Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
LỀ THÀNH LÂM
NGHIÊN CỨU XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
HÀM LƯỢNG TẠP DHA TRONG ARTESUNAT NGUYÊN
LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP bược SỸ KHOÁ 2000- 2005)
^ i
-
Người hướng dẫn: PGS.TS TRẦN ĐỨC HẬU
Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá Dược
Thời gian thực hiện: tháng 10/2004-5/2005
Hà nội, tháng 5-2005
LỜI CẢM ƠN
Nhân dịp hoàn thành khoá luận tốt nghiệp cho phép tôi được bày tỏ
lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành tới:
Thầy giáo PGS.TS TRẦN ĐỨC HẬU, chủ nhiệm bộ môn Hoá Dược đã
tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ của bộ môn Hoá
Dược đã giúp đỡ, khuyến khích, động viên tôi hoàn thành khoá luận.
Xin được cảm ơn sự giúp đỡ của các bộ môn Phân Tích, Vô Cơ, phòng thí
nghiệm Vật Lý trung tâm.
Cuối cùng xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong
thời gian qua.
Hà Nội, tháng 5 năm 2005
Sinh viên
Lê Thành Lâm
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỂ 1
PHẦN 1: TỔNG Q U AN 3
1.1 Tổng quan về artesunat 3

1.1.1 Công thức 3
1.1.2 Nguồn gốc và cách điều chế 3
1.1.3 Tính chất 4
1.1.4 Tác dụng 5
1.1.5 Dược động học 5
1.1.6 Tác dụng không mong muốn 5
1.1.7. Chế phẩm 5
1.1.8 Chỉ định 5
1.2 Tổng quan về tạp DHA trong artesunat nguên liệu
5
1.2.1 Tạp DHA và nguyên nhân gây tạp DHA trong artesunat nguyên liệu 5
1.2.2 Tổng quan một số phươQg pháp xác đinh tạp chất liên quan trong thuốc,
ưu nhược điểm, các phương pháp xác định tạp DHA 6
1.3. Tổng quan về HPLC 9
1.3.1 Khái niệm về sắc ký lỏng và sắc ký lỏng hiệu năng c a o

9
1.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký 10
1.3.3 Cơ sở lý thuyết sắc k ý 11
1.3.4 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống sắc k ý
11
1.3.5 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và yếu tố ảnh hưởng

12
1.3.6 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc k ý

15
1.3.7 úhg dụng của H PL C 18
PHẨN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
22

2.1 Đối tưọng, hoá chất, thiết bị, nội dung và phưotig pháp nghiên cứu. 22
2.1.1 .Đối tượng 22
2.1.2Phương tiện, dụng cụ, hoá chất
22
2.1.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 23
2.1.4 Một số công thức sử dụng tính toán thống kê

23
2.2 Thực nghiệm và kết quả 24
2.2.1 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện sắc ký 24
2.2.2 Thử tính thích hợp của hệ thống
25
2.2.3 Đánh giá tính tuyến tính của phương pháp xác định DHA trong artesunat
nguyên liệu 27
2.2.4Tínli chính xác của phương pháp xác định DHA trong artesunat nguyên
liệu 28
2.2.5 Tính đúng của phương pháp xác định DHA trong artesunat nguyên
liệu 29
2.2.6 Tính đặc hiệu của phương pháp xác định DHA trong artesunat nguyên
liệu 31
2.2.7 Xác định giới hạn định lượng DHA theo phương pháp xây dựng

34
2.2.8 Xây dựng cách xác định DHA trong nguyên liệu artesunat khi không
có DHA chuẩn 35
2.2.9 Kết luận 38
Phần n i: Kết luận và đề xuất 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
CHỮ VIẾT TẮT
DHA :

Dihydro Artemisinin
HPLC :
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
NXB :
Nhà xuất bản
PA :
Tinh khiết phân tích
SKS :
Số kiểm soát
UV-VIS :
Tử ngoại - Khả kiến
VKN :
Viện kiểm nghiệm
ĐẶT VẤN ĐỂ
rét là một bệnh nguy hiểm mang tính xã hội. Bệnh truyền từ người
'^ n à y sang người khác do muỗi Anophen. Hàng năm trên thế giới có tới
300- 500 triệu trường hợp bị mắc sốt rét [18] trong đó có khoảng 2,7 triệu ca
tử vong do sốt rét mỗi năm [23]. Những vùng có số người bị bệnh sốt rét cao
là Châu Phi, Đông Nam Á, Việt Nam là một nước thuộc khu vực Đông
Nam Á, và nằm trong vùng sốt rét lưu hành. Hàng năm nước ta có tới 1 triệu
ca sốt rét trong đó có 30.000 ca sốt rét ác tính [11].
Việc điều trị sốt rét ngày càng trở nên khó khăn do ký sinh trùng sốt rét
càng ngày càng kháng mạnh với các loại thuốc điều trị sốt rét trước đây như:
Cloroquin, Mefloquin, Primaquin, [17]. Trong khoảng mười năm trở lại đây
artemisinin (hoạt chất chiết từ cây Thanh Hao Hoa Vàng) và các dẫn chất của
nó được đưa vào điều trị cho kết quả rất tốt, đặc biệt là dẫn chất artesunat. Đây
là một thuốc cắt cơn sốt nhanh, ít bị tái phát như artemisinin, có tác dụng cả
với chủng p.falciparum đã kháng Cloroquin. Thuốc qua được hàng rào máu
não nên có tác dụng tốt trong điều trị sốt rét thể não [5].
Tuy vậy phương pháp kiểm tra chất lượng artesunat đang áp dụng ở nước

