ĐẶC điểm PHÂN tử của VIRÚT cúm a h5n1 lưu HÀNH tại MIỀN bắc VIỆT NAM, 2003 2008

Y học thực hành (764) - số 5/2011




86
Nam. Kết quả PCR trên một nhóm gồm 75 bệnh nhân
cho độ nhậy là 92% và độ đặc hiệu là 100% và các
phản ứng PCR trên ADN sinh thiết của một nhóm bệnh
nhân khác gồm 38 bệnh nhân cho độ nhậy là 82% và
độ đặc hiệu là 100%. Cặp mồi cagA có thể sử dụng để
phát hiện vi khuẩn với độ nhạy và độ đặc hiệu cao
TàI liệu tham khảo
1. Marshall, B. F and Warren J. R (1984). Unidentified
curved bacilli in the stomach of patient with gastritis and
peptic ulceration. Lancet, pp 311 - 315.
2. Nguyễn Thị Hồng Hạnh và Nguyễn Thị Thanh Lợi
(2001). Sự tồn tại của các chủng Helicobacter pylori
khiếm khuyết gene urease B ở các bệnh nhân viêm loét
và ung th dạ dày Việt Nam. Đại hội lần thứ hai hội nghị
khoa học hoá sinh y dợc năm 2001- Các báo cáo khoa
học. Trang106 -113.
3.Trần Quỳnh Hoa., Lê Băng Sơn, Nguyễn Thị Thanh
Lợi., Hoàng Tuấn Anh, Nguyễn Thị Nguyệt, Bùi Phơng
Thuận, Đặng Đức Trạch và Nguyễn Thị Hồng Hạnh
(2001). Sự đứt đọan của hai nucleotide ở đầu 5 của gien
cagA của vi khuẩn Helicobacter pylori, chủng Việt Nam.
Hội thảo quốc tế về Sinh học. Hà Nội- Việt Nam 2-5 tháng
6 / 2001.
4.Vũ Văn Hạnh, Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2003). Xác
định độ nhậy và tính đặc thù của cặp mồi PCR nhằm phát

hiện vi khuẩn Helicobacter pylori (in press)
5. Nguyễn Thị Nguyệt và Nguyễn Thị Hồng Hạnh
(2003). Tính nhậy và tính đặc thù của của hai cặp mồi
PCR TH1 và TH2 trong phát hiện vi khuẩn Helicobacter
pylori (in press)
6. Lê Băng Sơn và Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2001).
Nghiên cứu vi khuần Helicobacter pylori, chủng Việt Nam.
Hội thảo quốc tế về Sinh học. Hà Nội - Việt Nam 2-5
tháng 6/2001. Tr 414 - 417.

ĐặC ĐIểM PHÂN Tử CủA VIRúT CúM A/H5N1 LƯU HàNH TạI MIềN BắC VIệT NAM, 2003-2008

LÊ QUỳNH MAI - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương
TóM TắT
Virút cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1 đã đợc ghi
nhận không chỉ gây bệnh cho gia cầm mà còn gây
bệnh viêm đờng hô hấp cấp nguy hiểm cho ngời.
Trờng hợp nhiễm virút cúm gia cầm đầu tiên tại Việt
Nam đợc xác định vào cuối năm 2003 và đến nay đã
có 119 trờng hợp đợc ghi nhận trong đó 59 trờng
hợp tử vong. Virút cúm gia cầm A/H5N1 có đặc điểm
tiến hóa về di truyền học tơng tự các virút cúm A đã
biết. Nghiên cứu của chúng tôi trên 23 chủng virút cúm
gia cầm độc lực cao phân lập trên ngời tại miền Bắc
Việt Nam, 2003-2008 cho thấy hầu hết các phân đoạn
gen của virút cúm A/H5N1 nhóm vào 2 kiểu hình
kháng nguyên là clade 1 và clade 2.3.4. Tuy nhiên gen
NA lại biểu hiện trên 3 kiểu hình kháng nguyên là clade
1, clade 2.3.2 và clade 2.3.4 tơng tự với virút cúm gia
cầm A/H5N1 lu hành trên gia cầm tại Việt Nam và

