Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor

BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
NGHIÊN CỨU ĐỘC ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG
TRÊN KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT THựC NGHIỆM CỦA
DẪN XUẤT ARTEMISININ GẮN FLUOR
( KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHÓA 2000- 2005 )
Người hướng dẫn : TS. NGUYỄN XUÂN TRƯỜNG
TS. TRƯƠNG VĂN NHƯ
Nơi thực hiện ; VIỆN SỐT RÉT KST - CT TW
Thời gian thực hiện : 10/2004 - 4/2005
HÀ NỘI 5- 2005
í è s € ẩ m ( 0 M
(Đểẩạt được những quả trong quá trình nghiên cứu ểề tài nảy, tồi ấã
ấược các thầy cô ßido ẫưóng ấẫn chi sảo nũỉệt tìníi. Vói ßnß ^n fi trọng và
Siết ơn sâu sắc, tôi jận chân tíiành cầm ơn:
Ts. 9i£uyen Xuân Thtdnß
‘25’. Trươtĩ£ Văn íNíiư
Là nẫững người trực tữ ị hưóng cC ẩ n tôi trong quá trình tdực íiiện ^ o ấ
íuận này.
‘Toi jận cíiân tíiành cảm ơn các tdầy cô, anh cfd nßimn cứu, ^ tíiuật
vừn tại Viện Sốt %ySinH ‘Trùng Côn Tninß Trung Vơng, Sộ môn ấược
[ý, các Sộ môn và cácpãòng San trường đại học (Dược !Hâ !Nọi đã tận tìníi
fiu0nß dẫn, ßitip đõ và tạo ấ i ề u tíiuận Cợi cho tôi hoàn thàníi ^ o á Cuận
tốt ngßiäp nảy.
Xin cầm ơn cíia mẹ, người tẫân và Sạn Sè ấãgiúp đd, ấộng viên tồi trong
suốt quá trìníi tíiực hiện đề tài này.
Hà Nội ngày 27 tháng 5 năm 2005
SinH vữn: (Đô ĩCữu ‘Tài
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
- KSTSR
- BNSRAT

- WHO (World Health Organization)
-ART
- DHA
- P.
- LD5Q (Lethal Dose 50%)
- IC^o (Inhibitory Concentration 50%)
Ký sinh triàng sốt rét
Bệnh nhân sốt rét ác tính
Tổ chức y tế thế giới
Artemisinin
Dihydroartemisinin
Plasmodium
Liều chết 50% động vật thí
nghiệm.
Nồng độ ức chế 50% ký sinh
trùng phát triển
MIC (Minimum Inhibitory Concentration) Nồng độ tối thiểu ức chế ký
sinh trùng phát triển
BB 101 lO a-trifluoromethyl
dihydroartemisinin
BB 134 16-piperazinoethanol lOa-
triíluormethyl-
anhydrodihydroartemisinin
MỤC LỤC
Đặt vấn đ ề 1
Phần l.Tổng quan 2
1.1. Tình hình sốt rét trên thế giới và Việt Nam

2
1.2. Tmh hình nghiên cứu artemisinin và các dẫn xuất

4
1.2.1. Nguồn gốc, cấu trúc và tích chất của artemisinin
4
1.2.2. Một số dẫn xuất của artemisinin 4
1.2.3. Hoạt tính chống sốt rét của artemisinin và dẫn xuất 5
1.2.4. Cơ chế tác dụng của artemisinin và dẫn xuất

5
1.2.5. Nhược điểm của artemisinin và các dẫn xuất
6
1.3. Tình hình nghiên cứu dẫn xuất artemisinin gắn fluor

7
1.3.1. Sơ lược qui trình tổng hợp các dẫn xuất artemisinin gắn fluor 7
1.3.2. Đặc điểm và quá trình nghiên cứu các dẫn xuất artemisinin gắn
fluor 8
1.4. Các kỹ thuật liên quan đến nghiên cứu

12
1.4.1. Kỹ thuật nghiên cứu in vitro 12
1.4.2. Kỹ thuật nghiên cứu in vivo
13
Phần 2.Thực nghiệm và kết quả
.
14
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 14
2.1.1. Nguyên vật liệu 14
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu 14
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 18

2.2.1. Xác định độc tính cấp LD50 của BB 134
18
2.2.2. Thử nghiệm in vitro trên Plasmodium falciparum nuôi cấy

21
2.2.3. Thử nghiệm in vivo trên mô hình chuột nhắt nhiễm Plasmodium
berghei 23
2.3. Bàn luận 27
Phần 3. Kết luận và đề xuất 31
Tài liệu tham khảo
ĐẬT VẤN ĐỂ
Sốt rét là một bệnh truyền nhiễm khá phổ biến trên thế giới. Trong thời
gian gần đây sốt rét có chiều hướng gia tăng, đặc biệt là tại các vùng khí hậu
nhiệt đới và cận nhiệt đói.
Khó khăn nhất trong công tác phòng chống sốt rét là do ký sinh trùng sốt
rét (KSTSR) Plasmodium falciparum ị p. falciparum) đã kháng lại chloroquin
và hầu hết các thuốc sốt rét khác. Sự kháng thuốc sốt rét của p. falciparum đã
làm tăng số người mắc sốt rét, tăng các vụ dịch và tăng tỷ lệ tử vong.
Artemisinin được các nhà khoa học Trung Quốc chiết xuất lần đầu tiên
vào năm 1972 từ cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L), sau đó nhanh
chóng trở thành một thuốc điều trị sốt rét hàng đầu, đặc biệt là sốt rét ác tính.
Sau đó nhiều dẫn xuất mới của artemisinin đã được bán tổng hợp như:
dihydroartemisinin, artesunat, tuy nhiên cũng giống như artemisinin tất cả
các thuốc này đều có nhược điểm là tỷ lệ tái phát vẫn còn rất cao. Do đó, mục
tiêu hiện nay của các nhà khoa học là tìm ra một thuốc điều trị sốt rét mới vừa
có khả năng cắt sốt nhanh lại vừa giảm thiểu tỷ lệ tái phát.
Một trong các dẫn xuất được quan tâm nhiều nhất là các dẫn xuất của
artemisinin gắn flúor. Các nhà khoa học Pháp đã nghiên cứu và tổng hợp
thành công dẫn xuất của artemisinin gắn flúor ký hiệu là BB 134. Những thử
nghiệm ban đầu tại Pháp cho thấy thuốc có nhiều triển vọng trong điều trị sốt

