Báo cáo vi sinh học thực phẩm

BÀI 1: HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM
QUAN SÁT TIÊU BẢN VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC
Mục tiêu:
- Chuẩn bị trang thiết bị cần thiết của một phòng thí nghiệm vi sinh vật.
- Vận dụng được các quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm vi sinh vật
I – Cơ sở lý thuyết
1. Các quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm vi sinh vật
• Hiểu đúng nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật.
• Thao tác an toàn trên đối tượng vi sinh vật ở mật độ cao.
• Không ăn uốn, hút thuốc trong phòng thí nghiệm vi sinh vật
• Mặc áo blouse trong thời gian thực hành.
• Không dùng miệng hút bằng ống hút ( pipette) để định lượng vi sinh vật
hay hóa chất, mà phải dùng quả bóp cao su khi thao tác hút bằng ống
hút.
• Hộp Petri đã đổ môi trường hoặc sau nuôi cấy vi sinh vật, không mở
nắp, dùng tay để sờ và dùng mũi để ngửi.
• Khi lỡ tay làm đổ vi sinh vật ra nơi làm việc, dùng khăn hay giấy tẩm
cồn 70 độ để lau và lau sạch lại bằng khăn hay giấy tẩm cồn 70 độ
khác.
• Khi sử dụng que cấy để gieo cấy vi sinh vật cần phải được khử trùng
bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn tránh vươn vãi ra xung quanh.
• Trước và sau khi thao tác trên vi sinh vật cần lau tay kỹ bằng cồn 70 độ.
Khi thực hiện thao tác này cần phải tránh xa ngọn lửa đèn cồn khi tay
còn ướt.
• Cần ghi chú tên chủng vi sinh vật và ngày tháng thí nghiệm lên các
dụng cụ chứa môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
• Tất cả các chất thải và môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần
được hấp khử trùng trước khi đem đổ vào thùng rác. Các dụng cụ
nhiễm vi sinh vật cần được ngâm trong dung dịch sát khuẩn trước khi
rửa.
• Không đổ thạch vào bồn rửa và ống thoát nước.

2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm vi sinh vật
II – Tiến hành thí nghiệm
1. Làm nút bông
- Sau khi nhận dụng cụ ta phải làm sạch dụng cụ bằng nước.
- Sau đó dùng bông thấm nước làm khô.
 Ng n ng a các ch t t môi tr ng nuôi c y vào trong mi ng và tránhă ừ ấ ừ ườ ấ ệ
nhi m t p t mi ng vào môi tr ng.ễ ạ ừ ệ ườ
B c 1ướ : Dùng tay xé 1 mi ng l p bông hình ch nh t, g p các rìa mi ng bôngế ớ ữ ậ ấ ế
vào trong cho g n không b xù.ọ ị
B c 2ướ : cu n ch t l i thành nút sao cho v a khít ng nghi m (không quá ch tố ặ ạ ừ ố ệ ặ
c ng không quá l ng) :ũ ỏ để
 Không làm nút bông quá ch t gây v ng nghi m. ặ ỡ ố ệ
 Không làm nút bông quá l ng vì d b nhi m t p.ỏ ễ ị ễ ạ
2. Bao gi y d ng cấ ụ ụ
M c íchụ đ : Tr c khi h p kh trùng d ng c , v t li u, c n ph i ti n hành baoướ ấ ử ụ ụ ậ ệ ầ ả ế
gói k càng và úng k thu t thu n ti n cho công vi c kh trùng, tránh hi nỹ đ ỹ ậ để ậ ệ ệ ử ệ
t ng n t v hay b t p nhi m sau khi h p.ượ ứ ỡ ị ạ ễ ấ
Trong phòng thí nghi m vi sinh v t, ng i ta th ng cu n gi y trên nhi uệ ậ ườ ườ ố ấ ề
d ng c : ng nghi m, a Petri, bình tam giác,…ụ ụ ố ệ đĩ
Bao gói d ng c : Sau khi ã làm nút, các d ng c ph i c bao gói quy cách ụ ụ đ ụ ụ ả đượ để
em h p.đ ấ
B c 1ướ : i v i ng nghi m ng môi tr ng ã có nút bông, c n dùng gi y b cĐố ớ ố ệ đự ườ đ ầ ấ ọ
ch t phía u nút bông l i.ặ đầ ạ
B c 2ướ : Chai l c ng c b c ch t ph n nút b ng gi y.ọ ũ đượ ọ ặ ầ ằ ấ
B c 3ướ : Pipette c gói b t u t phía u nh gi t, cu n gi y d n theođượ ắ đầ ừ đầ ỏ ọ ộ ấ ầ
ki u xoáy trôn c cho t i h t phía u có nút bông.ể ố ớ ế ở đầ
B c 4ướ : Các pipet có th c gói t 1 t i vài chi cể đượ ừ ớ ế
Các a Petri c gói thành ch ng, m i ch ng t 3-5 chi c đĩ đượ ồ ỗ ồ ừ ế
Các d ng c khác, tu theo yêu c u mà có s bao gói cho thích h p. N u h p ụ ụ ỳ ầ ự ợ ế ấ ở
n i h p áp l c thì không c bao gói b ng gi y th m n c mà ph i dùng lo iồ ấ ự đượ ằ ấ ấ ướ ả ạ