Trung Quốc trong cùng thời gian.
Từ khóa: virút cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1,
kiểu hình kháng nguyên, gen HA, gen NA.
SUMMARY
The highly pathogenic avian influenza (HPAI)
A/H5N1 virus are causing of poultry outbreak as well
as acute severe pneumonia in human. The 1
st

confirmed A/H5N1 case was recognized in Vietnam in
the end of 2003 and up to now, 119 confirmed cases
were reported, of those 59 deaths. The genetic
evolution of HPAI/H5N1 is similar known influenza A
viruses and leaded to antigen changing that caused of
endemic or pandemic so far. Our study analyzes 23
strains of A/H5N1 isolated from A/H5N1 patients in the
North of Vietnam during 2003-2008 period by
molecular characterization. The results showed that
most of genetic fragments clustered into clade 1 and
clade 2.3.4, however, the NA gen have diverged into
clade 1, clade 2.3.2 and clade 2.3.4 that referred to
poultry isolates in Vietnam and China at same period.
Keywords: Highly pathogenic avian influenza
(HPAI) A/H5N1 virus, clade, HA gene, NA gene
ĐặT VấN Đề
Virút cúm gia cầm độc lực cao H5N1 (HPAI/H5N1)
đợc biết đến nh một tác nhân mới gây viêm đờng
hô hấp cấp nặng có tỷ lệ tử vong cao. Trờng hợp
nhiễm cúm A/H5N1 đầu tiên đợc ghi nhận tại Hồng
Kong năm 1997 và xuất hiện tại Việt Nam vào cuối

năm 2003 cùng với dịch bùng phát trên đàn gia cầm
ghi nhận tại 59/63 tỉnh/thành trong cả nớc. Đến nay,
virút cúm gia cầm A/H5N1 đã thờng xuyên xuất hiện
trên đàn gia cầm và tiếp tục gây bệnh cho ngời. Tại
Việt Nam, 119 ngời đã đợc xác định nhiễm virút cúm
A/H5N1 và 59 ngời tử vong [3].
Virút cúm A với đặc tính tiến hóa nhanh do sự thay
đổi vật liệu di truyền trong quá trình nhân lên đã ảnh
hởng nhiều đến chiến lợc sản xuất vaccine toàn cầu,
virút cúm gia cầm A/H5N1 cũng mang đặc điểm này.
Tìm hiểu sự thay đổi về phân tử trong các vật liệu di
truyền của virút cúm A/H5N1 phân lập trên ngời tại
miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn 2003-2008 nhằm
đánh giá khả năng tiến hóa của virút liên quan đến
thay đổi về đặc điểm kháng nguyên và so sánh với các
virút cúm A/H5N1 lu hành trên gia cầm trong cùng
thời gian là mục đích nghiên cứu của chúng tôi.
VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU
Vật liệu
Hai mơi ba (23) chủng virút cúm A/H5N1 phân lập
từ bệnh phẩm đờng hô hấp (dịch họng, dịch phế
quản, dịch tỵ hầu) của các bệnh nhân nhiễm virút cúm
A/H5N1 tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn 2003-
2008 (bảng 1).
Toàn bộ quá trình phân lập virút cúm A/H5N1 đợc
thực hiện tại phòng thí nghiệm (PTN) an toàn sinh học
cấp độ 3 (BSL-3) tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng
theo thờng quy của Tổ chức Y tế thế giới [4]
Y học thực hành (764) - số 5/2011

