Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ chủng streptomyces 315

BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
Họ tên sinh viên : Huỳnh Thu Trang.
GÓP PHẦN NGHIÊN cứu KHÁNG SINH
TỪ CHỦNG STREPTOMYCES 315
(Khoá luận tốt nghiệp dược sĩ đại học khoá 1997 - 2002)
Giáo viên hướng dẫn : TS. Cao Vãn Thu
BS. Lê Thị Thu Hương
Nơi thực hiện : Bộ môn Công nghiệp Dược
Đại học Dược Hà nội
Thời gian thực hiện : 2/2002 - 5/2002.
Hà nội tháng 5 - 2002
ÌÍVM.
r/
^ A m ƠQl
<ĩ)ởi Lòềtg. k ín h tmnụ. tm l%ièl íUt Ễuâu iẨe.^ ejnt æin Imụ.
tó
Lời eản t Ổ4Z iê i :
Qhầạ^ gỉáờ^ <ĩ)ăn Çîhu
^ ạ iá a (BS. Mê Çîhi Çîhu ^ ư ổnụ .
Là nhữễiạ nạưM khènụ^ e hi đ ã kưênụ^ dẫ n f eh l IwLö^
tó /r
tìn h ehơ^ ejti ỉmni^ IhM
ạicưi IhựẨí hiệễt k hơă Luận m à eền^ ạ ià n h eím em nhiều lồ i khuụỈM ạuẠ ỉìúu trm iạ
eềnụ. mĨẨi tưổnjg. Lai.
^)ềnjạ th ồ i ent eủnụ æui ehãn th à n h eảm ỔH tấ t eả eáe thầy, eô ạiáũ f eúa kậ
tk n á l ơiỀít mèn^ ^ởềiạ nqhiejft n)ujổ4i eùitg. lờ ăn th ỉ eáe im m ỏềt, fthènjg. luur ehứe
nănự. ừf
4
ư iạ irưằnụ. Œiiii họ^ nữujổ4í 'Tùỉi n ộ i đ ã n h iêi tìn h ạ iú ft ÌẨỊua đìỈẦi kỉêM^
ỉh iiậ n Iđi ehũ em húàn th à n h khơú luán tố t nụliíẻp caìa Ịnình.

7ỗà n ội th á n ạ 5 / 2002.
S in h men
Tôuijnh ^ k u Çîi^OMg
MỤC LỤC
Đặt vấn đề 1
Phần 1 - Tổng quan 2
1.1. Vài nét về kháng sinh 2
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2
1.1.2. Tính kháng kháng sinh 2
1.2. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces 2
1.2.1. Đặc điểm hình thái 2
1.2.2. Đạc điểm sinh lý 3
1.2.3. Khả năng tạo sắc tố 4
1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh 4
1.3. Phân lập và cải tạo giống vi sinh vật 5
1.3.1. Chọn lọc ngẫu nhiên 5
1.3.2. Đột biến bằng ánh sáng u v 6
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 7
1.4.1. Lên men bề mặt 7
1.4.2. Lên men chìm 8
1.5. Chiết tách & tinh chế 9
1.5.1. Chiết tách kháng sinh 10
1.5.2. Sắc ký 10
1.6. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập và sàng lọc vi sinh vật
sinh tổng hợp kháng sinh. 11
1.7. Phân loại Streptomyces 12
1.8. Một số nghiên cứu công nghệ sản xuất kháng sinh trong
thời gian gần đây 12
1.8.1. Kháng sinh milbemyein 12
1.8.2. Kháng sinh methylsulfomycin 13

1.8.3.Actinohivin - Kháng sinh chống HIV 13
1.8.4. Nâng cao sản lượng kasugamycin 14
Phần 2 - Thực nghiệm & kết quả 16
2.1. Nguyên liệu 16
2.1.1. Giống xạ khuẩn 16
2.1.2. Giống vi sinh vật kiểm định 16
2.1.3. Các môi trường đã sử dụng 16
2.1.4. Các dung môi chiết 18
2.1.5. Nguyên liệu dùng cho sắc ký 18
2.1.6. Một số dụng cụ - thiết bị quan trọng 18
2.2. Các phưoíng pháp nghiên cứu 18
2.2.1. Chuẩn bị giống trong phòng thí nghiệm 20
2.2.2. Phuofng pháp phân loại 20
2.2.3. Phương pháp đột biến bằng ánh sáng u v 22
2.2.4. Phương pháp lên men 23
2.2.5. Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh 24
2.2.6. Phương pháp chiết xuất kháng sinh 25
2.2.7. Phương pháp sắc ký lớp mỏng 27
2.3. Kết quả và nhận xét 28
2.3.1. Ket quả thử khả năng kháng khuẩn 28
2.3.2. Kết quả chọn môi trường thích hợp nuôi cấy 29
2.3.3. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên giống xạ khuẩn 29
2.3.4. Kết quả đột biến cải tạo giống 31
2.3.5. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 34
2.3.6. Kết quả chiết xuất & tinh chế 34
2.3.7. Hình thái xạ khuẩn Streptomyces 315
và sơ bộ phân loại 38
Phần 3 - Kết luận và đề xuất. 41
Tài liêu tham khảo.
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ngày càng có nhiều kháng sinh