ta còn rất nhiều hạn chế [12], [13], [14], [15], [16], Mặt khác artesunat lại đắt
nên rất dễ bị làm giả. Vì là thuốc điều trị sốt rét nên thuốc giả hay kém phẩm
chất rất nguy hiểm cho bệnh nhân. Theo một bài báo ở Đông Nam Á artesunat
bị làm giả rất nhiều. Mỗi năm thế giói có khoảng 1 triệu người chết vì sốt rét
trong đó có tới 200.000 người có thể cứu được nếu dùng đúng thuốc.
DHA là một tạp chất chính trong artesunat. Mặc dù DHA là một thuốc
điều trị sốt rét mạnh gấp 2 lần artemisinin nhưng tác dụng yếu hơn artesunat
2, 3 lần, DHA lại rất ít tan trong nước nên DHA là một nguyên nhân quan
trọng làm giảm hiệu quả điều trị của artesunat [21]. Vì vậy xác định và khống
chế hàm lượng DHA trong artesunat là rất quan trọng.
Trong điều kiện khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, kỹ thuật phân
tích HPLC đang được triển khai áp dụng rộng rãi ờ Việt Nam. Việc nghiên
cứu và thực hành phương pháp HPLC đối với một Dược sỹ là rất cần thiết.
Nằm trong mảng đề tài xây dựng phương pháp kiểm nghiệm artesunat
bằng phương pháp HPLC, trong khoá luận tốt nghiệp của mình tôi tham gia
cải tiến điều kiện sắc ký đã xây dựng trong khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ đại
học của Nguyễn Thanh Tùng (2004) để rút ngắn thời gian phân tích và xây
dựng phương pháp xác định giới hạn DHA trong artesunat nguyên liệu với
những mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu và sử dụng được máy HPLC để áp dụng phương pháp
HPLC vào kiểm nghiệm trong thời gian làm khoá luận.
2. Học tập cách nghiên cứu, trình bày một vấn đề khoa học.
3. Xây dựng được phương pháp xác định tạp DHA trong nguyên liệu
và đánh giá phương pháp vừa xây dựng.
PHẦN 1: TỔNG QUAN
I.ITỔNG QUAN VỂ ARTESUNAT
l.l.lC ông thức [1], [7].
CO OH
Công thức phân tử: CigHjgOg
Trọng lượng phân tử: 384.4

TKH: (3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 10S,12R)- Decahydro-3,6,9-trimethyl-3,12-
epoxy-12H-pyrano[4,3-j] 1,2-benzodioxepin-lO-ol,hydrogen succinat.
1.1.2 Nguồn gốc, cách điều chế
+ Nguồn gốc: Artemisinin phân lập từ cây Thanh Hao Hoa Vàng có tác
dụng tốt trong điều trị sốt rét kể cả chủng đã kháng cloroquin. Tuy vậy,
artemisinin khó tan và điều trị bằng artemisinin tái phát sớm mặc dù bệnh
nhân sạch ký sinh trùng trong máu.
Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bán tổng hợp ra các dẫn chất
của artemisinin có tác dụng tốt hơn là DHA, artemether, arteether, artesunat,
artelinic.
Trong đó artesunat có tác dụng tốt, tan trong dung dịch kiềm dùng để pha
tiêm, điều trị bằng artesunat ít bị tái phát và vì vậy được dùng phổ biến hcfn cả.
+ Bán tổng hợp: Artesunat là sản phẩm bán tổng hợp của artemisinin
qua sản phẩm trung gian là DHA.
Trưòỉng Đại học Dược Hà Nội bán tổng hợp artesunat qua 2 giai đoạn như
sau [9]:
Giai đoạn 1; Artemisinin khử hoá nhóm lacton thành DHA bởi NaBH4/
MeOH ở 0°c - 5°c, phương trình:
Giai đoạn 2: DHA được ester hoá thành artesunat khi tác dụng với
anhydrit succinic hoặc acid succinic xúc tác là Dimethylamino Pyridin
(DMPA) hay hỗn hợp DMPA và Dicyclohexyl Carbodiimid.
Phương trình:
o
ọ / DMAP H31
COOH /
ỘH2 / dmap
ỉ ỉ o h / DDC
C0-(CH2)2-C00H
Từ công thức cấu tạo và phương pháp điều chế trên có thể thấy tạp chất
chính có trong artesunat nguyên liệu là: DHA và acid succinic.

