Nghiên cứu các đặc tính vi khuẩn methylobacterium spp phân lập ở vùng đông nam bộ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




KIỀU PHƯƠNG NAM



NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH VI KHUẨN
METHYLOBACTERIUM SPP. PHÂN LẬP Ở VÙNG
ĐÔNG NAM BỘ



Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 62 42 40 01


LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. BÙI VĂN LỆ



THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2010
Luận án Tiến sĩ Sinh học

i

1MỤC LỤC

MỤC LỤC i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC BẢNG vii
DANH MỤC HÌNH x
TÓM TẮT 1
MỞ ĐẦU 2
1 Chương 1 - TỔNG QUAN 4
1.1 Chi vi khuẩn Methylobacterium 4
1.1.1 Lịch sử phát hiện và phân loại chi Methylobacterium 4
1.1.2 Đặc điểm sinh thái 5
1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá 7
1.1.4 Phương pháp phân lập và định danh 11
1.1.5 Các loài vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium 12
1.1.6 Khoá phân loại chi Methylobacterium 13
1.1.7 Các đặc tính của vi khuẩn Methylobacterium spp. 16
1.2 Các cơ chế tương tác của vi khuẩn Methylobacterium spp. 26
1.2.1 Sinh tổng hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ở vi sinh vật và
Methylobacterium spp. 29
1.2.2 Methylobacterium spp. và sự kiểm soát bệnh hại ở thực vật 35
1.3 Địa lý và điều kiện tự nhiên vùng Đông Nam Bộ 47
2 Chương 2 - VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP 48
Luận án Tiến sĩ Sinh học

ii

2.1 Vật liệu 48
2.1.1 Nguồn phân lập 48

2.1.2 Chủng vi sinh vật 48
2.1.3 Hạt, giống thực vật 49
2.1.4 Môi trường 49
2.2 Phương pháp 51
2.2.1 Phân lập và định danh 51
2.2.2 Xác định đặc điểm sinh lý – sinh hóa của chủng phân lập 56
2.2.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium radiotolerans 1019 lên sự
tăng trưởng và phát sinh cơ quan ở thực vật 59
2.2.4 Sự sinh tổng hợp gibberellin, auxin và cytokinin 61
2.2.5 Vai trò của M. radiotolerans H2T trong việc hạn chế bệnh thối nhũn ở
cây A. thaliana 65
2.2.6 Đặc tính làm gia tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt giống 71
2.2.7 Tác dụng kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành của chủng Methylobacterium
radiotolerans H2T 73
2.2.8 Xác định khả năng sinh tổng hợp poly-β-hydroxybutyrate (PHB) 76
3 Chương 3 - KẾT QUẢ, BIỆN LUẬN 84
3.1 Phân lập và định danh vi khuẩn Methylobacterium spp. 84
3.1.1 Phân lập 84
3.1.2 Định danh 84
3.1.3 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa của chủng phân lập 91
3.2 Nghiên cứu các đặc tính của các chủng phân lập được 96
3.2.1 Ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium radiotolerans 1019 lên sự
tăng trưởng và phát sinh cơ quan ở thực vật 96
Luận án Tiến sĩ Sinh học

iii

3.2.2 Sự sinh tổng hợp gibberellin, auxin và cytokinin 104
3.2.3 Vai trò của Methylobacterium radiotolerans H2T trong việc hạn chế
bệnh thối nhũn ở cây Arabidopsis thaliana 111

3.3 Nghiên cứu định hướng các ứng dụng của các chủng Methylobacterium
spp. phân lập 121
3.3.1 Đặc tính làm gia tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt giống 121
3.3.2 Tác dụng kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành của chủng M. radiotolerans H2T
126
3.3.3 Đặc điểm sinh tổng hợp poly-β-hydroxybutyrate (PHB) 131
3.4 Tóm tắt tổng kết các đặc điểm và khả năng ứng dụng của các chủng
Methylobacterium spp. phân lập ở Vùng Đông Nam Bộ 142
4 Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 143
4.1 Kết luận 143
4.2 Đề nghị 144
CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN TỚI NỘI DUNG
LUẬN ÁN 145
TÀI LIỆU THAM KHẢO 147
TIẾNG VIỆT 147
TIẾNG ANH 148
INTERNET 163
PHỤ LỤC 165

Luận án Tiến sĩ Sinh học

v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Tiếng việt
cfu: đơn vị hình thành khuẩn lạc
CMS: môi trường MS bổ sung 2g/l cao thịt và casein
DEPC – H
2
O: nước cất hai lần xử lý bằng DEPC

ĐC: đối chứng
LB: môi trường Luria – Bertani
STN: sinh trắc nghiệm
tRNA: RNA vận chuyển
MMS: môi trường Methanol Mineral Salts
MS: môi trường Murashige và Skoog, 1962
rDNA: gen mã hóa rRNA
Tiếng Anh
ABA : abscisic acid
ACC deaminase: 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase
AHL: N-acyl homoserine lactone
BA: N
6
-Benzylaminopurine
DNA: deoxyribonucleotide
DNS: 3,5 dinitrosalicylic acid
GA: gibberellic acid
GUS: β-glucuronidase
HPLC: High Performance Liquid Chromatography
HR: hypersensitive response
IAA: indole - 3- acetic acid
IBA: indole -3- butyric acid
ISR: induced systemic resistance
NAA: -Naphthaleneacetic acid
Luận án Tiến sĩ Sinh học