được sản xuất bằng phương pháp tổng hợp và bán tổng hợp. Tuy nhiên, việc tìm ra
kháng sinh mới từ các loài vi sinh vật vẫn được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan
tâm.
ở Việt Nam, do điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm đã tạo nên một quần thể vi
sinh vật phong phú, trong đó phải kể đến chi Streptomyces - thuộc lớp (bộ)
Actinomycetales - có khả năng sinh kháng sinh. Việc phân lập các chủng Streptomyces
gần đây đã được tiến hành nghiên cứu rộng rãi nhằm phục vụ cho việc tìm kiếm những
kháng sinh mới ứng dụng trong điều trị, nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh để
chiết tách và tinh chế trước khi đưa vào quy mô sản xuất công nghiệp.
Cũng không ngoài những mục đích trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Góp phần
nghiên cứu kháng sinh từ chủng Streptomyces 575” với những mục tiêu cụ thể sau:
- Từ chủng Streptomyces đã được phân lập, tiến hành nghiên cứu cải tạo giống
trong quy mô phòng thí nghiệm sao cho tìm kiếm được nhưng chủng giống có
hoạt lưc kháng sinh ngày càng cao hofn so với chủng xuất phát.
- Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh quy mô nhỏ tại phòng thí nghiệm.
Bưóc đầu nghiên cứu quá trình chiết tách và tinh chế kháng sinh.
PHẦN 1: TỔNG QUAN.
1.1. Vài nét về kháng sinh.
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh:
Có rất nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh , nhưng có thể nêu lên một
định nghĩa được coi là hoàn chỉnh nhất:
“Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn
tự nhiên khác , có hoạt tính sinh học cao, ở nồng độ thấp có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu
diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh
động vật ) hay tế bào ung thư”.
1.1.2. Tính kháng kháng sình:
Hiện tượng kháng kháng sinh và hoá trị liệu đã xuất hiện ở hầu hết các loài vi
sinh vật. Trong những năm gần đây, sự phát triển của sinh học phân tử đã tạo cơ sở để
nghiên cứu một cách toàn diện bản chất phân tử của tính kháng thuốc ở vi khuẩn.
Bản chất di truyền của tính kháng thuốc được khẳng định là do sự cảm ứng tính

kháng thuốc nhờ tác nhân gây đột biến. Các quá trình này xảy ra ở mức độ phân tử do
tải nạp, biến nạp và tiếp hợp tế bào vi khuẩn.
Quá trình phát minh và sử dụng kháng sinh đã giúp các nhà nghiên cứu nhận ra
rằng kháng sinh không bị vi khuẩn kháng lại chỉ trong một thời gian nhất định. Điều
này là không thể tránh khỏi nhưng có thể tiến hành nghiên cứu để kéo dài thời gian
thuốc không bị vi khuẩn kháng .
1.2. Những đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces:
1.2.1. Đặc điểm hình thái:
Ngoài những đặc điểm chung của xạ khuẩn như:
- kích thước tế bào từ 0,5 -2,0|am
- màng tế bào xạ khuẩn không có cellulose hoặc kitin
- Sinh sản vô tính
- Khuẩn lạc của xạ khuẩn trong môi trường đặc thường rắn chắc, xù xì, có hoặc
không có màu
- Bắt màu gram (+),
chi Streptomyces cũng có một số các đặc điểm khác đáng chú ý trong quá trình nuôi
cấy:
- Khuẩn lạc: Tạo thành cụm, ban đầu bề mặt trơn nhẵn nhưng sau đó phát triển
các sợi ngang nên bề mặt bào tử trở nên khô, xù xì. Chúng có thể xuất hiện dưới
dạng hình hạt được bao phủ bởi một lớp bột mịn như bụi phấn, hoặc bởi những
sợi nhỏ, bông như lông tơ. Khuẩn lạc có chân khá vững chắc , khó tách khỏi môi
trường nuôi cấy.
- Khuẩn ty cơ chất: Có xu hướng mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, bề mặt có thể
nhẩn hoặc sần sùi.
- Khuẩn ty khí sinh: thường có đường kính từ lịim - l,4|im.
- Chuỗi sinh bào tử: hình thành từ khuẩn ty khí sinh, có nhiều hình dạng khác
nhau (thẳng hoặc uốn cong )- Quá trình sinh sản bào tử bắt đầu từ quá trình
phân mảnh; thành tế bào và màng tế bào chất đồng thời xuất hiện vách ngăn tiến
dần vào phía trong và làm cho sợi bào tử phân cắt đổng thời tạo chuỗi bào tử
trần.

- Bào tử trần: Đây là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bào tử trần có thể có
hình cầu (0,3 - 0,8|im), hình bầu dục, hình que , hình trụ (0.8 - Bề mặt
bào tử có dạng trơn nhẵn, xù xì, có gai hoặc có tóc. Các bào tử tập hợp thành
chuỗi (3 - 50). Hình dạng và kích thước của bào tử có vai trò quan trọng trong
việc định tên Streptomyces.
1.2.2. Đặc điểm sinh lý :
Streptomyces là vi sinh vật dị dưõng, có tính oxy hoá cao. Để phát triển, chúng
sử dụng glucose và thuỷ phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột . Chúng cũng
có thể khử nitrat thành nitrit.
Streptomyces là loài xạ khuẩn hô hấp hiếu khí, nó cần cung cấp ôxy để duy trì
khả năng tạo sinh khối. Nhiệt độ tối ưu của chúng thường là 25 - 35°c, một vài loài có
thể mọc tốt ở nhiệt độ cao hơn ; pH tối ưu thưòỉng từ 6,5 - 8,0.
1.2.3.Khả năng tạo sắc tố:
Sắc tô tạo thành của Streptomyces được chia làm 4 loại:
- Sắc tố hoà tan.
- Sắc tố cơ chất.
- Melanoiđ (hay sắc tố đen).
- Sắc tố của khuẩn ty khí sinh (màu sắc bề mặt khuẩn lạc).
1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh:
Những kháng sinh do các loài của chi Streptomyces tổng hợp rất đa dạng. Có thể
sắp xếp theo cấu trúc hoá học như sau;
• Nhóm aminoglycosid:
Kanamycin do Streptomyces kanamyceticus (Umezawa, 1957).
Neomycin do Streptomyces fradiae (Waksman & Lechevalier , 1949).
Tobramycin do Streptomyces tenebraiius
Streptomycin do Streptomyces griseus (Waksman , 1943)
Paromomycin do Streptomyces rimosus.
Lincomycin do Streptomyces linconensis (1962).
• Nhóm tetracyclin:
Oxytetracyclin do Streptomyces rimosus (Finlay và cộng sự , 1950).

