NGHIÊN cứu cặp mồi TH2 TRÊN BỆNH PHẨM SINH THIẾT dạ dày để CHẨN đoán HELICOBACTER PYLORI

y học thực hành (762) - số 4/2011




54

Nghiên cứu cặp mồi TH2 trên bệnh phẩm sinh thiết dạ dày
để chẩn đoán helicobacter pylori

Nguyễn thị hồng hạnh, Nguyễn Thuý Vinh
Viện Công Nghệ Sinh học; Bệnh viện Hữu Nghị
Tóm tắt
Cặp mồi TH2 đã đợc thiết kế nhằm khuếch đại
gien HP1125 mã hoá cho một trong số 32 protein
màng ngoài của Helicobacter pylori và đợc thử
nghiệm trên 113 mẫu ADN tách từ sinh thiết hoặc từ
vi khuẩn phân lập từ các bệnh nhân. Độ nhậy và độ
đặc hiệu của mồi thiết kế tơng ứng là 99.11% và 100.
Các bác sĩ có thể sử dụng trực tiếp các sinh thiết dạ
dày để làm PCR không cần nuôi cấy vi khuẩn đòi hỏi
thời gian và tốn kém. Trong tơng lai, cặp mồi TH2 có
thể đợc sử dụng để chẩn đoán H. pylori.
Từ khoá: Helicobacter pylori; gien HP1125; cặp
mồi TH2; PCR; độ nhạy; độ đặc hiệu.
SUMMARY
A set of PCR primers named TH2 was
designed and tested on ADN samples of 113
Vietnamese patients to monitor Helicobacter
pylori. As shown by the results, the domain
located on HP1125 gene appears to be highly

conserved. It is amplified successfully in almost
all cases. The sensitivity as well as the
specificity of PCR method are 99. 11% and
100% respectively. In sum, TH2 primers can be
used to detect Helicobacter pylori.
Keywords: Helicobacter pylori; gene HP1125; TH2
primers; PCR; Sensitivity; Specificity.
Đặt vấn đề
Vi khuẩn Helicobacter pylori (H. pylori ) là căn
nguyên của các bệnh về dạ dày ở ngời và một số
động vật. Trên thế giới cũng nh ở Việt nam, có hơn
một nửa số dân c bị nhiễm vi khuẩn HP. Do HP là các
vi sinh vật siêu đột biến, nên các dấu ấn phân tử của
chúng đợc lựa chọn khác nhau ở các vùng dân c
khác nhau trên thế giới. Chẳng hạn, nếu ở phơng
Tây, các vi khuẩn HP mang cagA+ status dờng nh
liên quan đến các biểu hiện bệnh dạ dày rất nặng nh
ung th, thì ở các nớc phơng Đông nh Nhật, Hàn
quốc, Trung Quốc, qui luật đó không đợc xem xét
[1, 2].Hiện nay, các nhà khoa học ớc tính, H. pylori có
thể có đến 32 gien mã hoá cho protein màng ngoài [3].
Các gien của các protein này đợc quan tâm nghiên
cứu ở nhiều khía cạnh, trong đó có việc sử dụng chúng
làm dấu ấn phân tử để phát hiện vi khuẩn HP [4,5].
Trong bài báo này, chúng tôi thông báo các
kết quả khảo nghiệm cặp mồi TH2 để phát hiện
vi khuẩn HP. Chúng tôi sử dụng phơng pháp
PCR để khuếch đại một vùng bảo thủ trên gien
HP1125 của vi khuẩn H. pylori.
Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu

Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân : các bệnh nhân có
nhiễm H. pylori theo tiêu chuẩn vàng (hoặc nuôi cấy
dơng tính, hoặc cả hai phơng pháp Clotest và mô
bệnh học dơng tính) đợc lựa chọn cho nghiên cứu.
Tiêu chuẩn loại bệnh nhân:
Dừng kháng sinh cha đợc 1 tháng và ức chế
bơm proton cha đợc 1 tuần.
Tổng số 113 bệnh nhân trong đó có 35 nữ và 78
nam. Tuổi của các bệnh nhân từ 20 đến 82, tuổi
trung bình là 47,1. Các bệnh nhân đợc chẩn đoán
loét dạ dày và hành tá tràng, đáp ứng các tiêu chuẩn
chọn lựa và loại trừ đợc chọn vào nghiên cứu.
Lấy sinh thiết: sinh thiết đợc lấy từ 113 bệnh
nhân, trong đó 38 mẫu đợc sử dụng trực tiếp để
tách chiết ADN trong vòng một vài tiếng sau khi lấy,
còn 75 mẫu đợc sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn theo
phơng pháp đã công bố [6].
Tách ADN từ sinh thiết: ADN đợc tách từ sinh
thiết và từ vi khuẩn theo các phơng pháp đã miêu tả.
Phản ứng PCR: Cặp mồi TH2 đợc thiết kế dựa
trên trình tự đã biết của gien HP1125 của chủng vi
khuẩn chuẩn J99 và 26295.
Cặp mồi khuếch đại gien HP1125: Sơ đồ hình 1
chỉ vị trí của mồi trên gien HP1125 của chủng chuẩn
J99.

Hình 1. Vị trí của cặp mồi TH2 ( F+R) trên
gien HP1125 của chủng J99
Cặp mồi TH2 có trình tự nh sau:
Th2F: 5- acttgaattccttgatcggattctttgatttc- 3

TH2R: 5-tttaggatccccatggataataagactgtggcc-3
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
94
o
C 1 phút
55
o
C 50 giây
72
o
C 50 giây
Lặp lạị 35 chu kỳ
Xác định độ nhậy của phản ứng PCR
Độ nhậy = số các mẫu dơng tính thật / số các
mẫu dơng tính thật + âm tính giả.
Độ đặc thù= số mẫu âm tính thật/ số mẫu âm tính
thật + dơng tính giả.
Kết quả và bàn luận
Giới thiệu về bệnh nhân
113 mẫu ADN đợc tách từ sinh thiết và từ vi
khuẩn Helicobacter pylori, trong đó số phụ nữ bị
nhiễm H. pylori là 35 ngời chiếm 30.97% và nam
giới là 78 ngời chiếm 69.03%.
Kết quả thống kê cho thấy, bệnh dạ dày do vi
khuẩn H. pylori có liên quan chặt chẽ đến độ tuổi và
giới tính của các bệnh nhân. ở độ tuổi dới 40 số
bệnh nhân bị nhiễm H. pylori chiếm tỷ lệ thấp, sau đó
tăng dần ở độ tuổi 41 đến 50, ở độ tuổi trên 50 tuổi số
bệnh nhân bị nhiễm H. pylori tăng một cách đột biến
chiếm 59.29%. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, ở

y học thực hành (762) - số 4/2011



55
bất cứ độ tuổi nào thì số lợng bệnh nhân nam bị
nhiễm H. pylori cũng cao số lợng bệnh nhân nữ. Sự
liên quan bệnh dạ dày đến độ tuổi, giới tính đợc chỉ
ra ở hình 2 và bảng 1 dới đây.
Bảng 1. Bệnh dạ dày do vi khuẩn H. pylori theo
tuổi và giới
Tuổi
Giới tính

