Xạ khuẩn STREPTOMYCES SINH XYLANASE đặc điểm sinh học và phân loại

TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 45-50
45

XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CHARTREUSIS CP23X9 SINH XYLANASE:
ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI

Vũ Văn Lợi, Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Thị Hồng Liên,
Phạm Thị Bích Hợp, Phan Thị Hồng Thảo
*
Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *

TÓM TẮT: Xylan là thành phần chính của hemicellulose, được cấu tạo từ các phân tử D-xylopyranose
thông qua liên kết β-1,4 và các chuỗi bên. Sự phân hủy xylan bởi xylanase được nghiên cứu nhiều ở vi
sinh vật, đặc biệt là nấm và xạ khuẩn. Hiện nay, việc phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả
năng sinh xylanase cao được quan tâm bởi tiềm năng ứng dụng rộng rãi của chúng trong nhiều lĩnh vực
khác nhau, đặc biệt là trong công nghiệp giấy và bột giấy. Trong nghiên cứu này, chủng CP23X9 có khả
năng phân hủy xylan đã được mô tả đặc điểm sinh học và phân loại. Chủng CP23X9 thuộc nhóm xạ
khuẩn xanh và vàng xám, có chuỗi bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử dạng gai, số lượng bào tử trên
từng chuỗi khoảng từ 10-50. Chủng CP23X9 sinh trưởng tốt trên nhiều loại môi trường, ở điều kiện nhiệt
độ, pH khá rộng (nhiệt độ 15-45
o
C; pH = 5-10) và chịu được nồng độ muối NaCl đến 6%. Xạ khuẩn
CP23X9 có khả năng đồng hoá nhiều loại đường như D-glucose, D-xylose, D-mannitol, L-arabinose và L-
rhamnose. Đặc biệt, chủng có khả năng sinh enzyme ngoại bào phong phú (ligninase, protease, amylase),
có hoạt tính xylanase cao (42,7 U/ml) và không sinh cellulase. Đối chiếu các đặc điểm phân loại của
chủng với khóa phân loại xạ khuẩn ISP, khóa phân loại của Bergey và kết quả phân tích trình tự gen mã
hóa 16S rRNA cho thấy, chủng CP23X9 có đặc điểm tương đồng cao (99%) với loài Streptomyces
chartreusis. Hoạt tính xylanase của Streptomyces chartreusis CP23X9 có thể ứng dụng trong tẩy trắng bột
giấy.
Từ khóa: Streptomyces chartreusis, 16S rDNA, đặc điểm sinh học, phân loại xạ khuẩn, xylanase.

MỞ ĐẦU
Xylan là thành phần chính của
hemicellulose, chiếm 20-35% khối lượng chất
khô. Thành phần của xylan bao gồm mạch
chính được cấu tạo bởi đường D-xylopyranose
thông qua liên kết β-1,4 và các chuỗi bên O-
acetyl, α-L-arabinofuranosyl, α-D-glucuronosyl.
Để thủy phân hoàn toàn xylan cần có sự tham
gia hoạt động của tổ hợp xylanase [4]. Đến nay,
xylanase từ vi sinh vật được quan tâm chú ý
mạnh mẽ bởi khả năng ứng dụng trong nhiều
lĩnh vực như bột giấy, thức ăn chăn nuôi,
chuyển hóa lignocellulose, cồn sinh học và công
nghiệp đồ uống.
Xylanase được sinh tổng hợp bởi nhiều loài
vi sinh vật khác nhau như vi nấm, vi khuẩn, xạ
khuẩn (Penicillium janthinellum, Arthrobacter
sp., Streptomyces cyaneus, S. albus,
S. Chromofuscus và S. chartreusis) [2, 5, 8].
Trong đó, xylanase từ xạ khuẩn được công bố
có khả năng chịu nhiệt, chịu kiềm và không có
hoạt tính cellulase [8]. Sử dụng xylanase trong
tẩy trắng bột giấy giúp làm giảm lượng chlorine
(Cl
2
) và hypochlorine (ClO
2
) dùng trong trong
tẩy trắng, đồng thời giảm lượng hóa chất thải ra
môi trường. Đến nay, xylanase từ S. albus và S.

