiễm vi khuẩn
[6].
15
PHẦN II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu của đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:
Phân lập, mô tả đặc điểm sinh học và định danh bằng sinh học phân tử một số chủng vi
khuẩn cố định đạm cộng sinh trong rễ cây ngô.
Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm bằng nghiên cứu thử
nghiệm trên cây ngô.
Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng vi khuẩn nội sinh được
tuyển chọn.
2.2 Vật liệu và địa điểm nghiên cứu
2.2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
* Vật liệu:
- Các chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh được phân lập từ rễ cây ngô trong giai đoạn
trổ cờ tại huyện Ea Súp, Buôn Ma Thuột, Krông Năng thuộc tỉnh Đăk Lăk.
- Giống ngô lai Giống DK-888 là một giống lai đơn do tập đoàn Charoen - Pokphand

của Thái Lan sản xuất.
* Hóa chất: Acid Malic, KH
2
PO
4
, Na
2
MoO
4
, CuSO
4
, ZnSO
4
, Saccarose, Agar, Biotin,
Pyridoxine
* Thiết bị nghiên cứu: Đĩa petri, micropipette, que cấy, box cấy vô trùng, máy quang
phổ spectrophotometer Plus 100 (Nhật Bản), máy ủ nhiệt, nồi hấp khử trùng, PCR C1000
(Biorad, Mỹ); GelDoc (Biorad, Mỹ); Điện di Biorad (Mỹ).
2.2.2 Địa điểm nghiên cứu.
- Địa điểm thu mẫu: Được thực hiện tại các huyện Ea Súp, Krông Năng, Krông Păk
thuộc tỉnh Đăk Lăk.
- Địa điểm thí nghiệm: Được thực hiện tại viện CNSH & MT, Trường Đại học Tây
Nguyên.
- Địa điểm thực nghiệm: Tại xã Ea Rôk – Huyện Ea Súp – Tỉnh Đăk Lăk.
2.2.3 Thời gian nghiên cứu.
Đề tài thực hiện từ tháng 08/2012 tới tháng 08/2013.
2.3 Phương pháp nghiên cứu.
2.3.1 Phương pháp thu mẫu.
Thu thập một cách ngẫu nhiên rễ cây ngô trong giai đoạn trổ cờ thuộc các giống khác
nhau, trên các nền đất khác nhau, mỗi ruộng lấy 5 cây (4 cây ở 4 góc và 1 cây ở giữa ruộng) tại

các huyện Ea Súp, Krông Năng, thành phố BMT tỉnh Đăk Lăk.
Toàn bộ bộ rễ được đựng trong túi nilon đã khử trùng. Các mẫu sau khi lấy được ghi
nhãn nơi lấy, ngày lấy và người thu mẫu. Mẫu rễ cây ngô sau khi thu được đem tới phòng thí
nghiệm, rửa thật sạch đất bám ở rễ dưới vòi nước chảy, để ráo tự nhiên, để riêng từng mẫu rồi
tiến hành phân lập hoặc bọc riêng từng mẫu trong túi nilon đã khử trùng buộc chặt và bảo
quản trong tủ lạnh (5
0
C) nếu chưa phân lập ngay [7], [20].
2.3.2 Phương pháp phân lập
Cắt rễ thành những khúc nhỏ 2 - 3cm. Các mẫu rễ được để riêng trong các bình tam
giác tiến hành khử trùng bề mặt. Rễ được khử trùng bằng dung dịch chloromine 1% trong 30
16
phút, tiếp tục khử trùng bằng cồn 70
0
5 phút, H
2
O
2
3 phút rồi rửa thật sạch bằng nước cất vô
trùng (6 lần). Sau đó lấy khoảng 2g mẫu cho vào cối giã nhuyễn rồi thêm 0,5 - 2ml nước cất
vô trùng vào cối, để yên 10 phút và hút lấy phần trong cho vào eppendorf, để yên 10 phút cho
dịch mẫu lắng xuống và lấy phần nước trong để tiến hành phân lập. Lấy 0,5ml dịch nghiền rễ
cho vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường NFb bán đặc (không đạm). Ủ ở nhiệt độ 32
0
C trong
vòng 4 - 5 ngày, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Quan sát những ống nghiệm có vòng đậm (vòng pellicle), cách bề mặt môi trường 2 –
5 mm chỉ thị có sự hiện diện của vi khuẩn cố định đạm nội sinh. Chuyển vi khuẩn từ môi
trường bán đặc sang môi trường đặc tiến hành làm thuần giống [20].
Làm thuần giống: Cấy ria các khuẩn lạc được lựa chọn lên các đĩa petri chứa môi