Tetracyclin do Streptomyces viridifaciens ( 1952 ), Streptomyces aureofaciens.
• Nhóm macrolid:
Erythromycin do Streptomyces erythreus
Oleandomycin do Streptomyces antibioticus
Spiramycin do Streptomyces ambofaciens
• Những kháng sinh khác:
Amphotericin B do Streptomyces nodosus.
Actinomycin do Streptomyces antibioticus, Streptomyces chrysomallus
Streptomyces parallus.
Viomycin A, B do Streptomyces vinaceus, Streptomyces puniceus,
Streptomyces flordiae.
Fosfomycin do Streptomyces fradiae.
Novobiocin do Streptomyces spheroides.
1.3. Phân lập và cải tạo giống vi sinh vật:
Giống vi sinh vật thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên như bùn đất,
nước, các mô thực vật, các vật liệu hữu cơ, vô cơ đã bị phân huỷ ít nhiều. Thực tế cho
thấy từ tự nhiên không một chủng vi sinh vật nào có khả năng tạo chất kháng sinh
mong muốn với hàm lượng cao đạt yêu cầu của sản xuất công nghiêp. Do đó, một trong
những nhiệm vụ hàng đầu của các nhà vi sinh vật học công nghiệp là cải tạo chủng
giống vi sinh vật đáp ứng yêu cầu của quá trình sản xuất.
Công việc chọn giống này có thể được tiến hành bằng nhiều cách khác nhau dựa
trên cơ sở di truyền với hai cơ chế làm thay đổi thông tin di truyền:
- Một cơ chế liên quan đến sự phát sinh đột biến, ứng dụng tiến hành chọn giống
bằng đột biến gây tạo kết hợp với sàng lọc ngẫu nhiên.
- Một cơ chế liên quan đến tái tổ hợp di truyền ứng dụng, tiến hành chọn giống
bằng phương pháp lai với mục đích kết hợp những đức tính quý giá từ bố mẹ vào
con cái trên cơ sở tái tổ hợp lại gen.
1.3.1. Chọn lọc ngẫu nhiên.
Các vi sinh vật biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau, có cá thể tăng tính kháng
sinh lên so với những cá thể khác. Cần chọn những cá thể có hoạt tính cao nhất để

nghiên cứu tiếp.
Trên thực tế, tần suất xuất hiện các cá thể dương tính rất thấp và việc chọn lọc tự
nhiên chỉ giúp cho những nghiên cứu ban đầu, ít có giá trị áp dụng vào sản xuất công
nghiệp.
1.3.2. Đột biến bằng ánh sáng UV:
Đột biến nhân tạo được tạo ra bỏfi các tác nhân đột biến khác nhau như tác nhân
vật lý, tác nhân hoá học , tác nhân sinh học nhằm mục đích nâng cao tần suất xuất hiện
đột biến. Đột biến bằng ánh sáng u v cũng là một thể đột biến gây tạo thông qua tác
nhân vật lý như vậy.
Tia u v là những bức xạ nhìn thấy được có bước sóng từ 1360A° đến 3900A°,
khả năng đâm xuyên kém. Tuy nhiên, với những tế bào vi sinh vật có kích thước nhỏ
(0,6 - 3 ịiim) thì nó có thể đâm xuyên tới nhân, do đó được dùng phổ biến trong di
truyền chọn giống vi sinh vật. Dưới tác dụng của tia tử ngoại, vi sinh vật bị đột biến
nhiều nhất ở bước sóng 260 nm.
Cơ chế gây đột biến của tia ư v ỏ mức độ phân tử như sau: Khi chiếu tia u v liều
lượng cao, các liên kết hydro trong mạch kép ADN của tế bào vi sinh vật bị đứt gẫy dẫn
đến hiện tượng dimer hoá thimine. ở đây, hai thimine gần nhau sẽ được liên kết cộng
hoá trị với nhau ở nguyên tử C5 và C6. Hậu quả là sao chép bị sai lệch vì ADN-
polymerase dễ lắp một nucleotid không đúng vào vị trí trên. Do tác dụng của tia uv ,
trên sợi AND cũng xuất hiện một dime pyrimidin khác gọi là quang sản phẩm 6-4. ở
đây C6 của pyrimidin 5’ (tymin hoặc cytosin) được liên kết với C4 của pyrimidin 3’
(thường là cytosin). Các sản phẩm này là nguyên nhân chủ yếu của đột biến gây nên
bởi tia ưv.
Các yếu tố ảnh hưcmg đến tác dụng gây chết và tần số phát sinh đột biến:
- Liều lượng chiếu: được đặc trưng bởi 3 tham số là thời gian chiếu, khoảng cách
chiếu và độ pha loãng bào tử. Thường thì đột biến dương sẽ xuất hiện ở những
liều lượng chiếu có độ sông sót bào tử từ 0,1 - 1,0%, còn đột biến âm thưcmg
xuất hiện ở những liều lượng chiếu cao hơn.
- Ánh sáng thường: Sau khi đột biến bằng tia tử ngoại , nếu đem chiếu ánh sáng
thường (bước sóng 320 - 480 nm) trở lại thì sẽ có khoảng 50 - 80% tế bào được