vi

OD: optical density
PCR: Polymerase Chain Reaction

PGPR: Plant Growth Promoting Rhizobacteria
PPFM: Pink Pigmented Facultative Methylotroph
PR: pathogenic-related protein
PHB: poly-ß-Hydroxybutyrate (poly-beta-Hydroxybutyrate)
Q-PCR: quantitative PCR
QS: Quorum Sensing
RNA: ribonucleic acid
rRNA: RNA ribosome
RT-PCR: reverse-transcription PCR
SA: salicylic acid
SAR: systemic acquired resistance
UV: ultraviolet
Zeatin: 4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine
Luận án Tiến sĩ Sinh học

vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Danh mục các loài Methylobacterium spp. đã được đặt tên. Lựa chọn
dựa trên công bố của các tạp chí trong ngân hàng NCBI 13
Bảng 1.2. Tóm tắt các đặc điểm của các chi vi khuẩn dinh dưỡng methyl
(methylotrophic bacteria) 14
Bảng 1.3. Đặc điểm sử dụng carbon của các loài thuộc chi Methylobacterium 15
Bảng 1.4. Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp IAA 30
Bảng 1.5. Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp gibberellin 31
Bảng 1.6. Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cytokinin 31
Bảng 1.7. Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp abscisic acid 32
Bảng 1.8. Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp ethylene 32
Bảng 1.9. Một số AHL và hoạt động phụ thuộc vào mật độ quần thể được điều
hòa bởi AHL 38

Bảng 2.1. Các loại môi trường sử dụng 60
Bảng 2.2. Thành phần của các dung dịch cắm hoa 76
Bảng 2.3. Các thông số cần được khảo sát trong nuôi cấy lỏng lắc 80
Bảng 2.4. Các thông số cần được khảo sát ở điều kiện nuôi cấy lỏng có lắc trong
thí nghiệm 2.2.8.5 82
Bảng 3.1. Thông tin về các chủng phân lập được 84
Bảng 3.2. Sự tương đồng của các chủng mục tiêu và các trình tự đã công bố dựa
trên kết quả Blast trong NCBI 85
Bảng 3.3. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý của M. radiotolerans H2T, M.
oryzae 1021b, M. zatmanii 6012 và M. komagatae TN10 92
Bảng 3.4. Đặc điểm sử dụng nguồn carbon của bốn chủng khảo sát và bốn
chủng chuẩn của loài. 94
Bảng 3.5. Một số thử nghiệm sinh hoá khác 95
Luận án Tiến sĩ Sinh học

viii

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn 1019 lên sự phát sinh chồi ở thuốc lá
và Saintpaulia ionathna nuôi cấy in vitro 98
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của chủng 1019 lên sự hình thành mô sẹo ở cúc và thuốc
lá 99
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chủng 1019 lên sự hình thành rễ ở cây hoa cúc và
thuốc lá 100
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium radiotolerans 1019 lên sự
tăng trưởng chồi và tạo rễ ở cây in vitro, sau 14 ngày nuôi cấy 102
Bảng 3.10. Tỉ lệ sống của cây thuốc lá, cà chua và cây hoa cúc sau 10 ngày đưa
ra vườn ươm, và chiều cao trung bình của cây sau 21 ngày 103
Bảng 3.11. Kết quả phổ HPLC/MS của dịch chiết GA
3
từ M. radiotolerans H2T108

Bảng 3.12. Kết quả sinh trắc nghiệm 108
Bảng 3.13. Tốc độ nảy mầm của hạt lúa 109
Bảng 3.14. Sự thay đổi hoạt tính amylase. Đơn vị là UI, trong đó 1 đơn vị là
lượng enzyme cần để giải phóng 1µM maltose từ tinh bột trong 1 phút, ở pH 6,9
ở 20
0
C 110
Bảng 3.15. Thông số tăng trưởng của lúa sau 14 ngày 110
Bảng 3.16. Kết quả phân tích mẫu AHL tách được từ vi khuẩn M. radiotolerans
H2T cùng các chất chuẩn bằng phương pháp HPLC-MS 115
Bảng 3.17. Giá trị 2
^
[

ct2( ct1)] của các gen kháng ở cây Arabidopsis
thaliana Col0 khi lây nhiễm với Methylobacterium spp. 118
Bảng 3.18. Giá trị 2
^
[

ct2( ct1)] của các gen kháng ở cây Arabidopsis
thaliana Col0 và sid2 khi lây nhiễm với Methylobacterium spp. 48 giờ 120
Bảng 3.19. Tỉ lệ % nảy mầm và sức nảy mầm của các loại hạt thí nghiệm 122
Bảng 3.20. Mật độ tế bào sau khi bảo quản bằng phương pháp đông khô (tế
bào/ml) 124
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của M. radiotolerans H2T đến các chỉ tiêu cảm quan của
hoa cẩm chướng cắt cành. 127
Luận án Tiến sĩ Sinh học

ix

Bảng 3.22. Hàm lượng chlorophyll, đường, protein, phytohormone của hoa cắt
cành cắm trong dung dịch sinh khối vi khuẩn 127
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa nồng độ đường, AgNO
3
35mg/l (A);
và sinh khối vi khuẩn lên các chỉ tiêu theo dõi ở hoa cẩm chướng. 128
Bảng 3.24. Hàm lượng chlorophyll, đường, protein, phytohormone của hoa cắt
cành cắm trong dung dịch có sự phối hợp giữa nồng độ sucrose 1,5%, AgNO
3

