Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
%Ị^ %Ị^
TRẦN THI HẰNG
/ ặ ? '\ X
# / 6 J . o f 7 í ^
Mĩ HƯ^VÌỆN:;
lr ,T c f,.í'/
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
CARBAMAZEPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BANG SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NÃNG CAO
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỢC sĩ KHOÁ 2000-2005)
Người hướng dẫn
Nơi thực hiện
: ThS. Nguyễn Thị Kiều Anh
ThS. Trần Nguyên Hà
: Bộ môn Hoá phân tích
Thời gian thực hiện : 10/2004-5/2005
HÀ NỘI 5/2005
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định
lượng Carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”,
chúng tôi đã nhận được sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo và các cán bộ
bộ môn Hoá phân tích trường đại học Dược Hà Nội.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Thạc sĩ Nguyễn Thị
Kiều Anh, người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực
hiện khoá luận này.
Tồi cũng xin chân thành cảm ơn Thạc sĩ Trần Nguyên Hà, các thầy cô
giáo, các cán bộ trong bộ môn Hoá Phân Tích đã tạo điều kiện, thời gian, và
kinh phí giúp tôi hoàn thành khoá luận này.
Và cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cả các thầy cô giáo, cán bộ các

bộ môn và các phòng ban trong nhà trường đã giảng dạy và tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Dược Hà Nội.
Hà Nội ngày 20 tháng 5 năm 2005.
Sinh viên:
Trần Thị Hằng.
M ục lục Trang
Đặt vấn đề 1
Phần 1. Tổng quan 2
1.1. Tổng quan về Carbamazepin 2
1.2. Tổng quan về HPLC 4
1.2.1. Khái niệm cơ bản 4
1.2.2. Sắc ký pha liên kết 5
1.2.3. Một sô'thông số đặc trưng của HPLC 6
1.2.4. Cách tính kết quả trong phương pháp HPLC 6
1.3. Một số nghiên cứu định lượng CAR bằng HPLC 7
1.4. Vài nét về thẩm định phưoỉng pháp phân tích dược 10
chất trong dịch sinh học
ì A .ì. Khái niệm 10
1.4.2. Tính chọn lọc 10
1.4.3. Giới hạn định lượng ( Limit of quantỉtation : LOQ) 10
1.4.4. Khoảng nồng độ tuyến tính 11
lA.S.Đ ộđúng 11
1.4.6. Độ chính xác 11
1.4.7. Độ ổn định 12
Phần 2. Máy móc - dụng cụ, hoá chất, súc vật thí nghiệm 13
và phương pháp nghiên cứu
2.1. Máy móc - dụng cụ 13
2.2. Qiất chuẩn và chế phẩm thử 13
2.3. Hoáchất 13
2.4. Súc vật thí nghiệm 14

2.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 14
2.5.1. Khảo sát và tìm điều kiện để chiết CAR từ huyết tương 14
2.5.2. Định lượng CAR trong HT bằng HPLC 16
2.53. Thẩm định phương pháp phân tích 16
2.5.4. Định lượng CAR trong HT thỏ uống viên nén Tegretol 200mg 17
Phần 3. Kết quả thực nghiệm và bàn luận 19
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng CAR trong HT 19
3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc kỷ 19
3.1.2.Thẩm định phương pháp phân tích 21
3.2. Phân tích CAR trong HT thỏ sau khi uống viên nén Tegretol 200mg 27
3.3. Bàn luận 27
Phần 4. Kết luận và đề xuất 30
4.1. Kết luận 30
4.2. Đề xuất 31
Tài liệu tham khảo 32
Phụ lục 35
Phụ lục 1. Phổ hấp thụ u v của CAR và PHE 35
Phụ lục 2. SK đồ khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của CAR trong HT 36
Phụ lục 3. Đường chuẩn xây dựng trên nền HT trắng của thỏ 39
Phụ lục 4. SK đồ mẫu HT thỏ sau khi uống thuốc 2 giờ 39
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
AcOH : Acid acetic
CAR ; Carbamazepin.
CAR-E: Carbamazepin-10,ll-epoxid
• Nồng độ thuốc tối đa trong huyết tưcmg.
: Nồng độ thuốc tối thiểu trong huyết tương.
EtOH : Ethanol.
HPLC : Sắc kí lỏng hiệu năng cao.
(High perfomance liquid chromatography)
HT : Huyết tương

