Định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của flavonoid trong lá lốt

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
CAO TIẾN DŨNG
ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẢM DÒ MỘT s ố TÁC
DỤNG SINH HỌC CỦA FLAVONOID TRONG LÁ LỐT
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1999-2004)
-Người hướng dẫn: TS Vũ Văn Điền
Dược sĩ Lê Quốc Hùng
-Nơi thực hiện:Bộ môn Dược học cổ truyền
-Thời gian thực hiện:9/2003-5/2004
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình làm khtìá luận tốt nghiệp, em đã nhận được sự 'hướng dẫn
chỉ bảo tận tình của các thầy cô. Với lỏng biết ơn sâu sắc, em xin trân trọng
gửi lời cảm ơn tới: TsVũVăn Điền
Dược sĩ Lê Quốc Hùng
Đã giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian qua.
Em cũng xin chân thành cảm ơn, các thầy cô trong bộ môn Dược học cổ
truyền, bộ môn Dược lý và các phòng ban, gia đình và bạn bè đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi để em hoàn thành đề tài này.
Hà nội, tháng 5 năm 2004
Sinh viên
Cao Tiến Dũng
MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn đề 7
Phần 1-tổng quan 8
1. lĐặc điểm thực vật phân bố
8
1.2Đặc điểm cấu tạo giải phẫu 8
1.3 Trồng trọt, thu hái và chế biến 9
1.4 Thành phần hoá học 9

1.5 Tác dụng dược lý 10
1.6 Công năng chủ trị 11
1.7 Một số bài thuốc có vị Lá lốt được dùng trong điều tr ị

11
Phần 2-Thực nghiệm và kết quả 12
2.1-Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm 12
2.1. lNguyên liệu 12
2.12.Phương pháp thực nghiệm 13
a. Định tính flavonoid 13
b. Định lượng flavonoid 13
c. Thử tác dụng sinh học
13
❖ Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan và não chuột

13
❖ Xác định hoạt tính dọn gốc tự do 14
❖ Tác dụng lợi mật 14
2.2Kết quả thực nghiệm và nhận xét

14
2.2.1.Định tính flavonoid 14
2.2.2Định lượng flavonoid 15
2.2.3Thử tác dụng sinh học 20
❖ Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan và não chuột nhắt

20
❖ Xác định hoạt tính dọn gốc tự d o
23
❖ Tác dụng lợi mật 26

Phần 3-Kết luận và đề xuất 29
3.1 Kết luận 29
3.2Đề xuất 29
Tài liệu tham khảo 30
Phu luc 32
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Nội dung
uv

Utra violet
M DA

Manonyl dialdehyd
AST

ánh sáng thường
EtOAc

Ethyl acetat
tp
toàn phần
ĐẬT VẤN ĐỂ
•
Cây Lá lốt từ lâu đã được nhân dân ta sử dụng làm thuốc và gia v ị. Lá lốt
mọc khắp mọi nơi trên đất nước ta và có trữ lượng lớn ở vùng Đông Nam á. Lá
lốt thường được nhân dân sử dụng trong các trường hợp :Đau răng, đau xương
thấp khớp, tê thấp đổ mồ hôi tay chân, đầy bụng khó tiêu, bệnh đi ngoài lỏng
Đã có một số tác giả nghiên cứu về cây Lá lốt, các kết quả cho thấy cây Lá lốt
có chứa các nhóm hoạt chất tinh dầu, alcaloid, tanin, Aavonoid.Thành phần
flavonoid hầu như chưa có tác giả nghiên cứu. Với mong muốn đóng góp một

phần nhỏ vào việc nghiên cứu, đánh giá thực chất vai trò của cây thuốc để
định hướng cho việc khai thác sử dụng hợp lý an toàn và hiệu quả.Trong khoá
luận này chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số nội dung sau
• Định tính, định lượng flavonoid toàn phần trong Lá lốt
• Thử tác dụng chống oxy hoá, hoạt tính dọn gốc tự do, tác dụng lợi mật
của dịch chiết cồn và flavonoid toàn phần
PHẦN 1-TổNG QUAN
1.1.Đặc điểm thực vật,phân bô
Cây Lá lốt thuộc bộ Hồ tiêu (Piperales), họ Hồ tiêu (Piperaceae).Trong họ Hồ
tiêu có hai chi :Peperomia và piper, trong chi piper có 10 cây làm thuốc trong
đó có cây Lá lốt .Cây Lá lốt còn có tên khác là tất bát, phjăc pat(Tày), ana
khia táo, lau chuẩy(Dao)[5] ana klùa táo(Buôn Mê Thuột)[l 1]
Tên khoa học là :Piper lolot C.DC. họ Hồ tiêu Piperaceae
Cây thân thảo, sống dai, cao 30-50 cm .Thân hình trụ, có đốt, phồng lên ở các
mấu, thân có rãnh dọc, có lông nhỏ.Thân non màu xanh già chuyển sang màu
nâu, toàn cây có mùi thơm
Lá đơn nguyên mọc so le, dài khoảng 13cm rộng 8-10cm ,gốc lá hình tim, đầu
lá nhọn phiến lá mỏng mặt trên nhẵn màu xanh, mặt dưới có lông nhỏ ở các
đường gân, cuống lá dài khoảng 2,5cm có bẹ gốc ôm lấy thân
Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành bông đơn tính, dài khoảng l,5cm .Trục bông cái
có lông, lá bắc có phiến tròn không có cuống .Bầu nhẵn hình trứng, nằm sâu
trong trục bông, đầu nhụy hình sợi
Quả mọng một hạt màu vàng nâu. Mùa hoa quả tháng 8-10
Lá lốt được coi là loài đặc hữu phổ biến ở các nước Lào, Việt Nam, Campuchia
Tại Việt Nam Lá lốt mọc hoang ở khắp mọi nơi trong cả nước, đặc biệt là ở
các tỉnh vùng núi thấp (dưới 1000m)[5,l 1,9,4,3]
1.2 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu
Vi phẫu lá:biếu bì trên và dưới gồm một lớp tế bào xếp đều đặn, biểu bì dưới
của gân lá mang lông che chở đơn bào và đa bào ngắn, đầu nhọn có từ 2-3 tế
bào xếp thành dãy, lỗ khí ở mặt dưới phiến lá. Đám mô dày xếp sát biểu bì

trên và biểu bì dưới. Mô mềm gồm tế bào tròn màng mỏng. Một bó libe gỗ
nằm giữa gân lá gồm có vòng mô dày bao bọc xung quanh bó gỗ có nhiều
mạch to xếp phía trên , cung libe ở phía dưới .Phiến lá có mô mềm đồng hoá
xếp giữa hai lớp hạ bì tê bào nhỏ ,thành mỏng xếp lộn xộn. Rải rác có tế bào
tiết tinh dầu trong mô mềm và trong libe
Bôt:Màu lục xám mùi thơm vị hơi đắng. Soi kính hiển vi thấy : mảnh biểu bì
trên của lá gồm tế bào màng mỏng, hình nhiều cạnh mang tế bào tiết .Mảnh
biểu bì dưới là tế bào màng mỏng, nhăn,mang lỗ khí và tế bào tiết .Tế bào tiết
màu vàng, xung quanh có khoảng 6 tế bào xếp toả ra.Tế bào biểu bì dưới gân
lá hình nhiều cạnh màng mỏng mang lông che chở đơn hay đa bào ngắn đầu
nhọn. Mảnh thân cây :tế bào hình nhiều cạnh, mang lỗ vỏ, lông che chở và tế
bào tiết, có khi lông đã rụng để lại những vết tròn nhỏ .Sợi mô cứng thành
mỏng hay hơi dày, khoang rộng, mảnh mạch xuắn, mạch mạng, mạch điểm
[3]
1.3. Thu hái, trồng trọt, chê biến
- Thu hái:Lá lốt thu hái quanh năm có thể dùng cả thân lá và rễ, hái về dùng
tươi hay phơi khô để dùng, nhưng thường dùng tươi. Nếu dùng rễ thường thu
hái vào tháng 8-9[5 ,11]
- Trồng trọt: Lá lốt được trồng bằng các đoạn thân dài 20-30cm, các đoạn
thân đem giâm vào những nơi ẩm ướt dưới bóng mát như dọc theo hàng rào,
tường xây. Cây ít bị sâu bệnh[5,l 1]
- Chế biến:Sau khi thu hái rửa sạch loại bỏ tạp chất cắt đoạn 3-5cm có thể
dùng tươi hay phơi khô hoặc sấy khô ở nhiệt độ thấp. Nếu có dược liệu khô
cần rửa sạch cắt đoạn như trên phơi khô, khi dùng tiến hành vi sao tới khi có
mùi thơm là được[ 13]
1.4.Thành phần hoá học
-Theo các tài liệu toàn cây Lá lốt có tinh dầu alkaloid, flavonoid, tanin. Hàm
lượng tinh dầu trong lá non là 0,17%:0,2% trong lá già và 0,06% trong cọng
thân.Các chỉ số tinh dầu:d25:0,9677;nd32: l,5202;aD32:-4, chỉ số acid 0,697, chỉ
số este 6,256; chỉ số acetyl 32,820-Thành phần tinh dầu có trên 35 hợp chất

trong đó đã xác định được 25 chất bằng sắc ký khí .Chất có hàm lượng cao
nhất là P-caryophylline và bomyl acetat.[19]
-Theo tài liệu [20,21] trong dịch chiết n_hexan của cây Lá lốt có Ị3-asarone
và một chất kết tinh dược xác định cấu trúc bằng phương pháp nhiễu xạ tia X
là:3-(4'-Methoxyphenyl)propanoyl pyrrole[21]
1.5 TÉC dụng dược lý
Theo các tài liệu Lá lốt có các tác dụng sau:
-Tác dụng kháng khuẩn với vi khuẩn :Bacillus pyocyaneus, Staphylococus
aureus và Bacillus subtilis.Tác dụng kháng khuẩn của ba dạng bào chế cao lá
khô ,cao lá tươi, và nước ép lá tươi gần tương tự như nhau[5]
-Tác dụng chống viêm.Cao lỏng Lá lốt dùng ngậm và viên cao Lá lốt dùng
uống được thử nghiệm trên lâm sàng tỏ ra có tác dụng giảm đau và và trị các
-Theo tài liệu [12]trong Lá lốt có các hợp chất
CH,
H 1 o nrDíTnono
14-beta pregnane
bênh viêm cấp tính về răng miệng , trị viêm răng do răng sâu có biến chứng,
túi viêm răng khôn, nhất là ở hàm dưới[5]. Dịch chiết cồn(2:1), flavonoid toàn
phần 4% có tác dụng chống viêm tương tự như nhau trên chuột cống qua
đường uống[17]
-Tác dụng giãn mạch ngoại biên và ức chế hoạt tính gây co thắt cơ trơn ruột
của histamin và acetylcholin .[5]
l.ổ.Công năng và chủ trị
Tính v ị, quy kinh:Lá lốt có vị cay mùi thơm tính ấm, quy kinh tỳ, phế
Công năng:ôn trung tán hàn, hạ khí, chỉ thống [3,5,11,18]
Chủ trị: Phong hàn thấp chân tay lạnh, tê bại .Rối loạn tiêu hoá, nôn mửa, đầy
hơi, đau bụng ỉa chảy .Thận và bàng quang lạnh. Đau răng đau đầu chảy nước
mũi hôi
Liều dùng:8-12g dạng thuốc sắc
1.7.Một sô bài thuốc có vị Lá lốt đã được dùng trong điều trị

-Dược sĩ Triều Đắc (năm 1962) đã dùng nước sắc Lá lốt kết hợp với dầu hạt
dọc để điều trị các vết thương thấy có kết quả tốt [7]
-Viên Quân y 108,198,354 đã dùng cây Lá lốt để điều trị viêm loét trong khoa
Răng hàm mặt
-Bệnh viện Thuận Châu(Sơn La) dùng Lá lốt 15g, vả đay 30g, bạch hoa xà
lOg, thiên niên kiện 20g, rễ cỏ xước 20g, rễ cây xấu hổ 30g, cốt toái bổ 15g,
gừng sắc uống liên tục trong 10 ngày. Dùng đề điều trị đau khớp
-Bác sĩ Lò Kim (Bệnh viện Thuận Châu) và Bác sĩ Lò Cam(Bệnh viện 103) đã
dùng bài thuốc gia truyền để điều trị cho bệnh nhân bị đau khớp ở bệnh viện
Thuận Châu và nhân dân trong vùng có tác dụng tốt
Các chế phám từ Lá lố t:
Dentoxid [16]
Thành phần :Cao cồn Lá lốt 10% (70 ml), methanol 4g, tinh dầu
hương nhu 21g, clorophin lg
Cách sử dụng:Tẩm dịch vào bông đặt vào chỗ đau răng, sau 5-10 phút
súc miệng bằng nước sôi để nguội
Công dụng:Điều trị viêm răng cấp sâu răng, viêm khớp dây chằng ở
răng
Pipelô ngậm,Pipelô uống
Công dụng :Chữa đau răng nhức lợi[ 10]
Các bài thuốc khác cổ vi Lá lốt
• Chữa chân tay đau nhức
Lá lốt rễ bưởi bung, rễ cây vòi voi, rễ cỏ xước tất cả đều dùng tươi thái mỏng
sao vàng mỗi vị đều nhau 15g khô, sắc với 600ml nước. Cô còn 200ml. Chia 3
lần uống trong ngày [ 11 ]
• Giải độc nấm, rắn cắn:
Lá lốt, lá khế, lá đậu ván trắng mỗi vị 50g. Giã nát thêm nước Gạn uống
• Chữa viêm răng sâu răng[5]
Cao mềm Lá lốt 2g, đường kính 2g nước vừa đủ 10ml. Hoà tan rồi ngậm
• Chữa viêm xoang chảy nước mũi đặc[5]

Lá lốt vò nát đặt vào lỗ mũi
PHẦN 2-THựC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
2.1-Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm
2.1.1Nguyên liệu
□ Dược liệu :phần trên mặt đất của cây Lá lốt được thu hái vào tháng 9/2003
ở Hải Hậu -Nam Định .Dược liệu sau thu hái đem rửa sạch thái nhỏ thành
các đoạn 2-3cm, sấy khô ở 60° c ,bảo quản trong túi nilon để nghiên cứu
□ Hoá chất, dung môi:Sử dụng dung môi của Trung Quốc
Sắc ký lớp mỏng:bảng mỏng tráng sẩn (MERCK)
□ Súc vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng chủng swiss có trọng lượng 18-
22g,Đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, không phân biệt đực cái
□ Phương tiện thiết bị:
- Máy đo độ ẩm :Presica HA60(Thuỵ Sĩ)
- Cân kỹ thuật :Presica Xb320C( Thụy Sĩ)
- Tủ sấy :Memmert(Đức)
- Máy đo quang Lambda Ez 210
2.1.2Phương pháp thực nghiệm
a. Định tính flavonoid trong dược liệu bằng các phản ứng hoá học và sắc ký
lớp mỏng theo các tài liệu[ 1,3,4]
b. Định lượng:Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp cân[ 1,4]
c. Thử tác dụng sinh học:
❖ Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan và não của flavonoid toàn
phần và cao của Lá lố t: Tiến hành tại phòng Đông Y thực nghiệm viện Y
Học Cổ Truyền Việt Nam
• Phương pháp thực nghiệm:Phương pháp định lượng MDA được miêu tả
bởi Jadwiga Robax(Ba Lan, 1987) và Mitsno Tanaka(Nhật Bản, 1994)
• Nguyên lý của phương pháp :
-Trong quá trình peroxyd hoá lipid có tạo ra sản phẩm trung gian là MDA,
MDA có thể tạo phức với acid thiobarbituric tạo ra phức Trimethine có màu
hồng và có đỉnh hấp phụ cực đại ớ 530 và 532 nm

-Phản ứng của MDA với acid thiobarbituric:
ọ
H H
I I
o = c- ch2-c = o +
NH
NH N
Malonyl dialdehyd acid thiobarbituric
Phức hợp Trimethine
-Cường độ màu của dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ MDA. Nồng độ
MDA được xác định bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 532 nm. Hàm
lượng MDA được tính theo đường cong chuẩn sử dụng MDA tinh khiết nồng
độ từ 2,00 nmol đến 15,2 nmol
-Nồng độ MDA càng nhỏ chứng tỏ mẫu thử có tác dụng chống oxy hoá
càng lớn
❖ Xác định hoạt tính dọn gốc tự do của Lá lốt:
• Phương pháp : Hoạt tính dọn gốc tự do anion superoxyde xác định theo
phương pháp của Imanari và cộng sự
• Nguyên lý:Anion superoxide 0 2 tạo phức với Nitro Blue Tetrazolium
trong hệ Xanthin/Xanthin oxydase cho màu tím có độ hấp phụ cực đại ở
570nm. Tác dụng dọn gốc tự do (theo phần trăm) được tính bằng cách so
sánh độ hấp phụ quang học của dung dịch thử với độ hấp phụ quang học
của dung dịch không chứa mẫu thử
❖ Tác dụng lợi mật:Thử theo phương pháp rudi
2.2-Kết quả thực nghiệm và nhận xét
2.2.1Đinh tính flavonoid bàng phản ứng hoá hoc:
□ Chuẩn bị dịch thử
Lấy 15g dược liệu cho vào bình cầu 250ml cho thêm 60ml cồn 80° chiết hồi
lưu cách thuỷ trong 1 giờ lọc lấy dịch .Bốc hơi dịch lọc thu được cao đặc
thêm 15 ml nước cất để lắng qua đêm, lọc lấy dịch cô cạn dịch đến cắn hoà

tan cắn bằng cồn 96° để làm các phản ứng định tính
□ Tiến hành phản ứng
• Phản ứng Cyanidin: Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm to thêm
một ít bột Magiê kim loại, cho từng giọt acid HC1 đặc. Sau hai phút
dung dịch có màu hồng nhạt
• Phản ứng với NH3 :Nhỏ một ít dịch chiết lên giấy lọc, để cho khô tự
nhiên, hơ giấy lọc trên miệng lọ NH3 đặc .Giấy lọc chuyển từ màu vàng
nâu nhạt sang màu vàng đậm
• Phản ứng với FeCl35%:Lấy lml dịch chiết cho vào ống nghiệm nhỏ,
thêm hai giọt FeCl3, thấy xuất hiện tủa xanh đen
□ Nhận x ét: Dược liệu có chứa flavonoid
2.2.2.Đinh lương flavonoid
a.Kiểm traflavonoid trong một sô'phân đoạn chiết:
Để có thể chiết kiệt nhất flavonoid cho quá trình định lượng , chúng tôi tiến
hành kiểm tra sơ bộ trên hai phân đoạn chiết là Ethyl acetat và n_Butanol.
Lấy 50g dược liệu đã sấy khô cho vào bình Sohxlet chiết loại tạp bằng
cloroform cho đến khi dịch cloroform không màu. Lấy dược liệu ra để cho
bay hơi hết cloroform .Tiếp tục chiết bằng MeOH trong 24 giờ. Dịch chiết thu
được cất bay hơi dung môi ở áp lực giảm thu được cao đặc . Hoà tan cao đặc
bằng 200ml nước nóng để trong tủ lạnh qua đêm, lọc lấy dịch .Dịch lọc thu
được chiết bằng Ethyl acetat. Chiết nhiều lần cho đến khi lớp Ethyl acetat
không có màu(kiểm tra bằng hơi NH3 thấy không có màu).
Dịch nước còn lại đem thử với NH3, kết quả vẫn có màu vàng đậm, chiết tiếp
dịch nước bằng n_Butanol cho đến khi dịch nước và dịch n_Butanol hết màu
vàng với NH3,cất thu hồi n_Butanol thu được cao đặc.Quá trình chiết xuất
được tóm tắt ở sơ đồ 1
Hình 1: Sơ đồ chiết flavonoid ở các phân đoạn dung môi khác nhau
❖ Định tính phân đoạn Ethyl acetat .Cất thu hồi Ethyl acetat thu được cao
đặc.Cao đặc thu được đem làm các hòa tan bằng cồn 96° đem làm phản
ứng định tính

o Phản ứng cyanidin :Cho màu đỏ cam
o Phản ứng hơi NH3:màu vàng đậm với NH3
❖ Định tính flavonoid trong dịch n_Butanol :Cất thu hồi n_Butanol thu
được cao đặc, cao đặc hoà với cồn 96° để làm phản ứng định tính
flavonoid, phản ứng định tính cho kết quả dương tính giống với phân
đoạn Ethyl acetat
Thừ nghiêm chav sác kv lớp mỏng với dich chiết Ethyl acetat và n Butanol
trên các hê dung môi:
Hệ I:n_Butanol bão hòa nước
Hệ II: Ethyl acetat:toluen:acid focmic(5:6:l)
Hệ III: Ethyl acetat:MeOH(4:l)
Hệ IV: Ethyl acetat:MeOH:H20(100:17:13)
Hệ V: n_Butanol:Ethanol:NH3(7:2:5)
Hệ VI: n_Butan0l:CH3C00H:H20 (4:1:5)
Hệ VII:n_Butanol:HCl 2N( 1:1) (pha trên) ,x
Kết quả hệ dung môi VII tách tốt nhất
Kết quả sắc ký lớp mỏng của dịch chiết Ethyl acetat và n_Butanol với hệ VII
được trình bày ở hình 2(phụ lục)
Nhận xét: sắc ký đồ của dịch chiết Ethyl acetat và n_Butanol gần giống nhau
Các vết của sắc ký đồ của dịch chiết n_Butanol có màu đậm hơn và nhiều hơn,
có nhiều vết lên màu với NH3 hơn.
Kết quả flavonoid toàn phần của dịch chiết n_Butanol được trình bày ở bảng
1, hình l(phụ lục)
Bảng 1 Kết quả sắc ký lớp mỏng flavonoid toàn phần phân đoạn n_Butanol
Vết Đậm
độ
Rị. 100
uv365
A1C13
nh 3

FeCl3
SbCl3
AST
uv365
AST
uv365
AST
AST
uv365
1
+
90,0
xanh
xanh xanh
xanh
2
+ 83.3 Nâu
xỉn
Vàng Vàng
sáng
Vàng Vàng
sáng
Nâu Vàng xanh
3
+++
69,4
Nâu
xỉn
Vàng Vàng
sáng

Vàng Vàng
sáng
Nâu Vàng xanh
4
+++
57,0
Nâu
xỉn
Vàng Vàng
sáng
Vàng Vàng
sáng
Nâu Vàng xanh
5
++
40,9
Nâu Vàng
Vàng
sáng
Vàng Vàng
sáng
Nâu Vàng
xanh
6
+ 33,3 xanh
xanh xanh xanh đen
xanh
Nhân xét:các vết 2, 3, 4 có tính chất giống nhau với các thuốc thử vết số 3 có
đâm độ cao nhất, riêng vết 2 có màu nâu ở u v 365 để ra ngoài không khí 10
phút phát quang màu hồng đỏ ở UV365 khi hơ qua NH3 lại mất màu hồng đỏ

Kết luân: Flavonoid trong Lá lốt nằm chủ yếu ở phần dịch chiết n_Butanol
Vì vậy chúng tôi đưa ra quy trình định lượng như sau
b. Định lượng: Lấy 15g dược liệu gói vào giấy lọc cho vào bình Sohxlet chiết
loại tạp bằng cloroform cho đến khi dịch chiết hết màu xanh. Để khô tự nhiên.
Chiết tiếp bằng MeOH trong 20 giờ .Cô cạn dịch chiết đến cắn hoà tan bằng
1 OOml nước nóng để qua đêm cho lắng , lọc, dịch nước chiết bằng n_Butanol
cho đến khi dịch nước hết màu vàng với NH3. Dịch n_Butanol thu được cho
vào cốc đã cân b ì, cô cách thủy dịch n_Butanol đến cắn , sấy khô ở 80° c đến
khối lượng không đ ổ i, cân cốc trên cân kỹ thuật
Làm song song với ba mẫu và đo độ ẩm
Quy trình chiết xuất định lượng được trình bày ở hình 2
clorophin
Bột dược liệu
▼ Cloroform
Hình2:Sơ đồ chiết xuất flavonoid toàn phần định lượng
Hàm lượng flavonoid toàn phần được tính theo công thức
X = — f

100.
m (\ - b )
X:Hàm lương flavonoid toàn phần %
a:Khối lượng flavonoid toàn phần chiết được (g)
m:khối lượng dược liệu đem chiết(. fg)
b:Hàm ẩm dược liệu (%)
Kết quả được trình bày ở bảng 2
Bảng2:Hàm lượng íìavonoid toàn phần
Lầnl
Khối lượng dược liệu
độ ẩm Khối lượng
Hàm lượng

m (g)
b(%)
flavonoid
flavonoid
toàn phần(g) toàn phần(%)
1
15,05
10,20 0,22 1,63
2 15,32
9,34
0,20 1,44
3
15,04
10,44 0,21 1,56
Trung bình
1,54
2.2.4Thử tác dung sinh hoc
❖ Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan và não
> Chuẩn bị dung dịch nghiên cứu
- Cao Lá lốt: lấy 50g bột dược liệu cho vào bình Sohxlet chiết loại tạp bằng
cloroform, tiếp tục chiết bằng Ethanol trong 24 giờ , cất thu hồi Ethanol thu
được cao đặc. Chọn nồng độ lmg/lml(pha từ nồng độ c=10mg/ml)
-Flavonoid toàn phần: Tiến hành chiết như trên phần chiết cao Lá lốt, cao đặc
thu được hoà tan vào nước nóng cho tan, để lắng, gạn lọc, chiết dịch lọc bằng
Ethyl acetat cho đến khi phần Ethyl acetat hết màu vàng với hơi NH?, cất thu
hồi Ethyl acetat flavonoid toàn phần. Chọn nồng độ lmg/lml(pha từ nồng độ
c=10mg/ml)
> Tiến hành
Các dịch chiết được chuẩn bị ở các nồng độ gọi là nồng độ ban đầu sau đó tiến
hành thí nghiệm với các nồng độ pha loãng khác nhau nhằm tìm được các

nồng độ thích hợp có thể xác định được nồng độ ức chế 50%. X MDA ± SD là
hàm lượng MDA trung bình tính theo nmol
> Kết quả
Bảng 3 1 Ảnh hưởng các nồng độ khác nhau của chế phẩm cao Lá lốt đến phản
ứng oxy hoá lipid dịch đồng thể tế bào gan và não chuột nhắt trắng
Dung dịch thử có nồng độ c=lmg/ml dung dịch được đưa vào các ống với các
liều lượng khác nhau
Lượng cao
Lá lốt đưa
vào phản
ứng(mi)
Nồng độ
cuối cùng
của cao
trong hh
phán ứng
(mg/ml)
XE ±SD
n=3
X MDA - S D
n=3
Tỷ lệ % so với đối
chứng
Não Gan
Não
Gan
Não Gan
0,000 0,000
0.627 ±0,009 0.498 ±0,001
13,78 ±0,33 10,96±0,13

100
100
0,100
0,050 0.487 ±0,001
0.446 ±0.002 10.63 ±0,30 9,73 ±0.06 77,1 88,8
0,200 0.100 0,466 ±0,008
0,441 ±0,007 10,16 ± 0,18 9,60 ±0,01 73,7 87,5
0,300
0,150
0.430 ±0.007 0,426 ±0,002
9,23±0,16
9,28 ±0,04 66,9 84,7
0,400 0.200
0,408 ±0,001 0,399 ±0,007 8,89 ±0.02 8,71 ±0,16 64.5 79,5
0,500 0,250 0.331 ±0,009
0,299 ±0,005 7,22 ±0,20 6,51 ±0,11 52,4 59,4
Nhận xét: Qua bảng trên ta thấy chế phẩm cao Lá lốt thể hiện tác dụng ức chế
phản ứng peroxyd hoá lipid dịch đồng thể đối với cả 2 tế bào gan và não .Độ
ức chế đạt gần 50%
Bảng 4 : Ảnh hưởng các nồng độ khác nhau của Flavonoid toàn phần đến
phản ứng oxy hoá lipid dịch đồng thể tế bào gan và não chuột nhắt trắng
Dung dịch thử có nồng độ c=lmg/ml dung dịch được đưa vào các ống phản
ứng với các liều lượng khác nhau
Lượng
chế
phấm
thử đưa
vào
phản
ứng(ml)

Nồng độ
cuối cùng
của chế
phấm
trong hh
phản ứng
X E
n=
±SD
=3
*MDA ±SD
n=3
Tỷ lệ %so với
đối chứng
Não Gan Não
Gan Não Gan
0,000
0,000 0,522 ±0,007 0,561 ±0,003
11,39 ±0,02 12,35 ±0,45 100 100
0,100 0,050 0.475 ±0,002 0,526 ±0,007
10.71 ±0,20
11,47 ±0,15
94 92,8
0,200 0,100 0,458 ±0,010 0,466 ±0,003
9,97 ±0,03
10,15±0,07
87,5 82,2
0,300 0,150 0,436 ±0,030 0,453 ±0,010
9,51 ±0,06
9,78 ±0,03

83,5 79,9
0,400 0,200 0,366 ±0,009
0,422 ±0,003 7,97 ±0,20
9,63 ±0,077 69,9 77,9
0,500 0,250
0,354 ±0,004
0,249 ±0,002 6,71 ±0,11
5,32 ±0,42 58,9 43,1
Nhận xét:Qua bảng trên ta thấy Flavonoid toàn phần thể hiện tác dụng ức chế
phản ứng peroxyd hoá lipid dịch đồng thể đối với cả hai tế bào gan và não .Độ
ức chế đều đạt gần 50%
cao flavonoid toan phan
nống đõ inâĩi thu(mg/ml)
Hình3:Biéu đồ tác dụng chống oxy hoá của cao và flavonoid toàn phần đối
với tế bào não chuột
Nhận xét:Qua biểu đồ trên ta thấy cao Lá lốt có tác dụng chống oxy hoá với tế
bào não chuột mạnh hơn so với flavonoid toàn phần
— cao flavonoid toần phan
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
** ^ I
nông độ mâu thu(mg/ml)
Hình 4: Biều đồ tác dụng chống oxy hoá của cao và flavonoid toàn phần đối
với tế bào gan chuột
Xác định hoạt tính dọn gốc tự do 0 2
> Chuẩn bị chất thử
r Tiến hành:
-Hỗn hợp phản ứng gồm :
700 |J.1 dung dịch Na2C03 0,05M
50 ỊLil dung dịch Xanthin 3 mM
50 ỊLil dung dịch EDTA 3 mM

50 ỊLil dung dịch thử ở các nồng độ khác nhau
-Hỗn hợp được trộn kỹ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng .Sau đó thêm 50 (il
dung dịch Xanthin oxydase 0,14mg Prot/ml, lắc kỹ và giữ 20 phút ở nhiệt độ
phòng . Ngưng phản ứng bằng cách cho thêm 50 ịil dung dịchCuCl2
ómM.Dung dịch sẽ có màu xanh tím do phản ứng giữa Nitro Blue Tetrazolium
và anion superoxyde 0 2. Đo quang ở bước sóng 570 nm
-Chuẩn bị dung dịch nghiên cứu
Hai mẫu được hoà tan trong đệm phosphat chọn liều thích hợp cho thử hoạt
tính dọn gốc tự do 0 2. Kết quả thử sơ bộ cho thấy dung dịch của cả hai mẫu
đều có màu xanh tím và đậm độ thay đổi rõ từ nồng độ 60|ig/ml đến
100|Lig/ml .Vì vậy mẫu được chuẩn bị bằng cách pha loãng để có dung dịch
thử là:
Mẫu l:2mg/ml
Mẫu 2:2mg/ml
> Kết quả
Bảng 5 :Tác dụng của cao Lá lốt với sự tạo thành anion superoxyd trong hệ
Xanthin/Xanthin oxydase (nồng độ thử 2mg/ml)
Mẫu
Thể tích mẫu
đưa vào(i^l)
Bù
PBS(fil)
Nồng độ mẫu
thử(fig/ml)
Ẽ ±SD
% so với
đối chứng
Độ ức
chế(%)
1 0

50 0
0,340± 0,012
100
0
2
30
20
60 0,212 ±0,002
62,35
37,65
3
40
10 80
0,187 ±0,005 55,00
45,00
4
50
0 100
0,183±0,012 53,82
46,18
Bảng 6 :Tác dụng của flavonoid toàn phần Lá lốt trong hệ Xanthin/Xanthin
oxydase (nồng độ thử 2mg/ml)
Mẫu
Thê tích mẫu
đưa vào(|Lil)
Bù
PBS(ịiI)
Nồng độ mẫu
thử(|ig/ml)
Ẽ ±SD

% so với
đối chứng
Độ ức
chế(%)
1
0
50 0
0,340 ±0,012 100
0
2 30
20
60 0,257 ±0,006
75.58 24,42
3
40
10
80 0,249 ±0,004 73,23
26,77
4 50
0
100 0,181 ±0,006 53,24
46,76
cao
flavonoid tp
0 60 80 100
nông độ (ịrtg/ml)
Hình 5:Biểu đồ tác dụng hạn chế tạo gốc tự do của cao và flavonoid tp
Nhận xét:Kết quả thử sơ bộ cho thấy ,mẫu 1 và 2 đều có tác dụng hạn chế sự
tạo thành gốc tự do anion superoxyd 0 2 khá mạnh ,đạt tới gần 50% ở nồng độ
chất thử là 100 |Lig/ml đối với cả hai mẫu. Đối với dịch cồn , ngay ở nồng độ

80fig/ml độ ức chế đạt 45% trong khi đó đối với flavonoid toàn phần chỉ đạt
26,77% ở cùng nồng độ .
Kết luận: Flavonoid toàn phần Lá lốt và dịch chiết cồn Lá lốt đều có tác dụng
hạn chế sự tạo thành gốc tự do anion superoxyd 0 2 .Tuy nhiên ngay ở những
nồng độ thấp ban đầu thì dịch cồn Lá lốt lại có tác dụng ức chế mạnh hơn
flavonoid toàn phần .Và khi nồng độ tăng cao, thì tại nồng độ 100ng/ml đạt
được tỷ lệ ức chế là tương đương.
♦♦♦ Tác dụng lợi mật
> Chuẩn bị mẫu thử
- Cao lỏng 2:1 :Cho dược liệu cho vào bình chiết .Chiết dược liệu bằng cồn
80°, chiết ba lần.Gộp dịch cồn lại thu hồi cồn, để lắng qua đêm lọc thêm nước
dể đươc cao 2:1