rét. Trong khuôn khổ công trình nghiên cứu hcfp tác giữa Viện SR KST- CT
TW và nhóm nghiến cứu CNRS- BIOCIS, Khoa dược, Đại học Paris XI,
Chatenay- Malabry 92296, France về đề tài “ Tổng hợp và phát triển tiền lâm
sàng các dẫn xuất gắn flúor”, chúng tôi thực hiện một phần nhánh đề tài:
''Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên ký sình trùng sốt rét
của dẫn xuất artemisinin gắn flúor BB 134” với mục tiêu:
1. Xác định độc tính cấp (LD50) của BB 134.
2. Đánh giá tác dụng trên KSTSR p. falciparum nuôi cấy và trên
chuột nhắt trắng nhiễm KSTSR p. bergei của chất BB 134.
PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1. Tình hình sốt rét trên thế giới và Việt Nam
1.1.1.Tình hình sốt rét trên thế giới:
Ngày nay trên thế giới sốt rét (SR) vẫn là một bệnh truyền nhiễm phổ
biến, ảnh hưởng rất lớn đến sức khoẻ con người cũng như sự phát triển kinh tế
xã hội của các nước trên thế giói. Bệnh SR phân bố rộng khắp tất cả các vùng
trên thế giới nhưng chủ yếu tập trung ở vùng khí hậu nhiệt đói và cận nhiệt đới
như: các nước phía nam sa mạc Sahara, Đông Nam Á, Ấn Độ, Châu Đại
Dương, Trung và Nam Mỹ [24]. Hiện nay SR lưu hành ở hơn 100 quốc gia và
vùng lãnh thổ, mỗi năm có từ 300 - 500 triệu ngưctì mắc SR và khoảng 1 -1,5
triệu người tử vong vì SR [29, 30].
WHO đã đề ra chiến lược thanh toán SR toàn cầu vào năm 1955 với việc
kết hợp sử dụng DDT diệt muỗi, sử dụng thuốc chống SR và giám sát chặt chẽ
dịch bệnh. Tuy nhiên chỉ sau đó vài năm dịch bệnh lại bùng phát trở lại [23].
Nguyên nhân chủ yếu gây bùng phát trở lại của dịch SR trên thế giới là
do sự gia tăng kháng thuốc của KSTSR, đặc biệt là KST p. falciparum. Chủng
KST p. falciparum không chỉ kháng chloroquin mà còn kháng nhiều loại
thuốc khác như hỗn hợp pyrimethamin- sulfadoxin, giảm nhạy với quinin,
mefloquin. Những vùng có tỷ lệ kháng cao là Thái Lan, Việt Nam,
Campuchia, vùng Amazon của Nam Mỹ và đang gia tăng ở Đông Phi [21].
Chính sự kháng thuốc hiện nay đang là một trở ngại lớn cho công tác phòng

chống SR trên thế giới và tại mỗi quốc gia. Chính vì vậy, nhu cầu về thuốc SR
mới đang là vấn đề cấp thiết hơn bao giờ hết để thực hiện mục tiêu này.
1.1.2. Tình hình ở Việt Nam:
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ và độ ẩm
rất thích hợp cho bệnh SR lưu hành và phát triển. Hiện tại Việt Nam có hơn
3/4 diện tích và trên 1/3 dân số sống trong vùng có SR lưu hành [9].
Trước năm 1980, tuy có nhiều biện pháp phòng chống SR nhưng SR chỉ
giảm một thời gian và lại bùng phát trở lại với đỉnh cao là năm 1991 với số
người mắc trên 1 triệu người và 4.646 người tử vong [2]. Những năm sau đó tỷ
lệ mắc và tử vong có giảm nhưng diễn biến còn rất phức tạp.
Bảng 1.1. Diễn biến sốt rét năm 1991- 2003 [2,18]
Năm BNSR
BNSRAT Sô vụ dịch SR
Tử vong
1991
1.091.257
31.741 144
4.646
1995 666.153
4.222 3
348
2 00 0
293.016 1.161
2
148
200 1 257.793
878 1 91
2 00 2
185.529 599
0

50
2003
164.706 423
2
50
Việc bùng phát SR ở nước ta như vậy nguyên nhân chủ yếu cũng là do
KSTSR kháng thuốc đặc biệt là p . falciparum. Năm 1961 đã phát hiện KSTSR
p. falciparum kháng chloroquin tại Nha Trang , cho đến năm 1995 đã xác
định p. falciparum kháng chloroquin tại 100% vùng SR ở các tỉnh miền Nam
và lan rộng ra nhiều tỉnh miền Bắc [16]. KST p. falciparum đã kháng
chloroquin và hầu hết các thuốc điều trị sốt rét khác như: hỗn hcfp sulfadoxin-
pyrimethamin, primaquin, quinin Đối với artemisinin và các dãn xuất như
artesunat, dihydroaitemisinin, chưa thấy hiện tượng kháng thuốc nhưng
trong điều trị thường xảy ra tái phát với tỷ lệ khá cao như artemisinin; tái phát
36,9% [11], artesunat liệu trình 5 ngày: tái phát sớm khoảng 30% [13]. Tình
hình KSTSR kháng thuốc ở Việt Nam ngày càng phức tạp và lan rộng. Chính
vì vậy việc nghiên cứu và tổng hợp ra những thuốc diệt KSTSR kháng thuốc
trong thời điểm hiện nay là rất cần thiết.
1.2. Tình hình nghiên cứu artemisinin và các dẫn xuất
1.2.1. Nguồn gốc, cấu trúc và tích chất của artemisinin
Artemisinin là một hoạt chất chống SR được chiết xuất từ cây Thanh hao
hoa vàng tên khoa học là Artemisia annua L., họ cúc Arteraceae.
Artemisinin có công thức phân tử là CjsHjiOj, với công thức cấu tạo
đươc xác đinh như sau:
15 C H 3
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của artemisinin
Artemisinin là 1 sesquiterpen lacton có cầu peroxid nội phân tử, trong đó
hoạt tính chống SR chủ yếu dựa vào cầu peroxid này. Trong công thức trên
vòng A là dạng cycloxan, vòng D là vòng lacton, còn vòng B và c đều là dị
vòng bão hoà trong đó vòng c là một trioxan, dạng có liên quan đến hoạt tính