IS : Internal standard (chất chuẩn nội)
MeCN : Acetonitril.
MeOH : Methanol.
|Lig : microgam.
PHE : Phenobarbital.
RSD : Độ lệch chuẩn tương đối.
s : Độ lệch chuẩn
SK : Sắc ký
STT : Số thứ tự
TB : Trung bình
TE : Triethylamin
ĐẶT VẤN ĐỂ
Động kinh là một bệnh phổ biến trên thế giới, tỉ lệ mắc bệnh động kinh
chiếm 0,2-5% dân số, phân bố ở cả hai giới và tất cả các lứa tuổi.
Trẻ em có tỉ lệ mắc bệnh cao, trong đó loại động kinh lành tính tự phát
chiếm khoảng 50%, loại này đáp ứng tốt với các điều trị bằng thuốc. Ngày
nay, thuốc đặc trị có thể kiểm soát 70% cơn động kinh. Tuy nhiên, điều trị
không tuân thủ đúng các nguyên tắc có thể dẫn đến tác hại nghiêm trọng, ảnh
hưởng trực tiếp tới sức khoẻ và tính mạng của người bệnh.
Carbamazepin là một dẫn xuất của iminostiben, được xem là một trong
những thuốc cơ bản hàng đầu để điều trị động kinh, đặc biệt là động kinh cục
bộ và động kinh thể co cứng giật rung.
Cũng như các thuốc chữa động kinh, khoảng điều trị của Carbamazepin
hẹp, cơ chế tác dụng phức tạp, nhiều tưcmg tác, tương kỵ và hay gặp trường
hợp ngộ độc thuốc. Hơn nữa trong thực tế điều trị, tính cá thể thưòfng thể hiện
rất rõ và phức tạp, các bệnh nhân khác nhau có đáp ứng khác nhau với thuốc.
Vì vậy, phải theo dõi sát sao trong suốt quá trình điều trị. Để đạt được kết quả
tốt nhất, tránh được những tai biến có thể xảy ra khi dùng thuốc và tìm cho
mỗi bệnh nhân một phác đồ điều trị phù hợp, cần phải tiến hành theo dõi
thường xuyên nồng độ thuốc trong máu bệnh nhân.

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xây
dựng phương pháp định lượng Carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký
lỏng hiệu năng cao” với mục tiêu:
- Xây dựng phương pháp định lượng Carbamazepin trong huyết tương .
- ứng dụng phương pháp phân tích xây dựng được để định lượng
Carbamazepin trong huyết tương thỏ sau khi uống viên nén chứa 200mg
Carbamazepin.
PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Carbamazepin (CAR)
Ll.LC ôngthức[7]
C15H12N2O; M = 236,3
1.1.2. Tên khoa học [7]
5-H-dibenz [b,f] azepin 5-carboxamid
1.1.3. Tính chất 17],[14]
Bột kết tinh màu trắng. Không tan trong nước, ít tan trong cồn và aceton,
tan trong methylen clorid.
Nhiệt độ nóng chảy : 187-193° c
1.1.4. Dựơc động học [2], [15]
Thuốc hấp thu chậm qua đưcmg tiêu hoá, phân bố khắp cơ thể. Thuốc đạt
nồng độ tối đa trong máu sau 4-8 giờ. Nồng độ tối đa sau khi dùng liều
duy nhất 400 mg (viên nén) khoảng 4,5 |J,g/ml. Nồng độ tác dụng trong huyết
tương khoảng 4-12 )Lig/ml.
CAR liên kết với protein huyết tương khoảng 70-80%,
CAR chuyển hoá qua gan bằng phản ứng hydroxyl hóa và liên hợp, hoạt
chất chuyển hoá là Carbamazepin-10,11-epoxid. Thời gian bán thải khoảng từ
10-20 giờ. Thải trừ qua nước tiểu 72% và qua phân 28%, chủ yếu dưới dạng đã
chuyển hoá.
1.1.5. Tác dụng [9], [13], [15]
Thuốc có tác dụng trên động kinh cục bộ (đơn giản hoặc phức tạp) có
hoặc không kèm cơn động kinh toàn thể hóa thứ phát, cơn co cứng toàn thể và