trường Nfb đặc để thu khuẩn lạc đơn. Quá trình làm thuần được tiến hành 2 - 3 lần. Chọn
khuẩn lạc đơn đã được làm thuần cấy chuyền vào ống thạch nghiêng để giữ giống [6],[7],[20].
* Môi trường Nfb không đạm: [6], [32].
- Acid Malic: 5g
- K
2
HPO
4
: 0,5g
- MgSO
4
.7H
2
O: 0,2g
- NaCl: 0,1g
- CaCl
2
: 0,02g
- KOH: 4g
- 1 ml dung dịch stock vitamin (10 mg biotin và 20mg pyridoxine trong 100 ml nước
cất).
- 2ml dung dịch vi lượng (200mg Na
2
MoO
4
.2H
2
O, 235mg MnSO
4
.H

2
O, 280 mg
H
3
BO
3
, 8 mg CuSO
4
.5H
2
O, 24 mg ZnSO
4
.7H
2
O hòa tan trong 200 ml nước cất).
- Agar: 1,75 g/ lít
- 2ml Bromthymol blue 0,5%
- Thêm nước cất vừa đủ 1 lít.
- pH điều chỉnh đến 6,8.
* Môi trường đặc có chứa 15g/lít agar (Dobreigner, 1995)
2.3.3 Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn
cố định đạm nội sinh.
Mô tả các đặc điểm hình thái của các chủng dưới kính hiển vi, xác định đặc điểm sinh
học và định danh theo khoá phân loại của Bergey 1994.
2.3.3.1. Phương pháp nhuộm gram.
Nhuộm gram bằng bộ kit nhuộm: Crystol Violet, Lugol, ethanol 95%, dung dịch
safanin 0,5%, nước cất.
2.3.3.2. Phương pháp đo kích thước tế bào vi khuẩn.
Kích thước vi khuẩn được đo trên kính hiển vi điện tử có thị kính ×10, vật kính
×40.

Quan sát vào kính hiển vi ta thấy có 5 khoảng chia của thước đo vật kính (tức
50 µm) nằm gọn vào 20 khoảng chia của thước đo thị kính, vậy mỗi khoảng chia của
thước đo thị kính với độ phóng đại đang dùng là 2,5 µm.
Tiến hành đo kích thước theo trình tự sau.
+ Bước 1: Đặt tiêu bản có vi sinh vật cần đo lên bàn kính. Điều chỉnh bàn kính
sao cho thấy rõ tế bào vi sinh vật và thước đo thị kính.
17
+ Bước 2: Điều chỉnh bàn kính sao cho tế bào vi sinh vật nằm gọn và dọc theo
thước đo thị kính.
+ Bước 3: Đếm số khoảng mà tế bào vi sinh vật choán chỗ.
+ Bước 4: Tính kết quả (Ví dụ: Chiều dài tế bào vi khuẩn nằm đúng vào 1
khoảng của thước đo thị kính, tức là (2,5 × 1 = 2,5 µm).
2.3.4 Phương pháp xác định khả năng tạo IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh trong rễ
cây ngô.
Đánh giá khả năng tạo IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh dựa trên nồng độ IAA có
trong dich chiết từ dịch nuôi cấy vi khuẩn. Nồng độ IAA có trong dịch chiết càng cao chứng tỏ
khả năng tạo IAA của chủng vi khuẩn càng mạnh. Nồng độ IAA được xác định bằng phương
pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm.
* Phương pháp xác định phương trình đường chuẩn của mối tương quan giữa chỉ số
OD
530nm
và nồng độ IAA.
- Chuẩn bị dung dịch đệm phosphat ( 200ml)
A: KH
2
PO
4
0,136g/100ml nước cất;
B: K
2