chống SR của artemisinin [12].
Artemisinin ít tan trong cả dung môi phân cực và không phân cực, rất dễ
thủy phân vòng lacton trong dung môi phân cực. Do vậy sinh khả dụng (SKD)
và độ bền vững của artemisinin không cao. Đây cũng chính là những hạn chế
của artemisinin khi sử dụng làm thuốc điều trị [14].
1.2.2. Một số dẫn xuất của artemisinin
Nhằm tăng cường hiệu lực chống SR và khả năng hoà tan của
artemisinin, năm 1976 các nhà khoa học Trung Quốc đã tiến hành thay đổi
cấu trúc hoá học của artemisinin bằng cách khử hoá artemisinin bằng natri
borohydric tạo ra dihydroaitemisinin (DHA). Từ DHA các nhà khoa học tiếp
tục tổng hợp các dẫn xuất acetal bằng các phản ứng ether hoá và este hoá [12].
15 QH3
R= -H : dihydroartemisinin (DHA)
R= - CH3 : artemether
R= -C2H5 : arteether
R=-CO-CH2-CH2-COONa: artesunat
R= -0 -CH2-C6ỈỈ4-C0 0 N a; aitelinat
Hình 1.2. Công thức cấu tạo các dẫn xuất của artemisinin
1.2.3. Hoạt tính chống sốt rét của artemisinin và dẫn xuất
Artemisinin và các dẫn xuất có nhiều ưu điểm mà các thuốc chống SR
trước không có như: chúng diệt nhanh các thể phân liệt trong máu và không có
sự đề kháng chéo với các thuốc SR khác. Các nghiên cứu cho thấy với nồng độ
10'^ mol/1 KST p. falciparum hoàn toàn bị ức chế không phát triển in vitro
được và thuốc có tác dụng trên cả KSTSR nhạy và kháng thuốc [5]. Nhóm
thuốc này nhanh chóng làm sạch KSTSR trong máu bệnh nhân kể cả KSTSR
đa kháng với thòi gian làm sạch trung bình là 2 ngày, thời gian cắt sốt cũng
tương tự [1]. Các thử nghiệm trên các chủng p. bergei, p.cylnomolgy và
p.knowlesi đều cho thấy các dẫn xuất khác đều có tác dụng tốt hofn
artemisinin, trong đó DHA là có tác dụng tốt nhất trong nhóm [25]. Cũng theo
các nghiên cứu này cho thấy, nhóm thuốc này có tác dụng không đáng kể tới

giao bào p. falciparum khi non (ở nồng độ gấp 1 00- 1000 nồng độ diệt thể vô
tính) và không có tác dụng với thể tiền hồng cầu cũng như với thoa trùng. Do
đó trong điều trị artemisinin và các dẫn xuất thường được kết hợp vói các loại
thuốc khác như: primaquin nhằm diệt hết các thể của KSTSR.
1.2.4. Cơ chế tác dụng của artemisinin và dẫn xuất
Theo Meshnick, artemisinin và các dẫn xuất đều có một cơ chế tác dụng
chung, đó là thông qua cầu peroxit nội phân tử (hình 1.3). Khi vào máu thuốc
gắn với hemozoin- dạng polymer của hem được tích luỹ trong các không bào
tiêu hoá sau khi KST sốt rét tiêu hoá hemoglobin, hemozoin (có chứa Fe^"^)
khử nhóm peroxit tạo ra các gốc tự do. Chính các gốc tự do này gây ra các tổn
hại tế bào KST sốt rét như: peroxy hoá lipid, oxy hoá protein, alkyl hoá
protein, và tiêu diệt chúng [28]. Do hemozoin là sản phẩm của KSTSR sau
khi tiêu hoá Hb nên thuốc chủ yếu tập trung trong các hồng cầu nhiễm. Điều
này giải thích tại sao nhóm thuốc này lại diệt KST sốt rét nhanh hơn hẳn các
nhóm thuốc trước đó. Cơ chế tác dụng này được củng cố thêm nhờ rất nhiều
thí nghiệm như sự ức chế tác dụng của thuốc bằng các chất khử (phá huỷ cầu
peroxit) như: a - tocoferol, vitamin c, trái lại các chất ức chế tổng hợp
glutathion lại tăng cường tác dụng của thuốc. Ngoài ra, nghiên cứu cấu trúc p.
falciparum còn cho thấy các tổn thương của KST ở không bào tiêu hoá, ti lạp
thể và màng tế bào [28].
H^c
Activatmn
Fe
(fre® or
h#rri©-boynci)
(fr®# radical m
@iectrophiỉỉc
intermediate)
A lkvtn tton
lyialaria target