chromofuscus đã được ứng dụng thành công
trong tẩy trắng bột giấy, sử dụng xylanase từ
chủng S. albus giúp độ sáng của bột giấy tăng
4% và xylanase từ S. chromofuscus có hiệu quả
tẩy trắng tăng 9,1% so với không xử lý [8].
Trong bài này, chúng tôi nghiên cứu đặc điểm
sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn
CP23X9 sinh xylanase cao nhằm ứng dụng
trong tẩy trắng bột giấy.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Các chủng xạ khuẩn và vi sinh vật kiểm
định: Bacillus subtilis ATCC 6633,
Pseudomonas aeruginosa, Sarcina lutea,
Escherichia coli PA2, Staphylococcus aureus
208P và Candida albicans nhận từ bộ sưu tập
giống của Phòng Công nghệ lên men, Viện
Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
Vu Van Loi et al.
46
Môi trường nuôi cấy và phân loại: các môi
trường theo ISP (International Streptomyces
Project). Môi trường GI (g/l): Oat spelts xylan
5; K
2
HPO
4
0,5; MgSO
4

.7H
2
O 0,5; KNO
3
0,5;
NaCl 0,5; FeSO
4
.H
2
O 0,0; pH 7,2-7,5. Môi
trường Gause I (g/l): Tinh bột tan 20; K
2
HPO
4
0,5; MgSO
4
.7H
2
O 0,5; KNO
3
0,5; NaCl 0,5;
FeSO
4
.H
2
O 0,01; pH 7,2-7,5. Môi trường Gause
II (g/l): Glucose 10; pepton 5; cao thịt 0,5; NaCl
5; pH 7,2-7,5.
Phương pháp
Phương pháp xác định hoạt tính xylanase

Hoạt tính xylanase được xác định bằng đo
lượng đường khử giải phóng ra từ 0,5% (w/v)
oat spelts xylan, sử dụng 3,5- Dinitrosalicylic
acid (DNS) là chất phản ứng [3] và D-xylose
làm đường chuẩn. Một đơn vị hoạt tính enzyme
xylanase được định nghĩa là lượng enzyme cần
để giải phóng ra 1µmol xylose từ oat spelts
xylan 0,5% (w/v) trong điều kiện thí nghiệm
[7].
Phân loại CP23X9 bằng quan sát đặc điểm hình
thái, phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA
Nghiên cứu đặc điểm sinh học theo phương
pháp trong ISP (1974) và khóa phân loại Bergey
[6, 12]. Màu sắc của khuẩn ty cơ chất (KTCC),
khuẩn ty khí sinh (KTKS) và sắc tố tan tiết ra
môi trường được đánh giá theo Shirling và
Gottlieb (1966) trên bảng màu của Tresner &
Backus [10, 11]. Hình dạng cuống sinh bào tử
và bào tử được quan sát và chụp ảnh dưới kính
hiển vi điện tử JSM-5000.
Phân tích trình tự gen 16S rDNA
DNA tổng số của chủng CP23X9 được tách
chiết theo phương pháp của Sambrook &
Russell (2001) [9]. Gen mã hóa 16S rRNA của
chủng vi khuẩn được khuếch đại bằng phản ứng
PCR từ DNA tổng số sử dụng cặp mồi GF1 (5'-
TAACACATGCAAGTCGAACG-3') và GR1
(5’-GG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3’) theo
chu trình nhiệt: 94
o

C trong 5 phút, 30 chu trình
(94
o
C trong 60 giây, 60
o
C trong 60 giây, 72
o
C
trong 90 giây), 72
o
C trong 10 phút, giữ mẫu ở
4
o
C. Sản phẩm của phản ứng PCR được phân
tích trên máy đọc trình tự ABI PRISM 3100
Avant Genetic Analyzer, xử lý bằng phần mềm
SeqAssem version 01/2005 và Sequencher
version 4.0.5. Mức độ tương đồng gen 16S
rDNA của chủng nghiên cứu được so sánh với
các trình tự gen 16S rDNA trong Genbank.
Mức độ tương đồng di truyền của các chủng
được xây dựng dựa trên phần mềm ClustalX
2.0.11.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tuyển chọn xạ khuẩn sinh xylanase
Từ các mẫu mùn gỗ mục đã phân lập được
12 chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp
xylanase. Trong số đó, chủng CP23X9 sinh tổng
hợp xylanase mạnh nhất (42,70 U/ml) được lựa
chọn để định tên đến loài nhằm sử dụng trong

các nghiên cứu tiếp theo (bảng 1).