hỗn hợp các loại động kinh trên.
Thuốc có tác dụng hướng tâm thần: tác động tới các triệu chứng lo âu
trầm cảm, làm giảm kích thích, hung hăng.
CAR còn có tác dụng hướng thần kinh: ngăn ngừa cơn đau dây thần kinh
số V cấp tính tự phát, hạ thấp ngưỡng co giật và làm giảm các triệu chứng
trong hội chứng cai nghiện rượu.
l.L6.C hỉđ ịnhl7 ],l2],[17]
- Đơn trị liệu cho bệnh nhân động kinh.
- Điều trị hưng cảm và phòng cơn hưng trầm cảm.
- Dùng trong hội chứng cai nghiện rượu
- Qiữa đau dây thần kinh số V.
1.1.7. Chống chỉ định [2], [17]
- Quá mẫn cảm với CAR và các thuốc có cấu trúc tương tự.
- Bloc nhĩ thất.
- Tiền sử bị giảm sản tuỷ và rối loạn chuyển hoá porphyrin cấp tính từng
đợt.
- Phụ nữ có thai, đặc biệt 3 tháng đầu.
- Glôcôm
1.1.8. Liều dùng và cách dùng [2], [17]
- Liều dùng: Người lớn: 200-400 mg X 2-3 lần/ngày.
Trẻ em: 10-20 mg/kg cân nặng hàng ngày.
- Cách dùng: Uống trong, sau hoặc giữa các bữa ăn.
Loại viên giải phóng chậm phải nuốt khi uống, không được nhai.
1.1.9. Các dạng bào chế[7], [2], [13], /22/
- Viên nén 100; 200; 400 mg
- Viên nhai 100 mg
- Viên bao giải phóng chậm 200 mg
- Hỗn dịch uống 100 mg/5ml
- Viên nang 300 mg
1.1.10. Các phương pháp định lượng

Đinh lương nguyên liêu:
+ Phương pháp 1110], [15], [22]
Dung dịch thử và dung dịch chuẩn được pha trong dung môi hỗn hợp
MeOHiHj 0(1:1) và đem tiêm sắc ký riêng biệt trong cùng điều kiện.
ĐKSK: Cột CN (25 X 4,6 mm; 10 ịim)
Bước sóng: 235 nm
Lưu lượng dòng: 2 ml/phút
Tính toán hàm lượng theo phương pháp so sánh với dung dịch chuẩn.
+ Phương pháp 2 [14]
Trong cấu trúc của CAR có các dây nối đôi nên có khả năng hấp thụ bức
xạ tử ngoại. Dựa vào đặc tính này người ta định lượng CAR bằng phưcmg pháp
đo quang. Nguyên liệu CAR được hoà tan và pha loãng trong dung môi EtOH
95% và đem đo độ hấp thụ u v à bước sóng cực đại = 285 nm. Tính toán
hàm lượng theo A(l%;lcm) = 490 .
Đinh lương chế phám r 141
Chế phẩm được hòa tan bằng EtOH 95%, lọc để thu được dung dịch
trong và đem đo độ hấp thụ u v tương tự như đối với định lượng nguyên liệu
CAR. Tính toán hàm lượng so với hàm lượng CAR dựa vào A(l%;lcm).
1.2. Tổng quan về HPLC
1.2.1. Khái niệm cơ bản [5], [4]
+ Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC hay còn gọi là sắc ký lỏng cao áp ra
đời vào cuối những năm 60. Đó là một phương pháp hoá lý dùng để tách các
chất dựa vào ái lực khác nhau của các chất với hai pha luôn tiếp xúc và không
đồng tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh. Pha động là chất lỏng chảy
qua cột với một tốc độ nhất định, pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã
được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất
mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng liẽn kết hoá học với các
nhóm hữu cơ. Quá trình SK xảy ra theo cơ chế: hấp phụ, trao đổi ion, phân bố
hoặc rây phân tử.
+ Tuỳ thuộc vào tính chất các pha mà ta có những phương pháp SK khác

nhau. Trong khoá luận này chúng tôi chỉ trình bày về sắc ký pha liên kết.
1.2.2. Sắc ký pha liên kết [4]:
Trong sắc ký pha liên kết, pha tĩnh được gắn hoá học với chất mang tạo
nên hcfp chất cơ siloxan:
CH3 CH3 CH3 CH3
I ' I I
-Si-OH + Cl-Si-R

► -Si-O -Si-R + HCl
I I I I
CH3 CH3 CH3 CH3
Nhóm silanol Dẫn chất Dẫn chất
của silicagel clorosilan siloxan
- Nếu R là một nhóm ít phân cực như Octyl (Cg), Otadecyl (Cis), hay phenyl
và dung môi phân cực như MeOH, MeCN, .thì ta có SK pha đảo.
- Nếu R là nhóm khá phân cực như alkylamin -(CIỈ2)-NH2 hay alkylnitril
-(CH2)n-CN và dung môi ít phân cực như hexan thì ta có SK pha thuận.
- Thứ tự rửa giải: Trong SK pha thuận, các chất ít phân cực ra trước. Trong SK
pha đảo, các chất phân cực ra trước rồi đến các chất ít và không phân cực ra
sau. Quyết định hiệu quả sự tách các chất ở đây là tổng hợp các tưofng tác:
- Giữa chất tan với pha tĩnh
- Giữa chất tan với pha động
- Giữa pha tĩnh với pha động
Tổng của ba tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra trước tiên
khi lực lưu giữ là nhỏ nhất và ngược lại.
* Hiện nay, SK phân bố pha đảo được dùng nhiều vì nó cho kết quả tách tốt
với rất nhiều đối tượng tách.
1.23. Một số thông số đặc trưng của HPLC [5]
- Thời gian lưu Ir (phút) là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống SK đến
lúc xuất hiện đỉnh của pic.