1.1.3 Tính chất
Tinh thể không mầu hay bột kết tinh trắng, không mùi, dễ tan trong
ethanol, aceton, cloroíorm, benzen, khó tan trong nước, kém bền trong môi
trường kiềm hay acid. [a]°25= +10°+ 14° [1], [26].
1.1.4 Tác dụng
Diệt thể phân liệt trong máu của mọi chủng ký sinh trùng sốt rét, đặc biệt
tốt với sốt rét thể não do p.falciprum, không diệt thể giao bào và không tác
dụng trên giai đoạn ngoại hồng cầu, cắt cơn sốt nhanh.
1.1.5 Dược động học
Sinh khả dụng đường uống: 24-64%, tj/2= 41phút bị giảm hoạt tính do
chuyển hoá qua gan; qua được hàng rào máu não và nhau thai; thải qua nước
tiểu: dạng deoxy [2].
1.1.6 Tác dụng không mong muốn: Nhẹ và thoảng qua: Rối loạn tiêu hoá,
đau đầu, hoa mắt, chóng mặt.
1.1.7 Chế phẩm: Có ba dạng: viên nén 50 mg artesunat, bột pha tiêm 60 mg
artesunat, thuốc đạn 50 mg artesunat [8].
1.1.8 Chỉ định: Điều trị sốt rét do p. falciparum, p. malaria, p. vivax, kể cả
p.falciparum đã kháng thuốc khác[2].
1.2 TỔNG QUAN VỂ TẠP DHA TRONG ARTESUNAT NGUYÊN
LIỆU
2.1. Tạp DHA và nguyên nhân gây tạp DHA trong artesunat nguyên liệu
Bản thân DHA là thuốc điều trị sốt rét mạnh hơn cả artemisinin. Tuy
nhiên, trong artesunat thì DHA lại được coi như là tạp chất, mặt khác DHA rất
ít tan, sinh khả dụng thấp, tác dụng kém hơn artesunat. Vì vậy nếu artesunat
lẫn nhiều DHA thì hiệu lực điều trị của thuốc sẽ giảm, đồng thời DHA còn là
chỉ thị cho mức độ tinh chế artesunat và cũng là yếu tố đánh giá bảo quản
thuốc [19], [21].
Nguyên nhân chính gây tạp DHA trong nguyên liệu artersunat:
- Tinh chế chưa tốt.
- Sản phẩm phân huỷ của artesunat trong bảo quản.

1.2.2 Tổng quan về một số phương pháp xác định giói hạn tạp chất liên
quan trong thuốc, ưu nhược điểm. Các phương pháp xác định tạp DHA
a. Một số phương pháp xác định tạp chất liên quan trong thuốc và ưu
nhược điểm
♦ Làm phản ứng bán định lượng (hay áp dụng đối vói tạp vô cơ)
Lấy 2 ống nghiệm giống nhau để thực hiện phản ứng.
Ống 1 lấy chính xác 1 thể tích dung dịch thuốc đem thử.
Ống 2 lấy chính xác 1 thể tích dung dịch chuẩn, dung dịch này chứa hàm
lượng chất chuẩn tạp bằng giới hạn cho phép của tạp đó trong chế phẩm.Sau
đó cho vào mỗi ống, thuốc thử như nhau, số lượng như nhau rồi so sánh kết
quả phản ứng ở 2 ống; từ đó xác định giói hạn tạp có trong mẫu thuốc đem
thử. Kết quả thường so sánh về mầu sắc, độ đục [3].
Phương pháp này đơn giản, song chỉ cho kết quả bán định lượng.
♦ Đo quang
Nguyên tắc là làm phản ứng mầu đặc trưng của tạp rồi đo độ hấp thụ của
dung dịch mẫu so với độ hấp thụ của dung dịch có chứa tạp đó ở mức tiêu
chuẩn trong cùng điều kiện.
Phưoĩìg pháp chỉ xác định mức giới hạn, việc áp dụng hạn chế do phải có
phản ứng đặc hiệu [1], [25].
♦ Sác ký lóp mỏng
Pha dung dịch thử của chế phẩm. Pha dung dịch so sánh, dung dịch này
chứa chuẩn tạp có nồng độ bằng mức giới hạn quy định tính theo dung dịch
thử. Tiến hành chấm riêng biệt lên bản mỏng một lượng thể tích bằng nhau
của hai dung dịch. Triển khai sắc ký, lấy ra sấy khô, hiện mầu và so sánh vết
tạp của dung dịch chuẩn tạp và vết tạp tương ứng của dung dịch thử. Yêu cầu
vết tạp của dung dịch thử có diện tích và đậm độ không được lófn hơn vết tạp
của dung dịch chuẩn tạp.
Nếu không có chuẩn tạp thì người ta dùng chính dung dịch thử để pha
dung dịch so sánh; dung dịch này có nồng độ bằng mức giới hạn quy định của
tạp và cũng tiến hành tương tự như trên, rồi so sánh vết tạp của dung dịch thử

và vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch so sánh [1], [25], [28].
Nhận xét: Khi không có chuẩn tạp, người ta đã xem đáp ứng của tạp và
chất thử là như nhau.
♦ Sắc ký lỏng hiệu năng cao [1], [25], [28]
- Chuẩn hoá diện tích pic:
Pha dung dịch thử và tiến hành sắc ký, ghi diện tích của tất cả các pic trừ
pic dung môi và những pic có đáp ứng rất nhỏ (thường là những pic có đáp
ứng nhỏ hơn 0.1 % so với tổng diện tích các pic). Phần trăm diện tích của mỗi
pic được tính là phần trăm khối lượng mỗi chất có trong mẫu thử.
Phương pháp này cho kết quả khá chính xác nhưng đã xem đáp ứng của
các pic là như nhau khi nồng độ bằng nhau và tất cả các chất có trong mẫu thử
đều cho đáp ứng trên sắc ký đồ. Để xác định đúng hàm lượng phần trăm mỗi
chất (tạp chất) trong mẫu thử, cần xác định sự liên quan giữa tỉ lệ phần trăm
diện tích pic với phần trăm hàm lượng giữa các chất, thường xem hoạt chất có
tỉ lệ này bằng: 1. Vì vậy cần xác định hệ số biến đổi phần trăm diện tích pic ra
phần trăm hàm lượng (hệ số F). Khi đó phần trăm tạp được tính như sau:
% Tạp = -|í^ .lO O %
Ẻ Si-ß
i= ỉ
- So sánh với chuẩn tạp (khi chỉ cần xác định giới hạn cho phép của tạp).
Tiến hành sắc ký dung dịch thử và dung dịch chuẩn tạp có hàm lượng
bằng giới hạn quy định và ghi đáp ứng các pic. Diện tích pic tạp của dung dịch
thử tương ứng pic chuẩn tạp không được lớn hơn diện tích của pic chuẩn tạp.
- So sánh vói chuẩn của thử.
Tiến hành sắc ký dung dịch thử và dung dịch chuẩn, dung dịch này được
pha từ dung dịch thử, có nồng độ so với dung dịch thử bằng giới hạn cho phép
của tạp. Diện tích của bất kỳ pic tạp nào trên sắc ký đồ của dung dịch thử
không được lớn hơn diện tích pic chính của dung dịch chuẩn.
Nhận xét: Các phương pháp trên khi không có hệ số đáp ứng đã coi hệ số
đáp ứng bằng 1, trường hợp này rất khó xẩy ra,

b. Các phưoTig pháp xác định tạp DHA trong artesunat nguyên liệu
♦ Phưotig pháp Dược Điển Việt Nam và Dược Điển Trung Quốc
Xác định bằng sắc ký lớp mỏng:
- Pha tĩnh: Bản mỏng silicagel GF254.
- Dung môi: Ethylacetat: Toluen(l:l)
- Dung dịch thử: 10 mg chế phẩm trong Iml cloroform.
- Dung dịch đối chiếul: 0,1 mg DHA/lml cloroform.
- Dung dịch đối chiếu 2: 0,05 mg DHA/lml cloroform.
Chấm riêng biệt các dung dịch lên một bản mỏng, mỗi dung dịch
10|al.Triển khai sắc ký, hiện mầu bằng Vanilin 2%/H2S04, sấy ở 100°c trong
thời gian 10 phút. Bất kỳ vết nào ngoài vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch
thử tương ứng với vết DHA không được đậm hơn vết DHA của dung dịch đối
chiếu 1 (< 1%). Ngoài vết chính và vết phụ tương ứng vói DHA không được
quá 1 vết đậm hơn vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu 2 (<
0,5%) [1], [24].
Nhận xét: Phương pháp tiến hành khá phức tạp, kết quả còn phụ thuộc
chủ quan và chưa cho kết quả xác định chính xác hàm lượng tạp.
♦ Phưong pháp của Dược Điển Quốc Tế (volume 5)
Phưoỉng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao:
o Cột: (12,5x3mm; 5Ịim).
o Pha động; Acetonitril R: Đệm pH3 (50:50)
o Tốc độ dòng: 0,6ml/phút.
o Nhiệt độ: 30°c
o Thể tích tiêm: 20|il.
o Dung dịch A: 4mg/ml artesunat nguyên liệu,
o Dung dịch C; 0,04mg/ml artesunat nguyên liệu,
o Tiêm 20 |il dung dịch A, ghi kết quả.
o Tiêm 20 |Lil dung dịch c, ghi kết quả.
Diện tích của bất kỳ pic nào trên sắc ký đồ của dung dịch A trừ pic chính
không được lớn hơn diện tích pic chính trên sắc ký đồ của c (< 1%).