87

Phơng pháp nghiên cứu
Vật liệu di truyền của virút (ARN) đợc tách chiết từ
nớc nổi nuôi cấy tế bào (Tissue Culture Fluid- TCF)
bằng bộ sinh phẩm tách chiết ARN -QIAamp, Qiagen-
Mỹ. Quy trình tách chiết thực hiện theo thờng quy của
bộ sinh phẩm.
- Sử dụng primer U12 (5-AGCAAAAGCAGG-3) để
tổng hợp cADN từ ARN theo quy trình của bộ sinh phẩm
SuperScript
TM
III reverse transcriptase (Invitrogen).
- Sản phẩm cADN thu đợc sẽ đợc sử dụng để
khuếch đại toàn bộ 8 phân đoạn gen của virút cúm
A/H5N1 (HA; NA; NP; NS1; M; PB1; PB2 và PA) bằng
phơng pháp PCR chuẩn khi sử dụng bộ sinh phẩm
ProofStart DNA Polymersase (Qiagen- Mỹ) với DNA
polymerase và các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi phân
đoạn gen của virút cúm A/H5N1.
- Sản phẩm PCR đợc tinh khiết bằng bộ sinh
phẩm MinElute PCR Purification (Qiagen- Mỹ). Hỗn
hợp sequencing bao gồm BigDye@ 3.1. Sản phẩm
PCR cùng với các cặp mồi thích hợp. Phản ứng
Sequencing thực hiện trên máy giải trình tự ABI 3100
(ABI, Foster City, Mỹ) và đợc kiểm tra trên cả hai đầu
3và 5. Trình tự chuỗi nucleotide đợc sắp xếp và thu
thập bằng phần mềm SeqSpace 2.1 (ABI- Mỹ).

- Cây gia hệ đợc xây dựng trên các thông số đã
biết đợc xử lý bằng phần mềm ClustalW và dựng cây
bằng phơng pháp Neighbor-Joining (NJ), độ tiến hóa
đợc ớc tính toán theo chỉ số nhân lên của bootstrap
(100 neighbor-joining bootstrap).
KếT QUả NGHIÊN CứU
Toàn bộ 8 phân đoạn gen của 23 chủng virút cúm
A/H5N1 phân lập tại miền Bắc Việt Nam, 2003-2008
đã đợc phân tích sự tiến hóa về mặt di truyền. Các
chủng virút cúm A/H5N1 Việt Nam cũng đợc so sánh
với các chủng virút A/H5N1 đại diện lu hành trên thế
giới trong cùng thời gian. Cây gia hệ của các phân
đoạn gen đều lấy gốc là chủng virút cúm
A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1). Chủng virút cúm
A/H5N1 này phân lập trên ngỗng tại Miền Nam Trung
Quốc đợc cho là tổ tiên của virút cúm A/H5N1 đang
lu hành hiện nay [2].
Bảng 1: Các chủng virut cúm A/H5N1 phân lập tại
miền Bắc Việt Nam 2003-2008.
Tên chủng virut
Ngày
thu thập