So sánh thời gian lưu của mẫu chuẩn và mẫu thử làm trong cùng điều
kiện ta sẽ định tính được chất đó.
- Thời gian chết to (phút) là thời gian lưu của chất không bị lưu giữ (tức là chất
có tốc độ di chuyển bằng tốc độ trung bình của các phân tử dung môi khi đi
qua cột).
- Số đĩa lý thuyết N: Biểu thị hiệu lực cột SK:
2
N=
^ hoặc N= 16
^ hoặc N= 5,54
Trong đó:
ỏt (Độ lệch chuẩn): Độ rộng nửa píc tại các điểm uốn tương ứng.
cOq 5 (Độ rộng píc ở nửa chiều cao) = 2,354ôf
(0^: Độ rộng đáy píc
- Độ phân giải R^: Là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột SK
R3= hoặc Rs=
% r \ 2 - -
® 0 ,5 .1 + < ^ 0,5 .2
Để tách riêng hai chất, Rs phải không nhỏ hofn 1,5.
- Chiều cao pic hay diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng
điều kiện cho ta tính được hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử.
1.2.4. Cách tính kết quả trong phương pháp HPLC[1J
Phưcmg pháp chuán ngoai:
Chuẩn hoá một điểm: Nồng độ chất phân tích được xác định bằng cách
so sánh đáp ứng (diện tích hoặc chiều cao pic) của chất đó trong dung dịch thử
và dung dịch chuẩn tiến hành phân tích ở cùng điều kiện.
Chuẩn hoá nhiều điểm: Lập mối quan hệ giữa đáp ứng y (diện tích hoặc
chiều cao pic) và lượng chất X trong dãy dung dịch chuẩn. Tính kết quả của
chất phân tích trong dung dịch thử dựa trên đồ thị của mối quan hệ giữa y và
X. Yêu cầu đáp ứng của dung dịch thử phải nằm trong khoảng đáp ứng của dãy

dung dịch chuẩn.
Phương pháp chuẩn nối: Dung dịch thử và dung dịch chuẩn được chuẩn
bị từ mẫu thử và mẫu chuẩn có chứa chất phân tích và được thêm cùng một
lượng xác định chất chuẩn nội (chất chuẩn thứ hai).
Chuẩn hoá một điểm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử được tính
bằng cách so sánh tỷ số giữa chiều cao hay diện tích pic của chất phân tích với
chuẩn nội trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
Chuẩn hoá nhiều điểm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử được tính
toán dựa vào đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ chất phân tích và
tỉ lệ giữa chiều cao hay diện tích pic của chất phân tích và chất chuẩn nội
trong dãy dung dịch chuẩn.
Phương pháp chuán hoá diên tích:
Hàm lượng phần trăm chất cần định lượng được tính bằng cách lấy phần
trăm diện tích pic của chất đó chia cho tổng diện tích các pic, trừ pic dung
môi, thuốc thử và pic thấp hơn giới hạn phát hiện.
* Trong phân tích sinh dược học người ta hay sử dụng cách tính kết quả
theo phương pháp chuẩn hoá nhiều điểm có dùng chất chuẩn nội.
13. Một số nghiên cứu định lượng CAR bằng HPLC
Bảng 1: Một số nghiên cứu định lượng CAR trong huyết tương bằng HPLC
Tài
liệu
Cột
Pha động
Dung môi chiết
Chuẩn nội
Mục đích
[2 0 ]
Spherisorb
OSD-2
(250 X 4,5 mm;

10 )am)
MeCN: MeOH: đệm
phosphat pH 7,0
(18: 18: 70)
MeCN
1 0 ,1 1 - dihydro
Carbamazepin
Phân tích đồng
thời CAR,
CAR-E và
phenytoin
[17]
Extrashot-
Silica™
(250 X 4,5 mm;
5 I^m)
n-hexan: AcOH: EtOH:
Dicloromethan
(82,8: 0,2: 2: 15)
Dicloromethan
Phân tích CAR
trong HT và ứng
dụng trên lâm
sàng
[19]
Zorbax SB-CN
(250 X 4,6; 5 |im)
HjOiACNiMeOH
:AcOH:'Hi
(725 : 150 : 125