Không được có hơn một pic có diện tích lớn hơn 1/2 diện tích pic chính
của c (< 0,5%).
Tổng diện tích các pic tạp (bỏ qua pic có diện tích nhỏ hofn hoặc bằng
0,1% diện tích pic chính của C) không lớn hơn 2 lần diện tích của pic chính
của c (< 2 %) [29],
Nhận xét: Phương pháp đã thừa nhận đáp ứng pic của các tạp chất và
artesunat là như nhau khi hàm lượng bằng nhau.
1.3 TỔNG QUAN VỂ PHƯƠNG PHÁP HPLC
1.3.1 Khái niệm về sắc ký và sác ký lỏng hiệu năng cao
a. Khái niệm về sắc ký: sắc ký là một nhóm các phương pháp hóa lý
dùng để tách và phân tích các cấu tử của những hỗn hợp phức tạp dựa vào sự
sử dụng các quá trình sắc ký khác nhau trong các điều kiện động. Sự tách các
thành phần trong mẫu dựa vào sự phân chia khác nhau vào hai pha, là pha
động và pha tĩnh. Pha tĩnh có thể là chất rắn hay chất lỏng phủ trên nền chất
rắn. Pha rắn được nhồi trong cột hay tráng trên bản mỏng hay dàn thành film.
Pha động là khí hay chất lỏng. Sự tách là do hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay
loại cỡ [4].
b. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Phương pháp HPLC
là một phương pháp phân tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau của các
chất giữa hai pha không trộn lẫn với nhau. Trong đó, pha động là chất lỏng
được đẩy qua pha tĩnh trong cột dưới áp lực cao của một bơm cao áp. sắc ký
lỏng dựa trên cơ sở là cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại cỡ
hay tương tác hoá học ở bề mặt [4].
1.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kỹ thuật nhất định. Pha tĩnh là
yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ
thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì
ta có sắc ký phân bố. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi
ion.
Khi đặt chất phân tích lên pha tĩnh đầu cột rồi cho pha động liên tục đi

qua chúng ta đã thực hiện quá trình sắc ký. Ví dụ: Nếu ta nạp một mẫu gồm 3
chất là A, B, c vào cột tách thì khi bơm pha động qua cột tách các quá trình
sắc ký xẩy ra, khi đó A, B, c tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột tách. Yếu tố
quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây là tổng của các tương tác:
- Tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh (Fl).
- Tương tác giữa chất phân tích và pha động (F2).
- Tương tác giữa pha tĩnh và pha động (F3).
Theo sơ đồ sau:
Trong đó tương tác F1 và F2 đóng vai trò quyết định [10].
1.3.3 Cơ sở lý thuyết sắc ký
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và
phân bố chất tan giữa hai pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc
độ nhất định sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột. Tuỳ theo bản
chất pha động, pha tĩnh, chất tan mà quá trình rửa giải tách được các chất ra
khỏi cột. Khi ra khỏi cột mỗi chất sẽ được phát hiện và ghi dưới dạng pic. Tín
hiệu của cả quá trình sắc ký cho ta sắc ký đồ. Một sắc ký đồ sẽ có một hay
nhiều pic phụ thuộc vào thành phần mẫu.
1.3.4 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống sắc ký
a. Hệ thống bơm
Bơm được xem là một trong những thành phần quan trọng nhất của hệ
thống sắc ký. Bơm đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ hằng định.
* Có hai loại bơm: + Một là bơm áp suất hằng định, ít được áp dụng.
+ Hai là bơm tốc độ dòng hằng định, loại bơm này
được áp dụng cho phân tích HPLC thông thường.
b. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi
Bình chứa dung môi thường bằng thuỷ tinh đôi khi bằng thép không gỉ.
Cần lọc loại các hạt trong dung môi (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45 |Lim) và
đuổi khí hoà tan trong dung môi. Trong phương pháp thông thường chỉ cần
một bình dung môi. Trong phương pháp gradien cần tới 2, 3, 4 bình chứa các
dung môi.

c.Hệ tiêm mẫu
Để đưa mẫu vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ
tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay)
hay microsyringe tiêm trong hệ tiêm mẫu tự động.
d. Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao
Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký. Vì ở cột
xẩy ra quá trình tách các chất. Cột đóng vai trò rất quan trọng tới khả năng
tách các chất. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hoá chất, chịu được
áp suất cao đến vài trăm bar. Trong cột nhồi pha tĩnh của hệ sắc ký. Cột tách
có nhiều cỡ khác nhau, tuỳ theo mức độ và mục đích của quá trình sắc ký.
Một cách đại cương có thể chia ra 3 loại cột:
- Cột phân tích: dài 10-25 cm, đường kính 2-5mm.
- Cột bán điều chế: dài 5 0-1 00 cm, đường kính 5 - lOcm
- Cột điều chế: dài 100-150 cm, đường kính 10 - 50cm
e. Detector trong HPLC
Là bộ phận phát hiện các chất trong pha động từ cột sắc ký đi ra liên tục.
Đó là bộ phận thu nhận, phát hiện các chất hay hợp chất của chúng dựa theo
một tính chất hoá lý nào đó của chất phân tích. Thường có các loại Detector
sau:
- Detector UV- VIS.
- Detector huỳnh quang.
- Detector phổ phát xạ nguyên tử.
- Detector điện hoá, cực phổ.
- Detector đo thế.
- Detector đo độ dẫn điện
- Detector khúc xạ kế.
f. Bộ phận ghi tín hiệu: gồm có Recorder.
g. Hệ điều khiển: Computer.
1.3.5 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh
hưỏtig [1], [25], [28]