< 30


31- 40


41 -
50

> 50


Tổng

Tuổi
trung

bình
% theo
giới tính

Nam 10 6 12 50 78 55.21 68.75
Nữ 6 7 5 17 35 48.93 31.25
% theo độ
tuổi
14.3

11.6 15.2 58.9


Khảo sát cặp mồi TH2 trên 113 mẫu bệnh phẩm
Tất cả 113 mẫu ADN sinh thiết đợc tách và làm
sạch theo phơng pháp cải tiến đơn giản và dễ áp
dụng trong các bệnh viện. Tất cả ADN đều đạt tiêu
chuẩn về chất lợng ( hình 3). Chúng đã đợc sử
dụng có kết quả trong các phản ứng PCR nhằm phát
hiện vi khuẩn H. pylori. Cặp mồi TH2 đợc sử dụng
để khuếch đại đầu 5của gien HP1125 trên 113 mẫu
ADN. Trên điện di đồ (hình 3), sản phẩm PCR là một
băng duy nhất có kích thớc nh mong đợi từ thiết kế
là 220 cặp bazơ.
Qua khảo sát PCR trên 113 mẫu ADN, cặp mồi
TH2 đã tỏ ra có khả năng nhận biết gien HP1125 rất
cao, trong đó 112 mẫu ADN cho kết quả PCR dơng
tính trên tổng số 113 mẫu ADN nghiên cứu, chiếm tỷ
lệ 99,11%. Điều này cũng gián tiếp cho thấy, đoạn
gien đợc khuếch đại có tính bảo thủ cao

1 2 3 4 5 6 8 7 9 10 11 12 13 14 15 16 M
Hình 3. Điện di đồ một số mẫu ADN tổng số tách
từ các chủng vi khuẩn H. pylori.
Giếng: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16 có một băng ADN tổng số.
M là bậc thang ADN chuẩn 100 cặp bazơ.



Hình 4. Đầu 5 của gien HP1125 đợc khuếch đại trên
mẫu ADN của các bệnh nhân nhiễm khuẩn H. pylori.

Giếng: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 có một băng
ADN kích thớc 220bp
M: Thang chuẩn ADN 100 cặp bazơ.
Các kết quả PCR trên 113 mẫu ADN, đợc xử lý
bằng chơng trình Excel và thống kê sinh học cho
thấy độ nhậy của cặp mồi TH2 thiết kế > 99.11% và
độ đặc thù của phản ứng PCR đạt 100%. Bảng 2 dới
đây là kết quả PCR của các mẫu ADN nghiên cứu.
Bảng 2 : Kết quả PCR nhận đợc khi khảo sát 113
mẫu ADN
Chỉ tiêu nghiên cứu Kết quả
PCR
Số mẫu ADN cho sản phẩm PCR dơng tính thật 112/ 113
Số mẫu AND cho sản phẩm PCR dơng tính giả 0/113
Số mẫu AND cho sản phẩm PCR âm tính thật 1/113
Số mẫu ADN cho sản phẩm PCR âm tính giả 0/113
Độ nhậy của cặp mồi TH2 99,11%

Độ đặc thù của cặp mồi TH2 100%
Việc phát hiện các nguồn bệnh bằng khuếch đại
một số gien đặc trng của vi khuẩn bằng phản
ứngPCR là một phơng pháp nhanh, nhậy, chính xác
và tơng đối dễ thao tác. Tuy nhiên, vấn đề sẽ khó
khăn hơn, nếu các nguồn bệnh có một hệ gienom
linh hoạt và luôn thay đổi nh virus HIV, nguyên sinh
động vật Trypanosoma, vi khuẩn Helicobacter
pyloriTrong những trờng hợp nh vậy, các nhà
khoa học bắt buộc phải tìm kiếm các vùng bảo thủ
nhất trên hệ gien nhằm đạt một độ nhậy cũng nh độ
đặc thù cao cho phải ứng PCR. Trong nghiên cứu của
mình, chúng tôi đã may mắn tìm thấy một trong
những vùng nh vậy trên gien HP1125 của vi khuẩn.
Điều đó giải thích độ nhậy đạt 99,11% cũng nh độ
đặc thù cao 100% của phơng pháp.
Chúng tôi cho rằng, cặp mồi TH2 có thể sử dụng
nhằm chẩn đóan vi khuẩn H. pylori ở Việt Nam.
Kết luận:
Cặp mồi TH2 đã đợc thiết kế nhằm khuếch đại
gien HP1125 mã hoá cho một trong số 32 protein
màng ngoài của Helicobacter pylori và đợc thử
nghiệm trên 113 mẫu ADN tách từ mảnh sinh thiết
dạ dày của bệnh nhân. Độ nhậy và độ đặc hiệu của
mồi thiết kế tơng ứng là 99.11% và 100. Cặp mồi
TH2 có thể đợc sử dụng để chẩn đoán H. pylori
trực tiếp từ các mảnh sinh thiết dạ dày bằng phơng
pháp PCR mà không cần nuôi cấy vi khuẩn đòi hỏi
thời gian và tốn kém.
Tài liệu tham khảo