35mg/l và sinh khối vi khuẩn 129
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của các dạng chế phẩm lên các chỉ tiêu cảm quan của
hoa cẩm chướng 130
Bảng 3.26. Kết quả khảo sát môi trường và chủng vi khuẩn trong thu nhận PHB
ở điều kiện nuôi cấy lỏng lắc 135
Bảng 3.27. Các thông số của quá trình nuôi cấy thu nhận PHB từ chủng M.
radiotolerans H2T trên môi trường Med3 với các nồng độ methanol bổ sung ở
các thời điểm khác nhau 138
Bảng 3.28. Tóm tắt về đặc tính của các chủng Methylobacterium spp. phân lập
được ở vùng Đông Nam Bộ 142


Luận án Tiến sĩ Sinh học

x

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Pseudomonas methanica và Vibrio extorquens 5
Hình 1.2. Methylobacterium spp. trên cây rêu (A), hình dạng tế bào vi khuẩn

chụp qua kính hiển vi điện tử (B) 6
Hình 1.3. Methylobacterium spp. chủng BJ001 nuôi cấy trên môi trường thạch
LB (A) và môi trường dịch thể LB (B) 7
Hình 1.4. Biến dưỡng hợp chất một carbon ở vi khuẩn Methylobacterium
extorquens AM1 9
Hình 1.5. Cây phát sinh loài (dựa theo trình tự 16S rRNA) thể hiện các nhánh
khác nhau của vi khuẩn nốt sần (rhizobia), 11
Hình 1.6. Nốt sần rễ cây C. perrottetii hình thành khi ủ chung với vi khuẩn 11
Hình 1.7. Khuẩn lạc của vi khuẩn Methylobacterium spp. phân lập 12
Hình 1.8. Sự tái sinh chồi của lá cây thuốc lá chuyển gen ipt trên môi trường MS
không bổ sung hormone sau một tháng nuôi cấy 17
Hình 1.9. Sự hiện diện của dòng vi khuẩn PPFM (đã dòng hoá gen gfp) trên lá
cây cỏ ba lá đỏ (A,B), rễ cây cỏ ba lá (C) và cây lúa mì (D) 18
Hình 1.10. P. deltoides _ nigra DN34 tái sinh từ mô nuôi cấy in vitro trên môi
trường thạch MS 18
Hình 1.11. Sự phát triển của rêu Funaria hygrometrica trong điều kiện có vi
khuẩn Methylobacterium spp. (+) và đối chứng (-) 20
Hình 1.12. Giả thuyết về cơ chế tương tác ở mức độ trao đổi các chất chuyển
hóa giữa mô thực vật và vi khuẩn PPFM 22
Hình 1.13. Cấu trúc phân nhánh của tế bào Methylobacteium extorquens (A) và
phân bố của PHB trong tế bào (B) 24
Hình 1.14. Các cơ chế kích thích sự tăng trưởng ở thực vật của Rhizobacteria 28
Hình 1.15. Tương tác quorum sensing 36
Hình 1.16. Hệ thống điều hòa sinh tổng hợp AHL ở vi khuẩn Garm âm 37
Luận án Tiến sĩ Sinh học

xi

Hình 1.17. Mô hình tương tác QS giữa thực vật và vi khuẩn 40
Hình 1.18. Hiện tượng thối nhũn ở cây Amorphophallus konjac sau khi ủ với vi

khuẩn Erwinia carotovora SCG1 sau 5 ngày 42
Hình 1.19. Sơ đồ các con đường tín hiệu được hoạt hóa và sự liên hệ các phản
ứng đề kháng ở thực vật 44
Hình 1.20. Sơ đồ về hệ thống truyền tín hiệu được cảm ứng với Rhizobacteria và
tác nhân gây bệnh 45
Hình 1.21. Các khu vực bảo tồn ở vùng Đông Nam Bộ 47
Hình 2.1. Sơ đồ vị trí lấy mẫu phân lập vi khuẩn Methylobacterium spp. tại vùng
Đông Nam Bộ 48
Hình 2.2. Hệ thống cấp độ đánh giá mức độ gây bệnh của vi khuẩn Erwinia
chrysanthemi trên Arabidopsis thaliana 66
Hình 2.3. Bảng điểm đánh giá các mức độ tươi của hoa cẩm chướng 75
Hình 2.4. Bảng điểm đánh giá các mức độ tươi của thân và lá cành hoa cẩm
chướng 75
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi 2F,2R 85
Hình 3.2. Cây phát sinh loài của tất cả các loài trong chi Methylobacterium và
các chủng phân lập được ở vùng Đông Nam Bộ 87
Hình 3.3. Cây phát sinh loài chi tiết cho nhóm IV 88
Hình 3.4. Cây phát sinh loài chi tiết cho nhóm II. 88
Hình 3.5. Cây phát sinh loài chi tiết cho nhóm III 89
Hình 3.6. Cây phát sinh loài chi tiết cho nhóm I 90
Hình 3.7. Hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium
dưới kính lúp (x55) 92
Hình 3.8. Hình thái tế bào M. komagatae TN10 quan sát dưới kính hiển vi
quang học sau khi nhuộm Gram; hình dạng tế bào M. radiotolerans H2T chụp
qua kính hiển vi điện tử quét 93
Luận án Tiến sĩ Sinh học