mẫu

Địa chỉ
Tình trạng
bệnh nhân

Loại

bệnh
phẩm

A/Vietnam/UT3028/2003

12/2003

Ha Nam Tử vong DPQ
a

A/Vietnam/UT3028II/2003

12/2003

Ha Nam Tử vong DPQ

A/Vietnam/UT3030/2003

12/2003

Nam Định Tử vong DPQ

A/Vietnam/UT3035/2003

12/2003

Bac Giang

Hồi phục DH
b

A/Vietnam/UT3040/2004

1/2004

Bac Ninh Tử vong DTH
c

A/Vietnam/UT3040II/2004

1/2004

Bac Ninh Tử vong DPQ

A/Vietnam/UT3047III/2004

1/2004

Bac Binh Tử vong DTH

A/Vietnam/UT3062/2004

1/2004

Bac Giang

Tử vong DTH

A/Vietnam/UT30259/2004

7/2004

Ha Tay Tử vong DPQ

A/Vietnam/30262III/2004

8/2004

Ha Tay Tử vong DPQ

A/Vietnam/UT30408III/2005

2/2005

Thai binh Hồi phục DTH

A/Vietnam/UT30850/2005

10/2005

Ha Noi Tử vong DPQ

A/Vietnam/UT31203A/2007

5/2007

Vinh Phuc Hồi phục DTH

A/Vietnam/UT31239/2007

6/2007

Thanh Hoa

Hồi phục DH
A/Vietnam/UT31244II/2007

6/2007

Ha Nam Tử vong DTH

A/Vietnam/UT31244III/2007

6/2007

Ha Nam Tử vong DTH

A/Vietnam/UT31312II/2007

6/2007

Ha Tay Tử vong DPQ

A/Vietnam/31388/2007 12/2007

Son La Tử vong DPQ

A/Vietnam/UT31394II/2008

1/2008

Tuyen Quang

Tử vong DPQ

A/Vietnam/UT31412II/2008

2/2008

Hai Duong

Tử vong DPQ

A/Vietnam/UT31413II/2008

3/2008

Ninh Binh Tử vong DPQ

A/Vietnam/31432/2008 4/ 2008

Phu Tho Tử vong DTH

a
: Dịch phế quản;
b
: Dịch hang;
c
: Dịch tỵ hầu
Sự tiến hóa về di truyền của virút cúm A/H5N1

đợc ghi nhận thông qua các kiểu hình kháng nguyên
(clade) đợc hình thành. Tại gen HA có 9 clade đã
đợc hình thành và các virút cúm A/H5N1 phân lập
trên ngời tại Việt Nam tập trung vào clade 1 và 2.3.4
(hình 1). Trên cây gia hệ của gen NA, sự khác biệt của
các clade không rõ ràng, tuy nhiên có hai clade chính
là clade 1 và clade 2 cũng đợc ghi nhận trong đó các
virút cúm A/H5N1 của nghiên cứu đợc nhóm vào
clade 1, clade 2.3.2 và clade 2.3.4 (hình 1).
Tơng tự nh vậy, các gen còn lại M, NS, PB1,
PB2., PA và NP, các virút cúm A/H5N1 trong nghiên
cứu cũng tập trung nhóm tại clade 1 và clade 2.3.4
(hình 2,3,4).

2.3.4
2.3.3
2.3.2
2.3.1
2.2
2.5
2.4
2.1
1
9
8
6
5
7
4
3

0
A/goose/Guangdong/1/96
0.005

Clade 2.2
Clade 2.1
Clade 2.3.4
Clade 1
A/Vietnam/HN31432M/2008
A/Viet nam/UT30850/2005
Clade 2.3.2

G V Z
Gs/ GD X-series
20 aa deletion
Gs/ GD B C W Z+ (no deletion)
HK/97-like 19 aa deletion
A/African starling/England/983/79 H7N1
0.01

Gen HA Gen NA
Hình 1. Cây gia hệ gen HA và NA của virút cúm A/H5N1 lu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2003-2008
Y häc thùc hµnh (764) - sè 5/2011




88
Clade 2.3.4
Clade 1

Aquatic B C V Z Z+
H9N2
X-series
Early
Ck/Bei
Gs/ GD
Aquatic W G
Early
Early
G1
Aquatic
A/equine/Prague/1/1956 (H7N7)
0.02

Aquatic V (clade 2.3.4)
H9N2
Gs/ GD
B C G W Z Z+ (clade 1)
Aquatic
Early
G1
Ck/ Bei
X-series

A/t urkey/England/N28/73 H5N2
0.01

Gen PB2 Gen PA

H×nh 2. C©y gia hÖ gen PB2 vµ PA cña virót cóm A/H5N1 lu hµnh t¹i miÒn B¾c ViÖt Nam, 2003-2008

clade 2.3.4
clade 1
B G W V Z Z+
Gs/ GD
H9N2
Outliers
G1

Early
Aquatic
X-series
Outliers
Outliers
Ck/Bei
A/pintail duck/ALB/628/1979(H6N8)
0.02

Clade 2.3.4
Clade 1
G V X-series Z Z+
Aquatic W
G1
B
Gs/GD C

Ck/Bei
Early
Early
Early

Early
Aquatic
A/equine/Prague/1/1956(H7N7)(8)
0.02

Gen PB1 Gen NP
H×nh 3. C©y gia hÖ gen PB1 vµ NP cña virót cóm A/H5N1 lu hµnh t¹i miÒn B¾c ViÖt Nam, 2003-2008
Clade 2.3.4