HPO
4
0,174g/100ml nước cất;
Lấy 39ml A + 61ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, điều chỉnh pH 7.
- Chuẩn bị thuốc thử Salkowski
Lấy 553 ml H
2
SO
4
(98%) cho vào nước cất đủ 1 lít, để nguội sau 12 giờ được dung
dịch H
2
SO
4
đậm đặc 10,8M.
Cân 4,5g FeCl
3
cho vào 1 lít H
2
SO
4
10,8M đã pha ở trên để được thuốc thử Salkowski.
- Chuẩn bị đường chuẩn IAA
Cân 1,6 mg IAA tổng hợp hòa tan với 10 ml dung dịch đệm phosphat được nồng độ là
160mg/l. Sau đó tiến hành pha loãng ra các nồng độ 0, 5, 10, 16, 20, 40, 80 mg/l.
Lấy 4 ml thuốc thử cho vào các ống nghiệm có nồng độ IAA khác nhau có thể tích 2
ml, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần.
Để 10 phút trong tối ở nhiệt độ phòng để phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó tiến hành
đo OD ở bước sóng 530 nm.
Từ kết quả trên, chúng tôi xác định được phương trình đường chuẩn của dung dịch

IAA thông qua chỉ số OD
530nm
. Dựa vào phương trình đường chuẩn để xác định nồng độ IAA (
mg/l) do các vi khuẩn tạo ra có trong môi trường nuôi cấy.
Bảng nồng độ IAA thành lập đồ thị đường chuẩn
Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6
Thể tích IAA 160 mg/l 0 0,0625 0,125 0,25 0,50 1,0
Dung dịch đệm (ml) 2 1,9375 1,875 1,75 1,50 1,0
Tổng thể tích 2 2 2 2 2 2
Nồng độ IAA (mg/l) 0 5 10 20 40 80
Thuốc thử Salkowski 4 4 4 4 4 4
OD
530nm
Thực hiện nuôi cấy các chủng vi khuẩn phân lập được trên môi trường chiết khoai tây
(BMS). Chuẩn bị môi trường lỏng trong các bình tam giác, mỗi bình chứa 50ml dịch môi
trường, hấp khử trùng, để nguội. Tiến hành cấy các chủng vi khuẩn vào các bình tam giác
chứa môi trường đã khử trùng. Nuôi ở nhiệt độ phòng, trên máy lắc xoay vòng 150 vòng/phút.
Sau 60h thu dịch nuôi cấy và li tâm 8000 vòng/phút, li tâm 4 phút, lấy dịch trong để đo lượng
18
IAA được vi khuẩn tổng hợp và tiết ra môi trường bằng phương pháp so màu Salkowski ở
bước sóng 530 nm, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.3.5. Phương pháp xác định khả năng cố định N của các chủng vi khuẩn
Đánh giá hoạt tính cố định đạm của các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được dựa
trên N

tổng số có trong lá và các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô. N tổng số có trong lá và các
chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô của các lô thực nghiệm càng cao hơn so với lô đối chứng,
chứng tỏ hoạt tính cố định đạm của chủng vi khuẩn càng mạnh.
* Phương pháp thí nghiệm: Hạt ngô lai DK - 888 được khử trùng bằng H
2

O
2
3%
trong 3 phút, rửa lại 4 lần với nước cất. Sau đó, cho hạt vào đĩa petri có bông đã được khử
trùng, với một ít nước và ủ cho tới khi hạt nứt mộng chuẩn bị nảy mầm. Rửa sạch hạt bằng
nước cất. Vi khuẩn cố định đạm được nuôi trong ống nghiệm sau 48hh lấy dịch sinh khối tế
bào cho hạt ngô vào và ngâm 15 phút. Sau đó đem gieo 1 hạt/bầu đất. Loại đất đóng bầu là
đất vàng nhạt trên đá cát trắng chỉ lấy lớp đất mặt, mỗi bầu đóng khoảng 5 kg đất. Mỗi
chủng vi khuẩn 1 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 10 bầu đất, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Nghiệm thức 1: Đối chứng không bón phân, không nhiễm vi khuẩn
Nghiệm thức 2: Không bón phân, nhiễm các chủng vi khuẩn cố định đạm phân lập
được.
Các chỉ tiêu theo dõi cây ngô sau khi gieo 45 ngày: Chiều cao cây, số lá trên cây,
chiều dài lá, đường kính gốc, chiều dài rễ, khối lượng tươi, khô.
Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm:
- Chiều cao cây (cm), số lá trên cây, chiều dài lá (cm), đo từ gốc sát mặt đất đến đỉnh
của lá ngọn
- Đường kính gốc (mm)
- Hàm lượng diệp lục trong lá được xác định sau 45 ngày.
2.3.5.1. Phương pháp xác định hàm lượng diệp lục.
Hàm lượng diệp lục (chlorophyll) và carotenoid được xác định bằng phương pháp so
màu[35].
+ Lấy 500mg lá, cắt nhỏ, ngâm trong 50ml aceton 80%, để trong tối.
+ Sau 3 ngày lấy toàn bộ dịch chiết định mức đến 100ml. Sau đó lấy dịch chiết đo ở các
bước sóng 663nm, 645nm và 440,5nm.
Hàm lượng chlorophyll a (C
a
), chlorophyll b (C
b
) và carotenoid (C

car
) được tính theo
công thức:
C
a
= (0,0127 x OD
663
- 0,00269 x OD
645
)x100
C
b
(mg x g
-1
) = (0,0299 x OD
645
- 0,00468 x OD
663
)x100
C
car
(mg x g
-1
) = (0,004695 x OD
440,5
- 0,000268 x (C
a
+ C
b
))x100

2.3.5.2. Xác định hàm lượng đạm tổng số trong lá bằng phương pháp Kjeldahl.
Chất đạm đã được vô cơ hóa nằm dưới dạng (NH
4
)
2
SO
4
đem cho tác dụng với
dung dịch NaOH 30 % sẽ giải phóng NH
3
.
Sau đó lượng NH
3
được hơi nước lôi cuốn trong máy Parnas-Wargner và được dẫn
đến một bình tam giác có chứa một lượng dư H
2
SO
4
. Từ đây cho phép xác định được
lượng NH
3
phóng thích ra, có nghĩa là xác định được lượng đạm có trong mẫu nguyên
liệu.
Quá trình này gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Vô cơ hóa mẫu
(NH
4
)
2
SO

4
+ 2NaOH
Na
2
SO
4
+ 2 NH
3
+ 2 H
2
O
19
Nguyên tắc: Tất cả các chất đạm có trong nguyên liệu dù nằm ở dạng nào (hữu cơ, vô
cơ, protein) chuyển thành hợp chất vô cơ (NH
4
)
2
SO
4
bằng cách đun sôi với H
2
SO
4
đậm
đặc và chất xúc tác.
Cách tiến hành:
Cân 100mg lá ngô đã sấy khô tuyệt đối cho vào bình Kjeldahl, cho tiếp 10ml
H
2
SO

4
đậm đặc. Thêm vào 200mg chất xúc tác (K
2
SO
4
: CuSO
4
3:1), lắc nhẹ, đậy kín
để khoảng 3 phút. Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun, đun cho đến khi dung dịch hoàn
toàn trong suốt. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức100
ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch.
Giai đoạn 2: Cất đạm
Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn
50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro, lúc này trong bình có màu tím hồng. Tiếp
tục cho vào bình cất 20ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang
màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết
sang màu xanh lá mạ).
Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H
2
SO
4
0,1N và 3 giọt
thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống
sinh hàn. Bật công tắc cất đạm. Kiểm tra xem hơi ra từ đầu ống sinh hàn có làm xanh
giấy quỳ không, nếu không thêm NaOH 40%.
Sau khi cất đạm 20-25 phút để kiểm tra xem NH
4
OH còn được tạo ra không,
dùng giấy quỳ thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy quỳ không đổi sang màu xanh là
được. Ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới đem đi rửa.

Giai đoạn 3: Chuẩn độ.
Chuẩn độ H
2
SO
4
dư trong bình hứng bằng NaOH 0.1N cho đến khi mất màu tím
hồng và chuyển sang màu vàng cam (xanh lá mạ). Ghi nhận thể tích NaOH 0.1 N sử
dụng.
Tính kết quả
Hàm lượng % nitơ tổng số được tính theo công thức
N (mg%) = {1,42 * (V1-V2)*100/a}*2
 V1: số ml H
2
SO
4
cho vào bình hứng
 V2: số ml NaOH 0.1N đã chuẩn độ
 a số miligam nguyên liệu
 1,42: hệ số, cứ 1 ml H
2
SO
4
dùng để trung hòa NH
4
OH thì tương đương
với 1,42 mg Nitơ.
2.3.5.3. Xác định hàm lượng phosphat tổng số trong lá bằng phương pháp quang
phổ.
2.3.6. Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh bằng phương
pháp PCR xác định gen nifH.

Sau khi sàng lọc các chủng vi khuẩn trên môi trường giới hạn Nfb vô đạm, và khảo sát
khả năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh. Cũng như những chi tiêu sinh trưởng, tích
lũy cholrophyll, N, P chúng tôi sẽ tuyển chọn các chủng cho phản ứng tốt với các chỉ tiêu trên
và tiến hành PCR để xác định sự tồn tại của gen nifH trong các chủng vi khuẩn nội sinh này
Mồi đặc hiệu cho gen nifH cũng như quy trình cho phản ứng PCR được cung cấp và
thực hiện tại VCNSH &MT, trường Đại học Tây Nguyên.
Chất đạm
H
2
SO
4
đậm đặc
Xúc tác, t
0
(NH
4
)
2
SO
4
20
Môi xuôi (Pol F) (5' - TGCGAYCCSAARGCBGACTC - 3')
Mồi ngược (Pol R) (5' - ATSGCCATCATYTCRCCGGA - 3')
Sản phẩm sau phản ứng được điện di có kích thước 360bp ghi nhận thông qua thang
chuẩn 100bp để kết luận.
Nếu xuất hiện vạch có kích thước 360bp thì kết luận vi khuẩn phân lập có mang gen
nifH.
Nếu xuất hiện vạch có kích thước khác 360bp thì kết luận vi khuẩn phân lập không
mang gen nifH.
Quy trình thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn nội sinh có mang gen

nifH.
Tách chiết tế bào thu nhận DNA
- Thu 1ml sinh khối vi khuẩn, chứng âm vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 5.500v/5 phút.
Thu cặn, loại dịch nổi
- Thêm 900μl dung dịch 1, Vortex 30 giây, để yên 10 phút. Thêm 200μl dung dịch 2
(lắc kỹ trước khi hút), trộn đều, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Cẩn thận hút 600μl dịch trong nổi có chứa DNA (tránh làm xáo trộn hai lớp) và một
eppendorf khác có chứa sẵn 600μl dung dịch 3 (trộn đều trước khi sử dụng). Trộn đều hỗn
hợp, để yên 10 phút ở nhiệt độ lạnh, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Hỗn hợp sau khi ly tâm sẽ có cặn nằm dưới đáy eppendorf. Cẩn thận loại bỏ dịch nổi,
thu cặn. Cho từ từ 900μl dung dịch 4 vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
- Tiếp tục loại bỏ hết dịch nổi và thu cặn. Để khô ở nhiệt độ 60°C trong 10 phút. Sau
đó, thêm vào 50μl dung dịch 5.
Nếu chưa đặt phản ứng PCR, bảo quản mẫu tách chiết ở -20°C.
Phản ứng PCR
Thành phần phản ứng 25µl bao gồm: 5µl DNA khuôn mẫu, chứng âm, 0.5µl mồi xuôi
và ngược (PolF 5' - TGCGAYCCSAARGCBGACTC - 3', PolR 5' -
ATSGCCATCATYTCRCCGGA - 3), 12.5µl PCR mastermix, 7.5µl nước.
Chương trình luân nhiệt: 95 – 5 phút 1 chu kỳ
95 – 30 giây
55 – 30 giây 39 chu kỳ
72 – 30 giây
72 – 6 phút 1 chu kỳ
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Thành phần điện di bao gồm 7µl sản phẩm PCR, chứng âm và 3µl dịch nạp mẫu, 1µl
thang 100bp. Cho hỗn hợp vào các giếng trên gel agarose 1%. Điện di ở điện thế 50V trong 5
phút. Sau đó tăng lên 80V trong 30 phút. Nhuộm gel trong dung dịch TAE 1X có ethidium
bromide trong 15 phút.
Quan sát kết quả điện di thông qua thiết bị chụp hình chuyên dụng GelDoc XR có kết
nối phần mềm chuyên dụng (Biorad).

2.3.7. Phương pháp định danh các chủng vi khuẩn được tuyển chọn.
Gửi mẫu tuyển chọn giải trình tự gen 16S xác định loài tại Công ty TNHH Nam Khoa
– TP. Hồ Chí Minh.
2.3.8. Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng vi
khuẩn được tuyển chọn
21
2.3.8.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh khối của
các chủng vi khuẩn.
Các chủng vi khuẩn sẽ được nuôi trên 3 loại môi trường Nfb, Fallik, môi trường nước
chiết khoai tây (BMS), ở nhiệt độ phòng, pH 6,8. Tiến hành đo OD
660
sau 24h, 48h, 72h, 96h
để xác định sinh khối tế bào. Mật độ tế bào được xác định tương quan OD
660
= 1,0 tương
đương với mật độ 10
9
tế bào/ml [27].
* Môi trường Nfb [33].
- Acid Malic: 5g
- K
2
HPO
4
: 0,5g
- MgSO
4
.7H
2
O: 0,2g

- NaCl: 0,1g
- CaCl
2
: 0,02g
- KOH: 4g
- Thành phần khoáng vi lượng, vitamin như môi trường phân lập.
- Thêm nước cất cho đủ 1000ml
- Điều chỉnh pH: 6,8
* Môi trường của Fallik [25].
- KH
2
PO
4
: 4g
- K
2
HPO
4
: 6 g
- Na-Succinate:5g
- NH
4
Cl: 1g
- MgSO
4
.7H
2
O: 0,2g
- Cao nấm men: 0,2g
- NaOH: 3,5g

- Nước cất vừa đủ 1 lít
- Điều chỉnh pH: 6,8
* Môi trường nước chiết khoai tây (BMS) [14], [32].
- Nước chiết khoai tây: 500ml ( 200g/l )
- Acid Malic: 2,5g
- KOH: 2,0g
- Đường Sacarose: 2,5 g
- Thành phần khoáng vi lượng, vitamin như môi trường phân lập.
- Thêm nước cất vừa đủ 1 lít.
- pH điều chỉnh đến 6,8.
2.3.8.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của
các chủng vi khuẩn.
Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường thuận lợi nhất chọn ra từ thí
nghiệm trên, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, pH = 6,8 trên máy lắc 150 vòng/phút. Sau 24
h
, 48
h
,
72h, 96
h
tiến hành đo OD
660
để xác định sinh khối tế bào [6], [7].
2.3.8.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh khối của các chủng
vi khuẩn.
Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường thuận lợi nhất ( môi trường ở
dạng lỏng ) chọn ra từ thí nghiệm trên, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, pH = 6,8 trên máy lắc xoay
vòng ở các tốc độ 0, 100, 150, 200, 250 vòng/phút. Sau thời gian thuận lợi nhất chọn ra từ các
thí nghiệm trên tiến hành đo OD
660nm

để xác định sinh khối tế bào [7].
22
2.3.8.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sinh khối
của các chủng vi khuẩn.
Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường tối ưu( môi trường ở dạng
lỏng ), ở các pH 4,8; 5,8; 6,3; 6,8 và 7,8. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, trên máy lắc xoay vòng
150 vòng/phút. Sau thời gian thuận lợi nhất chọn ra từ các thí nghiệm trên tiến hành đo OD
660
để xác định sinh khối tế bào [7].
2.3.8.5. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh khối của các
chủng vi khuẩn.
Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn cố định đạm trên môi trường, pH thuận lợi nhất
chọn ra từ các thí nghiệm trên ở các nhiệt độ 27
0
C, 32
0
C, 37
0
C, 42
0
C. Sau thời gian thuận lợi
nhất chọn ra từ các thí nghiệm trên tiến hành đo OD
660
để xác định sinh khối tế bào [7].
2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu thống kê
Các số liệu được xử lý trên phần mềm MSTATC version 2.10 của Đại học Michigan,
Mỹ.
Đồ thị tương quan và phương trình tương quan giữa chỉ số mật độ quang OD với sinh
khối tế bào, nồng độ IAA được xử lý trên phần mềm EXCELL 2003 của Microsoft. Các biểu
đồ khác cũng được xử lý trên phần mềm này.

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập một số chủng vi khuẩn cố định đạm trong rễ cây ngô ở Đăk Lăk.
Để đảm bảo các chủng vi khuẩn phân lập được đều là nội sinh chúng tôi đã text nước
rửa cuối cùng của các mẫu trên môi trường giàu dinh dưỡng BMS có bổ sung thêm cao nấm
men. Sau 3 ngày trên đĩa petri có cấy dung dịch nước rửa cuối không thấy xuất hiện vi khuẩn
chứng tỏ khâu xử lý mẫu đã đạt.
Hình 3.1 Sự hiện diện của vi khuẩn cố định đạm trong môi trường giới hạn Nfb
Vòng pellicle
23
Hình 3.2 Khuẩn lạc đơn của một số chủng VK cố định đạm trong môi trường đặc Nfb
Các dòng thuần được cấy trong ống thạch nghiêng trong môi trường giữ giống Nfb +
0,2g cao nấm men + 50ml NH4Cl bảo quản trong tủ lạnh 5
o
C.
Hình 3.3 Dòng thuần được cấy trên môi trường giữ giống
Sau một thời gian phân lập tại 3 địa điểm của tỉnh Đăk Lăk ( Ea Súp, Buôn Ma Thuột, Krông
Năng) chúng tôi đã thu được 31 dòng vi khuẩn được đặt tên theo thứ tự từ 1 đến 31 (C1, C2,
C3…C31). Trong đó có 9 dòng ở Krông Năng (C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9), 10 dòng
ở dòng ở thành phố Buôn Ma Thuột (C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19)
và 12 dòng ở huyện Ea Súp (C20, C21, C22, C23, C24, C25, C26, C27, C28, C29, C30, C31).
3.2. Kết quả mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn
cố định đạm
Quan sát khuẩn lạc đơn dưới kính lúp điện tử, các khuẩn lạc đơn sẽ được phân loại sơ
bộ theo hình thái, màu sắc và kích thước. Kết quả phân loại khuẩn lạc được ghi nhận trong
bảng 3.1 cho thấy hầu hết các chủng có đặc điểm chung là khuẩn lạc tròn, bìa khuẩn lạc
nguyên, kích thước từ 1-2 mm, màu trắng sữa đến vàng nhạt khi sinh trưởng trên môi trường
Nfb đặc.
Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn cố định N nội sinh trong rễ cây ngô
STT
Chủng

Vi
khuẩn
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Hình dạng Bề mặt Màu sắc Mép
Đường
kính
(mm)
1 C1 Tròn đều Bóng Trắng đục Bằng phẳng 1,2
2 C2 Tròn đều Trơn Trắng sữa Bằng phẳng 1,4
24
3 C3 Tròn đều Nhăn nheo Vàng óng Bằng phẳng 1,1
4 C4 Tròn đều Bóng
Trắng
trong
Bằng phẳng 1,7
5 C5
Tròn không
đều
Nhẵn
Trắng
trong
Bằng phẳng 0,9
6 C6
Hình bầu
dục
Nhẵn Trắng đục Bằng phẳng 1,6
7 C7 Tròn đều Nhẵn
Trắng
trong
Bằng phẳng 1,2

8 C8 Tròn đều Nhẵn Trắng đục Bằng phẳng 1,3
9 C9 Tròn Bóng Trắng xanh Bằng phẳng 0,9
10 C10 Tròn Nhẵn Trắng đục Bằng phẳng 1,5
11 C11 Tròn Nhẵn Đỏ gạch Bằng phẳng 1,6
12 C12 Tròn Nhẵn Trắng đục Bằng phẳng 1,8
13 C13 Tròn Bóng Hồng Bằng phẳng 2,2
14 C14 Tròn
Nhẵn,
nhầy
Trắng đục Bằng phẳng 2,1
15 C15 Tròn Nhẵn
Trắng
trong
Bằng phẳng 1,0
16 C16 Tròn Nhẵn Vàng sáng Bằng phẳng 1,1
17 C17 Tròn Bóng Xanh nhạt Răng cưa 1,0
18 C18 Tròn Bóng
Trắng
trong
Bằng phẳng 1,0
19 C19 Tròn Nhẵn
Trắng
trong
Bằng phẳng 1,2
20 C20 Tròn Nhẵn
Trắng
trong
Bằng phẳng 1,6
21 C21 Tròn Nhẵn Trắng đục Bằng phẳng 1,4
22 C22 Tròn đều Bóng Đỏ gạch Bằng phẳng 1,0

23 C23 Tròn
Nhẵn,
bóng
Trắng đục,
hơi nâu
Răng cưa 1,4
24 C24 Tròn
Nhẵn,
bóng
Trong như
giọt nước
Bằng phẳng 1,3
25 C25 Tròn
Nhẵn,
bóng
Trắng
trong
Bằng phẳng 1,1
26 C26 Tròn Nhẵn
Trắng
trong
Bằng phẳng 0,7
27 C27 Tròn đều Bóng Trắng đục Bằng phẳng 2,4
25
28 C28 Tròn Nhẵn
Trong như
giọt nước
Bằng phẳng 2,3
29 C29 Tròn Nhẵn
Trắng

trong
Bằng phẳng 0,8
30 C30 Tròn
Nhẵn,
nhầy
Hồng nhạt Bằng phẳng 0,9
31 C31 Tròn
Nhẵn,
nhầy
Vàng nhạt Bằng phẳng 1,5
Bảng 3.2. Hình thái tế bào và gram của các chủng vi khuẩn phân lập
STT Chủng Gram Hình dạng tế bào Kích thước tế bào (µm)
1 C1 - Que dài 1,2x2,4
2 C2 - Que ngắn 0,5x1,5
3 C3 + Que ngắn 1,4x2,8
4 C4 - Que dài 1,4x3,2
5 C5 - Que dài 0,7x2,4
6 C6 - Que dài 1,6x2,8
7 C7 - Que dài 1,4x3,3
8 C8 - Que ngắn 1,6x3,8
9 C9 - Que dài 1,1x3,6
10 C10 - Que dài 0,6x2,5
11 C11 + Que ngắn 0,9x1,8
12 C12 - Que dài 1,3x2,4
13 C13 - Que dài 1,1x2,6
14 C14 - Que ngắn 1,4x2,8
15 C15 - Que dài 1,2x2,5
16 C16 - Que dài 1,2x2,5
17 C17 - Que dài 1,2x2,5
18 C18 + Que dài 1,5x3,4

19 C19 - Que ngắn 0,7x1,5
20 C20 - Que dài 0,8x2,5
21 C21 - Que dài 1,8x3,0
22 C22 - Que ngắn 0,7x1,5
23 C23 - Que dài 0,7x1,4
24 C24 - Que dài 0,9x2,5
25 C25 - Que ngắn 0,9x1,5
26 C26 - Que dài 0,7x2,5
27 C27 - Que dài 1,9x3,8
28 C28 - Que dài 0,8x2,5
29 C29 - Que dài 1,5x3,5
30 C30 - Que dài 1,4x2,5
31 C31 - Que ngắn 1,2x2,5