a. Thòi gian lưu Ir và thể tích lưu Vr
- ĩr là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký,
tói detector và cho pic trên sắc đồ.
- Vr là thể tích dung môi đi qua cột cần để di chuyển chất từ nơi tiêm
mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ: Vr = ÍrxFc (Fc là thể
tích pha động trên một đơn vị thời gian).
- tjỊ và Vr là các đại lượng phản ánh sự phân bố của chất tan vì vậy hai đại
lượng này phụ thuộc vào: Tính chất pha tĩnh, bản chất pha động tốc độ dòng,
tính chất chất tan, nhiệt độ
b. Hệ số phân bố K
K = k.c^c„
c, và là nồng độ chất tan ò pha tĩnh và pha động tưoĩig ứng, k là hệ số
phân bố ỏ trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất
tan do pha động vận chuyển khi nó đi qua cột. K chỉ phụ thuộc vào: Bản chất
chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ.
K lớn thì tRỈỚn (ra muộn).
K nhỏ thì ír nhỏ (ra sớm).
c. Thừa số dung lượng K
pr Î _ (r
tã ■ K,
+ Ir là thời gian lưu.
+ t¿ là thời gian chết.
K’phụ thuộc: Bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc điểm cột:
V /V
^ s / ^ m*
K’ càng lớn tốc độ di chuyển càng thấp,
Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích
sao cho: 1< K’ < 8.
Nếu K’ < 1 thì pic ra sớm dễ lẫn với pic tạp.
Nếu K’ > 8 thì thời gian phân tích sẽ quá dài.

d. Tốc độ di chuyển tỉ đối của hai chất
Được đánh giá qua thừa số chọn lọc (select!vity-factor).
Để tách riêng hai chất thường chọn a = 1,05 - 2,0. Nếu a càng lớn 2 chất
tách nhau càng tốt, a nhỏ 2 chất khó tách nhau, nhưng a quá lớn thì thời gian
phân tích sẽ quá dài. Giá trị a phụ thuộc yếu tố quyết định t’jỊA và I’rb.
e. Độ phân giải (Resolution)
Là đại lượng đo mức độ tách 2 chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B).
_ tiỊg —tjị^ _ ~ f m ) _ -{(X — ] ) - K g
0,5.(ỊW^+Wg) Wo,5^+Wo5« 4.a(ỉ-K'„)
Như vậy Rs phụ thuộc vào:
+ Hiệu lực cột,
+ Thừa số chọn lọc a.
+ Thừa số dung lượng K’g.
- Rj. tối ưu > 1,5.
Có thể làm tăng Rs bằng cách:
Tăng N: Tăng chiều dài cột, giảm tốc độ dòng, cách này ít hiệu quả.
Tăng K’b: Thay đổi pha động làm Rs thay đổi lớn.
Tăng a: Thay đổi pha động hay pha tĩnh sẽ làm R, thay đổi lớn.
f. Hệ sỏ bất đối AF
w
2 d
Wqos là độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
d là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong
phía trước ở 1/20 chiều cao pic[25].
Yêu cầu AF = 0,9 - 2,
Vai trò: AF càng gần 1 thì pic càng có dạng phân phối chuẩn Gauss nên kết
quả tính diện tích pic càng chính xác.
- Yếu tố ảnh hưởng:
Cột: Cột tốt AF sẽ tốt.
pH: Quyết định dạng tồn tại của chất tan từ đó có ảnh hưởng nên AF.