: 1 : 0 ,6 )
MeOH: HjO
(1 : 1)
Theo dõi nồng độ
oxcarbazepine,
CAR và các chất
chuyển hoá trên
bệnh nhân động
kinh
00
vo
[2 1 ]
Spherisorb
OSD-2
(250 X 4,5 mm;
10 |am)
MeCN: H2O
(30: 70)
Cloroform: ethylacetat
(1 : 1)
l,3-dimethyl-7-
benzinxanthin
Phân tích đồng
thời CAR và
CAR-E, so sánh
với kết quả của
phương pháp SK
khí
[12 ]
Lichro Spher

RP18
(125 X 4 mm; 85
^im)
MeCN: H2O: đệm
phosphat pH 7,0
(20: 75: 5)
MeCN
butalbital
Phân tích CAR
trong HT
[9]
Lichrosorb-RP8
(250 X 4,9 mm;
1 0 |am)
MeCN: H2O
(32: 6 8 )
Dicloromethan
1 0 -methoxy
carbamazepin
Phân tích đồng
thời CAR,
oxcarbamazepin
và chất chuyển
hoá có hoạt tính.
1.4. Vài nét về thẩm định phương pháp phân tích dược chất trong dịch
sinh học [1]
1.4.1. Khái niệm:
Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học là quá
trình xác định bằng thực nghiệm những đặc điểm đặc tnmg của phương pháp
để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế.

Các đặc điểm phân tích đặc trưng cần thẩm định bao gồm: khoảng nồng độ
tuyến tính, độ tìm lại, độ đúng, độ chính xác, tính chọn lọc, giới hạn phát hiện
và giới hạn định lượng. Ngoài ra, còn có những yêu cầu khác tuỳ theo loại
phương pháp và đối tượng nghiên cứu.
Thẩm định phưofng pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học là một quá
trình nhằm chứng minh rằng phương pháp phân tích đó là đáng tin cậy và có
khả năng thực hiện phân tích đối với những mẫu cần khảo sát.
1.42. Tính chọn lọc:
- Định nghĩa:
Tính chọn lọc của một phương pháp phân tích là khả năng phân biệt các
chất trong mẫu thử dùng khi tách và định lượng hai hoặc nhiều thành phần
trong một hỗn hợp của phương pháp đó.
- Yêu cầu:
+ Mẫu trắng không được có đáp ứng của chất phân tích hoặc chất chuẩn
nội.
+ Các chất khác nhau phải cho đáp ứng khác nhau, tách biệt.
1.43.Giới hạn định lượng (Limit of quantitation: LOQ):
- Định nghĩa:
LOQ là nồng độ thấp nhất trong mẫu thử có thể định lượng được với
tính đúng và tính chính xác chấp nhận được
- LOQ được xem là nồng độ tại đó:
+ Đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng của mẫu trắng.
+ Píc của chất cần phân tích phải thấy rõ, riêng biệt và giá trị đáp ứng lặp lại
với độ chính xác 2 0 %.
1.43. Khoảng nồng độ tuyến tính'.
- Định nghĩa:
Độ tuyến tính là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được y và
nồng độ đã biết X của chất phân tích trong một khoảng nồng độ xác định.
- Các thông số tính toán:
Tính hệ số tương quan (r) và phương trình hồi quy y = ax + b biểu diễn

sự phụ thuộc của tín hiệu đáp ứng (y) vói nồng độ chất phân tích (x).
- Đánh giá kết quả;
Đưòỉng hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số
tương quan (r) phải không nhỏ hơn 0,99.
1.4.4. Độ đúng:
- Định nghĩa:
Độ đúng của một phương pháp phân tích là mức độ gần sát của kết quả
phân tích với giá trị thực của chất phân tích.
- Đánh giá kết quả:
Độ đúng được biểu thị bằng phần trăm của giá trị TB thu được so với
giá trị thực. Độ đúng có thể thay đổi từ 0% đến 100%
Giá trị trung bình thu được sau khi phân tích phải sai lệch không quá 15% so
với giá trị thực.
1.4.5. Độ chính xác:
- Định nghĩa:
Độ chính xác của một phương pháp là kết quả thống nhất giữa kết quả
riêng biệt khi phân tích được tiến hành lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một
mẫu đồng nhất. Độ chính xác được biểu thị bằng độ lệch chuẩn hoặc độ lệch
chuẩn tương đối. Độ chính xác được chia làm hai loại:
Độ lặp lại được tính khi phép phân tích được lặp lại trong cùng một
phòng thí nghiệm, trong khoảng thời gian ngắn và do cùng một người phân
tích.
Độ tái lặp được xác định bằng cách lặp lại phép phân tích đó ở cùng một
phòng thí nghiệm, với cùng một người phân tích nhưng trong ngày phân tích
khác.
- Các thông số tính toán:
Độ lệch chuẩn:
i
Độ lệch chuẩn tương đối:
____