gi y dai, không th m n c.ấ ấ ướ
Các d ng c bao gói ph i th t khô, s ch, tránh v trong khi h p. D ng c baoụ ụ ả ậ ạ ỡ ấ ụ ụ
gói xong ph i dán nhãn, ngày em h p ti n vi c theo dõi, s d ng.ả đề đ ấ để ệ ệ ử ụ
3. H p ti t trùng d ng cấ ệ ụ ụ
 N I H P (AUTOCLAVE)Ồ Ấ
Nguyên lý: Ph ng pháp s d ng n i h p áp l c d a trên nguyên t c làm giaươ ử ụ ồ ấ ự ự ắ
nhi t các v t b ng h i n c bão hoà d i áp su t l n h n áp su t khí quy n. Khiệ ậ ằ ơ ướ ướ ấ ớ ơ ấ ể
áp su t t ng, nhi t c ng t ng theo. Tác d ng ph i h p gi a nhi t cao vàấ ă ệ độ ũ ă ụ ố ợ ữ ệ độ
áp su t m b o cho vi c kh trùng th c hi n c t t. Khi h p, áp l c s tiêuấ đả ả ệ ử ự ệ đượ ố ấ ự ẽ
di t c t bào và sinh d ng l n bào t c a vi sinh v t .ệ ả ế ưỡ ẫ ử ủ ậ
 CÁCH V N HÀNH N I H P C :Ậ Ồ Ấ Ơ
B c 1ướ : Ki m tra m c n c trong kho ng an toànể ự ướ ở ả
n c vào n i h p v i l ng thích h p ( n v ch chu n trên ng thu tinhĐổ ướ ồ ấ ớ ượ ợ đế ạ ẩ ố ỷ
t d i ph u rót n c). N c ph i , không nên quá vì khi sôi n c cóđặ ướ ễ ướ ướ ả đủ đổ ướ
th l t vào ng d n n áp k và làm sai l c ch s áp. N u ít, hi u qu khể ọ ố ẫ đế ế ạ ỉ ố ế đổ ệ ả ử
trùng kém, có th gây cháy n i. T t nh t nên dùng n c c t cho vào n i h p vì nóể ồ ố ấ ướ ấ ồ ấ
s không t o ra canxi.ẽ ạ
B c 2ướ : B t công t c gia nhi t tr c (10-15 phút).ậ ắ để ệ ướ
B c 3ướ : t các d ng c vào bu ng h p.Đặ ụ ụ ồ ấ
Các dùng ph i bao gói k r i m i x p vào n i h p. n ng trên. Không nênđồ ả ỹ ồ ớ ế ồ ấ Đồ ặ ở
x p d ng c quá sát nhau h i n c có th di chuy n d dàng .ế ụ ụ để ơ ướ ể ể ễ
B c 4ướ : Ki m tra và óng các valve x và valve an toàn.ể đ ả
B c 5ướ : y n p và v n c i x ng nhau t ng ôi m t.Đậ ắ ặ ố đố ứ ừ đ ộ
B c 6ướ : Khi ng h áp l c ch 0.4-0.5 kg/cm2 thì x khí l n 1 cho t i khiđồ ồ ự ỉ ả ầ ớ
ng h áp l c ch 0.1 kg/cm2 hay khi th y bu ng khí x xu t hi n dòng khíđồ ồ ự ỉ ấ ồ ả ấ ệ
tr ng liên t c thì ng valve x .ắ ụ đố ả
B c 7ướ : Ch cho ng h áp l c ch 1 atm hay nhi t ch 1210 C tính gi vàờ đồ ồ ự ỉ ệ độ ỉ ờ
canh 15 phút.
B c 8ướ : Khi ã th i gian kh trùng, i áp su t trong n i h d n t i v chđ đủ ờ ử đợ ấ ồ ạ ầ ớ ạ
s 0, m van thông h i x h t khí. V n c, m n p, l y các dùng ã cố ở ơ ả ế ặ ố ở ắ ấ đồ đ đượ