xii

Hình 3.9. Ảnh hưởng của chủng 1019 lên sự tạo chồi ở cây thuốc lá (A), ở cây

cà chua (B), ở cây Saintpaulia (C) sau 21 ngày nuôi cấy 97
Hình 3.10. Ảnh hưởng của chủng 1019 lên sự hình thành mô sẹo ở cây thuốc lá
(E); cây súp lơ (F) sau 21 ngày nuôi cấy 99
Hình 3.11. Ảnh hưởng của chủng 1019 lên sự hình thành rễ ở cây hoa cúc (A)
và cây hông sau 21 ngày đồng nuôi cấy (B). 100
Hình 3.12. Chồi ngọn cây thuốc lá nuôi cấy trên MS sau 14 ngày 102
Hình 3.13. Chồi cây cà chua nuôi cấy trên môi trường MS sau 14 ngày 102
Hình 3.14. Chồi ngọn cây hoa cúc nuôi cấy trên MS sau 14 ngày 102
Hình 3.15. Chồi ngủ cây hoa cúc nuôi cấy trên môi trường MS sau 14 ngày 102
Hình 3.16. Cây hoa cúc sau 21 ngày ra vườn ươm 103
Hình 3.17. Cây cà chua sau 21 ngày ra vườn ươm 103
Hình 3.18. Cây thuốc lá sau 21 ngày ra vườn ươm, 104
Hình 3.19. Phân tích dịch chiết pha acid bằng phương pháp sắc ký bản mỏng . 105
Hình 3.20. Vị trí của dịch chiết GA sau sắc ký bản mỏng 107
Hình 3.21. Triệu chứng thối nhũn (do Erwinia spp.) của cây Arabidopsis
thaliana Col0 trong điều kiện có hay không bổ sung vi khuẩn Methylobacterium
spp., A: cây in vitro; B: cây thủy canh. 114
Hình 3.22. Tín hiệu huỳnh quang trên bảng sắc ký dịch trích AHL, quan sát dưới
tia UV 115
Hình 3.23. Sự biểu hiện gus ở cây Arabidopsis thaliana dòng pr1::gus sau khi
xử lý với dung dịch AHLm (từ vi khuẩn M. radiotolerans H2T ) và các chất
chuẩn (C6; C8, C10) sau 96 giờ. 117
Hình 3.24. Sự biểu hiện gus ở cây Arabidopsis thaliana dòng pr1-gus sau khi xử
lý với vi khuẩn Methylobacterium spp. 96 giờ. 119
Hình 3.25. Tỉ lệ nảy mầm của hạt sau 4 ngày gieo. A: Hạt đậu xanh được xử lý
với M. oryzea 1021, B: hạt đậu xanh với nước cất, C: hạt cà chua với M. oryzea
1021b, D: hạt cà chua với nước cất. 125
Luận án Tiến sĩ Sinh học

xiii

Hình 3.26. Tình trạng hoa cẩm chướng trong dung dịch SK-ESG, ESG, NH, SK-
ASG, ASG so với nước cất sau 8 ngày 130
Hình 3.27. Sự phát ánh sáng cam dưới kính hiển vi huỳnh quang của một số
chủng khi nhuộm tế bào với NileBlue A 131
Hình 3.28. Sắc ký đồ GC gồm peak dung môi chloroform và peak 3-
hydroxylbutyryl methyl với mẫu PHB chuẩn 132
Hình 3.29. Sắc ký đồ GC - MS xác định sản phẩm 3-hydroxylbutyryl methyl,
được xử lý từ mẫu sinh khối khô của chủng M. radiotolerans H2T 133
Hình 3.30. Sản phẩm PHB dạng bản mỏng sau khi tách chiết bằng dung môi
chloroform từ chủng M. radiotolerans H2T 135


Luận án Tiến sĩ Sinh học

xiv

DANH MỤC ĐỒ THỊ-SƠ ĐỒ
Đồ thị 3.1. Đường cong tăng trưởng chủng M. radiotolerans H2T 93
Đồ thị 3.2. Đường tương quan giữa sai biệt trọng lượng tử diệp với nồng độ BA
(trái) và đường tương quan giữa OD
530
nm với nồng độ IAA (phải) 106
Đồ thị 3.3. Tỉ lệ % các cấp độ gây thối nhũn của vi khuẩn E. chrysanthemi lên
cây Arabidopsis thaliana Col0 trồng ở điều kiện thủy canh 112
Đồ thị 3.4. Tỉ lệ % các cấp độ gây thối nhũn của vi khuẩn E. chrysanthemi lên
cây Arabidopsis thaliana Col0 trồng ở điều kiện in vitro 112
Đồ thị 3.5. Tác động của các loại AHL khác nhau lên sự tăng trưởng của E.
chrysanthemi A470 116
Đồ thị 3.6. Tỉ lệ % các cấp độ gây thối nhũn của vi khuẩn E. chrysanthemi đã

xử lý với AHL từ M. radiotolerans H2T lên lá cây Arabidopsis thaliana Col0
trồng ở điều kiện thủy canh sau 48 và 72 giờ. 116
Đồ thị 3.7. Đồ thị biểu diễn sự biểu hiện các gen kháng ở cây Aradidopsis
thaliana Col0 khi lây nhiễm vi khuẩn Methylobacterium spp. ở các thời điểm
khác nhau. 118
Đồ thị 3.8. Đồ thị biểu diễn sự biểu hiện các gen kháng ở dòng Aradidopsis
thaliana Col0 và sid2 khi lây nhiễm vi khuẩn Methylobacterium spp. ở các thời
điểm 48 giờ sau khi lây nhiễm vi khuẩn. 120
Đồ thị 3.9. Tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu xanh trong các điều kiện bảo quản sinh
khối vi khuẩn khác nhau 123
Đồ thị 3.10. Tỉ lệ nảy mầm của các loại hạt thí nghiệm 124
Đồ thị 3.11. Đường chuẩn xác định hàm lượng PHB theo tỉ lệ diện tích peak
(Ax/Ao) bằng phương pháp sắc ký khí GC trên máy Shimadzu GC - 17A. 134