Bảng 1. Hoạt tính xylanase của một số chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Chủng Xylanase (U/ml) Chủng Xylanase (U/ml)
CP5X1 36,75 CP18X3 34,38
CP6X5 27,33 CP18X21 23,32
CP12X7 21,34 CP20X2 36,07
CP13X8 22,79 CP22X6 25,59
CP13X11 30,86 CP23X9 42,70
CP16X6 33,25 CP25X11 24,13

Chủng xạ khuẩn tuyển chọn có hoạt tính
xylanase tương đương với hoạt tính xylanase
thu nhận từ các chủng xạ khuẩn được một số tác
giả công bố trên thế giới như Streptomyces
chartreusis L1105 (45,16 U/ml), S. albus (32,53
U/ml), S. chromofuscus (43,01U/ml) [2, 8].
Đặc điểm sinh học của chủng CP23X9
Đặc điểm nuôi cấy
Chủng CP23X9 thuộc nhóm xạ khuẩn vàng
xám, sinh trưởng tốt trên các môi trường ISP1-
3, ISP5-7, Gause I, Gause II và sinh trưởng yếu
TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 45-50
47
trên môi trường ISP4 và Gause I. Khuẩn ty khí
sinh có màu vàng trên môi trường ISP1 và ISP6,
màu xanh trên ISP2-ISP5, Gause I và Gause II.
Trên các môi trường ISP1, ISP4, ISP5, ISP6 và
Gause I, khuẩn ty cơ chất có màu vàng và có
màu xám trên ISP2, ISP3, ISP7 và Gause II.

Chủng CP23X9 không tạo sắc tố melanin trên
các môi trường nghiên cứu (hình 1a, 1b).





Hình 1. Khuẩn lạc mặt trước (a), mặt sau (b), bề mặt bào tử (c)
và cuống sinh bào tử (d) của chủng CP23X9.

Đặc điểm bào tử dưới kính hiển vi điện tử
Chủng CP23X9 được nuôi trên môi trường
ISP2 sau 5 ngày. Quan sát dưới kính hiển vi
điện tử JSM-5000 ở độ phóng đại 5000 lần cho
thấy, cuống sinh bào tử của chủng CP23X9 có
dạng xoắn (S) (hình 1d), trên một chuỗi có
khoảng 10-50 bào tử. Ở độ phóng đại 10000
lần, bề mặt bào tử dạng gai (sp) (hình 1c).
Đặc điểm sinh lý sinh hóa
Nghiên cứu khả năng đồng hóa các nguồn
đường là chỉ tiêu quan trọng để tiến hành phân
loại xạ khuẩn theo khóa phân loại của
Nomomura trong ISP (1974) [6]. Kết quả cho
thấy chủng CP23X9 có khả năng đồng hoá
nhiều loại đường, phát triển tốt trên các môi
trường có bổ sung D-glucose, D-xylose,
D-mannitol, L-arabinose và L-rhamnose, phát
triển yếu trên môi trường có lactose, D-fructose
và saccharose nhưng không phát triển trên môi
trường có sorbitol. Xạ khuẩn CP23X9 có thể

sinh trưởng được ở điều kiện nhiệt độ từ 15-
45C, pH 5-10 và chịu được nồng độ muối
NaCl tới 6% w/v. Dịch nuôi cấy từ chủng
CP23X9 có khả năng ức chế một số chủng vi
khuẩn kiểm định như Bacillus subtilis 6630,
Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus
aureus 208P. Tuy nhiên, chủng này lại không
có khả năng ức chế Sarcina lutea, Escherichia
coli PA2 và nấm Candida albicans. Chủng có
hệ enzyme ngoại bào phong phú như ligninase,
protease, amylase, nhưng không sinh tổng hợp
cellulolase.
Định tên đến loài chủng CP23X9
Đối chiếu các đặc điểm phân loại của chủng
nghiên cứu theo các khóa định tên loài xạ khuẩn
trong ISP, so sánh với khóa phân loại Bergey,
chúng tôi xác định chủng CP23X9 có thể xếp
vào nhóm xạ khuẩn Streptomyces. Tuy nhiên,
để phân loại chủng CP23X9 đến loài, cần kết
a
b
c d
Vu Van Loi et al.
48
hợp kết quả về đặc điểm sinh hóa và trình tự
gen 16S rDNA.
Từ kết quả xác định trình tự cho thấy, gen
16S rDNA của chủng CP23X9 có độ tương
đồng cao (98-99%) với các gen tương ứng của
một số xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces (hình

2): S. chartreusis XSD08102, S. chartreusis
DA10203, S. chartreusis HA10304,
S. chartreusis DSM41255 (99%),
S. flavovariabilis 1184, S. phaeoluteigriseus
ISP5182, S. bobili NBRC13199, S. galilaeus
JCM 4757, S. pseudovenezuelae HBUM174623
(98%). Như vậy, kết quả phân loại cho thấy
chủng xạ khuẩn CP23X9 có đặc điểm rất gần
gũi và có độ tương đồng cao với loài
Streptomyces chartreusis nên chủng xạ khuẩn
này được đặt tên là Streptomyces chartreusis
CP23X9.


Hình 2. Mức độ tương đồng di truyền giữa chủng Streptomyces chartreusis CP23X9
với các loài xạ khuẩn có họ hàng gần dựa vào 16S rRNA

Khả năng sinh tổng hợp xylanase
Trong những năm gần đây, khả năng sinh
tổng hợp xylanase từ các chủng xạ khuẩn cũng
được nhiều tác giả công bố như S. cyaneus [5],
S. albus, S. chromofuscus [8], Streptomyces sp.
Lb24 [7], S. chartreusis [2] và Streptomyces
AMT-3 [40]. Theo Li et al. (2011) [2], chủng
S. chartreusis L1105 sinh xylanase đạt cực đại
(45,16 U/ml) sau 7 ngày trên môi trường sử
dụng oat spelt xylan làm nguồn cacbon. Chủng
xạ khuẩn CP23X9 trong công bố này thể hiện
khả năng sinh tổng hợp xylanase cao (42,70
U/ml) không sinh tổng hợp cellulose và qua

phân loại cho thấy đây là một trong những loài
xạ khuẩn có ý nghĩa trong việc ứng dụng xử lý
tẩy trắng bột giấy đã được nhiều tác giả công
bố. Thí dụ, sau quá trình ủ bột giấy với xylanase
từ S. chartreusis L1105, S. Thermoviolaceus và
Streptomyces sp. QG-11-3 hệ số kappa (thể hiện
mức độ khử lignin) giảm lần lượt là 12,2; 16 và
23% [2]. Sử dụng xylanase từ chủng S. albus
giúp độ sáng của bột giấy tăng 4% so với không
xử lý. Trong khi đó, hiệu quả tăng độ sáng của
bột giấy nhận được là 9,1% khi sử dụng
xylanase từ S. chromofuscus [8]. Khả năng sinh
tổng hợp xylanase của Streptomyces chartreusis
CP23X9 trong nghiên cứu này đạt tới 42,70
U/ml cho thấy là đây là một trong những chủng
xạ khuẩn bản địa quí, có triển vọng trong xử lý
tẩy trắng bột giấy.
TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 45-50
49
KẾT LUẬN
Chủng CP23X9 phân lập từ gỗ mục, sinh
trưởng tốt trên nhiều loại môi trường, trong
khoảng nhiệt độ và pH khá rộng (nhiệt độ 15-
45
o
C; pH 5-10) và chịu được nồng độ NaCl đến
6%. Chủng CP23X9 thuộc nhóm xạ khuẩn
xanh hoặc vàng xám, có chuỗi bào tử dạng
xoắn, bề mặt bào tử dạng gai, số lượng bào tử
trên từng chuỗi khoảng từ 10-50. Chủng có hệ

enzyme ngoại bào phong phú (ligninase,
protease, amylase), có hoạt tính xylanase cao
(42,7 U/ml) và không sinh cellulase. Đối chiếu
các đặc điểm phân loại của chủng nghiên cứu
theo các khóa phân loại ISP, so sánh với khóa
phân loại Bergey và kết hợp với kết quả phân
tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA cho thấy,
chủng CP23X9 thuộc loài Streptomyces
chartreusis với độ tương đồng 99%.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bajai B. K., Razdan K., Sharma A., 2010.
Thermoactive alkali-stable xylanase
production from a newly isolated
Streptomyces sp. SU9. Indian J. Chem.
Technol., 17: 375-380.
2. Li X., Sun B., Zhao J., Lv Y., Song H., Li
E., Zhu Y., 2011. Production and improved
bleaching abilities of a thermostable
xylanase from a newly isolated
Streptomyces chartreusis strain. Afr J.
Biotechnol., 10(64): 14132-14142.
3. Miller L., 1959. Use of dinitrosalicylic acid
reagent for determination of reducing sugar.
Anal. Chem., 31: 426-431.
4. Nascimento R. P., Coelho R. R. R.,
Marques S., Alves L., Gírio F. M., Bon E.
P. S., Amaral-Collaco M. T., 2002.
Production and partial characterisation of
xylanase from Streptomyces sp. strain
AMT-3 isolated from Brazilian cerrado soil.

Enzyme Microb. Technol., 31: 549-555.
5. Ninawe S., Kapoor M., Kuhad R. C., 2008.
Purification and characterization of
extracellular xylanase from Streptomyces
cyaneus SN32. Bioresour. Technol., 99:
1252-1258.
6. Nomomura H., 1974. Key for classification
and identification of 458 species of the
Streptomyces included in ISP. J. Ferment.
Technol., 52(2): 78-92.
7. Rawashded R., Saadoun I., Mahasneh A.,
2005. Effect of cultural conditions on
xylanase production by Streptomyces sp.
(strain Ib 24D) and its potential to utilize
tomato pomace. Afr. J. Biotechnol., 4(3):
251-255.
8. Rifaat H. M., Nagieb Z. A., Ahmed Y. M.,
2005. Production of xylanase by
Streptomyces species and their bleaching
effect on rice straw pulp. Appl. Ecol.
Environ. Res., 4(1): 151-160.
9. Sambrook J., Russell D. W., 2001.
Molecular cloning. A laboratory manual,
3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, New York.
10. Shirling E. B., Gottlieb D., 1966.
Cooperative description of type culture of
Streptomyces species. Int. J. Sys. Bacteriol.,
19(4): 391-512.
11. Shirling E. B., Gottlieb D., 1966. Methods

for characterisation of Streptomyces species.
Int. J. Sys. Bacteriol., 16(3): 313-340.
12. Wilkins W., 1989. Bergey’s Manual of
Systematic Bacteriology. Vol. 2, Vol. 3,
Vol. 4. Publisher Springer-Verlag, New
York.








Vu Van Loi et al.
50

STREPTOMYCES CHARTREUSIS CP23X9 PRODUCING XYLANASE:
BIOLOGICAL CHARACTERISTICS AND CLASSIFICATION

Vu Van Loi, Nguyen Van Hieu, Nguyen Thi Hong Lien,
Pham Thi Bich Hop, Phan Thi Hong Thao

Institute of Biotechnology, VAST

SUMMARY

Xylan is the major component of hemicellulose that makes up for plant cell. It is constructed by 1,4-β-
linked-D-xylopyranosyl units with several side-groups. Xylan can be degraded by xylanase from
microorganisms such as fungi, bacteria and actinomyces. Enzyme xylanase is widely applied in industry, such

as textile, paper and pulp, and food production. In this study, an Actinomyces strain CP23X9 producing
xylanase was characterized and identified. The results showed that strain CP23X9 can grow well on different
media with a wide range of temperature between 15-45
o
C; pH 5-10, and salinity of 0-6%. On the agar plate,
the strain has blue aerial mycelia and pale yellow vegetative mycelia. The mature spore chains appeared
spirals, moderately long, bearing 10 to 50 spores each; the spore surface spiny. The strain utilized carbon
sources such as D-glucose, D-xylose, D-mannitol, L-arabinose và L-rhamnose. Strain CP23X9 capable of
extracellular enzymes producing, such as ligninase, protease, amylase and with high xylanase activity (42.7
U/ml). Based on the biological characteristics and phylogenetic analysis of 16S rDNA, it can be concluded
that strain CP23X9 is close to Streptomyces chartreusis (99%), hence identified as Streptomyces chartreusis
CP23X9. The xylanase activity of Streptomyces chartreusis CP23X9 will be used in improved bleaching
abilities in future
Keywords: Streptomyces chartreusis, 16S rDNA, Actinomyces classification, biological characteristics,
xylanase.

Ngày nhận bài: 30-6-2013