Nghiên cứu đặc điểm hình thái, phân tử và sinh học của sán lá gan lớn fasciola SPP ở việt nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
***



NGUYỄN THỊ THU HUYỀN



NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI,
PHÂN TỬ VÀ SINH HỌC CỦA SÁN LÁ GAN LỚN
FASCIOLA SPP. Ở VIỆT NAM



CHUYÊN NGÀNH: ĐỘNG VẬT HỌC
Mã số: 60420103



LUẬN VĂN THẠC SỸ




Hà Nội, 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
***



NGUYỄN THỊ THU HUYỀN



NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI,
PHÂN TỬ VÀ SINH HỌC CỦA SÁN LÁ GAN LỚN
FASCIOLA SPP. Ở VIỆT NAM


CHUYÊN NGÀNH: ĐỘNG VẬT HỌC
Mã số: 60420103


LUẬN VĂN THẠC SỸ



Hƣớng dẫn khoa học: TS. Phạm Ngọc Doanh


Hà Nội, 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

Lời cảm ơn
Để hoàn thành được công trình nghiên cứu này, tôi đã nhận được rất
nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân, tổ chức. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đối tới
ban lãnh đạo Viện sốt rét – ký sinh trùng và côn trùng ương, Khoa sinh học
phân tử thuộc viện Sốt rét, phòng Ký sinh trùng, phòng Sau đại học cùng với
ban lãnh đạo viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện cho tôi
trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Ngọc Doanh,
người thầy luôn theo sát, tận tình chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn tôi trong
quá trình học tập cũng như trong quá trình thực hiện luận văn này!
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em thuộc khoa Sinh học phân tử
- Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng trung ương và phòng Ký sinh trùng
viện Sinh thái và tài nguyên Sinh vật đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện
đề tài cũng như đóng góp những ý kiến quý báu cho luận văn của tôi.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy/cô trong Hội đồng chấm luận văn
đã có những ý kiến đóng góp quý báu để luận văn của tôi được hoàn thiện.
Tôi xin chân thành cảm ơn, người thân, bạn bè đồng nghiệp đã ủng hộ
tôi và giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn đến 2 bên Cha, Mẹ
đã vất vả sinh thành, nuôi dưỡng cũng như tạo điều kiện để tôi có được kết
quả như ngày hôm nay. Cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến chồng và
con tôi! Những người luôn sát cánh bên tôi và luôn là chỗ dựa tinh thần để
tôi có thể hoàn thành tốt nhất luận văn này.
Hà Nội, tháng 12 Năm 2014


Nguyễn Thị Thu Huyền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là do chính tôi thực hiện.
Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn trung thực và chưa từng công
bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác.Tôi xin hoàn toàn chịu trách
nhiệm về tính trung thực và khoa học của các kết quả trong nghiên cứu này.

Hà Nội, tháng 12 năm 2014
Tác giả


Nguyễn Thị Thu Huyền


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

Mục Lục
Lời cảm ơn
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG
CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Khái quát chung về đặc điểm hình thái và vòng đời phát triển của sán lá
gan lớn Fasciola spp. 4
1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của sán lá gan lớn 4
1.2. Vòng đời phát triển của sán lá gan lớn 5

1.2. Tình hình nghiên cứu về sán lá gan lớn trên thế giới 6
1.2.1. Phân loại và phân bố của 2 loài sán lá gan lớn 6
1.2.2. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở động vật và người 7
1.2.3. Vật chủ trung gian của sán lá gan lớn 9
1.3 Tình hình nghiên cứu sán lá gan lớn tại Việt Nam. 11
1.3.1. Mầm bệnh 11
1.3.2. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu bò. 12
1.3.3. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn trên người tại Việt Nam 12
1.3.4. Tình hình nghiên cứu về vật chủ trung gian của sán lá gan lớn 13
CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG,ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNGVÀPHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. Đối tượng nghiên cứu: Sán lá gan lớn Fasciola spp. ở Việt Nam. 15
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 15
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu 15
2.2.2. Thời gian nghiên cứu 15
2.3. Nội dung nghiên cứu 15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

2.4. Phương pháp nghiên cứu 15
2.4.1. Phương pháp thu sán lá gan lớn trưởng thành từ bò: 15
2.4.2. Phương pháp thu trứng sán từ bò 16
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu hính thái sán lá gan lớn 16
2.4.4. Phương pháp nghiên cứu phân tử 16
2.4.5. Phương pháp nuôi trứng sán lá gan lớn 17
2.4.6. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của miracidium: 17
2.4.7. Phương pháp gây nhiễm miracidium cho ốc 17
2.4.8. Phương pháp nghiên cứu sự hóa nang và sức sống của metacercaria 18
2.4.9. Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và SPPS. 18
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

3.1. Đặc điểm phân loại của sán lá gan Fasciola spp. ở Việt Nam 19
3.1. 1. Đặc điểm hình thái sán lá gan Fasciola spp. ở Việt Nam 19
3.1.2. Đặc điểm phân tử và quan hệ tiến hóa phân tử của sán lá gan lớn dựa
trên trình tự ITS1-5.8S rDNA-ITS2 21
3.1.3. Thảo luận 26
3.2. Đặc điểm sinh học của sán lá gan F. gigantica 30
3.2.1. Sự phát triển của trứng sán lá gan F. gigantica 30
3.2.2. Đặc điểm sinh học của miracidium 34
KẾT LUẬN 51
KIẾN NGHỊ 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO 52







Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình thể sán lá gan lớn trưởng thành 4
Hình 1.2. Vòng đời phát triển của sán lá gan lớn. 6
Hình 3.1. Hình thái chung của sán lá gan có ruột và tinh hoàn phân nhánh 19
Hình 3.2. Các dạng hình thái của sán lá gan lớn thu từ bò 20
Hình 3.3. Trình tự của TN3-Tây Ninh thể hiện một số vị trí có 2 đỉnh 24
Hình 3.4. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các loài Fasciola spp. 25
Hình 3.5. Trứng sán lá gan trong nước cất (a) và dung dịch muối 0,85% (b) 31
Hình 3.6. Sự phát triển của trứng sán lá gan ở nhiệt độ 25-34

0
C 32
Hình 3.7. Miracidium của sán lá gan F. gigantica 32
Hình 3.8. Ba loài ốc Lymnaea ở Việt Nam 39
Hình 3.9. Các giai đoạn phát triển của ấu trùng sán lá gan 44
Hình 3.10. Metacercaria sống (a) và chết ở nước muối 1,5% sau 15 phút (b) 48
Hình 3.11. Ảnh hưởng của các nồng độ muối 3 và 5% lên rau dấp cá, rau diếp
và rau ngổ sau thời gian ngâm 15 phút 49
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nước muối 2% đến các loại rau sau khi ngâm 15
phút 50
Hình 3.13. Một muỗng canh muối 20 gram pha trong 1 lít nước để rửa rau
sống 50








Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Vật chủ trung gian của F. hepatica ở các nước và vùng địa lý 10
Bảng 3.1. Kích thước sán lá gan lớn thu từ các địa điểm nghiện cứu 20
Bảng 3.2. So sánh kích thước của các nhóm sán lá gan có hình dạngcơ thể
khác nhau 21
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái và phân tử của các mẫu nghiên cứu 22
Bảng 3.4. So sánh trình tự ITS1-5.8S-ITS2 của 2 loài sán lá gan 23

Bảng 3.5. Sự phát triển của trứng sán lá gan ở các điều kiện khác nhau 31
Bảng 3.6. Sự phát triển của trứng sán ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau 33
Bảng 3.7. Thời điểm trứng sán nở trong ngày 35
Bảng 3.8. Khả năng sống của miracidium ở điều kiện 26-28
0
C 36
Bảng 3.9. Độ sâu ưa thích của miracidium 38
Bảng 3.10. Kết quả gây nhiễm miracidium sán lá gan cho các loài ốc 40
Bảng 3.11. Thời gian cercaria thoát khỏi ốc và hóa nang 45
Bảng 3.12. Sức sống của nang sán trong các nồng độ muối khác nhau 48





Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

CHỮ VIẾT TẮT

ADN : Axit deoxyribonucleic
BL : Body length (chiều dài cơ thể)
PBS : Phosphate-buffered Saline
BW : Body width (chiều rộng cơ thể)
CO1 : Cytochrome c oxidase subunit 1
CS : Cộng sự
CT : Côn trùng
CW : Cone width (chiều rộng đầu sán)
ITS : Internal Transcribed Spacer (đoạn giao gen)
KST : Ký sinh trùng
NaCl : Natri clorua

NAD1 : Nicotinamide dehydrogenase subunit 1
PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi Polymerase)
SR : Sốt rét
WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)





1

MỞ ĐẦU
1. Sự cần thiết của đề tài
Bệnh sán lá gan lớn gây nên bởi các loài sán lá Fasciola spp., phổ biến
là 2 loài Fasciola hepatica Linnaeus, 1758và Fasciola giganticaCobbold,
1855, có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe gia súc và gây thiệt hại cho
ngành chăn nuôi.Hơn thế nữa, sán lá gan còn gây bệnh cho người.Theo tổ
chức Y tế thế giới (WHO) bệnh sán lá gan lớn là một trong những vấn đề y tế
quan trọng và luôn được quan tâm nghiên cứu. Người và động vật nhiễm
bệnh sán lá gan lớn do ăn phải rau, cỏ hoặc uống nước lã có chứa ấu trùng
cảm nhiễm metacercaria. Sán trưởng thành ký sinh ở gan vật chủ, gây tổn
thương chủ yếu ở gan, nhưng cũng có thể gây tổn thương ngoài gan khi ký
sinh lạc chỗ (Dalton 1999).
Trong vòng đời phát triển của sán lá gan lớn, trứng được thải ở gan vật
chủ, theo ống dẫn mật xuống ruột và ra môi trường cùng với phân. Gặp điều
kiện thuận lợi, trứng phát triển và nở ra thành ấu trùng
miracidium.Miracidium bơi trong nước, tìm vật chủ trung gian thích hợp để
xâm nhập và phát triển thành các giai đoạn ấu trùng sporocyst, redia và
cercaria.Cercaria trưởng thành thoát khỏi ốc, rụng đuôi hoá nang bám vào
thực vật thuỷ sinh hoặc trôi nổi trong nước. Khi vật chủ chính ăn phải thực

vật thuỷ sinh hoặc uống nước có chứa metacercaria của sán lá gan lớn thì
chúng phát triển thành con trưởng thành ký sinh ở gan. Vật chủ trung gian
thích hợp của sán lá gan lớn là ốc nước ngọt, thường là ốc thuộc họ
Lymnaeidae.Tuy nhiên, ốc vật chủ trung gian của các loài sán lá gan lớn,
thậm chí của cùng một loài ở các vùng địa lý khác nhau có thể là những loài
ốc khác nhau (Dalton 1999).Vì vậy, việc xác định chính xác vật chủ trung
gian của sán lá gan lớn rất quan trọng trong việc phòng chống bệnh sán lá gan
lớn cho gia súc và người.