A/Vietnam/HN31432M/2008
A/Vietnam/UT30850/ 2005
Clade 2.3.2
Clade 1
B C G W V Z Z+
X-series
Gs/ GD
Aquatic
Aquatic
Early
G1
Ck/Bei
A/equine/Prague/1/1956(H7N7)(8)
0.02

Clade 2.3.4
Clade 1
B C G W V Z Z+
Early
Aquatic

Aquatic
X-series
Ck/Bei
G1
Gs/ GD
0.05

Gen M Gen NS
H×nh 4. C©y gia hÖ gen M vµ NS cña virót cóm A/H5N1 lu hµnh t¹i miÒn B¾c ViÖt Nam, 2003-2008
Y học thực hành (764) - số 5/2011



89

BàN LUậN
Sự tiến hóa về di truyền học của virút cúm A là một
trong những đặc tính quan trọng của virút trong quá
trình duy trì sự tồn tại của mình trên các vật chủ. Đặc
tính này đã làm thay đổi đặc tính kháng nguyên giúp
cho virút cúm A trốn khỏi các miễn dịch bảo vệ đã biết
và tạo ra các vụ dịch hoặc đại dịch mới ảnh hởng lớn
tới sức khỏe cộng đồng. Các vụ dịch hoặc đại dịch đã
đợc ghi nhận trong suốt thế kỷ 20 nh đại dịch cúm
Tây Ban Nha 1918, đại dịch cúm Hồng Kông năm
1968 và gần đây nhất là đại dịch cúm A/H1N1/2009.
Virút cúm gia cầm A/H5N1 đã vợt qua hàng rào loài
gây bệnh cho một số động vật có vú khác nh ngựa,
hổ và ngời Các đột biến về di truyền là nguyên
nhân chính giúp virút cúm gia cầm A/H5N1 có thể vợt

qua hàng rào loài và có thể là tiềm tàng của các vụ
dịch/ đại dịch cúm cho ngời trong tơng lai. Nghiên
cứu tìm hiểu sự tiến hóa thông qua việc phân tích đặc
điểm vật liệu di truyền của virút cúm A/H5N1 phân lập
trên ngời tại miền Bắc Việt Nam trong những năm
2003-2008 sẽ phần nào giúp tìm hiểu khả năng tiến
hóa của virút và hiệu quả của vaccine (nếu có) để góp
phần phòng bệnh có hiệu quả.
Đặc điểm di truyền học trong kết quả của chúng tôi
đã cho thấy: clade 1 và clade 2.3.4 tơng ứng với đặc
tính kháng nguyên là các kiểu gen (genotype) chính
lu hành trên các virút cúm A/H5N1 gây bệnh cho
ngời tại miền Bắc cũng nh toàn lãnh thổ Việt Nam.
Nghiên cứu của Wan và cs [5] trên toàn bộ các virút
cúm gia cầm A/H5N1 lu hành tại Việt Nam trong giai
đoạn 2001-2007 cho thấy có 9 loại kiểu gen (từ
genotype 1 VN1 đến genotype 9 VN9) tơng
đơng với 6 kiểu hình kháng nguyên (clade 0, clade 1,
clade 2.3.2, clade 2.3.4, clade 3, và clade 5) nhng chỉ
có clade 1 và clade 2.3.4 đợc ghi nhận gây bệnh cho
ngời tại Việt Nam.
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy trong hầu hết
các phân đoạn gen của virút cúm A/H5N1 đều nhóm
vào 2 nhóm chính là clade 1 và clade 2.3.4. Tuy nhiên
tại gen NA các virút cúm A/H5N1 trong nghiên cứu lại
nhóm vào 3 phân nhóm chính là clade 1, clade 2.3.2
và clade 2.3.4. Kiểu hình 2.3.2 cùa virút cúm A/H5N1
trong nghiên cứu này đợc ghi nhận tại các virút phân
lập trên gia cầm tại Việt Nam và Trung Quốc trong
cùng thời gian, kết quả trên cho phép nghĩ đến sự đột