s
R S D ( % ) = ^ m
X
- Đánh giá kết quả:
Chỉ số hay được dùng là độ lệch chuẩn tương đối (RSD%).
RSD% thu được ở mỗi nồng độ phải không vượt quá 15%; riêng tại giới hạn
phát hiện cho phép RSD% không vượt quá 20%.
Hiện nay, đối với phân tích thuốc trong dịch sinh học:
RSD% <5% được xem là rất chính xác.
RSD% = 5-10% được xem là đạt yêu cầu.
RSD % = 15-20% được chấp nhận với những phưcfng pháp
cực kỳ khó.
1.4.6. Độ ổn định:
Độ ổn định của chất phân tích trong mẫu sinh học, bảo quản trong điều
kiện nhất định được theo dõi trong thời gian dài, cũng như trong quá trình
phân tích. Để đánh giá độ ổn định, người ta thường so sánh kết quả phân tích
mẫu bảo quản với mẫu mới chuẩn bị. Kết quả phải sai khác không quá 5%.
PHẦN 2. MÁY MÓC - DỤNG cụ , HOÁ CHẤT, s ú c VẬT
THÍ NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
•
2.1. Máy móc - dụng cụ
- Hệ thống HPLC
+ Bơm cao áp: Merck-Hitachi L-6000 Pump
+ Detector UV : Merck-Hitachi L-4000 UV detector
+ Máy tích phân: Merk-Hitachi D-2500 chromato integration
+ Van tiêm mẫu: Rheodyne 7125 (USA)
- Máy quang phổ Beckman DU-640 Spectrophotometer (USA)
- Máy ly tâm điện Jouan (Pháp)
- Máy lọc nước siêu sạch Elga (Anh)
- Cân phân tích Sartorius (Đức)

- Tủ lạnh sâu (T=-50°C) Frigor (Đan Mạch)
- Máy siêu âm Bransonic-USA
- Máy lắc Labinco (Hà Lan)
- Máy đo pH Metrohm (Thụy Sỹ)
- Máy khuấy từ Ikamag
- Autopipet 1-10 |al, 10-100 |xl, 100-1000 ụì
- Các dụng cụ thuỷ tinh và trang thiết bị khác có trong phòng thí nghiệm.
2.2. Chất chuẩn và chê phẩm thử:
- Carbamazepin: Chất đối chiếu (C = 99,0%)
- Phénobarbital: Chất đối chiếu (C = 98,7%)
- Viên nén Tegretol chứa 200mg CAR của hãng Novartis.
2.3. Hoá chất:
- MeCN và MeOH loại HPLC (Merck)
- Acid acetic băng, triethylamin, cloroform, ethylacetat, ether loại dùng cho
phân tích.
- Kali d ih y đ ro p h o s p h a t ( K H 2 P O 4 )
2.4. Súc vật thí nghiệm:
Thỏ đực khoẻ mạnh, cân nặng 2,2 - 2,7 kg, đạt tiêu chuẩn súc vật thí
nghiệm.
2.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu:
2.5.1. Khảo sát và tìm điều kiện để chiết CAR từ huyết tương [20]
CAR trong HT được chiết theo sơ đồ hình 1:
Lắc xoáy 1 phút
Cloroíorm (5 ml), lắc xoáy
5 phút, li tâm 15 phút
(3500 vòng/phút), hút 4 ml
cloroíorm
Bốc hơi cách thuỷ
f < 80°c
Pha động (200 |il), lắc

xoáy 30 giây, li tâm 5
phút (3500 vòng/phút),
hút lớp dung dịch ở trên.
Lọc qua đầu lọc 0,2 p,m
Hình 1: Sơ đồ chiết xuất CAR từ huyết tưofng .
2.5.2. Định lượng CAR trong HT bằng HPLC:
Tiến hành phân tích CAR trong HT với các điều kiện SK sau:
Pha tĩnh: Phenyl Nova-Park (3,9x150 mm; 5 |am)
Pha động: MeCN: AcOH: H2O: TE
(18: 0,5: 80: 0,15)
Bước sóng: 235 nm
Lưu lượng dòng: 0,8 ml/phút
Thể tích mẫu tiêm: 50 |il
Chất chuẩn nội: Phenobarbital (PHE)
Để đánh giá chưoỉng trình SK xây dựng được, chúng tôi tiến hành khảo
sát tính thích hợp của hệ thống SK: Tiêu chuẩn để đánh giá là độ lệch chuẩn
tương đối (RSD%) của các thông số phân tích như thời gian lưu của chất phân
tích, tỉ lệ diện tích pic của chất phân tích với chất chuẩn nội, và các đại lượng
đặc trưng khác như số đĩa lý thuyết, độ phân giải giữa hai pic liên tiếp trên SK
đồ phải không lớn hơn 2 %.
2.5.3. Thẩm định phương pháp phân tích:
- Khảo sát tính chọn lọc của phương pháp:
Chuẩn bị mẫu từ dịch sinh học không có chất phân tích: một mẫu trắng,
một mẫu thêm chuẩn và một mẫu thêm chuẩn nội. Xử lý mẫu theo sơ đồ hình
1 và tiến hành phân tích theo điều kiện SK ở mục 2.5.2.
- Xác định khoảng nồng độ tuyến tính:
Dùng mẫu sinh học (mẫu trắng) giống như mẫu nghiên cứu nhưng
không có chất phân tích. Các mẫu này sẽ được thêm chất phân tích với các
nồng độ khác nhau và chất chuẩn nội với cùng một nồng độ đã biết. Xử lý
mẫu theo sơ đồ hình 1 và tiến hành phân tích theo điều kiện SK ở mục 2.5.2.

- Khảo sát độ đúng của phương pháp:
Mẫu để xác định tính đúng được chuẩn bị bằng cách thêm một lượng
dung dịch chuẩn vào mẫu trắng, tối thiểu tại ba nồng độ trong khoảng nồng độ
khảo sát. Mỗi nồng độ tối thiểu năm mẫu. Xử lý mẫu theo sơ đồ hình 1 và tiến
hành phân tích theo điều kiện SK ở mục 2.5.2.
- Khảo sát độ chính xác của phương pháp:
Chuẩn bị mẫu như ở phần xác định độ đúng và tiến hành phân tích. Xác
định RSD% trong hai ngày phân tích khác nhau để đánh giá độ lặp lại và độ
tái lặp của phương pháp phân tích.
- Khảo sát độ ổn định của CAR:
+ Khảo sát độ ổn định của CAR trong HT theo thời gian bảo quản:
Để theo dõi sự ổn định của chất phân tích trong HT theo thời gian bảo
quản, chúng tôi lấy 200 )Lil HT trắng, cho thêm CAR ở nồng độ 8 |a,g/ml. Mẫu
được bảo quản trong ống thuỷ tinh dung tích 10 ml, có nút xoáy và bảo quản ở
nhiệt độ -30°c. Ngay sau khi chuẩn bị mẫu và sau những khoảng thời gian 10,
20, 30 ngày, lấy mẫu ra để hết đông và thêm chất chuẩn nội với nồng độ 20
|Lig/ml, xử lý mẫu theo sơ đồ hình 1 và tiến hành phân tích theo điều kiện SK ở
mục 2.5.2.
+ Khảo sát độ ổn định của CAR trong thời gian phân tích:
Mẫu HT trắng được cho thêm chất chuẩn ở nồng độ 8 |ig/ml và chất
chuẩn nội ở nồng độ 20 |Lig/ml, xử lý mẫu theo sơ đồ hình 1. (Các mẫu đã xử
lý để ở điều kiện thường). Tiến hành phân tích theo điều kiện SK ồ mục 2.5.2
ngay sau khi xử lý mẫu và tại các thời điểm 1, 2, 3, 4 giờ sau đó.
2.5.4.Định lượng CAR trong mẫu HT thỏ uống viên nén Tegretol lOOmg.
+ Uống thuốc: Hai thỏ được nuôi trong vòng một tuần trước khi thử. Cho mỗi
thỏ uống Iviên nén Tegretol chứa 200 mg CAR.
+ Lấy mẫu: Khoảng 2 ml máu được lấy từ tĩnh mạch vành tai thỏ ngay trước
khi uống thuốc và sau khi uống 2, 3, 4 giờ. Mẫu được cho vào ống nghiệm có
chứa EDTA để chống đông, lắc nhẹ và ly tâm với tốc độ 3500 vòng/phút trong
15 phút. Tách lấy phần HT, bảo quản trong tủ lạnh sâu ở -30°c cho tới khi