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ ly trích các chất từ canh trường nuôi vi khuẩn theo phương
pháp ly trích các chất điều hoà sinh trưởng thực vật 62
Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học

1

TÓM TẮT
16 chủng vi khuẩn Methylobacterium được phân lập lần đầu tiên ở Việt Nam
từ các nguồn mẫu lá cây, đất và nước ở các sinh cảnh đồng ruộng hay rừng tự nhiên
trong vùng Đông Nam Bộ. Thông qua phân tích trình tự gen mã hóa rRNA 16S xác
định 16 chủng thuộc 4 loài khác nhau: M. radiotolerans, M. oryzae, M. zatmanii và
M. komagatae. Loài M. radiotolerans (với 11 chủng phân lập) xuất hiện trên nhiều
loại mẫu và ở nhiều khu vực trong vùng Đông Nam Bộ.
Thông qua khảo sát các đặc tính của các chủng phân lập phát hiện những đặc
tính mới được ghi nhận bao gồm: ảnh hưởng lên quá trình phát sinh cơ quan ở thực
vật; Sinh tổng hợp chất điều hòa tăng trưởng thực vật, nhóm gibberellin; Cảm ứng

hệ thống kháng tập nhiễm (SAR) ở cây thông qua phân tử AHL và con đường
salicylic acid.
Trên cở sở đặc tính của các chủng, các định hướng nghiên cứu ứng dụng mới
đã được triển khai. Trong đó, chế phẩm có hoạt tính kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành là
sự phối hợp giữa sinh khối vi khuẩn và các chất bổ trợ (đường, nitrate bạc và GA3).
Chế phẩm gia tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt giống là lây nhiễm một hỗn hợp sinh khối
nhiều chủng vi khuẩn Methylobacterium spp. vào hạt và dùng chính hạt làm chất
mang sinh khối vi khuẩn.
Nhựa phân hủy sinh học (PHB) có thể thu nhận từ việc nuôi cấy các chủng
Methylobacterium spp. phân lập ở vùng Đông Nam Bộ. Sự tích lũy PHB cao
(50,55%) ở chủng M. radiotolerans H2T từ nguồn cơ chất methanol (có giá thành
hạ) là một điểm mới và ưu thế cho việc nghiên cứu thu nhận PHB ở nước ta.

Mở đầu Luận án Tiến sĩ Sinh học

2

MỞ ĐẦU
Từ lâu, khả năng cố định đạm của vi khuẩn nốt sần (Rhizobium) đã được sử
dụng để tăng năng suất cây trồng. Việc ứng dụng thành công nhóm vi sinh vật này
là cơ sở cho sự hình thành hướng vi sinh-nông nghiệp với mục tiêu nghiên cứu các
vi sinh vật và ứng dụng trong ngành nông nghiệp. Thành tựu của hướng nghiên cứu
này đã tạo ra các chế phẩm như phân bón vi sinh, thuốc trừ sâu vi sinh, góp phần
không nhỏ trong tăng năng suất cũng như gia tăng chất lượng nông sản. Ngày nay,
dưới áp lực về dân số và ô nhiễm môi trường, việc nghiên cứu và áp dụng các thành
tựu mới về vi sinh trong nông nghiệp ngày càng được quan tâm và đẩy mạnh.
Ở nước ta, nông nghiệp vẫn chiếm tỉ trọng lớn trong nền kinh tế và với mục
tiêu hiện đại hóa nền nông nghiệp thì việc nghiên cứu áp dụng vi sinh vật trong
nông nghiệp cũng cần được chú trọng. Do đặc điểm nền nông nghiệp và điều kiện
sinh thái nên hệ vi sinh vật ở nước ta cũng có những đặc điểm riêng. Chính vì thế,

chúng ta không thể áp dụng một cách máy móc các hệ vi sinh vật từ nước ngoài mà
cần nghiên cứu về hệ vi sinh vật trong nước và cân nhắc, chọn lọc các hệ vi sinh vật
nhập nội.
Hiện tại, các nghiên cứu không chỉ tập trung vào khai thác hệ vi sinh vật vùng
rễ mà hệ vi sinh vật vùng lá cũng được chú ý nhiều. Hệ vi sinh vật vùng lá tuy
không đa dạng và phong phú như hệ vi sinh vật vùng rễ nhưng chúng có những đặc
điểm khiến chúng trở nên đặc biệt như khả năng sử dụng methanol, sinh tổng hợp
các chất điều hòa tăng trưởng thực vật hay sinh tổng hợp những chất mới mà chưa
được biết tới.
Chi Methylobacterium là nhóm vi khuẩn hồng, dinh dưỡng methyl tùy ý (pink-
pigmented facultatively methylotrophic, PPFM) [63]. Chúng cư ngụ chủ yếu ở vùng
diệp quyển, nhưng đôi khi vẫn tìm thấy ở trong đất và trong nước. Chúng sử dụng
methanol từ thực vật làm nguồn carbon chủ yếu đồng thời sinh tổng hợp các chất
điều hòa tăng trưởng thực vật (auxin, cytokinin, salicylic acid), vitamine (B12) và
Mở đầu Luận án Tiến sĩ Sinh học