2

Ở Việt Nam, số ca bệnh mắc sán lá gan lớn ở người trong những năm
gần đây tăng đáng kể, đặc biệt là ở miền Trung và miền Nam (Trần Vinh
Hiển và CS. 2006; Triệu Nguyên Trung và CS. 2012).Vì vậy, sán lá gan lớn
và bệnh sán lá gan lớn ở nước ta được đặc biệt quan tâm nghiên cứu.Tuy
nhiên, nhiều vấn đề về định loại hình thái, phân tử và vật chủ trung gian chưa
thống nhất. Các thông báo trước đây cho rằng ở Việt Nam tồn tại cả 2 loài sán
lá gan lớn, trong khi những nghiên cứu về phân tử gần đây chỉ phát hiện một
loài F. gigatica và dạng lai (Lê Thanh Hòa và cs. 2002; Nguyễn Văn Đề
2003; Lê Quang Hưng và cs. 2003; Đặng Tất Thế và cs. 2003; Nguyễn Văn
Khá 2005; Trần Vinh Hiển và cs. 2006; Nguyễn Văn Đề và cs. 2006; Le et al.
2007; Periago et al. 2006; Nguyen et al. 2009; Nguyen et al. 2012). Một số
nghiên cứu cho thấy 2 loài ốc Lymnaea viridis và Lymnaea swinhoei là vật
chủ trung gian của sán lá gan lớn (Phan Địch Lân 1985; Nguyễn Trọng Kim
1997; Nguyễn Trọng Kim và cs. 1997; Lê Hữu Khương và cs. 2001; Vũ Sĩ
Nhàn và cs. 1989; Hồ Thị Nhuận và Nguyễn Ngọc Phương 1987), trong khi
một số tác giả khác chỉ tìm thấy ấu trùng sán lá gan lớn ở ốc L. viridis (Phạm
Ngọc Doanh và Nguyễn Thị Lê 2005;Phạm Ngọc Doanh và cs. 2012; Dung et
al. 2013). Để làm sáng tỏ những vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài
“Nghiên cứu đặc điểm hình thái, phân tử và sinh học của sán lá gan lớn

Fasciola spp. ở Việt Nam”.
2. Mục tiêu của đề tài: Làm sáng tỏ đặc điểm phân loại và sinh học của sán
lá gan lớn Fasciola spp. ở Việt Nam.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:
- Cung cấp dẫn liệu chính xác về phân loại và đặc điểm sinh học của sán lá
gan lớn ở Việt Nam.
- Tạo cơ sở khoa học cho công tác phòng chống sán lá gan lớn một cách hiệu
quả, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
4. Những điểm mới của luận văn

3

- Xác định chính xác sán lá gan lớn ở Việt Nam là loài F. gigantica và có
các cá thể lai hoặc chuyển gen giữa 2 loài F. gigantica và F. hepatica.
- Xác định khả năng sống của trứng sán lá gan trong các dung dịch nồng độ
muối khác nhau, điều kiện nhiệt độ khác nhau.
- Xác định thời điểm nở trong ngày, đặc điểm bơi, độ sâu ưa thích và thời
gian sống của miracidium.
- Khẳng định chỉ có loài ốc A. viridis bị nhiễm ấu trùng sán lá gan lớn F.
gigantica(= L. viridis) ở Việt Nam, còn loài R. auricularia (= L. swinhoei)
không bị nhiễm.
- Xác định ảnh hưởng của nồng độ muối đến sức sống của metacercaria, đưa
ra nồng độ muối thích hợp nhất để rửa sau sống an toàn là 2% ngâm trong 15
phút.

4

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Khái quát chung về đặc điểm hình thái và vòng đời phát triển của
sán lá gan lớn Fasciola spp.
1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của sán lá gan lớn
Vị trí phân loại của sán lá gan lớn như sau:
Ngành (Phylum): Platyhelminthes Schneider, 173
Lớp (Class): Trematoda Rudolphi, 1808
Bộ (Order): Fasciolida Skrjabin et Schulz, 1935
Họ (family): Fasciolidae Railliet, 1895
Giống (Genus): Fasciola Linnaeus, 1758
Loài (species): F. hepatica, F. gigantica
Sán trưởng thành có kích thước lớn, hình lá dẹt (hình 1.1).Khi còn sống cơ thể
màu nâu đỏ. Phần đầu có dạng hình nón, có giác miệng, tiếp theo là hầu, ruột
phân nhánh chạy dọc từ trước ra sau cơ thể. Hai tinh hoàn phân nhánh và nằm
ở phần giữa cơ thể.Buồng trứng phân nhánh, nằm ngay phía trước tinh
hoàn.Tử cung đổ vào lỗ sinh dục nằm ở vùng giác bụng.

Hình 1.1. Hình thể sán lá gan lớn trƣởng thành
( A: F. gigantica B: F. hepatica)
Hai loài sán lá gan F. hepatica và F. gigantica khác nhau về kích thước

và hình dạng cơ thể.Loài F. hepatica ngắn hơn và rộng hơn, trong khi loài F.