phân tích.
AỌ/ I \r.
17 0 Aoiioln 'ị
\ : \ n / í à ị %
+ xử lý mẫu theo sơ đồ hình 1 và định lượng CAR trong mẫu thử bằng
phương pháp HPLC theo điều kiện SK đã lựa chọn ở mục 2.5.2. Tính kết quả
dựa trên đường chuẩn xây dựng trong ngày phân tích trên nền mẫu là HT trắng
của thỏ.
Phân 3. KẾT QUẢ THựC NGHIỆM
VÀ BÀN LUẬN
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng CAR trong huyết tương:
3.1.1. Khảo sát và xác định điều kiện SK :
- Cột SK: Qua khảo sát trên các cột tách phenyl, Cg, Ci8 với kích cỡ khác nhau,
chúng tôi thấy cột phenyl là phù hợp, có khả năng tách chọn lọc CAR và
chuẩn nội ra khỏi mẫu phân tích.
- Pha động: Khảo sát khả năng tách CAR trong huyết tương với những hệ pha
động sau:
MeCN: MeOH: KH2PO4 10 mM với tỷ lệ pha hữu cơ từ 20-40%
MeCN: KH2PO4 5 mM với tỉ lệ pha hữu cơ từ 15-25%
MeCN: AcOH: H2O: TE với tỷ lệ pha hữu cơ 15-25%, trong đó:
AcOH từ 0,5-1%;
TE từ 15-25%.
Chúng tôi thấy hệ dung môi MeCN: AcOH: H2O: TE (18: 0,5: 80: 0,15)
có khả năng tách tốt nhất, pic sắc nét, chân pic gọn, các pic tách rời nhau và
thời gian phân tích hợp lý. Do đó trong nghiên cứu này chúng tôi chọn hệ
dung mồi trên làm pha động .
- Bước sóng: Pha chất chuẩn CAR và chất chuẩn nội PHE trong pha động,
quét phổ hấp thụ u v trong khoảng 200-320 nm. Chọn được bước sóng =
235 nm là phù hợp. (Phụ lục 1).
- Lưu lượng dòng: Kết quả khảo sát sự thay đổi lưu lượng dòng từ 0,5-1

ml/phút cho thấy lưu lượng dòng 0 ,8 ml/phút là tốt nhất để vừa tách riêng
được chất phân tích, chuẩn nội, vừa có thời gian phân tích hợp lý.
- Chất chuẩn nội: Định lượng CAR trong huyết tưofng đòi hỏi công đoạn xử lý
mẫu phức tạp, có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Do vậy định lượng theo
phương pháp dùng chất chuẩn nội là cần thiết.
Chất chuẩn nội được lựa chọn phải có công thức hoá học gần giống
CAR, đồng thời phải tách khỏi CAR và ổn định trong điều kiện SK. Lựa chọn
các chất đối chiếu có được, chúng tôi thấy chất chuẩn nội PHE cho kết quả
phù hợp với yêu cầu phân tích.
Từ các kết quả nghiên cứu trên đã lựa chọn được chương trình HPLC để
định lượng CAR trong HT như đã trình bày ở mục 2.5.2.
Xác định tính thích hợp của hệ thống SK:
Chuẩn bị một mẫu HT trắng, thêm CAR chuẩn ờ nồng độ 4 I^g/ml và
chất IS ở nồng độ 20 i-ig/ml. xử lý mẫu theo sơ đồ hình 1 và tiêm sắc ký lặp lại
5 lần với điều kiện như đã lựa chọn được ở trên.
Xác định các thông số sau mỗi lần tiêm mẫu: Thời gian lưu của CAR
( ír c a r ) ’ tỉ lệ diện tích pic giữa CAR và chuẩn nội PHE ( R car/is) ỉ s ố đĩa lý
thuyết tính theo pic CAR ( N car) và độ phân giải giữa pic CAR và pic IS (R s ).
Kết quả thực nghiệm được trình bày theo bảng sau:
Bảng 2: Kết quả khảo sát độ phù hợp của hệ thống SK
Lần tiêm
tR,CAR (phút)
^CAR/IS
Ncar
Rs
1
9,01
3,54
1073 3,01
2 9,01

3,53
1109
2,98
3
9,02 3,54
1098 3,02
4
9,02 3,53
1085 3,11
5
9,03 3,53
1074 3,01
TB
9,02
3,35
1088
3,02
RSD (%) 0,09
0,15
1,43 1 ,66
Nhận xét: Độ-lệch chuẩn tương đối của các thông số phân tích đều dưới 2%,
điều đó chứng tỏ hệ thống SK có tính thích hợp cao, có thể ứng dụng để phân
tích mẫu trong thực tế.