3

các enzyme (urease, ACC deaminase) để tác động ngược trở lại đối với thực vật, là
nhóm vi khuẩn có ích nên chúng đã được sử dụng để tăng năng suất lúa, kích thích
sự sinh trưởng của mía, bông vải hay gia tăng tính kháng bệnh ở đậu phộng [97],
[99], [102], [104].
Nhóm vi khuẩn này có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, cũng như trong
công nghiệp sản xuất polymer phân hủy sinh học, protein tái tổ hợp nên chúng đã
được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới nghiên cứu như Hàn Quốc, Nhật, Mỹ,
Thụy Sĩ, Pháp. Các nghiên cứu này đang dần làm rõ các đặc tính của chi vi khuẩn
này. Tuy nhiên, chính sự đa dạng về loài và các đặc tính mới là những vấn đề đang
được tiếp tục nghiên cứu. Thêm vào đó, Việt Nam được đánh giá có hệ sinh thái đa
dạng và hệ sinh vật phong phú nhưng chưa có công trình nào đề cập tới chi vi khuẩn
này. Vì thế, chúng tôi thực hiện đề tài:

Nghiên cứu các đặc tính vi khuẩn Methylobacterium spp. phân lập ở vùng
Đông Nam Bộ nhằm đạt được các mục tiêu như sau:
- Thu thập các chủng vi khuẩn Methylobacterium spp. ở vùng Đông Nam Bộ,
xác định tên và các đặc tính của chủng phân lập được nhằm tạo ra nguồn
chủng vi khuẩn Methylobacterium spp. phục vụ cho các nghiên cứu tiếp
theo.
- Nghiên cứu những đặc điểm về cơ chế tương tác với thực vật, tương tác với
vi sinh vật gây bệnh cho thực vật và sự sinh tổng hợp các hợp chất có giá trị
của các chủng phân lập được.
- Nghiên cứu phát triển các chế phẩm trên cơ sở nguồn chủng phân lập và các
đặc tính được nghiên cứu.
Các kết quả của luận án sẽ là cơ sở khoa học cho việc xây dựng, phát triển chế
phẩm vi sinh vật từ vi khuẩn Methylobacterium spp., phù hợp với điều kiện sinh
thái và nhu cầu của nền nông nghiệp nước ta.

Tổng quan Luận án Tiến sĩ Sinh học

4

1 Chương 1 - TỔNG QUAN
1.1 Chi vi khuẩn Methylobacterium
1.1.1 Lịch sử phát hiện và phân loại chi Methylobacterium
Chi Methylobacterium bao gồm nhiều loài vi khuẩn có sắc tố hồng dinh dưỡng
methyl tuỳ ý (pink-pigmented facultatively methylotrophic, PPFM). Chúng có khả
năng sử dụng các hợp chất chỉ chứa một nguyên tử carbon như fomate,
formaldehyde, methanol hay các hợp chất chứa nhiều nguyên tử carbon làm nguồn
cung cấp năng lượng và nguồn carbon cho quá trình sinh trưởng [63].
Vị trí phân loại chi Methylobacterium trong giới vi sinh vật như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacterium

Lớp: Alphaproteobacteria
Bộ: Rhizobiales
Họ: Methylobacteriaceae
Mặc dù, vi khuẩn PPFM hiện diện rất phổ biến trong đất hay trên các sinh vật
nhưng trong một thời gian dài nhóm vi khuẩn này không được nghiên cứu nhiều.
Những năm 1960-1970 khi các nghiên cứu tập trung vào con đường đồng hóa các
hợp chất một carbon thì nhóm vi khuẩn dinh dưỡng methyl được phân lập, nghiên
cứu, trong đó tập trung vào các phương thức biến dưỡng năng lượng và những ứng
dụng. Trong đó, loài Methylobacterium spp. được Bassalik phân lập lần đầu tiên
vào năm 1913 từ giun đất và được đặt tên lúc đầu là Bacillus extorquens. [63].
Trong giai đoạn trước năm 1960, một số loài vi khuẩn thuộc chi
Methylobacterium đã được phân lập nhưng do không có đầy đủ thông tin nên các
loài này được phân loại vào các chi vi khuẩn khác nhau chẳng hạn như:
Pseudomonas, Flavobacterium, Protaminobacter, Arthrobacter, Corynebacterium,
Vibrio… [63], [104].
Tổng quan Luận án Tiến sĩ Sinh học

5



Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Pseudomonas methanica (A) và Vibrio extorquens (B)
[140]
Năm 1976, Patt và cộng sự phân lập được loài vi khuẩn PPFM đầu tiên có khả
năng sử dụng methane. Loài này sắp xếp vào một chi mới là Methylobacterium với
tên loài là Methylobacterium organophilum (loài chuẩn cho Chi) [117]. Năm 1982,
Green và Bousfield nhận thấy chủng M. organophilum có nhiều đặc điểm rất giống
với các loài vi khuẩn PPFM đã được công bố trước đây (không có khả năng sử dụng
methane) và căn cứ trên sự tương đồng trên 70% của 140 đặc điểm sinh lý, sinh hóa
và hình thái của 149 chủng vi khuẩn PPFM với loài M. organophilum, Green và

Bousfield đã đề nghị sắp xếp các loài vi khuẩn PPFM vào chi Methylobacterium
[35], [63].
Từ năm 1992 đến nay, số lượng các loài Methylobacterium spp. mới được
phân lập và đặt tên gia tăng nhanh chóng một phần dựa trên sự phát triển của các
phương pháp sinh học phân tử. Tuy nhiên, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa vẫn là
công cụ không thể bỏ qua [50], [106], [165], [171], [172].
1.1.2 Đặc điểm sinh thái
Vi khuẩn Methylobacterium spp. phân bố rộng rãi trong tự nhiên, chúng hiện
diện trong nhiều môi trường khác nhau bao gồm: đất, đất bùn ao hồ, nước sạch [83],
nước mưa, không khí [164], băng ở hai cực, bề mặt lá cây (hình 1.2) [81], nốt sần ở
A B