phục hồi do tác dụng của men phục hồi. Hiện tượng này được gọi là quang phục
hoạt.
- Các yếu tố khác: Ngoài các yếu tố trên thì nhiệt độ, pH, thành phần môi trường,
trạng thái sinh lý của bào tử đem đột biến cũng ảnh hưcmg đến hiệu quả chiếu
ánh sáng uv .
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh:
Trừ một số rất ít kháng sinh có thể tổng hợp toàn phần như chloramphenicol ,
hầu hết các kháng sinh hiện có đều là sản phẩm của quá trình lên men hoặc bán tổng
hợp
Lên men là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong các điều kiện thích hợp nhằm tạo
ra những sản phẩm trao đổi chất từ chính các vi sinh vật hoặc các thành phần tế bào của
chúng. Có 2 kiểu lên men chính là lên men bề mặt và lên men chìm.
1.4.1. Lên men bề mặt:
Vi sinh vật được nuôi cấy trên bề mặt môi trường rắn hoặc lỏng, hấp thụ các chất
dinh dưỡng của môi trưòỉng và sử dụng ôxy không khí để hô hấp trên bề mặt môi trưòfng
dinh dưỡng. Do vậy , bề mặt lên men phải đủ rộng và lớp môi trường lên men không
được quá sâu (5 -1 0 cm).
Lên men bề mặt kháng sinh có một số đặc điểm sau:
- Khoáng chất được hoà tan vào nước, khuấy trộn đều các thành phần chính. Sau
khi khử trùng, thực hiện dàn đều hay san đều.
- Giống xạ khuẩn có thể là sợi nhũ dịch hay bào tử đựoc cấy bắng cách phun nhũ
dịch này lên bẻ mặt môi trường hoặc trộn đều.
- Trong quá trình lên men, phải điều chỉnh nhiêt độ cũng như duy trì cấp khí bằng
quạt sao cho đảm bảo thông thoáng, nồng độ O2, CO2 thích hợp cho sự phát triển
của vi sinh vật. Không khí cần được lọc vô trùng và độ ẩm luôn được điều chỉnh
nhằm tránh cho bề mặt môi trường khỏi bị khô.
Lên men bề mặt có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư ban đầu thấp. Song
cũng có nhược điém là đòi hỏi mặt bằng lớn, hiệu suất sử dụng thường thấp, khó cơ giới
và tự động hoá. Chính bởi lí do đó mà ngày nay, công nghiệp kháng sinh không áp
dụng lên men bề mặt trong sản xuất mà chỉ sử dụng trong các phòng thí nghiệm để

chọn giống.
1.4.2. Lên men chìm:
Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trưòỉng lỏng, phát triển trong không gian ba
chiều. Giống dùng cho lên men được tạo qua các cấp nhân giống khác nhau:
- Giống cấp 1: nuôi cấy trong bình nón trên máy lắc (100ml/500ml).
- Giống cấp 2: nuôi trong bình giống 50 1.
- Giống cấp 3: nuôi trong thiết bị nhân giống Im^ - 5m ^
Tỷ lệ giống thưcỉng từ 1 - 10 %. Có thể phải cho thêm các chất phá bọt, chất
điều chỉnh pH hay đệm pH nhằm đảm bảo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men
kháng sinh. Tuỳ thuộc vào sản phẩm mà thời gian lên men có thể từ 50 -120 giờ. Tuy
nhiên hiệu quả lên men sẽ tăng khi thời gian lên men được rút ngắn,
ưu điểm của phưofng pháp lên men chìm:
- Sử dụng tối m môi trường dinh dưỡng, đáp ứng được nhu cầu sinh lý của vi sinh
vật.
- Hiệu suất sử dụng không gian cao (ba chiều ), hiệu suất lên men cao.
- Các thiết bị lẽn men chìm dễ cơ giới hoá, tự động hoá đồng thời tiết kiệm nguồn
nhân lực.
Nhược điểm của phương pháp lên men chìm: Đòi hỏi nhiều trang thiết bị kỹ
thuật (chịu được áp lực, vô trùng tuyệt đối), đòi hỏi đầu tư lófn.
Tuy nhiên có thé thấy rằng chính bởi những ưu điểm vượt trội trên mà tuyệt đại đa số
kháng sinh được sản xuất bằng phương pháp lên men chìm này. Lên men chìm lại được
chia ra làm nhiều kiểu:
• Lên men gián đoạn (lên men mẻ):
Quá trình lên men gián đoạn được coi như một hệ thống kín. Trong suốt thời
gian lên men , ta không tác động hay bổ sung gì vào hệ thống trừ cung cấp oxy, chất
phá bọt, chất điều chỉnh pH (nếu cần).
Vi sinh vật phát triển qua bốn pha: pha tiềm tàng, pha luỹ thừa, pha dừng và pha
suy tàn. Trong sản xuất, người ta kết thúc lên men ở thời điểm của pha nào là tuỳ thuộc
vào việc sinh tổng hợp hoạt chất bị dừng ở pha nào trong chu kỳ sinh trưcmg của vi sinh
vật. Đôi khi, việc sinh tổng hợp hoạt chất tuy chưa dừng lại hẳn nhưng đã chậm lại hoặc

khi việc duy trì lên men không còn kinh tế nữa thì đó cũng là lúc cần kết thúc lên men.
• Lên men có bổ sung:
Đây là một biến tướng của phương pháp lên men gián đoạn khi ta bổ sung thêm
một số thành phần vào môi trường dinh dưỡng nhằm tránh các ức chế trao đổi chất của
vi sinh vật và nhắm tăng cường sinh tổng hợp hoạt chất.
Thực tế, sự tạo thành các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp sẽ bị nồng độ cao của
một số cơ chất như glucose hay các chất có chứa nitơ ức chế. Bởi vậy, khi bắt đầu lên
men theo phương pháp bổ sung, các thành phần “nguy hại” này được ứng dụng với
nồng độ thấp hơn phuofng pháp lên men mẻ; sau đó, chúng được bổ sung từ từ vào môi
trường dinh dưỡng với từng lượng nhỏ. Cũng có quá trình lên men cần bổ sung tiền
chất.
• Lên men liên tục:
Hệ thống lên men liên tục hoạt động như một hệ mở Trong quá trình lên men,
vừa bổ sung liên tục môi trường dinh dưỡng , vừa lấy bớt ra đồng luçfng dịch lên men đã
biến đổi cùng vi sinh vật trong đó. Lên men liên tục cho sản lượng cao hơn và có thời
gian “chết” ngắn hơn lên men gián đoạn.
• Lên men bán liên tục:
ở đây, việc rút bớt dịch lên men và bổ sung thêm vào môi trường dinh
dưỡng không xảy ra liên tục mà chỉ theo định kỳ.
1.5. Chiết tách và tinh chế:
Các sản phẩm có mặt trong dịch lên men thường có nhiều tạp chất và các thành
phần phụ. Do vậy bước tiếp theo quan trọng sau công việc lên men là chiết tách và tinh
chế sản phẩm. Công việc này rất phức tạp, tốn kém , đòi hỏi nhiều thời gian và tâm
huyết.
1.5.1. Chiết tách kháng sinh:
Sau khi đã lọc loại bỏ sinh khối khỏi dịch lên men nếu là kháng sinh ngoại bào,
hoặc lọc bỏ dịch nếu là kháng sinh nội bào, chiết xuất bằng cách dùng dung môi (đơn
hay hỗn hợp) là công đoạn tiếp theo nhằm thu lấy chất kháng sinh để nghiên cứu tiếp.
Nguyên tắc của phương pháp chiết xuất là dựa vào sự khác biệt hệ số phân bố
của chất kháng sinh giữa 2 pha (dung môi chiết với dịch lên men hay sinh khối) không

đồng tan được với nhau để tách lấy riêng chất kháng sinh (có thể là một chất hay một
nhóm chất).
Với các kháng sinh ngoại bào từ dịch lọc, người ta ứng dụng phép chiết lỏng -
lỏng với một số phưcỉng pháp chiết sau:
• Chiết đơn (chiết 1 lần): hiệu suất thường thấp.
• Chiết lặp (chiết nhiều lần): chiết càng nhiều lần hiệu suất càng cao nhưng lại tốn
thời gian và công sức, do vậy cần chọn điều kiện tối ưu.
• Chiết ngược dòng: Dựa trên nguyên tắc cho dung môi chiết và dung dịch cần
chiết đi ngược chiều nhau. Khi đó, 2 pha tiếp xúc chặt chẽ, pha trộn và di chuyển
ngược chiều nhau. Phương pháp này cho hiệu suất khá cao nhưng đòi hỏi cần có
những máy móc thiết bị thích hợp.
1.5.2. Sắc ký:
Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của
một hỗn hợp dựa trên sự phân bố khác nhau trên tương tác của hai pha động và tĩnh.
Trong nghiên cứu tinh chế các chất kháng sinh, người ta thường sử dụng các phương
pháp như sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, HPLC.
• Sắc ký lớp mỏng; Thường được tiến hành trên một bản mỏng (thuỷ tinh hoặc
kim loại) đã tráng sẵn một lớp mỏng chất hấp phụ dưới dạng bột mịn. Chất hấp
phụ thường dùng là Silicagel loại hạt mịn, nhôm oxyd, cellulose, thạch cao,
sephadex Dung môi sử sụng trong quá trình sắc ký phải tinh khiết, được lực
chọn kỹ lượng về chất lượng, số lượng và tỷ lệ.
Tuy là một phưoíng pháp khá đơn giản nhưng sắc ký lớp mỏng vẫn giữ một vai
trò quan trọng trong công việc chiết tách và tinh chế kháng sinh.
1.6. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập và sàng lọc vi sinh vật sinh tổng hợp kháng
sinh : Hình 1 dưới đây giới thiệu tổng quát quá trình phân lập , sàng lọc v s v
sinh tổng hợp KS.
1.
r ~ \ n > r \
Mỗuđđ^
Pha loãng

’S ư ìã
rv
ẽ
Nuôi oâự trong ó
ngày ò nhiệt độ
25 o c
Đìa đụng mõu đ ít
2 .
Phun vi khuđn
kiểm đỊnh
vão ơb đụng
mâuđđl'
Nuôi csđ^ trong
1 ngõy ở nhiệt
độ37oC
3.
4.
Phân lộp chủng Xâcđịnh hoạt lục
sà n X uíf khô ng của khã ng si n h
sinh
5.
klểnn tra sụ phôt
iTiển trong môi
truòng lòng
Xâcđịnh
hoạt lục của
khãng sinh •
trong khi lên
men
6.

Xôc (ạnh oâc thông số'
sau khi lên men:
• Hoạt lục của không
sinh
• Phuơng phãptâch
chiếl' vãtinhchố
7.
Xâcđịnh MIC
8.
Xôc định độc tinh
trôn động vđt
9.
Xãcđịnh cớc mỗu kjểm tra
trôn co thể ngLòi
Hình 1: Phân lập, sàng lọc v s v sinh tổng hợp KS.
1.7. Phân loại Streptomyces:
Chi Streptomyces bao gồm một lượng lớn các xạ khuẩn có khả năng sinh tổng
hợp kháng sinh có ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau: điều trị bệnh, nông
nghiệp Đã có nhiều khoá phân loại khác nhau như Krassilnikov (1961), Gottlieb
(1959,1961) và tới năm 1966 , khoá phân loại của E.B. Shirling và D. Gottlieb ra đời.
Trong khoá phân loại này, việc phân loại Streptomyces đã được tiến hành với sự tham
gia của hơn 40 nhà nghiên cứu từ 17 nước khác nhau, do vậy mà chương trình mang tên
International Streptomyces Project (ISP). Trong ISP, các nhà nghiên cứu đưa ra các
môi trường chuẩn để xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý , sinh hoá của chi
Streptomyces, cụ thể là:
• Các đặc điểm hình thái
• Sắc tố melanoid, màu của khuẩn ty cơ chất, màu của khuẩn ty khí sinh
• Khả năng tiêu thụ các nguồn carbon.
Sau khi xác định những đặc điểm này , bước tiếp theo sẽ là sử dụng khoá phân
loại để xác định tên loài Streptomyces.

1.8. Một số nghiên cứu công nghệ sản xuất kháng sinh trong thời gian gần đây:
1.8.1. Kháng sinh milbemycỉn [13],
Milbemycin được sản xuất từ Streptomyces hygroscopỉcus subsp.
aureolacrimosus là kháng sinh macrolid 16 cạnh, có thể tác dụng trên các ký sinh trùng
như giun chỉ. Trong sản xuất KS này, việc nâng cấp mở rộng quy mô khi sử dụng hệ
thống CMA (thay đổi vận tốc khuấy trộn ) bị thất bại.
Để thay đổi,tác giả đã tiến hành các nghiên cứu lên men trong các thiết bị quy mô thí
nghiệm, pilot và sản xuất có thể tích từ 5 - 30 dm^ đến 6000 - 12000 dm^, kết hợp với
việc ứng dụng các hệ thống kiểm soát tham số lên men từ CMA, CMB, đến CMF.
Với hệ thống kiểm soát lên men CMF (biến thiên lEAT = áp suất dư, tốc độ cấp khí,
vận tốc khuấy trộn và nhiệt độ) đã thực hiện thành công các mẻ lên men milbemycin
trong các thiết bị sản xuất, đạt hiệu suất bằng 96,5% so với khi lên men trong các thiết
bị thí nghiệm.
Hiệu suất được xác định bằng sắc ký HPLC, nồng độ milbemycin được xác định
bằng phương pháp đo quang ở 245 nm. Các đường ( saccarose, glucose và fructose)
trong dịch lến men cũng được xác định bằng HPLC. Các phân đoạn được kiểm tra bằng
bộ cảm RI để xác định nồng độ các đường.
Với phương pháp nghiên cứu như trên, kháng sinh milbemycin tinh khiết đã
được lên men và chiết tách từ chủng Streptomyces hygroscopicus subsp.
aureolacrimosus SANK 63985, hiện được ứng dụng trong thực tế đặc biệt là trong việc
điều trị bệnh giun chỉ.
1.8.2. Kháng sinh methylsuựomycin I [9].
Methylsulfomycin I là một kháng sinh có cấu trúc peptid mạch vòng mới được
chiết từ dịch lên men chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. HIL Y-9420704. Cấu trúc đã
được xác định bằng phổ cộng hưcmg từ hạt nhân và phổ khối. Thử tác dụng in vitro cho
thấy KS này có tác dụng với phổ rộng vi khuẩn Gram (+).
Kháng sinh thô thu được từ dịch lọc trong qua giai đoạn chiết bằng EtOAc ỏ pH
môi trường thích hợp và từ hệ sợi nấm chiết bằng MeOH. Hỗn hợp kháng sinh thô dược
tinh chế bằng HPLC . Quá trình sản xuất cũng như tinh chế methylsulfomycin I đều
được kiểm tra tác dụng trên 2 chủng Staphylococcus aureus 3066, Enterococcus

faecium R-2 và bằng HPLC.
Công thức phân tử của methylsulfomycin I được xác định la C55H54N16O16S2. Phổ
hổng ngoại xuất hiện trong dải 3380cm"' - 1680cm ' , cho biết sự có mặt của OH/NH và
các cacbonylamid tương ứng.
Việc methylsulfomycin thể hiện tác dụng in vitro tốt với phổ rộng các vi khuẩn
Gram (+), kể cả những chủng đã kháng lại methycillin, vancomycin và teicoplanin có ý
nghĩa thực tế rất lớn.
1.8.3. Actinohivin - kháng sinh chống HIV [18].
Glycoprotein gpl20/gp41 của HIVl khi liên kết với các thụ thể của tế bào sẽ tạo
thành cầu nối trung gian cho sự dung hợp giữa virus và màng tế bào. Quá trình này thực
sự là mục tiêu hấp dẫn đối với các loại thuốc chống sự xâm nhiễm của HIV 1 vào tế bào
đích.
Actinohivin do một loài Streptomyces tạo ra là một protein bao gồm 114
aminoacid, có cấu trúc bậc 3. Mô hình thử tác dụng của kháng sinh này là các dòng tế
bào tái tổ hợp HELA/T_env/Tat và HELA/CD4/Lac-Z cho sự hình thành hợp bào dòng
T và HELA/M-env/Tat và H0S/CD4/CCR%/Lac-Z cho sự hình thành hợp bào dòng M.
Khi nuôi cấy chung các dòng tế bào này, sự hình thành hợp bào xảy ra sau 8h đến 30h.
Actinohivin ức chế sự hình thành các hợp bào T và M với nồng độ ức chế 50% (IC50)
tương ứng 60 và 700 nM. Hofn nữa, actinohivin còn thể hiện hoạt tính chống HIV mạnh
đối với các chủng HIVl và 2 với nồng độ ức chế 50% trong khoảng 2 đến 110 nM.
Actinohivin có khả năng liên kêt với các chuỗi saccharide của nhiều glycoprotein khác
nhau. Để xác định tính đặc hiệu của actinohivin với cacbonhydrat, tiến hành kiểm tra
với nhiều glycoprotein có số liên kết N khác nhau bằng phương pháp phân tích ELISA.
Kết quả là actinohivin có ái lực với các glycoprotein có nhiều olygosaccharide dạng
mannose. Tỉ lệ mannose trong gpl20 chiếm gần 50% oligosaccharride. Những nghiên
cứu này cung cấp những thông tin quý báu trong việc phát triển các kháng sinh chống
HIV.
1.8.4.Nâng cao sản lượng kasugamycỉn [8].
Kasugamycin do Streptomces kasugaensỉs tạo ra (Umezawa, 1965) được biết
đến như một kháng sinh thay thế Blasticidin chống bệnh vàng lụi cho lúa và không độc

cho người.
Việc nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kasugamycin được thực hiện bằng
phương pháp shock pH trong lên men gián đoạn (dải pH được thay đổi liên tục từ pH
trung tính đến pH acid và sau đó lại được đưa trở về lại pH trung tính). Trong suốt giai
đoạn pH acid, sự phát triển của tế bào giảm xuống mức tối thiểu. Sau thời gian phục hồi
ở điều kiện trung tính, tế bào phát triển trở lại tương ứng với mức sinh tổng hợp
kasugamycin được nâng cao rất nhiều nếu so sánh vód trường hợp không thực hiện
shock pH.
Tác giả đã tiến hành hàng loạt các thử nghiệm nhằm xác định thời gian tối ưu
kéo dài shock pH 6h, 12h, 24h, 48h. Kết quả tốt nhất thu được khi shock pH diễn ra
trong 24h với sản lưọỉng kasugamycin tăng gấp gần 7 lần so với các lần lên men gián
đoạn trước đây. Cụ thể, khi shock pH trong 24h, nồng độ tế bào giảm đi sau khi pH
được điều chỉnh từ 4,0 trở lại pH trung tính. Tuy nhiên, nồng độ tế bào lại tăng lên vào
thời điểm khoảng 1 lOh khi lên men mà không hề có pha tiềm tàng như các trường hơp
khác. Nồng độ tế bào cực đại đạt được là 16,5 g/1 vào khoảng 203h trong lên men sau
khi nguồn maltose (nguồn cacbon chính trong nghiên cứu) cạn kiệt.Lúc này, nồng độ
kasugamycin khoảng 183 mg/1. Những nhà nghiên cứu vãn đang tiếp tục thử nghiệm
phương pháp này. Họ tin tưởng phương pháp shock pH sẽ rất thích họfp khi áp dụng vào
lên men công nghiệp vì hệ thống kiểm soát pH đã được trang bị sẵn sàng ở hầu hết các
thiết bị lên men công nghiệp và việc triển khai nó hoàn toàn đơn giản.
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ.
2.1 Nguyên liệu :
2.1.1. Giống xạ khuẩn:
Chủng Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng và có đặc
tính di truyền ổn định, phát triển tốt trên môi trường Gauze 1 được bộ môn Công nghiệp
Dược cung cấp. Chủng Streptomyces này được phân lập từ bùn đất của ruộng lúa Thanh
Hoá, có ký hiệu là 315.
2.1.2. Giống vi sinh vật kiểm định:
Trong số 10 chủng vi sinh vật kiểm định đã được đem thử chịu tác dụng của chất
kháng sinh từ Streptomyces 315, chọn 2 chủng có độ mẫn cảm cao để làm vi sinh vật

kiểm định tiêu biểu, đó là:
Gr (-): Pseudomonas aeruginosa VM 201.
Gr(+): Bacillus pumilus ATCC 10241.
2.1.3. Các môi trường đã sử dụng:
- Môi trường G a u z e l đặc (MT1): Tinh bột 2g; K2HPO4 0,05g; MgS04.7ĩỈ20
0,05g; KNO3 0,lg; NaCl 0,05g; Thạch l,8g; Nước vừa đủ lOOml; pH 6,8-7,2;
Khử trùng trong nồi hấp 118-120‘’c trong 30 phút.
Môi trường Gauze 1 lỏng (lên men): thành phần tương tự nhưng bỏ thạch.
- Môi trường Czapek (MT2): Tinh bột khoai tây 2,0g; K2HPO4 0,lg; MgS04.7H20;
KCl 0,05g; NaN03 0,2g; Thạch 1,8 g; Nước vừa đủ lOOml; pH 6,8-7,2; Khử
trùng trong nổi hấp 118-120°c trong 30 phút.
Môi trường Czapek lên men : thành phần tương tự nhưng bỏ thạch.
- Môi trưòíng 3 (MT3): Tinh bột khoai tây 2,0g; CaC03 0,4g; (NH4)2S04 0,2g; Bột
đậu tưofng l,5g; C0CI2.H2O 0,002g; Cao nấm men 0,5g; Thạch l,8g; pH 6,8-7,0;
Nước vừa đủ lOOml; Khử trùng trong nồi hấp 118-120“c trong 30 phút.
Môi trường 3 lên men: thành phần tương tự nhưng bỏ thạch.
- Môi trưòíng 4 (MT4): Bột ngô 2g; CaC03 0,2g; NaCl 0,lg; C0CI2.H2O 0,002g;
Bột đậu tương l,Og; Thạch l,8g; pH 7,0-7,2; Nước vừa đủ lOOml; Khử trùng
trong nồi hấp 118-120°c trong 30 phút.
Môi trưòỉng 4 lên men: thành phần tương tự nhưng bỏ thạch.
- Môi trường thạch thường: pepton 0,5g; cao thịt 0,3g; NaCl 0,5g; thạch l,6-l,8g;
pH 6,8-7,0; nước vừa đủ lOOml; khử trùng trong nồi hấp 118- 120°c trong 30
phút.
Môi trưòng canh thang : thành phần tương tự MT thạch thưòỉng nhưng bỏ thạch.
- Môi trường phân loại xạ khuẩn MT 2’(ISP2): Cao nấm men 4,0g; dịch chiết malt
10,Og; glucose 4,0g; nước cất vừa đủ lOOOml; pH 7,3; agar 20,Og; khử trùng
trong nồi hấp 118- 120°c trong 30 phút.
- Môi trường phân loại xạ khuẩn MT 4’(ISP4): K2HPO4 l,Og; MgS04.7H20 l,Og;
NaCl l.Og; (NH4)2S04 2,0g; CaC03 2,0g; tinh bột 10,Og; nước cất lOOOml; pH
7,0-7,4; agar 20,Og; khử trùng trong nồi hấp 118- 120°c trong 30 phút.

- Môi trường phân lập xạ khuẩn MT5’(ISP5): L-asparagine l,Og; glycerin 10,Og;
K2HPO4 l,Og; nước cất vừa đủ lOOOml; dung dịch muối vi lượng 1,0 ml; pH 7,0-
7,4; agar 20,2g; khử trùng trong nồi hấp 118- 120°c trong 30 phút.
Dung dịch muối vi lượng: CUSO4.5H2O 0,64g; FeS04.7H20 0,1 Ig; MnCl2.4H20 0,79g;
ZnSƠ4.7 H2O 0,15g; Nước cất vừa đủ lOOml;
- Môi trường phân loại xạ khuẩn MT6’(ISP6): Pepton Iron agar 36,Og; cao nấm
men l,Og; nước cất vừa đủ lOOOml; pH 7,0-7,2; khử trùng trong nồi hấp 118-
120°c trong 30 phút.
Pepton Iron agar : acid citric 0,384g; FeS04.7H20 0,556g; NH4OH 25% 0,264g;
NajSjOs 0,1N 10ml; Nước cất vừa đủ lOOOml;
- Mồi trường phân loại xạ khuẩn MT7’(ISP7): glycerol 15,04g; L-tyrosine 0,5g;
L-asparagine l,Og; K2HPO4 0,5g; MgS04.7H20 0,5g; NaCl 0,05g; FeS04.7H20
0,01g; Nước cất vừa đủ lOOOml; dung dịch muối vi lượng l,Oml; pH 7,2-7,4;
agar 20,Og; khử trùng trong nồi hấp 118- 120°c trong 30 phút.
- Môi trưòỉng phân loại xạ khuẩn MT 9’(ISP9): (NỈÌ4)2S04 2,64g; KH2PO 4 2,38g;
K2HPO4.3H2O 5,65g; MgS04.7H20 Ig; dung dịch muối vi lượng 1,00 ml; nước
cất vừa đủ lOOOml; pH 6,8 - 7,0; agar 15,0g.
Các nguồn cacbon sử dụng bổ sung vào môi trường phân loại xạ khuẩn MT9’: L-
arabinose; saccarose; D-xylose; I-inositol; D-mannitol; D-fructose; rhamnose;
raffinose.
2.1.3.CÚC dung môi chiết:
Cloroform (d = 1,489; t°s = 61 - 63°C)
Buthylacetat (d = 0,8813 ; t°s = 121 - 127°C)
n-butanol (d = 0,810 ; t°s = 114 - 118°C)
2.1.5.Nguyên liệu dùng cho sắc k ý :
Bản mỏng sắc ký tráng sẵn silicagel 60 F254 (MERCK).
Dung môi chạy sắc ký : cloroforai, ethylacetat, acid formic, butanol, etanol,
amoniac IN.
2.1.6.Một số dụng cụ thiết bị quan trọng ; Máy lắc tròn, tủ cấy vô trùng, cân phân tích,
nồi hấp, tủ ấm, tủ sấy, v.v

2.2. Các phương pháp nghiên cứu :
Hình vẽ dưới đây giới thiệu quá trình sản xuất kháng sinh từ vi sinh vật trong đất ở quy
mô phòng thí nghiệm.
Hình 2: Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh từ v s v trong đất.
2.2.1. Chuẩn bị giống trong phòng thí nghiệm : giống trước khi đem sử dụng vào các
nghiên cứu khác cần phải được tuyển chọn cẩn thận, bảo đảm có hoạt tính cao, mật độ
và các chỉ số hoá sinh thích hợp.
- Nuôi cấy trên ống thạch nghiêng : chủng Streptomyces được nuôi cấy trên ống
thạch nghiêng Gauze 1 ở 30 - 32°c. Sau khi phát triển đủ 6 ngày tuổi, có thể đem
tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
- Nuôi cấy trên thạch đĩa : chủng Streptomyces được cấy chuyển sang các môi
trưòỉng trên đĩa thạch. Hoạt tính kháng sinh của chúng cũng được thử sau nuôi
cấy 6 ngày ở 30 - 32°c.
2.2.2.Phương pháp phán loại xạ khuẩn : Phân loại xạ khuẩn được tiến hành theo
phương pháp của ISP, dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý của xạ khuẩn sau một
thời gian nuôi cấy trong những môi trưòỉng chuyên biệt.
a. Đánh giá hình thái xạ khuẩn :
• Môi trường nuôi cấy : các môi trường 2’, 4’ và 5’ được rót vào các đĩa Petri, mỗi
đĩa khoảng 20ml. Cấy xạ khuẩn vào các đĩa thạch rồi nuôi cấy ít nhất 7 ngày ở nhiệt độ
28 - 30°c.
• Xác định đặc điểm hình thái cơ quan mang bào tử ;
Xác định đặc điểm của chuỗi bào tử và bào tử nhờ vào việc quan sát chúng qua
kính hiển vi điện tử trên bề mặt môi trưcmg nuôi cấy.
Xác định số lượng bào tử trên mỗi chuỗi và quan sát trạng thái của chúng : bào
tử đơn, gắn với nhau thành từng đôi, thành chuỗi hoặc chuỗi có nhiều hơn 10 bào tử.
Nếu như trạng thái của bào tử biến đổi trên một dải rộng thì chọn các hình thái bào tử
đặc trưng nhất xuất hiện nhiều hơn cả trong môi trường nuôi cấy.
Hình dáng của chuỗi bào tử phần lớn gồm những dạng đơn giản sau : thẳng (R),
uốn lượn (F), cong hay có hình móc câu (RA), xoắn (S). Ngoài ra, có thể có các dạng

đặc biệt hơn như tạo thành các chùm bào tử xoắn theo nhiều tầng hoặc đôi khi không
thể xác định được hình dạng thật sự của chuỗi bào tử.
• Xác định đặc điểm bề mặt bào tử : Cần phải quan sát bề mặt bào tử của xạ khuẩn
qua kính hiển vi điện tử có độ phóng đại từ 10.000 đến 20.000 lần. Bề mặt bào tử có thể
trơn nhẩn (sm); sần sùi (w); có gai (sp); có nhiều sợi tóc (h);
b. Xác định màu sắc :
• Môi trường nuôi cấy ; môi trường 2’ và 4’ được dùng để phát hiện màu sắc nuôi
cấy xạ khuẩn. Lấy một vòng quay cấy bào tử cấy lên môi trường các đường zích zắc, từ
đó nghiên cứu màu sắc tạo thành trên môi trường nuôi cấy sau 7,14 và 21 ngày.
• Xác định màu sắc của khuẩn ty khí sinh : Căn cứ vào các màu chủ yếu đỏ, vàng,
xanh lá cây, xanh da trời, xám, trắng. Tuy nhiên có nhiều trường hợp khó xác định
chính xác một dạng màu nhất định, vì thế ta có thể định dạng với hai màu (ví dụ như
trắng xám - GW).
• Màu của khuẩn ty cơ chất: được xác định dựa vào màu sắc mặt sau bào tử (tức
là mặt sau của đĩa Petri). Đơn giản nhất là đục một lỗ nhỏ ở môi trường đang nuôi cấy