5

gigantica dài hơn và hẹp hơn.Ngoài ra loài F. hepatica có phần đầu rộng hơn,
làm thành bờ vai, còn loài F. gigantica thuôn hơn (Dalton et al. 1999; hình
1.1).Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp rất khó phân biệt 2 loài này về mặt
hình thái.
1.1.2. Vòng đời phát triển của sán lá gan lớn
Trong vòng đời phát triển, sán lá gan lớn trải qua 5 giai đoạn (hình 1.2),
bao gồm:
Giai đoạn trứng được thải khỏi vật chủ ra môi trường ngoài: Trứng sán lá
gan lớn được bài tiết theo phân vật chủ ra ngoài môi trường. Trong môi
trường nước, trứng phát triển thành ấu trùng miracidium.
Giai đoạn miracidium tìm kiếm và xâm nhập vào vật chủ trung gian: Trong
môi trường nước, miracidium tìm kiếm vật chủ ốc thích hợp để xâm nhập vào
vật chủ, chủ yếu là ốc Lymnaea.
Giai đoạn phát triển và tăng sinh số lượng trong cơ thể ốc: Trong cơ thể ốc,
ấu trùng sán phát triển qua các giai đoạn sporocyt, redia mẹ, redia con, và
cuối cùng là cercaria.
Giai đoạn cercaria thoát khỏi ốc và hoá nang: Sau khi rời khỏi ốc, cercaria
bơi trong nước và hóa nang thành metacercaria bám vào bề mặt thực vật thuỷ
sinh. Một số metacercaria không bám được vào thực vật thuỷ sinh mà trôi nổi
tự do trong nước.
Giai đoạn metacercaria được vật chủ cuối cùng ăn và phát triển thành sán
trưởng thành.
Con người và động vật khi ăn thức ăn (rau thuỷ sinh đối với con người và cỏ
đối với động vật) chứa ấu trùng giai đoạn lây nhiễm hoặc uống phải nước có
chứa mầm bệnh thì ấu trùng thoát khỏi vỏ nang trong đường ruột, xuyên qua
niêm mạc ruột vào khoang khúc mạc và sau đó di chuyển tới gan, đường mật.

Ở nhu mô gan thì quá trình hấp thu dinh dưỡng bắt đầu và gây tổn thương cho

6

gan, gây ỉa chảy, thiếu máu. Sán di chuyển đến mô gan trong thời gian từ 5-6
tuần và cuối cùng đến các ống mật. Sau 3- 4 tháng, sán phát triển thành con
trưởng thành và đẻ trứng. Ở động vật, một cá thể sán trưởng thành có thể đẻ
đến 25.000-50.000 trứng/ngày.Sán trưởng thành có thể sống từ 9-14 năm
trong vật chủ (Boray 1982).

Hình 1.2.Vòng đời phát triển của sán lá gan lớn.
Qua chu trình phát triển trên có thể thấy sự phát triển của sán lá gan
phụ thuộc vào nhiều yếu tố, vật chủ và môi trường. Vì vậy, nghiên cứu các
yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của sán lá gan sẽ cung cấp cơ sở khoa học
cho việc phòng bệnh thích hợp.
1.2. Tình hình nghiên cứu về sán lá gan lớn trên thế giới
1.2.1. Phân loại và phân bố của 2 loài sán lá gan lớn
Các nghiên cứu đã cung cấp những bằng chứng cho thấy tính hiệu lực của
2 loài F. hepatica và F. gigantica, chúng khác nhau về hình thái, vật chủ

7

chính và vật chủ trung gian là ốc ở các vùng địa lý với đặc điểm môi
trường khác nhau.
Loài F. hepatica phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới và cận nhiệt đới của châu
Âu, Bắc, Trung và Nam Mỹ; Bắc và Trung Á; châu Đại Dương; Bắc, Đông và
Nam Phi; và cả ở các quần đảo lớn như New Zealand, Tasmania, Iceland,
Cyprus, Corsica, Sardinia, Sicily, Nhật Bản, Papua New Guinea, Philippine
và một số đảo của Caribbean. Loài F. gigantica giới hạn ở vùng nhiệt đới và
có mặt ở châu Phi, châu Á, Viễn Đông, Đông Âu. Mặc dù nhiều sách cho

rằng F. gigantica có ở cả phía Nam nước Mỹ và Hawaii, nhưng không có
bằng chứng để chứng minh loài này trên nước Mỹ. Một số vùng có sự phân
bố của cả 2 loài (Dalton 1999).Ở những vùng có sự chồng chéo của 2 loài
xuất hiện dạng trung gian khó có thể kết luận là loài nào.Ở châu Á và châu
Phi, có nhiều dạng trung gian đã được phát hiện, một số giống F. hepatica, số
khác giống F. gigantica, và một số dạng trung gian.Sự lai và chuyển gen giữa
2 loài sán lá gan, F. hepatica và F. gigantica đã được thông báo ở các nước
châu Á, như Hàn Quốc (Agatsuma et al. 2000; Choe et al. 2011), Nhật Bản
(Itagaki et al. 2005), Iran (Ashrafi et al. 2006; Amor et al. 2011), Trung
Quốc (Peng et al. 2009; Ai et al. 2011) và Việt Nam (Le et al. 2008) cũng như
các nước châu Phi (Periago et al. 2008; Amer et al. 2011).
Một nghiên cứu hình thái tỷ mỉ và chính xác đã thực hiện để xem liệu có phân
biệt 2 loài F. hepatica và F. gigantica không.Tác giả kết luận rằng các chỉ số
chiều dài/rộng cơ thể (BL/BW) và khoảng cách từ mép sau giác bụng đến mút
cuối cơ thể có ý nghĩa phân biệt 2 loài (Periago et al. 2006).
1.2.2. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở động vật và người
Trâu, bò, cừu là động vật nuôi bị nhiễm sán lá gan lớn nặng nhất.Mặc
dù, dê, ngựa, lợn, hươu và nhiều loài động vật khác cũng có thể bị nhiễm,
nhưng ít quan trọng hơn ở những động vật này.Nhiều cuộc điều tra về tỷ lệ
nhiễm hai loàiđược thực hiện ở nhiều nước trên thế giới. Tỷ lệ nhiễm dao