Tổng quan Luận án Tiến sĩ Sinh học

6

rễ thực vật, các loại hạt giống, thực phẩm [25], mỹ phẩm, môi trường bệnh viện,
dung dịch ngâm xác động vật, trong một vài trường hợp vi khuẩn Methylobacterium
spp. còn được phân lập từ miệng, bề mặt da ở người, máu của bệnh nhân nhiễm
HIV… [20], [50], [58], [63], [163], [169].
Vi khuẩn PPFM là những vi khuẩn hiếu khí hoàn toàn, do vậy các vi khuẩn
này thường được phân lập từ bất kỳ môi trường nước sạch nào có chứa oxy hòa tan.
Ngoài ra, vi khuẩn PPFM còn có khả năng kháng với ion Cl
-
nên chúng vẫn hiện
diện trong nước sạch dùng để sinh hoạt [57], [58], [59], [67], [83].
Vi khuẩn PPFM hiện diện trên vùng căn quyển, diệp quyển của hơn 70 loài
thực vật và chúng có mối quan hệ mật thiết với thực vật. Thông qua phương pháp
sử dụng carbon phóng xạ (C
14

) Green đã làm sáng tỏ khả năng sử dụng các hợp chất
methanol từ thực vật của vi khuẩn PPFM, điều này giải thích nguyên nhân sự hiện
diện của vi khuẩn PPFM trên thực vật [63], [72], [115].

Hình 1.2. Methylobacterium spp. trên cây rêu (A), hình dạng tế bào vi khuẩn chụp
qua kính hiển vi điện tử (B) [72]
Vi khuẩn Methylobacterium spp. có hiện diện trên bề mặt lá, thân, rễ của thực
vật nhưng mật độ ở mỗi cơ quan thì khác nhau [122]. Bên cạnh đó, khi sử dụng các
phương pháp chuyên biệt chẳng hạn như phương pháp lai tại chỗ với mẫu dò đặc
trưng cho chi Methylobacterium, Pirttil và cộng sự (2000) đã chứng tỏ vi khuẩn
Tổng quan Luận án Tiến sĩ Sinh học

7

Methylobacterium spp. có hiện diện bên trong chồi của cây Thông (Pinus sylvestris)
hay nằm bên trong các bó mạch của các cây họ cam chanh [23], [119].
Vi khuẩn PPFM thường lan truyền qua không khí, có khả năng sử dụng các
hợp chất có tính độc với sinh vật làm nguồn cung cấp carbon và nitơ:
tetrachloromethane, trimethylamine. Chính vì vậy, các vi khuẩn PPFM còn đóng vai
trò quan trọng trong chu trình carbon trong tự nhiên [45], [63], ứng dụng trong xử lý
ô nhiễm môi trường [170]. Tuy nhiên, vai trò của chúng trong hệ sinh thái vẫn chưa
được sáng tỏ [85].
1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá
Hầu hết các loài vi khuẩn Methylobacterium spp. thường có hình que (0,8-1,0
x 1,0-0,8m) (hình 1.3). Tế bào thường có dạng phân nhánh hay có những hình
dạng bất thường khác đặc biệt thường xuất hiện ở pha cuối của quá trình tăng
trưởng, vi khuẩn thường nằm ở dạng tế bào đơn hay đôi khi kết lại theo dạng hoa
hồng (rosettes) [63], [83], [140].

Hình 1.3. Methylobacterium spp. chủng BJ001 nuôi cấy trên môi trường thạch LB

(A) và môi trường dịch thể LB (B) chụp qua kính hiển vi điện tử quét [141]
Hầu hết các chủng đều có khả năng di động nhờ một tiêm mao (flagellum) ở
cực hay gần cực, tuy nhiên một vài loài lại không có khả năng di động. Tế bào
thường chứa một lượng lớn các thể bắt màu với thuốc nhuộm sudan (poly--
hydroxybutyrate) hay các hạt volutin. Đa số các loài vi khuẩn Methylobacterium
Tổng quan Luận án Tiến sĩ Sinh học

8

spp. là vi khuẩn Gram âm, một số có Gram biến đổi. Một vài loài có cấu trúc thành
tế bào nhiều lớp và con đường biến dưỡng citrate đặc trưng cho nhóm vi khuẩn
Gram âm. Vi khuẩn thường tăng trưởng chậm, khuẩn lạc thường có màu hồng đậm
hay đỏ cam sáng, một vài chủng không tăng trưởng được trên môi trường nutrient
agar. Sắc tố hồng của vi khuẩn không tan trong nước, không phát ánh sáng huỳnh
quang và là hợp chất carotennoid, hấp thu bước sóng cực đại ở 473, 499 và 532nm
[50], [63].
Hầu hết các chủng là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Oxidase dương tính yếu,
catalase dương tính hay âm tính tùy thuộc vào loài vi khuẩn. Methylobacterium spp.
là những vi khuẩn hóa dị dưỡng, có khả năng sử dụng tùy ý các hợp chất methyl.
Do vậy, tất cả các loài đều có khả năng tăng trưởng trên môi trường có bổ sung
formaldehyde [40], formate và methanol, một vài loài có khả năng sử dụng các hợp
chất methylamine, chỉ có một loài duy nhất là M. organophilum có khả năng sử
dụng methane làm nguồn cung cấp carbon và năng lượng. Ngoài ra, các nghiên cứu
cũng cho thấy khả năng sử dụng methane của M. organophilum là do các gen nằm
trên plasmid chi phối, bởi vì khả năng sử dụng methane của vi khuẩn này bị mất đi
trong trường hợp môi trường nuôi cấy không thường xuyên được bổ sung methane
[50], [63].
Phương thức chuyển hóa các hợp chất một carbon ở tất cả các loài vi khuẩn
PPFM đều theo chu trình serine (hình 1.4), trong đó có sự gắn kết của chu trình
serine và chu trình tricarboxylic acid (TCA) để tạo ra các sản phẩm hữu cơ cuối