kh trùng ra.ử
III - Câu hỏi thảo luận
1. Nêu kỹ thuật chỉnh kính hiển vi khi quan sát trạng thái sống và trạng thái
chết
 Khi vi sinh vật ở trạng thái sống:
• Lấy một phiến kính sạch cho 1 giọt nước hay 1 giọt phẩm màu
methylene blue (0.1%). Sau đó cho vi sinh vật hòa tan trong giọt nước
hay giọt màu loãng đó.
• Đậy lá kính sao cho chân của lá kính chạm vào giọt nước hay giọt màu,
nghiêng một góc <= 45 độ và hạ lá kính xuống để không có bọt khí.
• Đặt phiến kính lên bàn mẫu, hạ tụ quang, đóng bớt chắn sáng, quang sát
ở vật kính 10X, dùng ốc chỉnh thô hạ bàn mẫu chạm tới vật kính, đặt
mắt vào quan sát, dùng ốc chỉnh thô hạ bàn mẫu xuống cho đến khi
thấy ảnh vi sinh vật rồi dùng nút chỉnh tinh vặn để xem rõ ảnh vi sinh
vật. Trên bàn mẫu, dùng ốc di chuyển mẫu vật di chuyển phiến kính
đến vùng muốn quan sát trong thị trường.
• Để quan sát ảnh có độ phóng đại lớn hơn, chuyển sang vật kính 40X và
điều chỉnh ốc chỉnh tinh để tìm ảnh.
 Khi vi sinh vật ở trạng thái chết:
• Cố định vi sinh vật bằng cách cho 1 giọt sinh khối vi sinh vật trải đều
trên phiến kính sạch, hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi khô (không
còn ướt, nhưng không được cháy).
• Cho 1 giọt (lớn) phẩm nhuộm đơn (methylene blue 0.1% hoặc
Carbofuchsin 0.1%) lên vết vi sinh vật đã cố định để trong 5 phút.
• Rửa nước bằng đầu xịt của bình tia cho đến khi sạch màu và làm khô
bằng ngọn lửa đèn cồn (có thể dùng giấy mềm để thấm nhẹ nước,
nhưng không dùng giấy mềm để lau).
• Nhỏ 1 giọt dầu cefdre lên vết nhuộm, đưa lên bàn mẫu.
• Nâng tụ quang, mở chắn sáng nhìn từ ngoài, hạ vật kính 100X xuống
chìm vào giọt dầu cefdre.

• Nhìn vào thị kính, điều chỉnh ốc chỉnh thô từ từ cho đến khi thoáng
thấy vật thì điều chỉnh ốc chỉnh tinh để trông rõ vật.
2. Sau khi thao tác với vi sinh vật, người ta thường dùng cồn 70 độ để tiệt
khuẩn tay và nơi làm việc mà không dùng cồn 90 độ hay 60 độ, giải thích?
- Vì cồn 90 độ đậm đặc nên bay hơi nhanh so với cồn 70 độ. Và chính vì cồn 90
độ đậm đặc nên sẽ làm thành tế bào của vi khuẩn, vi sinh vật đông lại, tạo
thành một lớp àng cứng bảo vệ nên sẽ mất tác dụng.
- Còn cồn 60 độ thì hơi loãng nên không hiệu quả.
- Do đó người ta sẽ dùng cồn 70 độ để tiệt khuẩn tay và nơi làm việc.
(o(o(
BÀI 2: KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG
Mục tiêu:
- Phân biệt được môi trường nuôi cấy và phân tích.
- Pha chế được các loại môi trường cơ bản.
- Áp dụng các phương pháp tiệt trùng môi trường, dụng cụ.
I – C s lý thuy tơ ở ế
1. Dinh dưỡng vi sinh vật
Môi trường dinh dưỡng vi sinh vật bao gồm nhiều thành phần dinh dưỡng cần thiết
khác nhau.thành phần dinh dưỡng này tùy thuộc vào nhu cầu của từng loại vi sinh
vật.
Mọi cơ thể sống đều cấu tạo từ những hợp chất hữu cơ, có cấu tạo từ các nguyên tố là
C, H, O và N.
Ngoài ra các nguyên tố thiết yếu,trong các cơ thể vi sinh vật còn có các nguyên tố đa
lượng: S, P; các nguyên tố vi lượng như : Fe, Cu, Mg, Zn, K, Ca, Cl, Bo vì thế
trong thành phần dinh dưỡng không thể cung cấp đơn thuần một số chất nào đó hoặc
một nhóm nguyên tố nào đó mà trong tự nhiên, vi sinh vật sử dụng các nguồn dưỡng
chất từ cơ thể thực vật, động vật hoặc vi sinh vật.
Nồng độ đường phù hợp để nuôi cấy vi khuẩn và xạ khuẩn khoảng 0.05-0.2%, nấm
mốc và nấm men khoảng 3-15%. Ngoài ra còn có nồng độ phù hợp của các gốc kiềm
purin, pirimidin hoặc các vitamin,…

2. Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Môi trường nơi cung cấp đầy đủ các thành phần về dinh dưỡng (nguồn nitơ, nguồn
carbon, khoáng đa-vi lượng, chất sinh trưởng…) cho sự phát triển của vi sinh vật.
Tùy theo mục đích mà thành phần, hàm lượng các chất trong môi trường là khác
nhau. Môi trường có thể được phân loại theo:
a) Theo cấu trúc: lỏng, rắn, bán rắn
b) Theo thành phần: tổng hợp, tự nhiên, bán tổng hợp
c) Theo công dụng: tiền tăng sinh, tang sinh, chọn lọc, phân biệt, chọn lọc-phân
biệt, thử nghiệm sinh hóa, đông khô thương phẩm
II – Tiến hành thí nghiệm
1. Pha chế môi trường Cao thịt - pepton:
Bước 1: Cân 5g agar + 125ml nước cất. Đun sôi cho đến khi tan hết (dung dịch 1).
Bước 2: Hòa tan 0.75g cao thịt + 2.5g pepton + 1.25g NaCl vào 125ml nước cất
(dung dịch 2)
Bước 3: Cho dung dịch 2 vào dung dịch 1 đang sôi, khuấy đều, tắt bếp.
Bước 4: Phân phối vào các dụng cụ chứa, đậy kín bằng nút bông và nắp giấy, dán
nhãn và đem đi hấp tiệt trùng ở 121
o
C trong thời gian 15 phút.
2. Pha chế môi trường DRBC_ Dichoran Rose Bengal Chloramphenicol.
Bước 1: Lấy 7.5g môi trường DRBC đã pha sẵn hòa tan vào 250ml nước cất
Bước 2: Phân phối vào các dụng cụ chứa, đậy kín bằng nút bông và nắp giấy, dán
nhãn và đem đi hấp tiệt trùng ở 121
o
C trong thời gian 15 phút.
III - Câu hỏi thảo luận
1. Trong kỹ thuật nuôi cấy vsv, mỗi loài hoặc mỗi nhóm vsv khác nhau, tại sao
cần phải pha chế các loại chất khác nhau và hàm lượng cũng khác nhau?
- Mỗi loài hoặc mỗi nhóm có điều kiện cho quá trình dị hóa, đồng hóa khác nhau;
các quá trình sinh lý sinh hóa; nhu cầu dinh dưỡng và đặc điểm sinh trưởng khác

nhau.
- Do mục tiêu nghiên cứu.
2. Tại sao môi trường thạch đĩa cần phải được úp ngược sau khi làm nguội?
- Kiểm tra được chất lượng thạch đổ.
- Không để nước đọng trên nắp rớt xuống làm hỏng khuẩn lạc nuôi cấy.
- Hạn chế một phần tạp nhiễm trong thời gian nuôi cấy do phần đáy nặng có xu
hướng úp từ trên xuống nên đậy kín đĩa thạch.
- Dễ dàng khi cầm nắm, vận chuyển đĩa thạch mà không bi rơi nắp bất ngờ làm
ngoại nhiễm.
3. Giải thích tại sao môi trường nuôi cấy cần nên được làm nguội khoảng 45-
55
0
C trước khi chúng được rót vào đĩa Petri?
- Thạch quá nóng dễ dàng làm nứt hoặc vỡ đĩa Petri.
- Nếu đổ đĩa (đổ môi trường) lúc agar có nhiệt độ cao thì khi để nguội sẽ có nhiều
nước đọng lại trên thành, trên nắp đĩa dễ tạo môi trường cho vi sinh ngoài không
khí xâm nhập vào làm hỏng môi trường.
(o(o(
BÀI 3: KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT
Mục tiêu:
- Thực hiện các kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật
- Thực hiện các kỹ thuật phân lập vi sinh vật
I – Cơ sở lý thuyết
1. Kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật
Mục đích của việc gieo cấy vi sinh vật để nhân giống vi sinh vật; phát hiện sự có mặt
của vi sinh vật trong các mẫu (thực phẩm, bệnh phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, nước,
đất ) cần phân tích; nghiên cứu các đặc tính hình thái, sinh lí, sinh hóa của đối
tượng vi sinh vật mục tiêu.
 Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa môi trường lỏng
Dùng que cấy vòng và làm theo trình tự các bước sau:

- Ống nghiệm được cầm ở tay trái, tay phái cầm que cấy, ngón út và lòng bàn
tay của tay phải dùng để mở và giữ nút bông. Sau khi khử trùng que cấy, mở
nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm bằng cách hơ qua ngọn lửa.
- Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm hay bình tam giác và
nhúng vào canh trường lấy một ít canh trường chứa vi sinh vật mà không để
đầu que cấy chạm vào thành bình và miệng ống nghiệm .
- Đầu que cấy có dính vi sinh vật được giữ ở không gian vô trùng gần ngọn lửa
đèn cồn.
- Dùng tay trái lấy ống nghiệm mới, mở nút bông, khử trùng miệng ống
nghiệm, rồi đưa que cấy vào bên trong ống nghiệm nhúng vào canh trường và
khuấy nhẹ que cấy.
- Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm và nút bông rồi đậy lại.
- Để các ống nghiệm vào giá, đốt que cấy trên đèn cồn ngay trước khi trả về giá
để que cấy.
 Cấy giống từ ống nghiệm thạch nghiêng hay môi trường lỏng sang ống
nghiệm thạch nghiêng
- Thường sử dụng que cấy vòng. Các bước tiến hành giống kỹ thuật cấy giống
từ môi trường lỏng sang môi trường lỏng, nhưng chỉ khác ở bước 4. Sau khi
lấy được sinh khối vi sinh vật vào đầu que cấy rồi, ta tiến hành đưa đầu que
cấy vào trong ống nghiệm và cấy ria theo đường dzích dzắc từ đáy ống lên.
 Cấy đâm sâu trên ống nghiệm thạch đứng
Người ta sử dụng que cấy thẳng để đâm sâu vào trong môi trường thạch đứng.
Các bước tiến hành cũng tương tự như mục trên, nhưng có điểm khác như sau:
- Quay ngược ống môi trường cho miệng ống nghiệm xuống dưới để tránh việc
nhiễm khuẩn lúc gieo cấy.
- Đưa ống nghiệm có vi sinh vật đâm sâu vào dọc theo ống thạch cho đến gần
đáy ống nghiệm.
2. Phân lập vi sinh vật
Vi sinh vật tồn tại trong tự nhiên ở dạng quần xã gồm nhiều quần thể các loài vi sinh
vật. Việc phân lập loài nhất định trong quần xã vi sinh vật dựa vào khả năng phân

tách các tế bào ra thành riêng lẻ trên môi trường chọn lọc.
Hầu hết các phương pháp phân lập và thuần chủng vi sinh vật đều dựa trên một số kỹ
thuật pha loãng để phân tách tế bào vi sinh vật kết hợp điều kiện nuôi cấy chọn lọc để
tạo ưu thế tăng trưởng cho chủng quan tâm. Hiện nay, có các kỹ thuật phổ biến sau:
 Kỹ thuật hộp ria
- Là kĩ thuật phân tách hỗn hợp vi sinh vật bằng cách ria trên bề mặt đĩa thạch
sao cho các tế bào riêng lẻ ra nhau. Sau khi được ủ trong thời gian , mỗi tế
bào sẽ tăng trưởng thành một khuẩn lạc riêng biệt. Khuẩn lạc này hình thành
do sự sính sản, phân chia từ một tế bào ban đầu.
- Trong kĩ thuật ria, có nhiều cách ria khác nhau và không có kỹ thuật nào hoàn
hảo tuyệt đối. Hiệu quả của kỹ thuật phần lớn phụ thuộc vào người cấy. Sau
đây là một số kỹ thuật ria thường dùng:
o Kỹ thuật ria chữ T
o Kỹ thuật ria liên tục
o Kỹ thuật ria 4 góc
o Kỹ thuật ria ria
II – Tiến hành thí nghiệm
Phân lập vi sinh vật – Kỹ thuật cấy ria trên đĩa thạch
Sử dụng các đĩa petri đã được chuẩn bị từ bài 2: petri chứa môi trường cao thịt-
pepton và Czapek-Dox hoặc DRBC đã hấp khử trùng. Các petri chứa môi trường
Czapek –Dox dùng để phân lập vi khuẩn. các petri chứa môi trường Czapek-Dox
hoặc DRBC dùng để phân lập nấm men hay nấm mốc.
Bước 1: Làm lỏng môi trường bằng lo vi sóng. Lắc đều.
Bước 2: Mở đĩa petri gần đèn cồn và đổ môi trường nuôi cấy ra các đĩa petri.
Chờ môi trường đặc lại.
Bước 3: Khử trùng đầu que cấy trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ.
Bước 4: Nhúng que cấy và canh khuẩn (nước mía) để lấy giống.
Bước 5: Cấy giống vi khuẩn vào đĩa petri. Cấy giống gần đèn cồn.
Bước 6: Tay trái mở nắp petri, tay phải cầm que cấy ria trên bề mặt thạch.
Bước 7: Khử trùng que cấy sau khi cấy ria xong.

III – Câu hỏi ôn tập
1. Người ta phân lập vi sinh vật từ môi trường tự nhiên dựa trên những
nguyên tắc gì?
Các nguyên tắc:
Dựa vào khả năng phân tách các tế bào ra thành riêng lẻ trên môi trường chọn lọc
Nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc
riêng lẻ, tách biệt nhau.
2. Trong một nhà máy lên men bia, do sơ ý về kỹ thuật, người ta đã làm mất
một giống nấm men có khả năng chịu được nồng độ ethanol cao. Hãy đề
xuất các bước tiến hành phân lập giống men có đặc tính trên để thu hồi và
tàng trữ nó.
Ta lấy 1 mẫu bã lên men bia (xác bia) (có thể đem quan sát trên kính hiển vi) rồi đem
phân lập nấm men bia mà mình mong muốn. sau đó cấy trong môi trường thích hợp,
nhân giống, bảo quản, tàng trữ và sử dụng.
Nấm men khi quan sát trên kính hiển vi thường có dạng hình cầu hay hình trứng. tế
bào có kích thước lớn, có khả năng nảy chồi. khuẩn lạc cho màu trắng sữa
Phân lập nấm men, cấy vào môi trường thích hợp như khoai tây hay môi trường
Sabouraud dùng phương pháp cấy trên đĩa petri.
Dùng que cấy đầu tròn và thực hiện theo trình tự:
• Để đĩa petri lên bàn
• Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật ( nấm men).
• Tay trái hé mở nắp petri vừa đủ để cho que cấy vào.
• Nhẹ nhàng và nhanh chóng lấy que cấy lên mặt thạch theo 1 trong kiểu
sau:
 theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch.
 theo những đường song song.
 theo 4 hình chữ chi ở 4 góc.
Dùng pipet cấy lên lượng khá nhiều giống, có 2 cách:
Cách 1:
 Trộn dịch cấy vào thạch bằng cách hút 0.1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống

nghiệm có môi trường thạch ở nhiệt độ 50 độ.
 Đậy nút bông lại, lắc nhẹ cho vi sinh vật phân phối đều trong môi trường.
 Để thạch vào đĩa petri đã khử trùng.
 Xoay tròn đĩa petri cho thạch trảng đều ở đáy hộp.
 Để yên cho thạch đông đặc lại và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp.
Cách 2:
 Hút 0.1 ml dịch cấy, nhỏ vào đĩa petri có môi trường đặc.
 Dùng que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa.
 Cất vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tùy loài vi sinh vật
3. Trình bày phương pháp phân lập vi sinh vật bằng kỹ thuật cấy ria và kỹ
thuật pha loãng kết hợp với cấy trải?
 Kỹ thuật cấy ria trên đĩa petri:
 Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng nhúng vào dịch mẫu để có được vi sinh
vật cần phân lập.
 Ria các đường trên đĩa petri chứa môi trường thạch thích hợp. sau mỗi đường
ria liên tục, đốt khử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria
tiếp theo.
 Lật ngược đĩa, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.
 Kỹ thuật cấy ria trên ống nghiệm thạch nghiêng.
 Kỹ thuật pha loãng kết hợp với cấy rải:
Kỹ thuật pha loãng mẫu:
Mẫu thực phẩm có thể ở dạng rắn hoặc lỏng.
Bước 1: Cân 10g ( hoặc 25g) hoặc hút 10 ml ( hoặc 25 ml) mẫu vào bình tam giác đã
có 90 ml ( hay 225 ml) SPW.
Bước 2:Nếu là mẫu rắn thì đồng nhất mẫu bằng máy. Dập mẫu hay xay mẫu trong
cốc vô trùng tối đa 2.5 phút.
Bước 3: Lắc đều mẫu trong bình tam giác ít nhất 2 phút ta được mẫu có độ pha loãng
1/10.
Kỹ thuật cấy trải:
 Là kỹ thuật pha loãng theo bậc 10 dịch chứa vi sinh vật thành các mức pha

loãng khác nhau và chuyển 0.1 ml dịch ở các mức pha loãng lên bề mặt môi
trường thạch. Sau thời gian ủ , mỗi tế bào sẽ phát triển thành khuẩn lạc.
 Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng và chuyển 0.1 ml dịch
chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri.
 Nhúng đầu thanh gạt ( que trải) thủy tinh vào cồn 70 độ , hơ qua ngọn lửa để
khử trùng. Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.
 Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu
thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trải, thực hiện
xoay đĩa 1 vài lần, mỗi lần khoảng ½ chi vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải
dịch giống đều khắp bề mặt môi trường.
 Rút thanh gạt khỏi đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.
(o(o(
BÀI 4: KỸ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
Mục tiêu:
- Thực hiện được thí nghiệm lấy mẫu phân tích
- Thực hiện được kỹ thuật hộp trải và hộp đổ
I – Cơ sở lý thuyết
Kỹ thuật hộp trải
Là kỹ thuật pha loãng theo bậc 10 dịch chứa vi sinh vật thành các mức pha loãng
khác nhau và chuyển 0,1ml dịch ở các mức pha loãng lên bề mặt môi trường thạch.
Sau thời gian ủ, mỗi một tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc.
Chú ý: Người ta cũng thường dung kỹ thuật này để nuôi cấy, phân lập hay phân tích
tổng số nấm men, nấm mốc,…
II – Tiến hành thí nghiệm
 Kỹ thuật hộp trải : Sử dụng các đĩa Petri chứa môi trường Cao thịt-Pepton và
Czapek-Dox đã hấp khử trùng. Các Petri chứa môi trường Cao thịt-Pepton
dung để phân lập vi khuẩn. Các Petri chứa môi trường Czapek-Dox dung để
phân lập nấm men hay nấm mốc.
Các bước thực hiện:
Bước 1: Dùng micropipette và đầu tip vô trùng hút 0,1ml dịch vi sinh vật lên bề mặt

môi trường thạch đĩa trong không gian vô trùng
Bước 2: Nhúng đầu que trang trong cốc thủy tinh chứa cồn 70
o
, đốt trên ngọn lửa
đèn cồn để khử trùng. Để đầu que trải nguội trong không gian vô trùng (gần ngọn lửa
đèn cồn).
Bước 3: Mở đĩa Petri, dung que trang gạt đều giọt vi sinh vật trên bề mặt thạch. Dùng
que trang gạt xoay đều trên bề mặt thạch. Trong khi gạt, xoay đĩa Petri tới lui 3 – 4
lần, mỗi lần ½ chu vi cho vi sinh vật được trải đều khắp trên bề mặt môi trường
Bước 4: Rút que trang ra khỏi đĩa, đậy đĩa, gói giấy và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích
hợp theo từng đối tượng vi sinh vật mục tiêu.
BÀI 5: LÊN MEN ETHANOL
Mục tiêu:
- Thực hiện quá trình lên men ethanol
- Nhận biết các dấu hiệu lên men ethanol
I – Cơ sở lý thuyết
Rượu ethanol là một loại sản phẩm lên men đường phổ biến của nhiều nhóm vi sinh
vật. Song tác nhân lên men chủ yếu là nấm men, đặc biệt là loài Saccharomyces
cervisiae. Nhiều loài vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí tùy tiện cũng có khả năng tạo thành
rượu như là một sản phẩm chủ yếu hay một sản phẩm phụ của quá trình lên men
hexose và pentose.
Quá trình lên men ethanol nhờ nấm men là cơ sở của việc sản xuất các loại rượu, bia,
cồn và glycerin. Quá trình này còn được ứng dụng trong sản xuất bánh mì (làm nở
bột mì) và một số loại nước giải khát.
1. Cơ chế quá trình lên men ethanol
Tinh bột Dextran Glucose
EMP
Pyruvate
Acetaldehyde
pH 4-5

Ethanol
Khi phân hủy đường trong điều kiện kỵ khí, vi sinh vật chuyển hydro từ NADH đến
acetaldehyde tạo thành rượu ethanol để tái tạo NAD
+
. Sản phẩm tạo thành là ethanol
và CO
2
. Phương trình phản ứng:
NADH NAD
+
C
6
H
12
O
6
CH
3
COCOOH CH
3
CHO C
2
H
5
OH + CO
2
+ 113,4
Kj
2. Quy trình lên men cơm rượu
Nếp trắng Nếp lức

(Ngâm 30-60 phút)
Vo gạo Vo gạo
Nấu
Để nguội (35-40
o
C)
Phối trộn Nghiền mịn Men
ngọt
Ủ (30
o
C, 3-4 ngày)