8

động lớn từ 1-81,4%, tuỳ thuộc vào loài gia súc và địa điểm nghiên cứu
(Dalton 1999).
Bệnh sán lá gan lớn ở người là một vấn đề sức khoẻ quan trọng ở nhiều quốc
gia trên thế giới (Dalton 1999).Bệnh sán lá gan lớn ở người thông báo từ châu
Âu, châu Mỹ, châu Phi, châu Á và châu Đại Dương. Một phân tích toàn cầu
cho thấy mặc dù số ca bệnh sán lá gan lớn ở người không hiếm ở những nơi
có động vặt ăn cỏ bị nhiễm bệnh, tỷ lệ nhiễm cao/thấp ở người không liên

quan đến tỷ lệ nhiễm cao/thấp ở động vật. Tỷ lệ nhiễm cao ở người không
nhất thiết phải tìm thấy ở nơi có tỷ lệ nhiễm cao ở gia súc.Ví dụ, ở Bolivia và
Peru tỷ lệ nhiễm ở người cao, trong khi tình hình nhiễm ở gia súc ít quan
trọng hơn so với các nước như Uruguay, Argentina và Chile, nơi mà bệnh sán
lá gan ở người lại ít gặp (Dalton 1999).
Ở châu Âu, bệnh công bố ở 19 nước, chủ yếu từ Pháp, Tây Ban Nha, Bồ Đào
Nha và Liên Xô (cũ). Pháp được coi là khu vực dịch tễ quan trọng với gần
6.000 ca bệnh được phát hiện từ 9 bệnh viện trong thời gian 1970-1982.Bệnh
cũng được cho là quan trọng ở Portugal với hơn 1.000 ca mắc trong thời kỳ
1970–1992.
Ở Bắc Mỹ, bệnh xuất hiện rải rác ở Mỹ và Canada.Ở Trung Mỹ, bệnh sán lá
gan lớn là vấn đề lớn ở đảo Caribbean, đặc biệt là của Puerto Rico và Cuba.Ở
Nam Mỹ, bệnh nghiêm trọng ở Bolivia và Peru, và có thể ở cả Ecuador. Ở
Bolivia, vùng dịch tễ cao thấy ở Altiplano, với tỷ lệ nhiễm tới 100%, số người
có nguy cơ nhiễm lên tới 2,5 triệu (Dalton 1999).
Ở châu Á, các ca bệnh được công bố ở một vài quốc gia, trong đó Iran là đáng quan
tâm nhất, ước tính hơn 10.000 ca nhiễm và khoảng 6 triệu có nguy cơ nhiễm.
Ở châu Phi, một số ít ca bệnh nhiễm sán lá gan lớn được thông báo.Một số
vùng có sự chồng chéo giữa 2 loài F. hepatica và F. gigantica.Loài F.
hepatica phân bố ở các nước bắc Phi (như Morocco, Algeria and Tunisia,
Zimbabwe) và Nam Phi, Kenya và Ethiopia.Loài F. gigantica xuất hiện ở

9

khắp lục địa châu Phi. Đa số các trường hợp công bố từ Ai Cập, nơi mà loài
Fasciola vẫn chưa được xác định ở hầu hết các trường hợp, mặc dù đôi khi F.
hepatica được cho là nguyên nhân gây bệnh.
Ở châu Đại Dương, chỉ có ít ca bệnh nhiễm từ Australia.
Người không phải là vật chủ thích hợp của sán lá gan, đa số sán bị giữ ở nhu
mô gan và chết, không đến được ống dẫn mật (Dalton 1999); tuy nhiên, ở

vùng dịch tễ cao sán lá gan lớn thích nghi tốt hơn với vật chủ người. Thời
gian nhiễm ở người chưa biết rõ, nhưng ước tính rằng chúng có thể sống tới
13,5 năm (Dalton 1999).
1.2.3. Vật chủ trung gian của sán lá gan lớn
Sán lá gan không có mặt ở những vùng mà điều kiện không thuận lợi cho sự
phát triển của ốc - vật chủ trung gian, thường là ốc thuộc họ Lymnaeidae.Ốc
Lymnaeidae rất đa dạng về hình thái và thành phần loài, vì thế hệ thống phân
loại của chúng rất phức tạp, vị trí phân loại của nhiều loài và giống có sự thay
đổi.Ốc đóng vai trò là vật chủ trung gian thích hợp của sán lá gan khác nhau
tùy thuộc vào loài sán và vùng địa lý.
Vật chủ trung gian của F. hepatica
Ốc điển hình liên quan đến truyền bệnh do F. hepatica là Lymnaea
truncatula. Ốc L. truncatula có khả năng thích nghi với nhiều môi trường
sống như độ cao (>4000m) ở Bolivian Altiplano.Ngoài ra, còn các loài ốc
khác.Dưới đây là danh sách các loài ốc đóng vai trò là vật chủ trung gian của
F. hepatica ở các nước và vùng địa lý (Boray 1985).