cùng cho vi khuẩn sử dụng. Ngoài ra, các chu trình này còn gắn kết với chu trình
PHB để tạo ra các sản phẩm dự trữ cho vi khuẩn (poly--hydroxybutyrate) [63].
Trong tất cả các loài PPFM thuộc chi Methylobacterium spp. thì loài
Methylobacterium extorquens được nghiên cứu nhiều nhất và M. extorquens cũng
được xem là vi khuẩn kiểu mẫu cho chi Methylobacterium spp Ngoài ra, còn rất
nhiều nghiên cứu tập trung vào tìm hiểu vai trò của các gen tham gia vào chu trình
Tổng quan Luận án Tiến sĩ Sinh học

9

chuyển hoá các hợp chất một carbon, điều này sẽ giúp cho việc sử dụng các loài vi
khuẩn Methylobacterium spp. một cách hữu ích nhất [41], [109].


Hình 1.4. Biến dưỡng hợp chất một carbon ở vi khuẩn Methylobacterium
extorquens AM1. Các gen đã biết được in nghiêng. Để đơn giản hóa các phản ứng
oxy hóa khử trong chu trình đồng hoá không trình bày trong sơ đồ này [41]
Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của các loài thuộc chi Methylobacterium
dao động từ 25 đến 30
0
C. Một vài loài vẫn có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 37
0
C hay
51
0
C. Mặc dù đa số các loài đều tăng trưởng ở khoảng pH trung tính nhưng cũng có
Tổng quan Luận án Tiến sĩ Sinh học

10

một số loài vẫn có khả năng phát triển ở các giá trị pH cực đoan (pH4; pH10). Tất
cả các loài đều không đòi hỏi các nhân tố tăng trưởng và không có khả năng phân
giải các hợp chất như: casein, tinh bột, gelatin, cellulose, lecithin và DNA. Khả
năng phân giải các hợp chất lipid chỉ có ở một số loài. Tất cả các loài đều không tạo
ra các enzyme: -galactosidase, L-ornithine decarboxylase, L-lysine decarboxylase,
L-arginine dihydrolase (ngoại trừ Urease lại hiện diện ở tất cả các loài). Một số loài
có khả năng sinh indole và H
2
S, test methyl red và Voges-Proskauer âm tính, hay
khử nitrate thành nitrite [50], [58], [63], [70], [83].
Hầu hết các loài đều nhạy cảm với các chất hay hợp chất kháng sinh như:
kanamycin, gentamycine, albamycin T, streptomycin, framycetin và tetracycline,
trong đó tetracyclin có hoạt tính ức chế mạnh đối với vi khuẩn Methylobacterium
spp Ngoài ra, các chủng vi khuẩn còn có khả năng đề kháng với nhiều kháng sinh
như: cephalothin, nalidixic acid, penicillin, bacitracin, carbenicillin, colistin sulfate,
polymyxin B và nitrofurantoin [63].
Khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ làm nguồn cung cấp carbon và năng
lượng ở các loài vi khuẩn PPFM thuộc chi Methylobacterium rất đặc trưng. Do vậy,
có thể xác định loài vi khuẩn Methylobacterium spp. căn cứ vào khả năng sử dụng
các hợp chất hữu cơ của chủng vi khuẩn này (Bảng 1.2) [70].
Những nghiên cứu phân tích DNA và rRNA cho thấy các loài vi khuẩn
Methylobacterium spp. có quan hệ họ hàng rất gần với các loài vi khuẩn trong chi
Agrobacterium và Rhizobium (hình 1.5). Những nghi vấn này được làm sáng tỏ khi
Sy và cộng sự (2001) phân lập được loài vi khuẩn M. nodulans từ nốt sần của các
cây Crotalaria, loài này không có sắc tố hồng như các loài vi khuẩn
Methylobacterium spp. nhưng có trình tự rRNA 16S tương đồng với chi
Methylobacterium và có vai trò trong việc hình thành nốt sần ở rễ các cây họ đậu,
trong đó có các gen như: nod, nifH đóng vai trò tương tự như các gen cố định nitơ ở
vi khuẩn Rhizobium (hình 1.6) [75], [141].
Tổng quan Luận án Tiến sĩ Sinh học

11


Hình 1.5. Cây phát sinh loài (dựa theo trình tự 16S rRNA) thể hiện các nhánh khác
nhau của vi khuẩn nốt sần (rhizobia), bao gồm cả vi khuẩn M. nodulans thuộc chi
Methylobacterium ở nhóm -proteobacteria [141]

Hình 1.6. Nốt sần rễ cây C. perrottetii hình thành khi ủ chung với vi khuẩn
M. nodulans ORS2060; (a) các nốt sần nguyên vẹn; (b) phẫu thức cắt dọc nốt sần
cho thấy vùng mô phân sinh thứ cấp (m), vùng bị tác động (iz), vùng lõi (sz), bó
mạch (vb) [141]
1.1.4 Phương pháp phân lập và định danh
Methylobacterium spp. là những vi khuẩn có khả năng sử dụng methanol làm
nguồn cung cấp carbon và năng lượng, vì thế môi trường methanol mineral salts
(MMS) là môi trường thích hợp để phân lập vi khuẩn Methylobacterium spp Ngoài