proteins
Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của artemisinin và dẫn xuất [28].
1.2.5. Nhược điểm của artemisinin và các dẫn xuất
Khi sử dụng đưcmg uống artemisinin và các dẫn xuất này đều bị thuỷ
phân mạnh bởi acid dịch vị; artemisinin bị thuỷ phân vòng lacton, trong khi đó
các dẫn xuất acetal bị thuỷ phân nhóm acetal tại Cio (tạo ra DHA). Do đó,
SKD của thuốc giảm và thuốc hấp thu chậm hơn. Các nghiên cứu về SKD của
arteether cho thấy ở điều kiện dịch axit pH = 2,0; nhiệt độ 37°c, arteete không
bền, rất dễ bị thuỷ phân và một lượng arteete khá lớn bị thuỷ phân mất đi
trong dạ dày trước khi thuốc đến được ruột non để được hấp thụ. Nếu pH ở dạ
dầy bằng 2, thời gian bán phân huỷ của arteete khoảng 50 phút và như vậy
chúng ta có thể chờ đợi từ 25 - 75% arteete bị phân huỷ suốt trong thời gian
đó, trước khi có thể đến các bộ phận khác [19].
Do kém bền với chuyển hoá (thuỷ phân và oxy hoá bed enzym cytocrom
P450 trong gan) nên artemisinin, DHA và các dẫn xuất acetal đều có thời gian
bán thải (ti/2) ngắn. Thử nghiệm trên người tình nguyện cho thấy: tj/2 đường
uống của artemisinin và aitemether là từ 1- 3h, của artesunat theo đường tiêm
tĩnh mạch chỉ là 45 phút [28]. Do đó khi sử dụng artemisinin và dẫn xuất
trong điều trị thường xảy ra tái phát với tỷ lệ cao. Điều này càng rõ khi tăng
thời gian điều trị (từ 5- 7 ngày) thì tỷ lệ tái phát giảm [1]. Ngoài ra, theo các
nghiên cứu tại Pháp cho thấy các sản phẩm thuỷ phân và oxy hoá của các dẫn
chất acetal còn gây độc đối với thần kinh trên chuột thí nghiệm [24].
1.3. Tình hình nghiên cứu dẫn xuất artemisinin gắn fluor
1.3.1. Sơ lược qui trình tổng hợp các dẫn xuất artemisinin gắn fluor
Các nhà khoa học Pháp đã nghiên cứu và tổng hợp ra các hợp chất
artemisinin gắn fluor trong đó có BB 134. Công thức được xác định như sau:
F3C OH
(I ): lOa- trifluoromethyl dihydroartemisinin (BBIOI)
(II): Nu =
-OH

: 16-piperazinoethanol 10a-trifluormethyl-
anhydrodihydroaitemisinin (BB 134)
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của các dẫn xuất artemisinin gắn fluor [24]
Để tổng hợp ra các dẫn xuất artemisinin gắn fluor, từ BB 101 người ta
loại nước tạo ra 10-trifluoromethyl anhydrodihydroartemisinin, từ đó tổng hợp
ra các dẫn xuất khác theo sơ đồ sau:
\
H,c
NBS
I
lÒỊ 16
CF,
Hình 1.5. Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất artemisinin gắn Flour [24]
1.3.2. Đặc điểm và quá trình nghiên cứu các dẫn xuất artemisinin
gắn flúor
Để khắc phục nhược điểm kém bền tại vị trí Cjo của artemisinin và các
dẫn xuất trước các nhà khoa học đã tìm cách thay thế nhóm -C=0, nhóm
acetal và hemiacetal ở Cio bẵng các nhóm chức bền vững hơn nhằm tăng độ
bền với các enzm oxy hoá và ngăn cản sự thuỷ phân của acid dạ dày đối với
thuốc.
Trong các nghiên cứu ban đầu, các nhà khoa học tiến hành thay thế các
liên kết kém bền với chuyển hoá là c=0 (artemisinin), C-O (acetal và bán
acetal) tại Cio bằng liên kết C-C bền vững hcfn. Kết quả cho thấy rằng một
loạt các dẫn xuất của artemisinin chứa liên kết C-C ở vị trí c 10 (dẫn xuất
không acetal) có độ bền gấp 15 đến 20 lần so với những dẫn xuất cùng loại có
chứa nhóm acetal -C-O ở vị trí Cio trong điều kiện thí nghiệm axit gần giống
trong dạ dày. Dưới đây là kết quả cho thấy điều đó [20].
Bảng 1.2. Độ ổn định của các dẫn xuất artemisinin dạng acetal C-O và
không acetal C-C trong dung dịch acid lmg/ml(HCl 0,01N; pH=2,0;37‘*C)
Hợp Chất

Ti/2
Dang acetal
Artemisinin
23,5
Dihydroartemisinin
17,9
Arteete
10,98
Artelinic axit
13,11
Dạng không acetal
Deoxoartemisinin (DOA)
213,36
10-(n-butyl)-DOA
165,12
10-benzyl-DOA
385,6
10-cacboxypropyl-DOA
386,88
10-cacboxybutyl-DOA 374,4
Ngoài ra, các kết quả nghiên cứu còn cho thấy hoạt tính chông sôt rét ỉn
vitro của dạng không acetal mạnh hơn 8 - 9 lần so với dạng acetal.
Dựa vào các nghiên cứu này, các nhà khoa học Pháp chủ tnicfng gắn một
nhóm chức bền vững với chuyển hoá là -CF3. Việc gắn nhóm -CF3 có hai ưu
điểm: một mặt thay thế liên kết kém bền C-O (acetal) bằng liên kết bền hơn là
C-CF3, mặt khác liên kết C-F do đặc điểm bền vững của nó với các phản ứng
oxy hoá và thuỷ phân nên tính bền vững các dẫn xuất có gắn nhóm -CF3 càng
được tăng cường. Tính bền vững đối với acid dịch vị do nhóm -CF3 đã được
chứng minh bằng các thí nghiệm tiến hành tại Pháp, có thể minh hoạ theo sơ
đồ sau:

9H3
H+
Hình 1.6. Cơ chế proton hoá của acid dịch vị [24].
Theo sơ đồ trên, do nhóm -CF3 là nhóm hút điện tử nên nó ngăn cản quá
trình proton hoá của acid dịch vị tại vị trí Cjo, do đó tăng cường độ bền vững
của nhóm dẫn xuất này trước tác động của acid dịch v ị.
Như vậy với việc gắn nhóm -CF3 bền vững vói chuyển hoá sẽ làm tăng độ
bền của thuốc trước các tác nhân thuỷ phân và oxy hóa góp phần làm tăng
SKD, giảm thời gian hấp thu thuốc và giảm các tác dụng gây độc đối với thần
kinh [24]. Nhiều thử nghiệm ban đầu trên BB 101 đã được tiến hành tại Pháp
cũng như Việt Nam cho thấy những ưu điểm đặc biệt của chất này trên
KSTSR cả in vitro và in vivo.
Thử nghiệm tại Pháp cho thấy BB 101 không có dấu hiệu độc thần kinh
đối với chuột thí nghiệm. Còn thử tác dụng in vivo và in vitro BB 101 cho tác
dụng hơn hẳn DHA và các dẫn xuất của chúng trên cả đường uống và đường
phúc mạc [24].
Tại Việt Nam, BB 101 đã được thử nghiệm tại Viện sốt rét - KST- CT
T ư năm 1999. Kết quả nghiên cứu cho thấy BB 101 có tác dụng diệt KST
mạnh và nhanh hơn artemisinin (ART). Nồng độ ức chế 50% KST phát triển
(IC50) là 4,4 nmol/1 với chủng nhạy chloroquin và 4,6 nmol/1 với chủng kháng
chloroquin, nồng độ này thấp hơn ART 3 lần. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
của BB 101 là 10 nmol/1, thấp hơn MIC của ART 3 lần. Trên chuột nhắt trắng
nhiễm
p. berghei BB 101 có tác dụng với liều 50 mg/kg, 100% chuột sạch
KST sau 24 giờ điều trị và tỷ lệ khỏi bệnh 100%, chưa thấy KST tái phát
trong vòng 60 ngày đối với cả chủng nhạy và kháng chloroquin [2 0 ]
Tuy nhiên điểm hạn chế của BB 101 là vẫn còn nhóm methyl tại Cj6, do
đó độ tan của BB 101 kém, điều này sẽ ảnh hưởng tới SKD của thuốc, đặc biệt
khi dùng đưòỉng uống. Để khắc phục nhược điểm này các nhà khoa học Pháp
đã tiến hành gắn các nhóm thế khác nhau vào vị trí Cj6 nhằm cải thiện độ tan

của các dẫn chất gắn fluor trước đó. Trong các dẫn chất chứa nhóm thế tại C16
được tổng hợp, hợp chất BB 134 ngoài các ưu điểm về độ bền vững như các
dẫn xuất artemisinin gắn flúor cùng loại, nó còn có nhóm chức
piperazinoethanol ở Cj6, chính điều này cải thiện đáng kể độ tan cũng như tác
dụng của chúng trên in vivo. Theo những nghiên cứu ban đầu tại Pháp, BB 134
là một trong những hợp chất artemisinin gắn flour chứa nhóm thế tại Ci6 có
hiệu lực mạnh nhất đối với KSTSR cả in vitro và in vivo. Dưói đây là một số
kết quả nghiên cứu ban đầu được tiến hành tại Pháp [24].
Bảng 1.3. Thử in vitro trên chủng kháng chloroquin p. falciparum
FcBl(a) và W2(b)
Hợp Chất
ICso
Artemether
3,5 ± 1,2"
BB 134
15,2 ± 6 , t
Bảng 1.4. Thử in vivo đối vói chủng kháng chỉoroquin p. bergei NK173
trên chuột nhắt trắng vói liều 35,5 p,mol.kg'^ X 5 ngày đưòtig phúc mạc
Hợp Chất
Mật Độ KST
ngày thứ 4
Mật Độ KST
ngày thứ 1 1
Tỷ lệ chuột sống
sau 2 0 ngày
Artemether
0
32
5/5
BB 134

0,5 37
5/5
Bảng 1.5. Thử in vivo đối với chủng kháng chỉoroquỉn p. bergei N trên
chuột nhắt trắng theo đường uống
Hợp Chất
ED5Q
(mg/kg)
ED9Q
(mg/kg)
Tỷ lệ giảm mật độ KST ở ngày
thứ 4 với liều lOmg/kg (%)
Artesunat
2 , 8 10,5
90
BB 134
< 1 0
< 1 0
1 0 0
Bảng 1.6. Các thông số dược động học thử nghiệm trên chuột cống với
liều tiêm tĩnh mạch 1 0 mg/kg hoặc đường uống 50 mg/kg
Các thông số dược động học
Artemether BB 134
T i/2 (ph)
52,2 ± 5,8
55,3
Cl (ml.ph'\kg'^)
114,1 ±20,6
148,7
V, (L.kg-1)
8,4 ± 1,7

1 1 , 8
SKD (%)
1,4 ±0,6
34,6
Độ tan (/ig/mL)
Dạng tiêm (1 )
4700
>3000
Dạng uống (2)
256
675,9
Trong PBS (pH = 7)
63,4
234,5
(1): Artemether: hoà tan trong Captisol/nước nồng độ 0,1M.
BB 134: hoà tan trong dung dịch Captisol/ethanol nồng độ 0,1 M, pH= 3.
(2): artemether và BB 134 được hoà tan vói cùng một loại dung môi gồm:
carboxymethyl cellulose 0,5% (g/ml), benzyl alcohol 0,5% (g/ml), Tween 80
0,4% (ml/ml) trong N ad 0,9% (g/ml).
1.4. Các kỹ thuật liên quan đến nghiên cứu
1.4.1 Kỹ thuật nghiên cứu in vitro
Kỹ thuật nuôi cấy p . falciparum dài ngày: kỹ thuật được sử dụng đầu tiên
là kỹ thuật nuôi cấy KST p. falciparum 24 giờ do Rieckemann cải tiến từ kĩ
thuật cổ điển của Bass- còn gọi là kỹ thuật macrotest [19]. Tuy nhiên kỹ thuật
này có điểm hạn chế là lưọng máu chứa KSTSR dùng cho mỗi lần thử khá lớn
(10-15ml), điều này rất bất lợi cho quá trình nghiên cứu trên lâm sàng cũng
như trong các nghiên cứu đánh giá [26]. Đến năm 1976, phương pháp bình
nến của Träger và Jensen mới được sử dụng rộng rãi như là phương pháp
thường qui trong quá trình nghiên cứu in vitro. Phưofng pháp này dựa trên việc
nuôi cấy p. falciparum dài ngày trong môi trường giàu acid amin( môi trường

RPMI). Nhờ phương pháp này mà nhiều chủng p. falciparum nhạy và kháng
trên thí nghiệm được duy trì liên tục nhằm phục vụ nhu cầu nghiên cứu in
vitro [27].
Kỹ thuật đánh giá hoạt tính của thuốc in vitro, hai kỹ thuật hay được
dùng phổ biến hiện nay là kỹ thuật microtest của WHO do Rieckemann cải
tiến từ kỹ thuật macrotest và kỹ thuật thử đáp ứng của Thaithong- Beale. ư u
điểm của kỹ thuật microtest là lượng máu thử ít và rất tiện lợi khi lấy máu để
nuôi cấy( mỗi thử nghiệm chỉ cần khoảng 50ụ 1 máu chứa p . falciparum) [26].
Kỹ thuật nghiên cứu của Thaithong- Beale (ra đời năm 1981, hoàn thiện vào
năm 1983) cũng được sử dụng khá phổ biến trong việc thử đáp ứng của thuốc
trên KSTSR, Các chỉ số đánh giá trong thử nghiệm in vitro là IC50 (Inhibitory
Concentration 50%- nồng độ ức chế 50% KST phát triển) và MIC (Minimum
Inhibitory Concentration- nồng độ tối thiểu ức chế KST phát triển).
1.4.2. Kỹ thuật nghiên cứu ỉn vivo
Đây là phương pháp thử tác dụng của thuốc đối vói KSTSR trên động vật
gây SR thực nghiệm. Trong lịch sử nghiên cứu in vivo có rất nhiều chủng
KSTSR gây bệnh trên động vật đã được ứng dụng để nghiên cứu về thuốc SR.
Phổ biến nhất là KSTSR gây bệnh ở loài lông vũ (do Danilevski tìm ra năm
1890), KSTSR gây bệnh trên chuột (do Vinke và Lips tìm ra năm 1948) và
trên khỉ (Maier phát hiện ra năm 1907). Mở đầu cho nghiên cứu trên mô hình
SR thực nghiêm là thử thuốc trên p.relictum à ngan do Poehl đề xuất năm
1926 [19]. Cho đến nay chủ yếu chỉ có 3 loại vật chủ trên (lông vũ, chuột, khỉ)
được sử dụng trong nghiên cứu. Tuy nhiên mô hình nghiên cứu trên
Plasmodium bergei ờ chuột vẫn được sử dụng nhiều nhất trong nghiên cứu
hiện nay do sự đơn giản, thuận tiện và kinh tế của nó. Mô hình này còn tỏ ra
hiệu quả hơn khi các nhà khoa học đã phân lập thành công các chủng p.
bergei kháng chloroquin trong phòng thí nghiệm. Điều này góp phần rất quan
trọng trong quá trình nghiên cứu các thuốc SR mới khi mà hiện nay ngày càng
xuất hiện nhiều chủng p . falciparum kháng chloroquin trong quá trình điều trị
SR.

PHẦN 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm
2.1.1. Nguyên vật liệu
* Hoá chất
- Bột BB 134 do khoa dược, nhóm nghiên cứu CNRS- BIOCIS, Khoa
dược, Đại học Paris XI, Chatenay- Malabry 92296, France cung cấp.
- Bột artesunat chuẩn do viện kiểm nghiệm cung cấp.
- Bột gôm Arabic 1% làm dung môi hoà tan artesunat và BB 134.
- Hoá chất, môi trường đầy đủ RPHS, hồng cầu, huyết thanh cho nuôi
cấy, đánh giá tác dụng của thuốc là những chất đạt tiêu chuẩn đang được sử
dụng tại Khoa nghiên cứu điều trị sốt rét Viện SR KST- CT TW.
* Chủng ký sinh trùng sốt rét
- Chủng KSTSR p. bergei của Khoa Nghiên cứu điều trị sốt rét Viện SR
KST- CT gồm có:
+ Chủng p. bergei nhạy với chloroquin - kí hiệu (T)
+ Chủng p. bergei kháng chloroquin - kí hiệu (K70)
- Các phân lập p. falciparum thử nghiệm (được lưu giữ tại băng của Viện
SRKST-CTTƯ) bao gồm:
+ Đơn dòng T96 nhạy chloroquin.
+ Phân lập KI kháng chloroquin.
* Động vật thử nghiệm
Chuột nhắt trắng thuần chủng (Swiss), trọng lượng 22g ± 2 được cung
cấp bởi Viện vệ sinh dịch tễ Hà Nội.
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu
* Xác định độc tính cấp LD50 của BB 134
Xác định liều chết 50% động vật thực nghiệm LD50 (Lethal dose 50%)
theo phương pháp Behrens- Karber: tiến hành thử trên 90 chuột chia thành 9
lô, mỗi lô 10 chuột.
BB 134 được hoà tan trong dung dịch gôm arabic 1%. Mỗi lô chuột được
uống BB 134 với liều từ 100 mg/kg đến 500 mg/kg cân nặng. Khoảng cách

giữa các liều là 50 mg/kg.
Theo dõi các triệu chứng và dấu hiệu của chuột, tính số chuột chết trong
thời gian 72 giờ.
Từ số liệu tính số chết trung bình giữa 2 liều kế tiếp, tỷ lệ % chết. Từ đó
tính LD50 và sai số chuẩn theo công thức;
Ea-d
LD.n = LD,
ntb
J
k sd
n
rijj,: Số chuột thử trung bình mỗi nhóm.
a: số chuột chết trung bình của 2 nhóm liên tiếp,
d: khoảng cách giữa các liều.
k: hằng số Behrens- Karber bằng 0,564
s: phân phối chuẩn, s =
Trong đó LDg4 và LDịộ được xác định thông qua đồ thị tỷ lệ chết- liều
thử.
* Thử tác dụng in vitro của BB 134 trên chủng KST Plasmodium
falciparum nuôi cấy
- Nuôi cấy KST p. falciparum dài ngày bằng phương pháp bình nến
Träger- Jensen:
+ Chuẩn bị môi trường đầy đủ: cho thêm vào môi trưòrng nuôi cấy
(RPMI + glucose + nước cất) dung dịch natri bicarbonat 5% (40|al/ml môi
trường), gentamycin (40|al/ml môi trường) và huyết thanh với nồng độ 10-
15% tuỳ theo nhu cầu.
+ Chuẩn bị HC: HC được rửa 2 lần bằng môi trường không có huyết
thanh và lần thứ 3 bằng môi trường đầy đủ. Tiếp đó pha thành dịch treo 50%,
bảo quản ở 4°c.
+ Chuẩn bị HC nhiễm: Máu nhiễm KST p. falciparum được rửa như

trên (mật độ KST nhiễm < 3%). Chia máu nhiễm vào các đĩa nuôi theo thể
tích tương ứng, cho thêm 1-2 giọt HC nuôi.
+ Cho đĩa nuôi vào bình hút ẩm, đốt nến và khi nến sắp tắt thì đóng
bình để tạo khoảng 5% CO2 + 95% không khí, để bình vào tủ ấm 37°c ± 5®c.
+ Hàng ngày thay môi trường, lấy lam giọt mỏng để theo dõi sự
phát triển của KST. 3 ngày thêm HC nuôi một lần. Nếu KST mọc tốt nhiều
hơn 3% thì nhân ra nhiều đĩa để bảo quản đông lạnh và sử dụng để thử thuốc.
Tỳ lệ HC nhiễm = X 100(%)
SỐ HC đếm được của n vi trường
- Thử thuốc theo phương pháp của Thaithong- Beale (1983).
+ Chuẩn bị thuốc và mẫu thử:
• Bột BB 134 được hoà tan trong hỗn hợp DMSO và Tween 80
và artesunat được hoà tan trong gôm arabicl% để có cùng nồng độ là 10'^
molAit. Sau đó pha loãng bằng nước cất 2 lần để được dãy nồng độ sau:
1.25 X 1 0 ^2.5 X 10-^5 x io ^ 1.10®; 2 X lO l
• Nuôi cấy p. falciparum liên tục trong môi trường đầy đủ
(RPMI 1640 10,40 gr + HEPES 5,94 gr + Glucose 2,0gr + NaHCOg 5%
+ gentamycin + 10% huyết thanh người) theo phương pháp Trager-
Jensen đã trình bày ở trên. Tất cả phải được tiến hành trong điều kiện vô
trùng, các dụng cụ đều phải xử lý vô trùng trước khi đem dùng.
+ Tiến hành:
• Thử nghiệm trên phiến nhựa 96 giếng, mật độ KST khi thử
thuốc là 0,5% hồng cầu nhiễm, dịch treo hồng cầu là 5% (1 0 |4,1), lượng hỗn
dịch thuốc cho vào mỗi giếng là 100 |il. Lắc đều, sau đó đặt phiến nhựa vào
bình nến và để bình vào tủ ấm 37°c ± 5°c. Hàng ngày thay môi trường mới
không có thuốc đối với ống chứng và môi trường có các nồng độ thuốc khác
nhau ở các giếng tương ứng.
• Sau 48 giờ kéo lam giọt mỏng, cố định bằng cồn methylic,
nhuộm Giemsa, đếm HC nhiễm, tính mật độ HC nhiễm trên 10.000 HC. Từ
kết quả đó sử dụng chương trình lập trình sẵn EXCEL- IC50- XLT

(Wemsdorfer) để tính IC50.
• Sau 72 giờ cũng kéo lam giọt mỏng và tiến hành như trên để
xác định MIC.
+ Các chỉ số đánh giá:
• Xác định IC50 (Inhibitory Concentration 50%- nồng độ ức
chế 50% KST phát triển):
_ (MĐ KST mẫu chứng-MĐKST mẫu thử)
—
.

.
I I X IUU( /€>)
MĐKSTmẫuthử
• Xác định MIC (Minimum Inhibitory Concentration- nồng độ
ức chế tối thiểu).
* Thử tác dụng của BB 134 đối vói chủng KST Plasmodium bergei
trên chuột nhắt trắng.
Đánh giá tác dụng của BB 134 trên mô hình chuột trắng nhiễm p. bergei
dựa theo phương pháp in vivo test 28 ngày của tổ chức y tế thế giới (WHO).
- Chuột thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành các lô khác nhau,
- Gây nhiễm KST p. bergei cho chuột nhắt bằng đường phúc mạc, mỗi
chuột 0,2 ml hồng cầu nhiễm KST p. ¿ergezjjtumg ứng với lOx íò^:^
- Sau 24 giờ gây nhiễm, chuột được xét nghiệm máu (ngày No). Tiếp đó
cho chuột uống thuốc với các phác đồ như sau:
Thí nghiệm I: vói liều 50mg/kg X 5 ngày
+ Lô đối chứng: uống dung môi gôm arabic 1%, số chuột =10 con.
+ Lô điều trị bằng aitesunat: 50mg/kg X 5 ngày, số chuột = 10 con.
+ Lô điều trị bằng BB 134 : SOmg/kg X 5 ngày, số chuột =10 con.
Thí nghiệm II: với liều lOOmg/kg X 3 ngày
+ Lô đối chứng: uống dung môi gôm arabic 1%, số chuột =10 con.

+ Lô điều trị bằng artesunat: lOOmg/kg X 3 ngày, số chuột = 10 con.
+ Lô điều trị bằng BB 134 : lOOmg/kg X 3 ngày, số chuột = 10 con.
- Cách tiến hành;
Hoà tan artesunat, BB 134 trong dung dịch gôm arabic 1%. Liều lượng
thuốc cho mỗi chuột được tính theo mg/kg cân nặng. Đưa thuốc vào dạ dày
chuột bằng bơm tiêm bơm thuốc qua sonde. Lô đối chứng cho uống lượng
dung môi gôm arabic 1% tương ứng.
Chuột thí nghiệm được chăm sóc và nuôi dưỡng trong cùng một điều
kiện ở phòng thí nghiệm trong 28 ngày. Theo dõi các diễn biến về tình trạng
sức khoẻ của chuột như các hiện tượng biếng ăn, xù lông, ỉa chảy và đếm số
chuột chết hàng ngày.
Theo dõi diễn biến mật độ KST bằng cách lấy máu đuôi chuột làm tiêu
bản giọt mỏng trong các ngày No, ngày N3 (ngày thứ 3), ngày N7 (ngày thứ 7),
Nj4 (ngày thứ 14). Cố định các giọt máu bằng cồn tuyệt đối và nhuộm Giemsa
5% và đếm mật độ KST theo tỷ lệ % HC nhiễm trên 10.000 HC. Nếu chuột
chết do các nguyên nhân khác thì sẽ không tính vào kết quả thí nghiệm.
* Phương pháp xử lý kết quả nghiên cứu
Kết quả nghiên được xử lý theo phương pháp thống kê y học được áp
dụng vói số lần thử nghiệm n < 30. Kết quả giữa các mẫu thử được so sánh
dựa vào việc tính giá trị P:
Nếu p > 0.05 : sự khác nhau không có ý nghĩa thống kê y học.
Nếu p < 0.05 : sự khác nhau có ý nghĩa thống kê y học.
Nếu p < 0,01 : sự khác nhau rất có ý nghĩa thống kê y học.
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét
2 .2 .1 . Xác định độc tính cấp LD50 của BB 134:
Xác định độc tính cấp LD50 của BB 134 theo phương pháp Behrens-
Karber cho kết quả như sau:
Bảng 2.1. Kết quả xác định LD5 0
Nhóm
Liều

(mg/kg)
SỐ
chuột
thử
ntb
SỐ
chuột
chếit
Hiệu 2
liều kế
tiếp
(d)
Số chết
trung
bình2
iiều kế
tiếp
(a)
Tích sô
(a.d)
Tỷ lệ
%
chết
1 1 0 0 1 0
0
- -
0
2 150
1 0
1 50 0.5

25 1 0
3
2 0 0 1 0 4
50
2.5 125 40
4
250 1 0 5
50 4.5
225 50
5 300
1 0 4
50 4.5 225 40
6 350 1 0
7 50
5.5 275 70
7
400 1 0 8 50
7.5 375 80
8 450 1 0
9
50 8.5 425 90
9 500 1 0 1 0 50 9.5 475 1 0 0
Nhận xét: Kết qủa bảng 2.1 cho thấy:
- Vói liều 100 mg/kg chuột sống 100%, với liều 500 mg/kg chuột
chết 1 00%.
- Khi chuột chết có hiện tượng ngộ độc, chuột chết nhanh, có máu
ra đằng mồm. Các chuột sống sau 8 - 12h trở lại ăn uống bình thường và vẫn
sống sau 7 ngày.
- Từ tỷ lệ % chuột chết trong từng lô thực nghiệm, chúng tôi tính
toán và kết hợp vối vẽ đồ thị tỷ lệ chết- liều thử được kết quả:

LD50 = 288,55 ± 11.08 (mg/kg).
- Kết quả này cho thấy độc tính của BB 134 cao hofn so với các dẫn
xuất khác của artemisinin đang sử dụng trong điều trị.
Hình 2 .1 . Hình ảnh chuột chết khỉ uống BB134 liều 500mg/kg(chết 100%)
Hình 2.2. Hình ảnh chuột chết khỉ uống BB 134 liều 350mg/kg (chết 70%)
2.2.2. Thử nghiệm ỉn viừ‘0 trên Plasmodium falciparum nuôi cấy
Sau khi pha mỗi thuốc thành dãy nồng độ là:
1.25 X 10-®; 2.5 X 10'^; 5 X 10'^; IQ-*; 2 X 10'^
Chúng tỏi tiến hành thử tác dụng của thuốc trên KST nuôi cấy F.
falciparum theo phương pháp của Thaithong- Beale. Kết quả được thể hiện ở
các bảng và đồ thị sau.
Bảng 2.2. Nồng độ ức chế 50% IC5 0 trên KST p. falciparum nuôi cấy
' X ± Sp, n= 6 )
Chủng p. falciparum
ICso (nmol/L)
p
Artesunat (1)
BB 134 (2)
(1) - (2 )
Chủng nhạy chloroquin (T96) 6 ,6 ± 0,1
8 ,0 ± 0 ,2
<0,05
Chủng kháng chloroquin (Kl) 7,8 ± 1,0
4,8 ± 0,8
<0,05
IC5010
(nmol/1)
^ Artesunat
■ BB 134
Chủng nhạy Chủng kháng

Hình 2.3. Biểu đồ biểu diễn giá trị IC5 0 của BB 134 và
artesunat trên chủng p.falciparum nuôi cấy
Nhận xét: Qua kết quả ở bảng 2.2 và đồ thị cho thấy:
- Đối với chủng KST p. falciparum nhạy chloroquin (T96):
+ Nồng độ ức chế 50% KST phát triển của aitesunat là 6,6 ± 0.1 nmolA.
+ Nồng độ ức chế 50% KST phát triển của BB 134 là 8,0 ± 0.2 nmol/1.