1. Warburton, V.J., Everett, S., Mapstone, N.P.,
Axon, A.T and HawkeyP., Dixon, M. F (1998).
Clinical and Histological associations of cagA and
vacA genotypes in Helicobacter pylori. J. Clin. Pathol.
51{1): 55-61.
2 .Shimoyama, T., Yoshimura, T., Mikami, T.,
Fukuda, S., Crabtree, J.E., Munakata, A (1998).
Evaluation of Helicobacter pylori in Japanese patients
with gastric cancer. J. Clin. Pathol. 51(4) : 299- 301.
3 Richard, Alm et al (2000). Comparative
Genomic of Helicobacter pylori :Analysis of the outer
membrane protein families. Infect and Immu. Vol 68
(7) : 4155- 4167.
4. Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2001). Sử dụng protein
màng ngoài HP1125 của vi khuẩn Helicobacter pylori
làm kháng nguyên đặc hiệu trong các phân tích

220bp
y học thực hành (762) - số 4/2011




56

Western. Đại hội lần thứ 2 Hội nghị khoa học Sinh Y
Dợc năm 2001, trang 125-129 .
5. Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2003). Sử dụng kháng
nguyên tái tổ hợp HP1125 để chẩn đoán nhiễm khuẩn
Helicobacter pylori. Những vấn đề nghiên cứu cơ bản

trong khoa học sự sống. Báo cáo khoa học. Nhà xuất
bản Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội 2003. Tr. 889-991.
6. Trần Công Tớc., Trần Quỳnh Hoa., Nguyễn
Thị Hồng Hạnh., Nguyễn Vân Phủng và Bùi Phơng
Thuân (2000). Sự có mặt của vi khuẩn Helicobacter
pylori mang CagA+ trong các sinh thiết dạ dày của
ngời Việt Nam. Tạp chí Sinh học 23 (2) : 51-54.
7. Nguyễn Thị Hồng Hạnh và Nguyễn Thị Thanh
Lợi (2001). Sự tồn tại của các chủng Helicobacter
pylori khiếm khuyết gene urease B ở các bệnh nhân
viêm loét và ung th dạ dày Việt Nam. Đại hội lần thứ
hai hội nghị khoa học hoá sinh y dợc năm 2001- Các
báo cáo khoa học. Trang106 -113.

KếT QUả BƯớC ĐầU SINH THIếT XUYÊN THàNH NGựC TRONG CHẩN ĐOáN ĐáM Mờ ở PHổI
DƯớI HƯớNG DẫN CủA CHụP CắT LớP VI TíNH TạI BệNH VIệN HữU NGHị

TRịNH MạNH HùNG
Đặt vấn đề
Ung th phi l mt trong nhng bnh thng gp,
cú t l mc v t vong ng u trong cỏc bnh v ung
th. Vic chn oỏn mụ bnh hc cú ngha vụ cựng
quan trng trong vic iu tr v tiờn lng bnh.
Soi ph qun (SPQ) l mt phng phỏp hu ớch khi
nhỡn thy c tn thng ly bnh phm lm xột
nghim. Tuy nhiờn rt nhiu trng hp SPQ khụng gúp
phn vo vic chn oỏn bnh, lỳc ny sinh thit xuyờn
thnh ngc (STXTN) l mt bin phỏp lớ tng trong
vic tip cn khi u. STXTN ó c tin hnh nhiu
nc trờn th gii v th hin c nhiu u im. Ti