10

Bảng 1.1. Vật chủ trung gian của F. hepatica ở các nƣớc và vùng địa lý
Loài ốc
Nƣớc
L. bulimoides
Australia, USA

L. columella
Bắc và Nam Mỹ
L. cousin
Nam Mỹ
L. (Fossaria) cubensis
Bắc và Trung Mỹ, Caribbean
L. ferruginea
Nam Mỹ
L. humilis
Nam Mỹ
L. mweruensis
Kenya
L. ollula (= L. viridis?)
Nhật Bản, châu Âu
L. palustris
châu Âu, Mỹ
L. peregra ovata
châu Âu
L. peregra peregra
châu Âu
L. stagnalis
châu Âu, Mỹ
L. traskii
Nam Mỹ
L. tomentosa
Úc
L. truncatula
Châu Âu
L. (Fossaria) viatrix
Nam Mỹ

L. proxima proxima
Mỹ
L. modicella
Mỹ
Stagnicola montanensis
Mỹ
F. (Galba) bulimoides
Nam Mỹ
G. bulimoides techella
Nam Mỹ

Vật chủ trung gian của F. gigantica
Ốc điển hình liên quan đến truyền sán lá gan F. gigantica là loài
Lymnaea auricularia.Kendall (1954, 1965) kết luận rằng không dễ dàng phân
biệt về mặt hình thái hoặc sinh thái của các dòng ốc thuộc loài L.

11

auricularia.Tác giả cho rằng các dòng ốc vật chủ trung gian của sán lá gan ở
nam, tây và đông châu Phi là L. a. natalensis; ở Ấn Độ, Bangladesh và
Pakistan là L. a. rufescens; ốc vật chủ ở Đông Nam Á là L. a. rubiginosa. Một
loài ốc tương tự, L. ollula, là vật chủ của F. gigantica ở Nhật Bản (Uneno and
Yoshihara 1974) và Hawaii (Alicata 1938).
Vai trò chính của L. auricularia là vật chủ trung gian của F. gigantica
(Kendall 1954).Tuy nhiên, một số loài ốc khác cũng bị nhiễm F.
gigantica.Dưới đây là danh sách các loài ốc đóng vai trò là vật chủ trung gian
của F. gigantica ở các nước và vùng địa lý (bảng 1.2).
Bảng 1.2. Vật chủ trung gian của F. gigantica ở các nƣớc và vùng địa lý
Loài ốc
Nước

L. auricularia/natalensis
Châu Phi, châu Á
L. gedrosiana
Iraq
L. ollula
Nhật Bản
L. peregra
Châu Âu
L. stagnalis
Châu Âu
L. tomentosa
Úc
Biomphalaria alexandrina
Ai cập

1.3 Tình hình nghiên cứu sán lá gan lớn tại Việt Nam.
1.3.1. Mầm bệnh
Một số tác giả cho rằng cả 2 loài sán lá gan lớnđều lưu hành ở Việt Nam
(Phan Địch Lân 1985; Hồ Thị Thuận và Nguyễn Ngọc Phương1987; Lê Hữu
Khương và cs. 2001).Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây phân tích phân tử
cho thấy rằng chỉ có loài F. gigantica và một số cá thể lai giữa loài F.
hepatica và F. gigantica(Lê Thanh Hòa và cs. 2002; Nguyễn Văn Đề 2003;
Lê Quang Hưng và cs. 2003; Đặng Tất Thế và cs. 2003; Nguyễn Văn Khá
2005; Trần Vinh Hiển và cs. 2006; Nguyễn Văn Đề và cs. 2006; Le et al.
2007; Periago et al. 2006; Nguyen et al. 2009; Nguyen et al. 2012).

12

1.3.2. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu bò.
Trước đây, ở nước ta có nhiều cuộc điều tra về tỷ lệ nhiễm sán lá gan.

Phan Địch Lân (1985) tổng kết tình hình nhiễm sán lá gan ở trâu bò cho thấy
tỷ lệ nhiễm tăng theo lứa tuổi và tăng dần từ miền biển đến miền núi, trung du
và đồng bằng; tỷ lệ nhiễm giao động từ 13,7 - 61,3%. Hồ Thị Nhuận và
Nguyễn Ngọc Phương (1987) điều tra ở các tỉnh miền Nam cho thấy tỷ lệ trâu
bò nhiễm sán lá gan từ 1,4-36,2%. Vũ Sĩ Nhàn và cs. (1989) công bố tỷ lệ
trâu bò nhiễm sán lá gan ở ở đồng bằng (44,5%) cao hơn so với ở miền biển
(4,1%).Nguyễn Trọng Kim và Phạm Ngọc Vĩnh (1997) công bố tỷ lệ nhiễm
sán lá gan lớn ở trâu bò tại Hà Bắc (cũ) là 49,95%; ở Nghệ An từ 25,27 –
32,65%; tỷ lệ nhiễm chung ở miền Bắc là 43,56%. Kết quả nghiên cứu của Lê
Hữu Khương và cs. (2001) cho thấy tỷ lệ nhiễm trung bình trên cả nước ở trâu
là 46,23%, dao động từ 8,74 – 61,09%, ở bò là 30,64%, tỷ lệ nhiễm tăng dần
từ miền Nam ra miền Bắc.
Những năm gần đây, Đỗ Đức Ngái và cs. (2006) thông báo tỷ lệ nhiễm sán lá
gan ở Đăk Lăk từ 34,2-62,6%. Nguyễn Khắc Lực và cs. (2010) nghiên cứu tại
Quảng Nam, đã xác định tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn trên 245 trâu bò cho thấy
tỷ lệ nhiễm chung là 40,8%. Có thể nói, tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu
bò tại một số địa điểm ở nước ta vẫn còn cao.
1.3.3. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn trên người tại Việt Nam
Những ca bệnh sán lá gan lớn ở người ở Việt Nam đã được chẩn đoán từ lâu.
Gần đây, số bệnh nhân sán lá gan ngày càng tăng, đặc biệt là ở miền Trung và
Nam (Lê Quang Hưng và cs. 2003; Trần Vinh Hiển và cs. 2006). Riêng tại
phòng khám Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Quy Nhơn đã khám và
điều trị cho khoảng 2.600 bệnh nhân nhiễm sán lá gan lớn. Số ca bệnh cao
nhất tại các tỉnh miền Trung và Tây Nguyên, đặc biệt các tỉnh Quảng Nam,
Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Gia Lai (Nguyễn Văn Chương và cs.
2009). Điều tra cắt ngang tại cộng đồng ở Quảng Nam, Quảng Bình, Bình

13

Định, Phú Yên và Gia Lai cho thấy tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn từ 0,2-2,1%

bằng xét nghiệm phân và 2,4-9,5% bằng ELISA (Lê Quang Hưng và cs.
2003; Đỗ Ngọc Ánh và cs. 2011). Tại các tỉnh miền Bắc, theo số liệu của
Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương trong gần 3 năm (2009-
2011) số ca bệnh sán lá gan lớn đến khám và điều trị tại Viện chiếm 4,6-8,0%
tổng số bệnh nhân nhiễm giun sán đều trị tại Viện, tuy nhiên bệnh nhân chủ
yếu đến từ Nghệ An, Thanh Hóa và Hà Tĩnh.
Một số trường hợp bệnh nhân được phát hiện với dấu hiệu sán ký sinh lạc chỗ
trên người, dưới da vùng bụng ở một phụ nữ 40 tuổi tỉnh Gia Lai (Xuan et al.
2005), đầu gối của một bé gái 11 tuổi ở Hà Tây và từ tuyến vú ở phụ nữ 48
tuổi từ tỉnh Quảng Bình (Nguyễn Văn Đề và cs. 2006).
1.3.4. Tình hình nghiên cứu về vật chủ trung gian của sán lá gan lớn
Trước đây, vật chủ trung gian của sán lá gan lớntại Việt Nam được thông báo
là 2 loài ốc L. viridis và L. swinhoei(Phan Địch Lân 1985).Ở Việt Nam có ít
tài liệu về ốc Lymnaea. Duy nhất trong cuốn sách “Định loại động vật không
xương sống nước ngọt Bắc Việt Nam” của Đặng Ngọc Thanh và cs. (1980)
mô tả 2 loài L. viridis và L. swinhoei ở miền Bắc Việt Nam. Mặt khác, có rất
ít nghiên cứu về sinh thái của 2 loài ốc này. Duy nhất có công trình của Phan
Địch Lân (1985) cho thấy ốc L. viridis phân bố rộng ở tất cả các vùng, ở vùng
núi chiếm 75% trong số 2 loài ốc Lymnaea, còn ở vùng trung du chiếm
66,5%, ven biển chiếm 51,5% và vùng đồng bằng là 42,0%. Loài L. swinhoei
phân bố hẹp hơn, tập trung chủ yếu ở đồng bằng và ven biển, ở vùng núi và
trung du ít hơn, đặc biệt ở miền núi rất ít, có nhiều nơi không có. Cũng theo
Phan Địch Lân (1985), trứng ốc có thể nở được quanh năm với tỷ lệ rất cao,
từ 89,1-100% và thời gian nở rất nhanh, mùa hè cần 5,5 ngày, mùa đông xuân
là 8,5 ngày. Về hình thái, có thể phân biệt cá thể trưởng thành của 2 loài ốc
này, tuy nhiên với những cá thể còn non thì việc phân biệt 2 loài này không
phải dễ dàng (Đặng Ngọc Thanh và cs. 1980; Phạm Ngọc Doanh và Nguyễn

14

Thị Lê 2005;Phạm Ngọc Doanh và cs. 2012; Dung et al. 2013).Vì vậy, còn có
những thông báo khác nhau về vai trò vật chủ trung gian truyền bệnh sán lá
gan của 2 loài ốc này.
Phan Địch Lân (1985) thông báo cả 2 loài ốc L. viridis và L. swinhoei
đóng vai trò là vật chủ trung gian của sán lá gan.Nguyễn Trọng Kim và Phạm
Ngọc Vĩnh (1997) cũng thông báo cả 2 loài ốc Lymnaea đều bị nhiễm ấu trùng
sán lá gan với tỷ lệ nhiễm rất cao 43,1-62,1% ở tỉnh Hà Bắc (cũ).Cũng theo
Nguyễn Trọng Kim (1997) công bố tỷ lệ nhiễm trung bình ở các tỉnh miền Bắc
ở ốc L. swinhoei là 20,8% và ở ốc L. viridis là 19,6%.Vũ Sĩ Nhàn và cs. (1989)
cũng cho thấy ốc L. swinhoei ở Đak lak nhiễm ấu trùng sán lá gan với tỷ lệ là
40,0-50,0 %.Hồ Thị Thuận và Nguyễn Ngọc Phương (1987) cũng công bố cả 2
loài ốc ở các tỉnh miền Nam đều là vật chủ trung gian của sán lá gan, nhưng tỷ
lệ nhiễm nhiễm rất thấp (1,1%). Trong khi đó, Nguyễn Thị Lê và cs. (1995)
không tìm thấy ấu trùng sán lá gan từ hơn 1.000 ốc Lymnaea ở tỉnh Hà Tây
(cũ). Gần đây, Dang and Nawa (2005) công bố 1,2-2,1% ốc Lymnaea ở tỉnh
Bình Định bị nhiễm ấu trùng sán lá gan; Đỗ Đức Ngái và cs. (2006) thông báo
tỷ lệ nhiễm ở ốc L. swinhoei ở Đak Lak là 0,45%. Kết quả điều tra của Phạm
Ngọc Doanh và Nguyễn Thị Lê (2005) cho thấy chỉ 0,06% và 1% ốc L. viridis
ở Đông Anh và Phú Xuyên, Hà Nội bị nhiễm ấu trùng sán lá gan. Phạm Ngọc
Doanh và cs. (2012) điều tra trên toàn quốc chỉ phát hiện ấu trùng sán lá gan ở
ốc L. viridis với tỷ lệ thấp từ 0,6-4,0%. Dung et al. (2013) cũng chỉ phát hiện
ốc L. viridis bị nhiễm ấu trùng sán lá gan.
Như vậy, có thể nói vấn đề định loại sán lá gan lớn Fasciolaspp. và ốc
vật chủ trung gian của chúng ở Việt Nam chưa được thống nhất giữa các
nghiên cứu.Xác định chính xác những vấn đề này rất quan trọng đối với khoa
học và thực tiễn, giúp cho công tác phân loại, tiến hóa và phòng chống bệnh
sán lá gan ở người và động vật, và cần được làm sang tỏ.


15

CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG
PHÁPNGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu:Sán lá gan lớnFasciola spp. ở Việt Nam.
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
- Nghiên cứu tại thực địa: Thu mẫu sán lá gan lớn ở bò tại lò mổ của 3 tỉnh
thành đại diện cho 3 miền: Bắc, Trung, Nam là Hà Nội, Nghệ An và Tây
Ninh.
- Phân tích phòng thí nghiệm:
+ Khoa Sinh học Phân tử - Viện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn Trùng
Trung ương.
+ Phòng Ký sinh trùng – Viện Sinh thái và tài nguyên Sinh vật.
2.2.2.Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 01/ 2013 – 12/2014.
2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Đặc điểm hình thái sán lá gan lớn thu từ bò tại lò mổ ở Hà Nội, Nghệ
An và Tây Ninh.
2.3.2. Đặc điểm phân tử trình tự ITS1-5.8S rDNA-ITS2 của sán lá gan lớn.
2.3.3. Sự phát triển của trứng sán lá gan lớn và đặc điểm sinh học của
miracidium.
2.3.4. Tính mẫn cảm của ốc Lymnaeidae với ấu trùng sán lá gan lớn qua gây
nhiễm thực nghiệm.
2.3.5. Sức sống của metacercaria sán lá gan lớnở các nồng độ muối.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp thusán lá gan lớn trưởng thành từ bò:
- Mua gan, túi mật của bò từ các lò mổ tại địa điểm nghiên cứu. Dùng
dao rạch ống dẫn mật ở gan và túi mật để thu sán trưởng thành, rửa sạch sán
bằng nước muối 0,85%. Các mẫu sán dùng cho nghiên cứu hình thái đượcđặt

16

giữa 2 lam kính (nhưng không dùng lực ép) trong dung dịch Bouine trong 30
phút, sau đó bảo quản trong cồn 70%.
- Các mẫu dùng để nghiên cứu phân tử được bảo quản trong cồn tuyệt đố.
2.4.2. Phương pháp thu trứng sán từ bò
- Lấy chất dịch từ túi mật bò bị nhiễm sán lá gan lớn lọc bằng nước cất đến
khi sạch để theo dõi sự phát triển của trứng.
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu hính thái sán lá gan lớn
- Chọn 55 mẫu sán trưởng thành (có trứng ở tử cung) ở mỗi địa điểm nghiên
cứu, gồm các mẫu sán có hình thái và kích thước khác nhau, làm tiêu bản cố
định bằng cách nhuộm carmine alumine.(Periago et al 2006)
- Sán được đo kích thước chiều dài và chiều rộng cơ thể, từ đó tính tỷ lệ chiều
dài/rộng (BL/BW) và đo khoảng cách từ mép sau giác bụng đến mút cuối cơ thể.
2.4.4. Phương pháp nghiên cứu phân tử
- Chọn đoạn ITS1-5.8S-ITS2 của gen nhân để phân tích.
- Mẫu nghiên cứu gồm: các mẫu sán lá trưởng thành có hình thái khác nhau
tại 3 địa điểm nghiên cứu.
- Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu nghiên cứu bằng DNeasy kit (QIAgen).
- Nhân bản trình tự đích bằng kỹ thuật PCR: sử dụng cặp mồi BD1: 5’-
GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3’và BD2: 5’-TATGCTTAAATT
CAGCGGGT-3’ (Oskouei et al. 2001).Kiểm tra sản phẩm PCR bằng gel
Agarose 2%. Tinh chế sản phẩm PCR bằng bộ hóa chất QIAquick PCR
purification kit.
- Phản ứng giải trình tự được tiến hành với bộ kit Big-Dye terminator cycle
sequencing kit v3.1 (ABI). Trình tự được đọc trực tiếp bằng máy tự động ABI
3100. Đối chiếu các trình tự thu được với các trình tự trong ngân hàng gen
bằng chương trình BLAST. Sử dụng chương trình phần mềm MEGA6
(Tamura et al. 2013) để xử lý, phân tích số liệu, xây dựng cây phát sinh chủng
loại và đánh giá mối quan hệ tiến hóa.