Thể tích tiêm
- Cách cải thiện AF:
Chọn cột thích hợp.
Điều chỉnh pH để chất tan tồn tại ở một dạng thích hợp.
Thể tích tiêm thích hợp.
g. Số dĩa lý thuyết N
N = 1 6 ^ [27] hay N = 5.5 4-^ [25] Số đĩa lý thuyết cho biết hiêu
lực cột. Khi phân tích yêu cầu N > 3000. Từ công thức ta thấy N phụ thuộc
vào ír và w (độ rộng pic).
tjỊ càng lớn thì N có thể sẽ tăng, tuy nhiên thời gian phân tích kéo dài.
w (độ rộng pic ở đáy) hay Wj/2 (độ rộng pic đo ở 1/2 chiều cao) càng bé
thì N càng lớn nhưng w và Wjỵ2 sẽ bé hơn nếu tjỊ bé.
Khi ír cố định thì bản chất cột, pha động, pH là yếu tố quyết định trong
đó cột đóng một vai trò rất quan trọng.
Để đánh giá hiệu lực cột thường tính số đĩa lý thuyết trên một đơn vị
chiều dài cột.
N = 16
Lw/
Khi các điều kiện khác là cố định thì cột nào có N lớn hơn cột đó có hiệu
lực cao hơn.
1.3.6 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký
a. Lựa chọn cột (pha tĩnh)
Vì phương pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu này là sắc ký hấp phụ
nên các phân tích dưới đây chỉ tập trung vào lựa chọn pha tĩnh cho sắc ký hấp
phụ. Sắc ký hấp phụ có hai loại là:
• sắc ký hấp phụ pha thuận (normal phase - HPLC).
• Sắc ký hấp phụ pha đảo (Reverse phase- HPLC).
Bản chất chính của sự tách sắc ký loại này là dựa trên tính chất hấp phụ
bề mặt của pha tĩnh. Cơ chế tách là cơ chế hấp phụ.
Trong sắc ký pha thuận thì pha tĩnh sẽ phân cực còn pha động không

phân cực, chất phân tích thường là các chất ít phân cực.Trong sắc ký pha đảo
thì pha tĩnh ít phân cực còn pha động phân cực, chất phân tích có thể phân cực
hay ít phân cực.
Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC.
• Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký.
• Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định.
• Tính chất bề mặt ổn định.
• Cân bằng động học của sự tách phải xẩy ra nhanh và lặp lại tốt.
• Cỡ hạt phải đồng nhất.
Vì Silica là loại pha tĩnh hay dùng và un việt nên ỏ’ đây giới thiệu về một
số loại Silica:
• Silica trung tính, trên bề mặt còn có các nhóm OH phân cực (ưa nước).
Loại này sử dụng làm pha tĩnh cho sắc ký hấp phụ pha thuận để phân tích các
chất ít hoặc không phân cực.
• Silica đã Alkyl hoá, được điều chế bằng cách Alkyl hoá các nhón OH
trên bề mặt Silica bằng các gốc Alkyl - R của mạch Cacbon (C2, C8, C18)
hay các gốc Cacbon vòng. Do các nhóm OH thân nước được thay bằng các
gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực. Silica đã alkyl hoá được sử
dụng cho sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực
hay sắc ký cặp ion.
• Silica Sulfon hoá hay Nitro hoá để làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi
cation. Silica amin hoá dùng làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi anion.
b. Lựa chọn pha động cho HPLC
Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ hay hỗn hợp
của 2, 3 dung môi theo tỉ lệ nhất định. Pha động là yếu tố thứ hai quyết định
hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp, thời gian lưu tjỊ và hiệu quả tách.
Pha động có thể ảnh hưởng tới:
• Độ chọn lọc của hệ pha động.
• Thời gian lưu giữ của chất tan.
• Hiệu lực tách của cột.

• Độ phân giải của chất tan.
• Độ rộng của pic sắc ký.
Vì những lý do đó nên khi các điều kiện khác đã cố định thì việc chọn pha
động thích hợp là rất quan trọng.
Yêu cầu của một pha động:
• Phải trơ đối với pha tĩnh.
• Phải hoà tan được chất mẫu.
• Phải bền vững theo thời gian.
• Phải có độ tinh khiết cao.
•Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
• Phù hợp với loại detector.
• Phải có tính kinh tế và đảm bảo môi trường.
Trong sắc ký pha thuận thì pha động thường là các dung môi hữu cơ ít
phân cực (kỵ nước) như: n_hexan, n_heptan, benzen, cloroform, Các pha
động này thường được bão hoà nước.
Trong sắc ký pha đảo thì pha động là hệ dung môi phân cực như: Nước,
Methanol, Acetonitril, hay hỗn hợp của chúng. Các dung môi đó có thể hoà
tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ.
c. Chọn đệm pH [22] / V
Trong nhiều trường hợp của sắc ký hấp phụ pha đảo thường phải cho
thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký. pH thường phải
ổn định trong trường hợp sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp
phụ mà chất tan có tính chất acid hay base, Nếu pH thích hợp sẽ góp phần làm
cho kết quả tách tốt hofn. Thông thường với chất tan là acid hữu cơ thì phải
dùng đệm pH acid nhưng cũng có trường hợp đặc biệt, còn sắc ký tạo cặp ion
thì pH tuỳ từng trường hợp.
d. Tốc độ pha động
Sau khi có pha động, pha tĩnh, pH thích hợp thì một yếu tố cần lựa chọn
để quá trình tách tốt hơn là tốc độ pha động.
1.3.7 ứng dụng của HPLC [4], [7], [28]

Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính.
a. Định tính: Thời gian lưii của chất thử trên sắc đồ phải tương ứng với thời
gian lưu của chất chuẩn đối chiếu trên sắc ký đồ. Tuy nhiên việc định tính đơn
thuần bằng HPLC không đảm bảo tính chắc chắn.
b. Sác ký điều chế: Qua quá trình sắc ký các chất được tách ra và dịch rửa
giải được hứng riêng rồi bốc hơi dung môi thu lấy chất.
c. Định lưọtig và xác định giói hạn tạp chất; sắc ký lỏng hiệu năng cao có
ứng dụng rất lớn trong định lượng chất trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp
chất.
Khi sắc ký, chất muốn phân tích được tách riêng ra khỏi hỗn hợp và được
định lượng dựa vào chiều cao hay diện tích của đáp ứng pic so với chất chuẩn.
Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong kỹ thuật HPLC là;
• Phương pháp chuẩn ngoại: Cả hai mẫu thử và chuẩn đều được tiến hành
sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó diện tích pic thu được từ mẫu thử được so
sánh với diện tích pic thu được từ mẫu chuẩn. Kết quả có thể được tính theo
cách chuẩn hoá một điểm hay từ đường chuẩn tuyến tính
• Phương pháp chuẩn nội
Là phưcttig pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ
hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và mẫu
thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ hai gọi là chuẩn nội.
• Phương pháp thêm chuẩn.
Phương pháp này được dùng trong HPLC khi có ảnh hưởng của chất phụ
hay quá trình xử lý mẫu phức tạp. Mẫu thử được thêm một lượng chính
xác chất chuẩn. Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa trên sự
chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của diện
tích. Với phương pháp thêm nhiều lần ta có phương pháp thêm đường
chuẩn.
• Phương pháp chuẩn hoá diện tích pic.
Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều cấu
tử được tính bằng tỉ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của

tất cả các pic thành phần.
□Yêu cầu:
Tất cả các thành phần đều được rửa giải và phát hiện.
Tất cả các thành phần có đáp ứng như nhau với detector.
Khi đó hàm lượng chất thử được tính như sau:
5,.100
0/x= >s,.100 lOC
s,+s,+s,+ ỵs,
Tuy vậy trong sắc ký lỏng thì điều kiện tất cả các thành phần đều có đáp ứng
như nhau với detector là rất khó. Khắc phục nhược điểm này, trong sắc ký
lỏng người ta xây dựng hệ số đáp ứng cho từng thành phần. Để xây dựng hệ số
đáp ứng ta chọn một thành phần làm chuẩn có hệ số đáp bằng 1. Các thành
phần khác có hệ số đáp ứng tính theo công thức sau: Fx =
S^.C,
S(. và Sx là diện tích pic của thành phần chọn làm chuẩn gốc và thành
phần cần tính hệ số đáp ứng.
Q và Q là nồng độ của thành phần chuẩn gốc và thành phần cần tính hệ
số đáp.
là hệ số hiệu chỉnh của chuẩn, khi đó hàm lượng của thành phần X tính
theo công thức : %x =

^ ^ —
S,.F,+S^.F^+S,.F,+
p r F ,
/=1
Đây là phương pháp hay áp dụng để định lượng tạp chất trong thuốc. Phương
pháp này được chúng tôi chọn áp dụng để xác định tạp DHA.
• Cách xác định hệ số đáp ứng.
- Cách 1: Dựa vào phương trình tuyến tính ở nồng độ khảo sát của mỗi
chất và tính ra hệ số đáp ứng theo biến đổi toán học. Nếu chất A có phương

trình tuyến tính là =kjXA + bj, B có phương trình tuyến tính y = kjXß + b2 thì
khi Ya = Yb Fß - Xạ/Xb = ki/kj + (bj- bi)/kiXB với Xß nằm trong khoảng khảo
sát ta tính được giá trị gần đúng của F.
- Cách 2: Xác định giá trị của độ hấp thụ riêng của từng chất và tính hệ
số đáp ứng dựa vào độ hấp thụ riêng. Ví dụ: có hai chất A và B, A được chọn
làm chất chuẩn có hệ số đáp ứng là 1, khi đó hệ số đáp ÚTig của B sẽ là: F =
E \ a/ E '. b.
- Cách 3: Tính hệ số đáp ứng dựa vào kết quả đo tại từng điểm rồi tính hệ
số hiệu chỉnh trung bình của các điểm. Ví dụ có 2 chất A và B trong đó A là
chất làm chuẩn ta phải tính hệ số hiệu chỉnh cho B. Kết quả xác định ở nồng
độ 100 % của A là Sạ, kết quả xác định của B ở 5 mức nồng trong khoảng
khảo sát tuyến tính là SiB, SjB, S3B, S4B, S5B ta lần lượt sẽ có FjB = S^/SiB, p2B =
F3B F4B “ F5B “ và Fji, = (F|b + p2B + F3B + F4B +
FjbVS (Ftb là hệ số đáp ứng tmng bình).
d. Xác định giói hạn định lương bằng HPLC