bnh vin Hu ngh H Ni, k thut ny c trin khai
t nm 2006 bng kim Chiba, sau ú t nm 2008 bng
kim Tro-cut cú kh nng ly mnh t chc rt tt. Sau 1
nm nghiờn cu chỳng tụi thc hin ti ny vi mc
tiờu sau:
- ỏnh giỏ kt qu bc u ca STXTN trong chn
oỏn ỏm m phi di hng dn ca chp ct lp
vi tớnh (CLVT).
- Xõy dng quy trỡnh k thut.
I TNG, PHNG PHP NGHIấN CU:
1. i tng nghiờn cu: 30 ngi bnh c
iu tr ti Bnh vin Hu ngh cú chn oỏn ỏm m
phi trờn ct lp vi tớnh.
1.1. Tiờu chun chn ngi bnh :
- Cú tn thng hỡnh ỏm m ngoi vi trờn phim
chp CLVT.
- Tt c tn thng hỡnh ỏm m khỏc trờn CLVT m
SPQ khụng thy khi u trong lũng ph qun, xột nghim
gii phu bnh qua SPQ khụng giỳp ớch cho chn oỏn.
- Ngi khụng cú chng ch nh vi STXTN.
1.2. Tiờu chun loi tr bnh nhõn: Ri lon ụng
cm mỏu. iu tr chng ụng.Tng ỏp lc ng mch
phi nng. Suy hụ hp, suy tim, ang th mỏy. Kộn khớ
ln cnh khi u. Ct thựy phi bờn i din khi u. Nghi
tn thng u mch. Nghi ng nang nc. Ngi bnh
khụng kt hp.
2. Thit k nghiờn cu: Nghiờn cu mụ t, tin cu
3. Phng phỏp tiờn hnh:
3.1. Chun b ngi bnh :
- Gii thớch cho ngi bnh v gia ỡnh ngi bnh

v s cn thit tin hnh k thut ng thi kớ vo giy
ng ý lm th thut.
- Trc khi tin hnh k thut phi cú phim chp phi
thng nghiờng, phim chp CLVT, xột nghim cụng thc
mỏu, ụng mỏu c bn.
- K thut c tin hnh ti phũng chp CLVT.
- Ngi bnh c nm sp, nghiờng hay nga tựy
thuc vo v trớ khi u hay l s thun li i vi th
thut viờn.
3.2. Chun b dng c: - Kim sinh thit. - Dao phu
thut. - Kim tiờm cỏc loi, bm tiờm 50ml. - L ng
bnh phm, lam kớnh. - Sng cú l v khụng l, bong
cn, gc, ỏo th thut, m, khu trang. - Thuc gõy tờ ti
ch: Lidocain hoc Novocain.
3.3. Phng phỏp tin hnh:
nh v v trớ chc trờn CLVT, o khong cỏch t khi
u n mt da, o gúc to bi gia mt phng ngang v
hng kim. Sỏt khun v trớ chc khong 20 cm. Tri
sng cú l lờn v trớ sinh thit. Gõy tờ ti ch. Tin hnh
sinh thit: Chc kim sinh thit vo v trớ ó c nh v:
sõu, gúc. Chp CLVT li xỏc nh v trớ u kim
sinh thit. Khi u kim sinh thit vo v trớ khi u, tin
hnh sinh thit ly 1-2 mnh t chc.




Hỡnh nh tin hnh sinh thit

3.4. Theo dừi v x trớ tai bin:

- Khi sinh thit xong chp CLVT li mt ln na
kim tra tai bin sau quỏ trỡnh sinh thit: chy mỏu, trn
khớ mng phi.
- Sau 4h cn chp phim X quang thng kim tra
li tai bin mt ln na.
- Ngi bnh cn thit phi c theo dừi trong 24h
phỏt hin kp thi nhng tai bin mun cú th xy ra.
KT QU NGHIấN CU V BN LUN:
- Phõn b ngi bnh theo tui: Bng 1
Tui S lng T l %
50 59 5 16,6
60 69 8 26,6
70 79 15 50
80 2 6,8
Tng s 30 100
Tui cao nht: 82, tui thp nht: 54
Trong 30 trng hp cú ỏm m trờn CLVT, la tui
chỳng tụi hay gp nht tui t 60-79, õy l im
c trng ca Bnh vin Hu ngh a phn iu tr cho
ngời bnh cao tui.
1. Phõn b ngi bnh theo gii: