HOÀN THIỆN KỸ THUẬT TRUNG HOÀ VI LƯỢNG (MICRONEUTRALIZATION) TRONG NGHIÊN CỨU HUYẾT THANH DỊCH TỄ HỌC TRÊN NGƯỜI TIẾP XÚC VỚI VIRUS CÚM GIA CẦM H5N1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------------



Nguyễn Hoà Bình


HOÀN THIỆN KỸ THUẬT TRUNG HOÀ VI LƯỢNG
(MICRONEUTRALIZATION) TRONG NGHIÊN CỨU
HUYẾT THANH DỊCH TỄ HỌC TRÊN NGƯỜI TIẾP XÚC
VỚI VIRUS CÚM GIA CẦM H5N1



LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC





Hà Nội - 2007

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-------------------

Nguyễn Hoà Bình



HOÀN THIỆN KỸ THUẬT TRUNG HOÀ VI LƯỢNG
(MICRONEUTRALIZATION) TRONG NGHIÊN CỨU
HUYẾT THANH DỊCH TỄ HỌC TRÊN NGƯỜI TIẾP XÚC
VỚI VIRUS CÚM GIA CẦM H5N1




Chuyên ngành: Hoá sinh học
Mã số: 1.05.10


LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC



NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. Nguyễn Vân Trang




Hà Nội - 2007

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình

Lời cảm ơn

Trong suốt thời gian thực hiện luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận
tình, chu đáo của các thầy cô giáo và các cán bộ khoa học công tác tại Phòng Hoá
sinh, Khoa Miễn dịch và Sinh học Phân tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ TW và Bộ môn
Hoá sinh học - Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, ĐHQGHN.
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Vân Trang, phụ
trách phòng Hoá sinh, Khoa Miễn dịch và Sinh học Phân tử
, Viện Vệ sinh Dịch tễ
TW người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho
tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu vừa qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Văn Mùi và PGS. TS. Vũ Tân
Trào – những người đã có định hướng quan trọng và đưa ra những lời khuyên bổ
ích trong quá trình nghiên cứu. Đồng thời, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới lãnh đạ
o
khoa, các anh chị cùng các bạn đã và đang công tác tại Khoa Miễn dịch và Sinh học
Phân tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã giúp đỡ tôi trong việc thu thập mẫu
ngoài thực địa và luôn nhiệt tình chỉ bảo cho tôi những kinh nghiệm thực tiễn quý
báu trong công tác nghiên cứu khoa học. Đặc biệt, tôi xin cảm ơn chị Đỗ Quỳnh
Nga đã giúp đỡ tôi về mặt kĩ thuật trong quá trình nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo trong B
ộ môn Hoá sinh học và Khoa Sinh
học, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên. Thầy, các cô là những người mang đến
cho tôi niềm đam mê khoa học và truyền đạt cho tôi những kiến thức cơ bản, bổ ích.
Tôi cũng xin cảm ơn sự PGS. TS. Đinh Duy Kháng (Viện Công nghệ Sinh
học), TS. Nguyễn Tiến Dũng (Viện Thú y Quốc gia), TS. Carl Mason (AFRIMS) và
TS. Roland Levandowski (NIH) đã cung cấp virus và những hướng dẫn kĩ thuật cần

thiết. Cảm ơn các tổ
chức SIDA, AFRIMS và NIH đã cấp kinh phí và hoá chất cho
nghiên cứu. Cảm ơn phòng Công nghệ cao - Công ty vacxin & Sinh phẩm số 1 đã
cho phép chụp ảnh các thí nghiệm.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo cùng các đồng nghiệp tại công ty Tư
vấn và Đại diện Sở hữu Trí tuệ Trường Xuân, đã tạo điều kiện tốt nhất về mặt thời
gian và công việc, cùng hỗ trợ về kinh phí để tôi hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, xin cảm
ơn gia đình tôi, những người thân yêu đã luôn bên tôi, tin
tưởng và cổ vũ cho tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, ngày 28 tháng 11 năm 2007
Học viên: Nguyễn Hoà Bình
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AA : Axit amin
BSA : Albumin huyết thanh bò
CPE : Hiệu ứng huỷ hoại tế bào
CTL : Tế bào Lympho độc
DMEM : Môi trường Dulbecco’s Modified Eagles
EID50 : Liều gây nhiễm 50% số trứng
FBS : Huyết thanh bào thai bê
HA : Hemagglutinin Assay
HEPES : Acid 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic
HI : Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu
IL : Interleukin
KN : Kháng nguyên
KT : Kháng thể

MDCK : Tế bào thận chó (Madin-Darby Canine Kidney)
MN : Trung hoà vi lượng (Microneutralization)
MOI : Số virus xâm nhiễm
NA : Neuraminidase Assay
NP : Nucleocapsid
OPD : o-phenylenediamine-dihydrochloride
RT-PCR : Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
TCID50 : Liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy
TPCK : L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone
WB : Western Blot
WHO : Tổ chức Y tế thế
giới (World Health Organization)

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU ...............................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN ..........................................................................................2
1.1 Dịch bệnh cúm gia cầm H5N1 .............................................................2
1.1.1 Dịch cúm gia cầm H5N1 trên thế giới ...............................................2
1.1.2 Dịch cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam ..............................................5
1.1.3 Sự lây truyền virus cúm gia cầm H5N1 .............................................6
1.2 Virus cúm A .........................................................................................9
1.2.1 Phân loại .............................................................................................9
1.2.2 Danh pháp ........................................................................................10
1.2.3 Đặc điểm cấu tạo virus cúm .............................................................10
1.2.4. Các subtype hiện nay của virus cúm ...............................................14

1.2.5. Sự xâm nhập và sao chép của virus cúm trong tế bào chủ .............14
1.2.6. Cơ chế hình thành chủng mới .........................................................16
1.2.7. B
ệnh học nhiễm virus H5N1 ở người .............................................18
1.2.8. Các biện pháp phòng ngừa và điều trị nhiễm virus H5N1 ..............18
1.3 Đáp ứng miễn dịch chống virus cúm ..................................................19
1.3.1. Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu ................................................20
1.3.2. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ...........................................................21
1.3.3. Tác dụng bảo vệ chéo .....................................................................23
1.4 Các phương pháp chẩn đoán virus .....................................................24
1.4.1. Phương pháp chẩn đoán trực tiếp ....................................................24
1.4.2. Phương pháp chẩn đoán gián tiếp ...................................................26
1.4.3. Phương pháp huyết thanh học .........................................................27
1.5 Kĩ thuật trung hòa vi lượng (MN) ......................................................29
1.5.1. Cơ sở của kĩ thuật ...........................................................................29
1.5.2. Ứng dụng kĩ thuật trong chẩn đoán virus .......................................29
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .........................................................31
2.1. Mẫu huyết thanh .................................................................................31
2.2. Vật liệu ...............................................................................................32
2.2.1. Dòng tế bào .....................................................................................32
2.2.2. Chủng virus .....................................................................................32
2.2.3. Kháng nguyên và kháng thể ............................................................32
2.2.4. Môi trường và hoá chất ...................................................................32
2.2.5. Trang thiết bị ...................................................................................33
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................34
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình

2.3.1. Thu nhận, xử lý và bảo quản mẫu huyết thanh ...............................34
2.3.2. Chuẩn độ kháng thể ........................................................................34

2.3.3. Chuẩn bị tế bào MDCK ..................................................................35
2.3.4. Chuẩn bị virus dùng cho phản ứng .................................................36
2.3.5. Xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy (TCID50) ..............37
2.3.6. Phản ứng trung hoà virus ................................................................38
2.3.7. Phản ứng ELISA .............................................................................40
2.4. Xử lý số liệu .......................................................................................41
2.4.1. Kết quả phản ứng trung hòa virus ...................................................41
2.4.2. Đọc kết quả .....................................................................................41
2.4.3. Xử lý thông tin về người tiếp xúc ...................................................42
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................43
3.1. K
ết quả chuẩn độ kháng thể dùng cho phản ứng ELISA ...................43
3.1.1. Nồng độ protein của virus cúm gia cầm .........................................43
3.1.2. Chuẩn độ kháng thể dùng cho phản ứng ELISA ............................44
3.2. Chuẩn bị virus dùng cho phản ứng MN .............................................46
3.2.1. Xác định nồng độ trypsin sử dụng trong gây nhiễm virus ..............46
3.2.2. Xác định MOI của virus sử dụng trong gây nhiễm .........................49
3.2.3. Xác định TCID50 của virus P2 dùng cho phản ứng MN ................50
3.3. Chuẩn bị tế bào MDCK, thời gian và điều kiện gây nhiễm ...............51
3.3.1. Xác định mật độ tế
bào MDCK thích hợp ......................................51
3.3.2. Xác định thời gian gây nhiễm virus vào tế bào ..............................54
3.4. Đánh giá kết quả thu được của phản ứng MN ....................................54
3.4.1. So sánh kết quả phản ứng MN ở điều kiện có và không có mặt của
trypsin-TPCK ...........................................................................................................54
3.4.2. Đánh giá độ ổn định của phản ứng MN ..........................................56
3.4.3. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng MN .........................................58
3.4.4. Đánh giá độ nhạy của phản ứng MN ...............................................58
3.5. Ứng dụng kĩ thuật MN trong
điều tra huyết thanh học ......................60

KẾT LUẬN .............................................................................................................64
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................66
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................67
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
1
MỞ ĐẦU
Virus cúm type A được phân thành 16 phân nhóm dựa trên tính kháng
nguyên (KN) của protein Hemagglutinin (HA) và 9 phân nhóm dựa trên tính KN
của protein Neuraminidase (NA). Virus cúm đã được phân lập từ nhiều loài động
vật như chim, hoang dã, thuỷ cầm, gia cầm, lợn, ngựa và người. Việc thay đổi
nhanh chóng về tính KN của virus đã gây khó khăn lớn trong phòng ngừa, điều trị
bệnh cúm, đặc biệt là trong sản xuất vaccine cúm. Lịch sử đã ghi nhận những vụ
dịch do virus cúm A gây ra với thiệt hại nghiêm trọng, đi
ển hình là đại dịch do cúm
H1N1 năm 1918 gây tử vong cho 40-60 triệu người và đại dịch cúm H2N2 năm
1957 đã cướp đi sinh mạng gần 2 triệu người.
Từ năm 1997 tới nay, nhiều vụ dịch do virus cúm gia cầm H5N1 đã liên tiếp
bùng phát trên diện rộng tại nhiều quốc gia, các châu lục trên thế giới gây thiệt hại
nặng nề về người và kinh tế. Virus cúm gia cầm H5N1 đã gây bệnh cho người với tỉ
lệ
tử vong lên tới 50%. Năm 2007, toàn thế giới đã có 71 ca nhiễm virus H5N1,
trong đó có 47 ca tử vong. Trong đó, Việt Nam là quốc gia đứng thứ hai sau In-đô-
nê-xia về số người nhiễm và tử vong do virus H5N1. Đứng trước tình hình đó, Việt
Nam cần phải luôn chủ động ứng phó kịp thời với những diễn biến dịch. Bên cạnh
việc phát hiện, khoanh vùng dịch bệnh sớm và chính xác để kiểm soát dịch, chúng
ta cần phải có nhữ
ng nghiên cứu, điều tra dịch tễ học một cách toàn diện nhằm xác
định khả năng miễn dịch của người đối với virus. Để thực hiện điều này, chúng ta
cần có các kĩ thuật chẩn đoán đặc hiệu và có độ tin cậy cao giúp xác định sự có mặt

của kháng thể (KT) kháng virus H5N1 trong huyết thanh người tiếp xúc với virus
cúm gia cầm H5N1.
Đáp ứng yêu cầu này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Hoàn thi
ện kĩ
thuật trung hòa vi lượng (Microneutralization) trong nghiên cứu huyết thanh
dịch tễ học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1”. Kĩ thuật được xây
dựng, tối ưu hoá và bước đầu áp dụng để xác định KT kháng virus H5N1 trong mẫu
huyết thanh thu thập tại các tỉnh Hà Tây, Hải Dương và Thái Bình trong các năm
2006-2007.
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
2
Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Dịch bệnh cúm gia cầm H5N1
1.1.1 Dịch cúm gia cầm H5N1 trên thế giới
Trước khi phân lập được trên người, năm 1996, virus cúm gia cầm H5N1 có
khả năng gây bệnh cao (HPAI) đã được phân lập từ ngỗng nuôi ở tỉnh Quảng Đông,
Trung Quốc[66]. Năm 1997, virus cúm gia cầm H5N1 là nguyên nhân gây bùng
phát dịch tại các trang trại nuôi gà và các khu vực chợ buôn bán gia cầm sống ở
Hồng Kông, đợt dịch này cũng ghi nhận trường hợp nhiễm virus cúm gia cầm
H5N1 đầu tiên ở người, sau đó có thêm 18 ng
ười được xác định bị nhiễm virus
H5N1, 6 người đã tử vong[66]. Vụ dịch này cũng dẫn đến việc phải tiêu huỷ 1,5
triệu gia cầm tại Hồng Kông, nhờ đó đã ngăn chặn được dịch bùng phát[57].
Từ năm 1997 tới cuối năm 2002, thế giới không có vụ dịch do virus H5N1
nào bùng phát. Đầu năm 2003, virus H5N1 với khả năng gây bệnh cao nêu trên đã
xuất hiện trở lại ở c
ả gia cầm nuôi nhốt và chim hoang dã tại Trung Quốc và lần đầu
tiên virus cúm gia cầm H5N1 đã xuất hiện tại Hàn Quốc[66]. Hồng Kông đã có hai

trường hợp được khẳng định là nhiễm virus gia cầm H5N1 trên người, trong đó có
một người tử vong[66]. Năm 2004, dịch đã bùng phát trên diện rộng, gây thiệt hại
lớn tại các nước Đông Nam Á bao gồm Cam-pu-chia, In-đô-nê-xia, Lào, Thái Lan
và Việt Nam. Trong năm này, Nhật Bản cũng đã ghi nhận trường h
ợp nhiễm virus
cúm H5N1 đầu tiên trên gia cầm. Nhiều ca nhiễm virus cúm H5N1 ở người dẫn tới
tử vong đã được ghi nhận tại Việt Nam và Thái Lan[66].
Năm 2004, trường hợp nhiễm virus cúm gia cầm H5N1 đầu tiên ở thú lớn
thuộc họ mèo là hai con hổ và hai con báo đã được ghi nhận tại Thái Lan[66].
Kuiken cùng các cộng sự đã chứng minh được rằng mèo nhà cũng bị nhiễm virus
H5N1 và có khả năng lây truyền từ mèo sang mèo[23]. Cùng thời gian này, 147 con
hổ trong số 441 con h
ổ nuôi nhốt tại một vườn thú ở Thái Lan đã chết do ăn xác gia
cầm sống. Các nghiên cứu đã khẳng định được rằng vịt nuôi có thể là vật chủ chứa
virus khi chúng thải ra một lượng lớn virus có khả năng lây nhiễm cao song hoàn
toàn không có các biểu hiện nhiễm bệnh[66]. Tuy nhiên, chủng virus H5N1 hiện tại
đã thu nhận thêm kiểu hình khác và có khả năng gây chết cho vịt[19].
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
3
Năm 2005, lần đầu tiên virus H5N1 gây chết 6.345 con chim thuộc nhiều
loài chim hoang dã khác nhau tại hồ Qinghai, Trung Quốc, ảnh hưởng lớn tới số
lượng chim hoang dã ở đây. Đợt dịch này làm giảm khoảng 10% tổng số ngỗng đầu
khoang (Anser indicus) toàn cầu, đồng thời cảnh báo nguy cơ ảnh hưởng nghiêm
trọng tới các loài động vật hoang dã[66].
Đến thời điểm năm 2005, virus cúm H5N1 đã xuất hiện ở cả người và gia
cầm tại nhiều nước châu Á, châu Âu và Trung Đông. Năm 2006, dịch cúm gia cầm
do virus H5N1 đã di dịch sang phía Tây, tiếp tục gây bùng phát dịch ở nhiều quốc
gia, đặc biệt là các quốc gia ở châu Âu (Thổ Nhĩ Kỳ, Italia, Anh, Pháp, Đức). Đồng
thời, các trường hợp người chết do nhiễm virus cúm H5N1 liên tục được ghi nhận

tại Indonesia. Lần đầu tiên virus H5N1 đã xuất hiện trên gia cầm tại Mỹ và các
nước châu Phi (Nigeria, Sudan, Bờ Biển Ngà …)[66].
Tính tới tháng 12 n
ăm 2007, số ca nhiễm virus cúm H5N1 ở người liên tục
được ghi nhận, nhiều nhất là tại Indonesia và Ai Cập. Dịch cúm trên gia cầm vẫn
xảy ra rải rác ở nhiều nơi[66]. Các khu vực trên thế giới đã được khẳng định là có
mặt của virus cúm H5N1 được thể hiện trên hình 1.1.
Như vậy, kể từ khi xuất hiện tại Hồng Kông năm 1997 tới nay, chủng virus
cúm H5N1 đã lan tràn, gây dịch bệnh cho gia cầm và chim hoang dã ở 60 quố
c gia
(hình 1.1), hơn 200 triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy. Các loài động vật đã bị nhiễm
virus H5N1 bao gồm gà, ngỗng, các loài chim hoang dã, mèo, hổ và báo. Thiệt hại
về kinh tế ước tính hơn 10 tỉ đô la[3, 30, 66]. Đáng lo ngại là sức khoẻ và tính mạng
của con người bị đe dọa nghiêm trọng. Bảng 1.1 cho thấy, tính đến năm 2005, Việt
Nam là quốc gia có số người tử vong do virus H5N1 cao nhất (42 người), tuy nhiên,
đến tháng 12 năm 2007 thì quốc gia có số
người tử vong do virus H5N1 nhiều nhất
là In-đô-nê-xia (91 người). Thế giới đã có 337 ca được khẳng định là nhiễm virus
H5N1 với 207 trường hợp tử vong tại 11 quốc gia (hình 1.2), tỉ lệ tử vong do nhiễm
virus cúm H5N1 lên tới hơn 61%.

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
4

Hình 1.1. Bản đồ lưu hành virus cúm A H5N1 trên gia cầm và chim hoang dã. Màu da
cam: các vùng có dịch cúm H5N1 trên gia cầm, màu gạch: nơi phát hiện thấy virus cúm A
H5N1 trên chim hoang dã (Tổ chức Y tế thế giới, 27/09/2007) website: www.who.int

Hình 1.2. Bản đồ phân bố các ca bệnh nhiễm virus cúm gia cầm H5N1 tính từ năm 2003
(Tổ chức Y tế thế giới, 30/11/2007), website: www.who.int


Các khu vực được khẳng định có bệnh nhân nhiễm
Khu vực bùng phát dịch trên gia cầm
Khu vực bùng phát dịch ở chim hoang dã
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
5
Bảng 1.1. Số người nhiễm và tử vong do virus H5N1 trên thế giới tới tháng 11 năm 2007
Quốc gia
2003 2004 2005 2006 2007 Tổng
Nhiễm
Tử
vong
Nhiễm
Tử
vong
Nhiễm
Tử
vong
Nhiễm
Tử
vong
Nhiễm
Tử
vong
Nhiễm
Tử

vong
Nigeria 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
Irắc 0 0 0 0 0 0 3 2 0 0 3 2
Lào 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2
Thổ Nhĩ Kỳ 0 0 0 0 0 0 12 4 0 0 12 4
Azerbaizan 0 0 0 0 0 0 8 5 0 0 8 5
Campuchia 0 0 0 0 4 4 2 2 1 1 7 7
Ai Cập 0 0 0 0 0 0 18 10 20 5 38 15
Trung Quốc 1 1 0 0 8 5 13 8 3 2 27 17
Thái Lan 0 0 17 12 5 2 3 3 0 0 25 17
Việt Nam 3 3 29 20 61 19 0 0 7 4 100 46
Indonesia 0 0 0 0 20 13 55 45 37 32 113 91
Tổng
4
4 46 32 98 43 115 79 70 46 337 207
Ghi chú: Số ca mắc bệnh bao gồm cả các ca tử vong. Tổ chức Y tế Thế giới chỉ ghi nhận
những ca được xác nhận bằng xét nghiệm và được báo cáo chính thức. (Tổ chức Y tế thế
giới, 28/11/2007), website: www.who.int
1.1.2 Dịch cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam
Theo ghi nhận của WHO, dịch cúm gia cầm H5N1 bùng phát lần đầu tiên tại
Việt Nam vào tháng 1 năm 2004[66]. Tính đến tháng 11 năm 2007, đã có 61/64 tỉnh
bùng phát dịch trên gia cầm, tổng số 50 triệu gia cầm các loại đã bị chết hoặc phải
tiêu huỷ. Cả nước đã có 30/64 tỉnh phát hiện bệnh nhân nhiễm virus cúm H5N1
(hình 1.3) với tổng số người bị nhiễm lên tới 100 trường hợp, trong số
đó có 46
trường hợp đã tử vong[7].

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
6















Hình 1.3. Bản đồ các tỉnh có trường hợp nhiễm cúm A H5N1 tại Việt Nam tính tới
28/11/2007. Màu vàng là các tỉnh đã bùng phát dịch trên gia cầm. Màu đỏ là các tỉnh có số
người tử vong do virus H5N1 (Số ca mắc bệnh bao gồm cả các ca tử vong được xác nhận
bằng xét nghiệm và được báo cáo chính thức).
(*): Số trường hợp nhiễm virus H5N1/số trường hợp tử vong. Bắc Ninh(2/1) tức là tỉnh
Bắc Ninh có hai người được xác định là nhiễm virus H5N1, trong đó 1 ng
ười đã tử vong.
1.1.3 Sự lây truyền virus cúm gia cầm H5N1
Sự lây truyền virus ở gia cầm
: trong tự nhiên, tất cả các subtype của virus

cúm A đã được tìm thấy ở các loài chim hoang dã, cụ thể là các loài chim nước như
vịt, ngỗng, nhạn biển, hải âu và mòng biển, từ đó cung cấp các gen cho virus cúm
nhiễm vào gia cầm được chăn nuôi, động vật có vú và cả con người[61]. Virus được
phát tán từ gia cầm nhiễm bệnh ra ngoài môi trường qua đường hô hấp, dịch nhày
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
7
và phân[6]. Như vậy, con đường lây truyền bệnh có thể diễn ra qua việc tiếp xúc
trực tiếp giữa gia cầm khoẻ mạnh với gia cầm nhiễm virus hoặc tiếp xúc gián tiếp
của gia cầm khoẻ mạnh với chất thải, dịch tiết có chứa virus hay virus được phát tán
trong môi trường sống. Việc lây nhiễm có thể xảy ra dễ dàng trong cùng một quần
thể gia cầm hoặc giữa các quần thể tại các vùng khác nhau[6].
Đặc biệt, virus lây
truyền nhanh giữa các vùng, các châu lục thông qua các loài chim di cư[9].
Sự lây truyền virus từ gia cầm sang động vật có vú
: đã có nhiều bằng chứng
cho thấy virus cúm H5N1 có khả năng truyền từ gia cầm sang các động vật có vú.
Như đã đề cập ở phần trên, giữa tháng 1 năm 2004, khi dịch cúm gia cầm H5N1
bùng phát tại Thái Lan, hai con hổ (Panthera tigris) và hai con báo (P. pardus) của
vườn thú Suphanburi đã chết sau khi có các triệu chứng sốt và suy hô hấp, và chúng
được khẳng định là đã bị nhiễm virus H5N1. Các con thú này có thể đã ăn thịt gà
sống có có chứa virus H5N1[56, 64]. Tháng 11 năm 2004, mộ
t con hổ khác cũng
được xác định bị nhiễm H5N1 mặc dù con hổ này hoàn toàn không được cho ăn xác
gà chết trong vòng 12 ngày và trong suốt đợt dịch, không có bất kì động vật nào
khác của vườn thú này bị nhiễm virus H5N1. Ngoài ra, các thí nghiệm cũng đã ghi
nhận hiện tượng lây bệnh giữa các con mèo nhà[56, 64]. Trên đảo Ruegen của Đức
đã phát hiện được virus cúm gia cầm H5N1 ở một con mèo nhà đã chết, sau khi có
hơn 100 con chim hoang dại chết, trong đó có nhiều con bị chết do virus H5N1
[66]. Đ

iều này cho thấy có khả năng virus H5N1 đã được truyền từ gia cầm sang
các loài động vật thuộc họ mèo và có khả năng giữa các động vật có vú với
nhau[56, 64].
Sự lây truyền virus từ gia cầm sang người
: virus cúm ở người thường gắn với
các thụ thể sialic acid bằng liên kết galactose α-2-6 ở các tế bào biểu mô trong ống
hô hấp, trong khi đó virus cúm gia cầm lại gắn với các thụ thể sialic acid bằng liên
kết galactose α-2-3 ở các tế bào biểu mô ruột[65]. Trước đó, người ta thường cho
rằng lợn là vật chủ trung gian quan trọng, là nơi tiếp xúc vật chất di truyền để thực
hiện tái tổ hợ
p gen, hình thành nên các chủng virus mới trước khi gây ra các vụ dịch
lớn[31, 45]. Do biểu mô khí quản của lợn bao gồm cả hai liên kết α-2-3 và α-2-6,
nên lợn có thể đóng vai trò làm vật chủ, cùng bị xâm nhiễm bởi các virus khác
nhau, là nơi xảy ra trao đổi vật chất di truyền của các virus; từ đó hình thành nên
các chủng virus mới. Biểu mô ống hô hấp của người có cả hai loại liên kết α-2-3 và
α-2-6 khiến con người cũng có nguy cơ
nhiễm virus cúm gia cầm. Cho tới nay các
bằng chứng về sự lây truyền từ động vật có vú sang người vẫn chưa đầy đủ[65].
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
8
Nghiên cứu virus cúm trong đợt dịch năm 1997 cho phép khẳng định rằng
virus cúm gia cầm H5N1 có thể truyền trực tiếp từ gia cầm sang người mà không
qua một vật chủ trung gian nào. Trong đợt dịch năm 1997, tại Hồng Kông đã có 18
ca được xác định là nhiễm virus H5N1, 6 người đã tử vong. Tháng 5 năm 1997, một
bé trai 3 tuổi chết do nhiễm virus H5N1, virus này được xác định là có nguồn gốc từ
gà nuôi đã chết hàng loạt vài ngày trước khi cậu bé có triệu chứng số
t[31]. Nghiên
cứu bởi Mount và cộng sự cho thấy có sự liên quan giữa việc tiếp xúc với gia cầm
bị bệnh trong vòng một tuần và khởi phát bệnh trên người tiếp xúc sau đó[26]. Điều

tra này cũng cho thấy nguy cơ nhiễm virus H5N1 do ăn hoặc chế biến thực phẩm từ
gia cầm cũng như do tiếp xúc với người nhiễm virus H5N1 là rất thấp, trong đó việc
tiếp xúc và làm thịt gia cầm bệ
nh có thể liên quan đến mẫu huyết thanh dương tính
với virus H5N1[26]. Cũng trong thời gian này, Kazt cùng cộng sự đã tiến hành
nghiên cứu huyết thanh học của những người tiếp xúc với gia cầm. Kết quả thu
được là trong 51 người chăn nuôi gia cầm có 6 người (12%) có huyết thanh dương
tính, trong nhóm 26 người là khách du lịch qua vùng dịch có 1 người (4%) huyết
thanh có KT kháng virus[5]. Như vậy, trong các trường hợp nhiễm virus H5N1,
mặc dù không phải là những người làm nghề giết mổ gia cầ
m song phần lớn các
bệnh nhân đều có tiền sử tiếp xúc trực tiếp với gia cầm, cụ thể như vặt lông, tiêu
huỷ gia cầm bệnh, chơi chọi gà, ăn tiết canh hoặc thịt gia cầm chưa nấu chín[5].
Tuy nhiên, Liêm cùng cộng sự (2004) đã nghiên cứu tình trạng nhiễm virus cúm
H5N1 ở 51 người chăn nuôi và 25 người có tiếp xúc với gia cầm bệnh, các mẫu
huyết thanh kiểm tra đều âm tính với virus H5N1[5, 27].
Sự lây truy
ền từ người sang người: kết quả của các điều tra huyết thanh và
virus học qua các vụ dịch đã đưa ra những kết luận khác nhau về khả năng lây
nhiễm từ người sang người của virus H5N1. Trong đó, các trường hợp nhiều bệnh
nhân nhiễm virus H5N1 là người trong cùng gia đình đã được phát hiện[59]. Trong
đó có trường hợp một bé gái 11 tuổi ở Thái Lan có thể đã lây truyền virus H5N1
sang mẹ và người họ hàng, những người này đã có nh
ững triệu chứng khởi phát sau
3 và 7 ngày tiếp xúc với bé gái, thời gian tiếp xúc lần lượt là 16-18 giờ và 12–13
giờ[59]. Bé gái đã có những biểu hiện ngày càng nặng hơn như suy hô hấp, giảm
oxi huyết, suy giảm chức năng thuỳ não phải, số lượng tế bào bạch cầu, bạch cầu
trong máu giảm và có biểu hiện sốc. Bé gái này đã tử vong sau 6 ngày kể từ khi có
các triệu chứng khởi phát. Mẹ của bé gái cũng có nh
ững triệu chứng tương tự và tử

vong sau 13 ngày kể từ lần tiếp xúc đầu tiên. Người họ hàng của bé gái được đưa
vào bệnh viện sau 12 ngày kể từ khi tiếp xúc và xuất viện sau 18 ngày điều trị với
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
9
oseltamivir. Bằng kĩ thuật RT-PCR, virus H5N1 ở cả người mẹ và người họ hàng
của bé gái được xác định là giống nhau. Việc tiếp xúc gần gũi mà không sử dụng
biện pháp bảo vệ có thể là lý do chính dẫn đến sự lây truyền này[59]. Năm 2004,
một trường hợp y tá bị bệnh nặng sau khi tiếp xúc với bệnh nhân đã được ghi nhận
tại Việt Nam[5, 27]. Năm 2006, bảy người trong một gia đình ở Indonesia
đã bị
nhiễm virus, sáu người đã tử vong, sự việc này gây lo ngại về việc virus H5N1 có
thể đã biến đổi và có khả năng lây từ người sang người[5, 59]. Việc phân biệt
những người trong cùng gia đình lây nhiễm cho nhau hay bị lây từ cùng một nguồn
gia cầm nhiễm bệnh là rất khó khăn. Gần đây, giám sát những người tiếp xúc với
bệnh nhân bằng xét nghiệm phản ứng RT-PCR đã ghi nhận m
ột số trường hợp có
biểu hiện nhẹ, khả năng nhiễm virus tăng lên theo độ tuổi của những người tiếp xúc,
đồng thời số lượng và thời gian nhiễm của các nhóm bệnh nhân trong cùng gia đình
ở miền bắc Việt Nam cũng tăng lên, kết quả này cho thấy các chủng virus địa
phương có lẽ đã thích nghi với người[5, 63].
Tuy nhiên, khi xét nghiệm huyết thanh của các nhân viên y tế tiếp xúc với
bệ
nh nhân, Katz và cộng sự không tìm thấy KT đặc hiệu H5N1, điều này gợi ý rằng
sự lây truyền từ người sang người khó xảy ra chỉ qua tiếp xúc thông thường[21].
Một số điều tra huyết thanh học ở Việt Nam và Thái Lan cũng chưa tìm thấy bằng
chứng của việc nhiễm virus cúm gia cầm ở người có tiếp xúc với người bệnh[5, 27].
Apisarthanarak (2005) đã nghiên cứu dấu hiệu của sự lây nhiễm virus trên 89 nhân
viên y tế, song tất cả các mẫu huyết thanh đều âm tính với KT kháng virus
H5N1[5]. Đến nay, nguy cơ lây truyền sang nhân viên y tế là khá thấp, ngay cả khi

không sử dụng biện pháp cách ly thích hợp[5, 27]. Khả năng lây nhiễm từ người
sang người của virus cúm H5N1 vẫn là một vấn đề gây nhiều tranh luận, cần tiếp
tục nghiên cứu để có kết luận chính xác.
1.2 Virus cúm A
1.2.1 Phân loại
Virus cúm gia cầm H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae bao gồm các virus có
genome RNA đơn, phân đoạn, âm tính. Dựa trên sự khác biệt KN giữa protein
nucleocapsid (NP) và matrix (M), họ Orthomyxoviridae được chia thành 5 chi:
- Virus cúm A
- Virus thogoto
- Virus cúm B
- Virus isa
- Virus cúm C

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
10
Trong 5 chi nêu trên, virus cúm A có độc lực cao nhất, thường gây ra những
vụ dịch lớn trên thế giới, virus cúm A được phân lập ở người, các động vật như lợn,
ngựa, hải cẩu, cá voi, vịt và gà[39]. Virus cúm B và virus cúm C chủ yếu được phân
lập từ người. Genome của virus cúm C gồm 7 phân đoạn RNA và chỉ có một
glycoprotein đơn có ba hoạt tính hemaglutinin, esterase và dung hợp, virus cúm C
không có KN nào chung với cúm A và B, virus cúm C thường nhiễm ở trẻ em song
không gây bệnh nguy hiểm. Chi virus thogoto gồm virus dhori được phân lập t
ừ bọ
ve (Hyalomma sp.), xâm nhiễm ở người, gây sốt và viêm não, genome có 6 phân
đoạn và virus thogoto được phân lập từ bọ ve Boophilis sp., gây nhiễm ở người, gia
súc. Virus isa được phân lập từ cá hồi (Salmo salar), chỉ gây bệnh cho cá hồi [20].
Chi virus cúm A chỉ bao gồm type cúm A, type này tiếp tục được phân chia
thành các subtype khác nhau dựa trên sự khác biệt KN giữa các protein

hemaglutinin (HA) và neuraminidase (NA) (ví dụ như các subtype: H5N1, H1N1,
H3N2 …). Virus H5N1 được chia làm các genotype dựa trên phân tích sự phát sinh
loài của cả 8 gen và so sánh với các chủng tham khảo. Virus H5N1 còn được chia
thành các clade dựa vào sự
khác nhau về trình tự gen HA. Hiện nay, virus H5N1 tại
Việt Nam bao gồm clade 2 ở miền Nam và clade 2.3 ở miền Bắc[48].
1.2.2 Danh pháp
Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) quy định cách viết dành cho virus cúm gồm:
- Type virus (A, B, C)
- Vật chủ phân lập được virus (nếu virus được phân lập trên động vật)
- Địa điểm phân lập
- Số chủng
- Năm phân lập
- Ký hiệu thụ thể H và N
Ví dụ: Chủng virus A/Vietnam/2004/H5N1 là chủng virus cúm H5N1 phân
lập được trên người, tại Việt Nam năm 2004.
1.2.3 Đặc điểm cấu tạo virus cúm
Cấu trúc virion của virus cúm
: các virion có vỏ đa hình thái, thường có hình
cầu hoặc đa diện, đường kính từ 80-120 nm; đôi khi chúng có dạng sợi nhỏ dài tới
vài μm[36]. Các virion gồm vỏ ngoài, protein nền M, phức hợp nucleoprotein,
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
11
nucleocapsid và phức hợp polymerase (hình 1.4). Trong đó, nucleocapsid được bao
quanh bằng màng protein nền (M1), phía ngoài tiếp tục được bọc bởi vỏ ngoài là
lớp lipit kép có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào vật chủ. Một lượng nhỏ
protein nền (M2) nằm xuyên qua và nhô ra khỏi vỏ ngoài, tạo thành kênh ion. Bề
mặt virus có khoảng 500 gai có bản chất là glycoprotein nhô ra ngoài, các gai này
có kích thước từ 10 tới 14 nm, và được phân chia thành hai loại là hemagglutinin

(HA) và neuraminidase (NA), hai loại gai này có tỉ lệ tương ứng HA/NA là từ 4/1
tới 5/1. Dự
a trên tính KN của chúng, gai HA được chia thành 16 loại khác nhau và
gai NA được chia thành 9 loại khác nhau. Các gai nêu trên gắn với lớp lipit kép có
nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào chủ qua các trình tự ngắn các amino acid
(AA) kị nước[36].








Hình 1.4. Cấu trúc điển hình của virion cúm A
[18]
Genome của virus cúm A
: virus cúm A có genome gồm 8 phân đoạn RNA
mạch đơn (ssRNA) mã hóa cho 10 protein khác nhau, cụ thể là:
- Phân đoạn 1 mã hóa cho PB2 (2.320 nucleotide);
- Phân đoạn 2 mã hóa cho PB1(2.320 nucleotide);
- Phân đoạn 3 mã hóa cho PA (2.211 nucleotide);
- Phân đoạn 4 mã hóa cho HA (1.757 nucleotide);
- Phân đoạn 5 mã hóa cho NP (1.540 nucleotide);
- Phân đoạn 6 mã hóa cho NA (1.392 nucleotide);
- Phân đoạn 7 mã hóa cho M1 và M2 (1.005 và 315 nucleotide);
- Phân đoạn 8 mã hóa cho NS1 và NS2 (868 và 395 nucleotide);
Lớp lipit kép
NA (Neuraminidase)
HA (Hemaglutinin)

M
2
(Kênh ion)
M
1
(protein nền)
NS
1
(protein không cấu
trúc, xâm nhiễm t
ế bào)
NP (protein nucleocapsit)
PB
1
, PB
2
, PA (phức hợp
polymeraza)
NS
2

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
12
Protein Hemagglutinin (HA) của virus cúm A: tên gọi hemagglutinin là do
phân tử này có khả năng gây ngưng kết hồng cầu khi gắn với các thụ thể đặc hiệu
có chứa sialic acid trên hồng cầu. HA gắn với các thụ thể trên bề mặt tế bào giúp
virus bám vào tế bào và đóng vai trò trung gian trong quá trình dung hợp màng của
virus với màng sinh chất của tế bào, đưa nucleocapsid vào trong tế bào chất[36].
HA là một trong hai KN chính của virus cúm mà cơ thể nhận biết được, từ đó sản

sinh ra các KT kháng virus, sự hình thành các chủng virus cúm A v
ới gen HA mới
trong quần thể không có khả năng miễn dịch với HA đó sẽ dẫn tới nguy cơ bùng
phát dịch khi virus lan truyền nhanh chóng giữa các cá thể trong quần thể[25].
HA được mã hoá bởi phân đoạn số 4 có từ 1.742 tới 1.778 nucleotide của
virus cúm A, có từ 563 tới 566 AA[36]. HA có chiều dài khoảng 10nm, gồm 3 tiểu
đơn vị glycoprotein giống nhau tạo thành dạng homotrimer, giữa các tiểu đơn vị
không có liên kết cộng hoá trị. Mỗi chuỗi polypeptide c
ủa HA bao gồm một vùng
ngoài màng, trên đó có gắn các chuỗi oligosaccharide, một vùng xuyên màng và
một đuôi cytoplasmic nằm trong tế bào chất[29]. Protein HA có thể tồn tại ở dạng
nguyên toàn phần (HA
0
) hoặc dạng bị phân cắt bao gồm 2 chuỗi polypeptide HA1
và HA2 có khối lượng phân tử lần lượt là 47.000Dalton và 29.000Dalton được nối
với nhau bằng cầu nối disulfur. Vị trí cắt giữa hai chuỗi có vai trò quan trọng đối
với quá trình xâm nhiễm cũng như khả năng gây bệnh của virus cúm A[36]. Sự lây
nhiễm virus cúm gia cầm có HA là H5 hoặc H7 có khả năng gây chết cao ở chim
sáo và gia cầm. Mức độ độc của virus H5 và H7 khác nhau tuỳ thuộc vào phân tử
HA c
ủa các subtype virus cúm A khác nhau và đoạn chứa các AA kiềm tính tại đầu
cuối carboxyl của HA1. Điều này cho phép các furin (protease của tế bào) nhận biết
được các AA kiềm tính để cắt phân tử HA và hạn chế sự xâm nhiễm của virus cũng
như sự lây truyền virus invitro và in vivo. Số AA kiềm tính có thể là từ 4 đến 6 AA
và khả năng bị cắt tuỳ thuộc vào sự có mặt của chuỗi oligosaccharide liền kề của
phân tử HA. Vị trí cắt của phân tử HA bởi furin có thể là X-X-R-X-R/K-R (X là các
AA không kiềm tính, R là arginine; K là lysin) hoặc R/K-X-R/K-R. Enzyme cắt
phân tử HA là furin – một protease trong mạng lưới Golgi.
Mặc dù độc tính của virus là một đặc điểm do nhiều gen quy định, song HA
có vai trò rất quan trọng đối với đặc điểm này. Vị trí cắt của phân tử HA thành HA1

và HA2 của virus cúm là yếu tố quyết định đối với sự lây nhiễm của virus. Bằng
việc sử d
ụng phương pháp điện di 2 chiều, Bosch và cộng sự đã xác định được mối
liên hệ giữa khả năng phân cắt phân tử HA và sự có mặt của các AA kiềm tính tại vị
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
13
trí cắt. Mặc dù chiều dài của đoạn peptit nối giữa HA1 và HA2 của H5 và H7 khác
nhau, song các virus này đều chứa ít nhất hai cặp AA kiềm tính tại vị trí cắt, trong
khi vị trí này của các chủng LPAI không có arginine nào[24]. Yoshihiro đã tiến
hành gây đột biến điểm tại những vị trí xác định trên phân tử HA của virus
A/Turkey/Ireland/ 1378/83 (H5N8)[22]. Kết quả thu được cho thấy arginine ở vị trí
số 4 tính từ đầu cuối carboxyl có vai trò đặc biệt quan trọng, trong khi đó vai trò của
lysin ở vị trí số 3 lại không quan trọng lắm, lysin chỉ có vai trò giúp cho việc cắt dễ
dàng hơn. Ngoài chuỗi peptit liên kết, thành phần cấu trúc khác của HA cũng cần
thiết để cho việc nhận biết của enzyme cắt[22].
Protein Neuraminidase (NA) của virus cúm A
: cùng với HA, NA là
glycoprotein quyết định KN chính thứ hai của virus cúm A. NA nằm xen với các
HA trên bề mặt virus và có vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi KN hình
thành nên chủng mới. NA có dạng hình nấm, homotetramer do 4 tiểu đơn vị dạng
hình cầu nối với nhau[36]. NA gồm một vùng kị nước nằm xuyên qua lớp lipit kép
gần đầu tận cùng N của chuỗi (từ AA thứ 7 tới 35), có vai trò như một tín hiệu kết
nối liên tục và là vùng giúp NA gắn chặt, ổn định trên b
ề mặt màng. NA được mã
hoá bởi phân đoạn thứ 6 có khoảng 1400 nucleotide, mã hoá cho 450 AA[36].
Cho tới nay, vai trò của NA trong chu trình sống của virus vẫn chưa được
biết rõ. Một số giả thiết cho rằng NA có vai trò loại bỏ sialic acid khỏi glycoprotein,
cụ thể là NA xúc tác cho phản ứng cắt liên kết α-ketosilic giữa sialic acid đầu cuối
và D-galactose hoặc D-galactosamine liền kề[43]. NA cũng giúp virus vượt qua lớp

nhày trong ống hô hấp, để tiếp xúc được với tế bào bi
ểu mô[2]. Ngoài ra, có nhiều
bằng chứng về vai trò của NA trong việc xác định vật chủ và thích ứng với môi
trường mới của virus cúm, do vậy NA có cũng tham gia vào việc lây truyền của
virus giữa các loài vật chủ khác nhau[53].
Protein polymerase (PB)
: bao gồm 757 AA, được mã hoá bởi phân đoạn 2
trong genome của virus. BP1 có khối lượng phân tử khoảng 86.500Dalton và là một
endonuclease trong phức hợp transcriptase, với vai trò là một protein gắn mũ[1, 36].
Trong khi đó, BP2 gồm 759 AA, được mã hoá bởi phân đoạn 1 trong genome. BP2
có khối lượng phân tử khoảng 85.700Dalton, nằm bên trong hạt virion và là
polymerase khởi đầu phiên mã trong phức hợp transcriptase[1, 36].
Protein polymerase (PA)
: có nhiệm vụ kéo dài phiên mã trong phức hợp
transcriptase, được mã hoá bởi phân đoạn 3 trong genome của virus. Protein bao
gồm 716 AA và có khối lượng phân tử khoảng 84.200Dalton[1, 36].
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
14
Protein nucleocapsid (NP): là protein cấu trúc dưới đơn vị nucleocapsid và
được mã hoá bởi phân đoạn 5 trong genome của virus. Protein bao gồm 498 AA và
có khối lượng phân tử khoảng 56.100Dalton[1].
Protein matrix (M)
: bao gồm M1 và M2, cùng được mã hoá bởi phân đoạn 7
trong genome của virus. Trong đó, M1 nằm dưới lớp lipit kép vỏ ngoài, gồm 252
AA với khối lượng phân tử 27.800Dalton và là thành phần cấu trúc chính, tham gia
vào quá trình lắp ráp, nảy chồi của virus. M2 gồm 97 AA, có khối lượng phân tử
11.000Dalton, M2 là protein không cấu trúc, là các kênh ion. M2 thay đổi pH trong
endosome bị phong bế bởi amatadin-là một thành phần trong các thuốc điều trị
virus hiện nay[36].

Protein không cấu trúc (NS)
: gồm NS1 và NS2 được mã hoá bởi phân đoạn 8
của genome virus. Trong đó, NS1 gồm 230 AA, khối lượng phân tử khoảng
26.815Dalton, ức chế vận chuyển mRNA và phân cắt. NS2 gồm 121 AA, khối
lượng phân tử 14.216Dalton, giúp đưa ribonucleoprotein ra ngoài nhân[1].
1.2.4 Các subtype hiện nay của virus cúm
Các subtype khác nhau của virus cúm A đã được tìm thấy trên nhiều loài vật
chủ. Cụ thể là, các subtype virus cúm đã tìm thấy trên người gồm: H1N1, H2N2,
H3N2, H5N1, H9N2, H7N1 và H7N7. Các subtype lây nhiễm ở gia cầm và chim
gồm: các subtype có chứa H4, H5, H7, H9, H10; N1, N2, N4, N7 như H5N1, H7N7
và H9N2. Các subtype: H7N7, H4N8, H10N4, H1N1, H1N2, H3N2, H4N6, H13N5
đ
ã được tìm thấy ở các loài thú như lợn, ngựa, cá voi và chồn[53].
1.2.5 Sự xâm nhập và sao chép của virus cúm trong tế bào chủ
Quá trình xâm nhập, sao chép của virus cúm trong tế bào chủ gồm các bước:
hấp phụ, xâm nhập và “cởi áo”, tổng hợp các thành phần, lắp ghép và phóng thích.
Hấp phụ
: virus cúm gắn với sialic acid trên glycoprotein của bề mặt tế bào
qua vị trí gắn thụ thể tại đầu cùng của gai HA. Virus cúm có mức độ đặc hiệu khác
nhau đối với sialic acid, acid này được gắn với galactose bằng liên kết α-2,3 hoặc
α-2,6 tùy thuộc vào các vị trí đặc hiệu trên phân tử HA[36]. Độ đặc hiệu của HA
với sialic acid qua liên kết α-2,3 hoặc α-2,6 với galactose quyết định sự lây truyền
giữa các loài khi không có đột bi
ến tại vị trí gắn với sialic acid của HA[36, 53].
Xâm nhập và “cởi áo”
: virus xâm nhập vào trong tế bào qua quá trình nội
thực bào có các thụ thể đặc hiệu làm trung gian[36]. Qua quá trình nội thực bào, các
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
15

RNA genom
chuỗi đơn (-)
RNA (+) đối
genom
mRNA virut
Protein capsit
và RdRp
Protein cấu trúc
và không cấu trúc
Virut mới
1
5
8
2
6
3
7
4
thành phần trung gian được hoà lẫn vào nhau tại điểm nhô ra trên màng tế bào,
điểm này được tạo thành nhờ việc lồng vào nhau của các vùng che phủ đặc hiệu.
Sau khi được hoà lẫn, phần nhô ra sẽ được dung hợp với thể nhân, bắt đầu bằng
việc thể nhân này chở nên acid do H+-ATPase gây ra. Quá trình “cởi áo” của các
virion cúm phụ thuộc vào pH acid của thể nhân này và các thể mang ion carboxilic
làm pH của thể nhân tăng lên sẽ ngăn cản quá trình “cởi áo” của virus cúm. Tuy
nhiên, các thành phầ
n nêu trên không có tác dụng chống virus đặc hiệu, chúng chỉ
làm tăng pH trong thể nhân, do đó ngăn cản quá trình xâm nhập của virus vào tế
bào qua con đường nội thực bào. Ngoài ra, nhiều thí nghiệm đã chứng minh được
rằng quá trình cởi áo của virus cần có sự tham gia của M2 với vai trò là kênh dẫn

ion[36]. Virion xâm nhập vào tế bào qua quá trình nội thực bào có các thụ thể trung
gian. Bơm proton ATP trong bọng làm giảm pH xuống khoảng 5 (pH acid). Sự thay
đổi pH khiến phần kị nước sắp xế
p lại, tạo điều kiện để màng virus dung hợp với
màng bọng, nhờ đó nucleocapsid được giải phóng vào tế bào chất[1].
Tổng hợp các thành phần của virus
:







Hình 1.5. Sơ đồ tổng hợp RNA và protein trong quá trình nhân lên của virus cúm A
Sau khi xâm nhập và “cởi áo” (bước 1, hình 1.5), RNA genome virus tiến
hành phiên mã để tạo mRNA với sự xúc tác của RNA polymerase phụ thuộc RNA
liên kết virion, tế bào không có enzyme này, tuy nhiên, enzyme này không thể tự
khởi động quá trình phiên mã được, chúng phải sử dụng tới sản phẩm của quá trình
phiên mã do RNA polymerase II xúc tác để làm đoạn mồi cho quá trình tổng hợp
mRNA, các đoạn mồi được tạo thành do enzyme endonuclease (thực chất là
polymerase của virus) cắt phân tử RNA từ đầu 5’ tại các purin để tạo thành các
đ
oạn có chiều dài từ 10-13 nucleotide (bước 2, hình 1.5). Các phân tử mRNA tạo
RNA (+) đối
genome
RNA genome
chuỗi đơn (+)
Protein capsid
và RdRp

mRNA virus
Virus mới
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
16
thành sẽ được sử dụng để tổng hợp protein cấu trúc và protein không cấu trúc.
Trong giai đoạn đầu, các protein được tổng hợp chủ yếu là NS và NP do chúng cần
thiết cho quá trình tổng hợp RNA của virus, còn M thì không được tổng hợp do
chúng ức chế phiên mã từ RNA genome thành mRNA và vận chuyển RNA genome
từ nhân ra ngoài tế bào chất. Sau đó, khi quá trình tổng hợp mRNA đạt mức cao
nhất và bắt đầu giảm dần thì lượng protein M, HA và các protein cấu trúc được tổng
h
ợp tăng dần (bước 3, hình 1.5). Để tổng hợp RNA genome từ mRNA, virus cần
trải qua bước tạo RNA chuỗi dương (bước 4, hình 1.5). Sau đó, RNA chuỗi dương
được dùng làm khuôn để tổng hợp RNA genome âm (bước 5, hình 1.5). Một phần
RNA genome được dùng để tiến hành phiên mã tạo ra một lượng lớn mRNA dùng
cho quá trình tổng hợp protein (bước 7, hình 1.5), một phần dùng để lắp ráp với
protein để tạo virus mới (bước 8, hình 1.5)[1, 36].
Lắp ghép và phóng thích
: sau khi được tổng hợp trên mạng lưới nội chất, HA
và NA được chuyển tới vị trí xác định trên màng sinh chất, M cũng di chuyển tới
màng và liên kết với màng nhờ HA và NA. Ribonucleoprotein và RNA-polymerase
cũng di chuyển từ nhân tới màng sinh chất. RNA-polymerase, HA, NA và M được
lắp ghép với nhau và ra khỏi tế bào theo lối nảy chồi với sự tham gia của enzyme
neuraminidase[36].
1.2.6 Cơ chế hình thành chủng mới
Virus cúm đã nhiều lần thay đổi KN gây ra các đại dịch ở
người cũng như ở
động vật, cụ thể là lần thay đổi của virus cúm H1N1 được ghi nhận gây hậu quả
nghiêm trọng nhất vào năm 1918 làm chết 40-60 triệu người[32]. Các vụ dịch do

virus cúm H2N2 và H3N2 lần lượt trong các năm 1957 và 1968 do sự tái tổ hợp của
chủng virus cúm ở người và chủng virus cúm gia cầm[46]. Những thay đổi của AA
ở virus H1N1 từ năm 1918 cũng được tìm thấy trên các chủng virus HPAI (H5N1
và H7N7), những thay đổi này tham gia vào quá trình nhân lên và gây bệ
nh của
virus[55]. Các chủng virus cúm mới được hình thành qua việc tích lũy thay đổi KN
của virus cụ thể là HA và NA. Thay đổi KN của virus xảy ra theo hai cơ chế: thay
đổi lớn KN (sắp xếp lại gen) và thay đổi nhỏ KN (đột biến điểm)[29].
Sự thay đổi lớn của kháng nguyên (antigenic shift)
: sự trao đổi vật chất di
truyền giữa hai virus cúm A được quan sát lần đầu tiên năm 1949 trong thí nghiệm
nghiên cứu tác dụng của virus với não chuột[36]. Khi có hai hay nhiều chủng virus
với các đoạn RNA khác nhau cùng xâm nhiễm vào một tế bào chủ, các chủng virus
này có thể trao đổi các đoạn gen với nhau và tạo ra chủng virus mới có KN thay đổi.
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
17
Đáp ứng miễn dịch của cơ thể không thể nhận biết được chủng virus mới hình
thành. Do vậy, chủng virus mới này có thể xâm nhiễm vào vật chủ mà các chủng
khi chưa hoán vị không thể gây nhiễm được. Sự thay đổi KN là nguyên nhân gây ra
các vụ dịch cúm lớn. Thực tế, HA, NA và PB1 của chủng A/HongKong/68 H3N2
và H5N1 được xác định là có nguồn gốc và đã được biến đổi từ chủng cúm gia cầm
A/equine/Miami/63 H3N8[1, 36]. Theo lý thuyết thì với 8 phân
đoạn của genome,
có thể xảy ra 256 khả năng sắp xếp lại các phân đoạn, tuy nhiên thực tế hoàn toàn
không xảy ra sự tái sắp xếp ngẫu nhiên do protein của virus cần kết hợp với các
protein đặc hiệu có mối quan hệ gần gũi[36].
Sự thay đổi nhỏ kháng nguyên (antigenic drift)
: sự thay đổi KN ở mức độ
thấp do đột biến ngẫu nhiên như thêm, mất, chèn điểm hoặc đoạn xảy ra ở gen mã

hoá cho HA dẫn tới sự thay đổi AA hoặc trình tự AA của protein HA. Do các RNA
polymerase không có khả năng sửa chữa như DNA polymerase, nên xác suất xảy ra
đột biến trong quá trình sao chép của virus cúm rất cao (10-4 base) so với của DNA
polymerase (10-9 base) [1, 53]. Theo ước tính, xác suất đột biến trung bình tại mỗi
AA của HA là 6,7.10
-3
một năm và xác suất đột biến qua mỗi chu kỳ xâm nhiễm tại
mỗi nucleotide là 1,5.10
-5
[53]. Chủng virus đột biến được chọn lọc và giữ lại trong
quần thể do chúng có khả năng xâm nhiễm vào vật chủ mới. Các đột biến được tích
luỹ gây khó khăn cho việc phòng dịch bằng vaccine. Sự thay đổi nhỏ KN gây ra các
vụ dịch nhỏ, tản phát[1, 53]. Sự hình thành chủng virus H5N1 từ năm 1997 tới năm
2005 trải qua bước tái tổ hợp vật chất di truyền giữa virus giống chủng
A/Goose/Guangdong/1/96 H5N1 và các virus H9N2, H6N1 ở
chim cút[25]. Gen
NA của virus bị mất đoạn giúp virus có khả năng xâm nhiễm vào các loài gia cầm
trên cạn như gà, chim cút. Từ năm 2000, nhiều lần tái tổ hợp vật chất di truyền của
virus đã được phát hiện ở vịt, gà và các loài gia cầm khác với HA có nguồn gốc từ
virus giống chủng A/Goose/Guandong/1/96, nhưng với các phân đoạn gen bên
trong có nguồn gốc từ các virus cúm của chim[33]. Nhiều genotype đã được xác
định trong năm 2001-2002, tới nă
m 2003, genotype Z trở nên chiếm ưu thế ở gia
cầm cạn tại Trung Quốc (Hình 1.6). Genotype Z đã thu nhận gen NA bị mất đoạn
nêu trên và có thể lây nhiễm trên gia cầm sống trên cạn. Virus H5N1 HPAI đã được
phát hiện tại Trung Quốc (1999), Việt Nam (2001) cho thấy rằng virus này tiếp tục
lây nhiễm ở vịt và ngỗng[33]. Từ tháng 12 năm 2003, Nhật Bản và Hàn Quốc đã
ghi nhận dịch bùng phát do virus genotype V, tuy nhiên genotype Z vẫn phổ biến
nhất. Sự
tiến hoá được minh hoạ bằng hình 1.6[33].

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
18

Hình 1.6: Sự sắp xếp lại và hình
thành virus cúm A H5N1 ở châu Á từ
năm 1999 tới 2005. Tám phân đoạn
gen (các thanh ngang) bắt đầu từ trên
xuống là PB2, PB1, PA, HA, NP,
NA, M, và NS. Mỗi màu thể hiện một
dòng. Màu đỏ là chủng giống
A/Goose/Guangong/1/96. Các
genotype khác nhau được thể hiện
bằng các chữ cái[33].
1.2.7 Bệnh học nhiễm virus
H5N1 ở người
Sau phơi nhiễm, thời gian ủ
bệnh khoảng 3 ngày. Lúc đầu,
bệnh nhân có triệu chứng như sốt
cao, khó chịu, toàn thân ê ẩm, ho,
sổ mũi, nhức đầu, tiến tới khó thở,
nghẹt thở, rối loạn thính giác và
thị giác[1]. Bệnh nhân nhiễm virus
cúm A thường tự phục hồi trong 1
tuần. Tuy nhiên, các bệnh nhân
nhiễm virus cúm H5N1 có các biểu hiện bệnh nghiêm trọ
ng như suy yếu nhanh, dễ
dẫn tới tử vong[10]. Bệnh nhân còn có các triệu chứng khác như tiêu chảy, nôn, đau
bụng, đau ngực, chảy máu mũi và có thể có biểu hiện của viêm não cấp[10]. Triệu
chứng đặc trưng khi nhiễm virus H5N1 là tiêu chảy và suy hô hấp[58]. Một số chức

năng sinh hoá cơ thể bất thường: lượng tế bào lympho và tiểu cầu giảm,
aminotransferase hoạt động tăng, tình trạng đông tụ
tại các điểm trong hệ mạch[36].
1.2.8 Các biện pháp phòng ngừa và điều trị nhiễm virus H5N1
Các biện pháp chủ yếu được áp dụng bao gồm: kiểm soát lây nhiễm, phòng
bệnh bằng tiêm vaccine và sử dụng thuốc kháng virus[25].
Sử dụng thuốc kháng virus
: Điều trị bằng cách sử dụng thuốc kháng virus,
các loại thuốc này thường hoạt động theo một trong hai cơ chế: là thành phần ức
chế kênh ion của M2 (amantadine), hoặc ức chế neuraminidase (oseltamivir)[28].
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nguyễn Hòa Bình
19
Kiểm soát lây nhiễm: Loại bỏ hoặc hạn chế tối đa nguồn gây nhiễm như gia
cầm nhiễm bệnh là biện pháp phòng ngừa, kiểm soát dịch hiệu quả nhất. Tiêu huỷ
gia cầm nhiễm bệnh là biện pháp thành công trong các đợt dịch tại Hồng Kông, Hà
Lan và Canada[8]. Tuy nhiên, khi dịch bùng phát trên một khu vực rộng (Đông
Nam Á), gia cầm được nuôi nhỏ lẻ, virus H5N1 là từ các loài chim di cư hoang dã
thì chỉ tiêu huỷ tại khu vực bùng phát dịch sẽ đem l
ại hiệu quả không cao[25, 28].
Sử dụng vaccine
: Hiện đã có rất nhiều cách tiếp cần khác nhau trong sản xuất
vaccine virus cúm gia cầm như: sản xuất vaccine bất hoạt từ virus kiểu hoang dại;
chọn lựa các chủng virus vaccine tương tự về khả năng tạo KT; sử dụng virus côn
trùng để biểu hiện HA tái tổ hợp; vaccine DNA, plasmid phiên mã ngược để tạo
chủng vaccine có các thành phần được làm yếu[50]. Vaccine phổ biến hiện nay là:
+ Vaccine bất hoạt: chủng virus để sả
n xuất vaccine bất hoạt phải có tính KN
giống với virus đang lưu hành và phát triển tốt trên phôi trứng. Từ vụ dịch tại Hồng
Kông (1997), chủng virus LPAI A/duck/Singapore/F119–3/97(H5N3) đã được lựa

chọn trong nghiên cứu sản xuất vaccine virus cúm H5N1 cho người[54].
+ Vaccine sống: virus sống được làm yếu nhờ nhiệt độ lạnh và phun qua
mũi. Vaccine này gồm các virus tái tổ hợp chứa gen mã hoá cho HA và NA của
chủng hoang dại, 6 gen còn lại là của chủng virus hoang dại đã bị bi
ến tính. Vaccine
này có điều kiện gây nhiễm giống trong tự nhiên và gây phản ứng miễn dịch chéo
do kích thích tạo KT S-IgA, IgG và CTL[47].
+ Vaccine DNA: khi tiêm vaccine plasmid DNA mã hóa cho protein virus
(NP, PR8 H1N1) cho chuột đã tạo khả năng miễn dịch chống virus cúm H3N2.
Điều này cho thấy, vaccine DNA có thể gây phản ứng bảo vệ chéo giữa các
subtype. Hiệu quả của vaccine DNA mã hóa cho HA, NA cao hơn của NP[47].
+ Vaccine phiên mã ngược: hệ thống phiên mã ngược được sử dụng để tạo
chủng virus cúm vaccine và rất hữu hi
ệu trong phòng ngừa các đại dịch cúm. Các
gen HA và NA từ virus gây bệnh được nhân dòng, trình tự vị trí cắt chứa các AA
kiềm tính của HA được loại bỏ. Plasmid được chuyển vào tế bào cùng plasmid mã
hóa các gen khác của chủng A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) để tạo virus vaccine[50].
1.3 Đáp ứng miễn dịch chống virus cúm
Tỉ lệ nhiễm virus H5N1 thấp ở người cả trong điều kiện tiếp xúc với gia cầm
nhiễm bệnh cho thấy việc ngăn ngừa lây nhiễm giữa các loài rất hiệu quả[5]. Virus