biến, trao đổi và tích hợp giữa virút cúm gia cầm
A/H5N1 gây bệnh cho ngời và gia cầm vẫn đang tiếp
tục, khả năng tiềm tàng xuất hiện một kiểu hình kháng
nguyên mới là có thể [1]. Vì vậy, việc theo dõi, kiểm
soát sự tiến hóa của virút cúm gia cầm A/H5N1 là một
công việc cần thiết trong hoạt động phòng chống cúm
gia cầm tại Việt Nam.
KếT LUậN
- 7 phân đoạn gen (HA, NP, M, NS, PB1, PB2 và
PA) của virút cúm A/H5N1 đều thuộc 2 kiểu hình
kháng nguyên là clade 1 và clade 2.3.4.
- Phân đoạn gen NA virút cúm A/H5N1 biểu hiện
trên 3 kiểu hình kháng nguyên là clade 1, clade 2.3.2
và clade 2.3.4 tơng tự với virút cúm gia cầm A/H5N1
lu hành trên gia cầm tại Việt Nam và Trung Quốc
trong cùng thời gian.
TàI LIệU THAM KHảO
1. Nguyen TD, Nguyen TV, Vijaykrishna D, Webter
RG, Guan Y, Peiris MJS and Smith GJD (2008), Multipe
sublineages of influenza A virus (H5N1), Vietnam, 2005-
2007, Emerg Infect Dis, 14, pp. 632-636.
2. Wallace RG, Hodac H, Lathrop RH, Fitch WM
(2007), A statitistical phylogeography of influenza A
H5N1, Proc Natl Acad Sci USA, 104, pp. 4473-4478.
3. World Heath Organization (WHO). Cumulative
Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza
A/(H5N1) Reported to WHO, 16 March 2011. Available:
/>ses_table_2011_03_16/en/index.html. Accessed 2011
March 18.
4. World Heath Organization (WHO).

Recommendations and laboratory procedures for
detection of avian influenza A (H5N1) virus in specimens
from suspected human cases. Available:
/>RecAIlabtestsAug07.pdf. Accessed 2011 March 17.
5. Xiu-Feng Wan, Tung Nguyen, C. Todd Davis,
Catherin B. Smith, Zi-Ming Zhao, Margaret Carrel, Kenjiro
Inui, Hoa T.Do, Duong T.Mai, Samadhan Jadhao,
Amanda Balish, Bo Shu, Feng Luo, Micheal Emch,
Yumiko Matsuoka, Stephen e Lindtrom, Nancy J Cox,
Cam V Nguyen, Alexander Klimov, Ruben O. Donis
(2008), Evolution of Highly Pathogenic H5N1 Avian
Influenza Viruses in Vietnam between 2001 to 2007,
PloS ONE, 3 (10), e3462.

NGHIÊN CứU ĐặC ĐIểM VI KHUẩN HọC ở Đờm và dịch rửa Phế quản
qua nội soi Phế quản ống mềm ở bệnh nhân giãn phế quản

lý tuấn hồng - Bệnh viện 354
đặt vấn đề
Nớc ta là một nớc nông nghiệp, khí hậu nhiệt đới
gió mùa, đang trong giai đoạn phát triển, tỷ lệ trẻ suy
dinh dỡng còn cao. Vấn đề bụi, khí thải công nghiệp,
chất thải của bệnh nhân (Bn) và ngời lành mang mầm
bệnh, chất thải bệnh viện, cũng nh ý thức phòng bệnh
của đại bộ phận ngời dân còn hạn chế nếu không
muốn nói là còn kém. Do đó nhiễm khuẩn hô hấp,
bệnh lao phổi, giảm không đáng kể, hậu quả là giản
phế quản (GPQ) không giảm [1],.
Các nớc kém phát triển trong đó có vùng Tây
Nam Thái Bình Dơng và Đông Nam á, GPQ còn là

nguyên nhân nhập viện, tàn phế và tử vong không