bước đầu nghiên cứu chuyển gen ipt (isopentenyl transferase) vào mô sẹo sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Tạ Thị Diễm Thu

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN
IPT (ISOPENTENYL TRANSFERASE) VÀO
MÔ SẸO SÂM NGỌC LINH (PANAX
VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Tạ Thị Diễm Thu

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN
IPT (ISOPENTENYL TRANSFERASE) VÀO
MÔ SẸO SÂM NGỌC LINH (PANAX
VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.)
Chuyên ngành : Sinh Học Thực Nghiệm
Mã số

: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN HỮU HỔ

Thành phố Hồ Chí Minh – 2011


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công
trình nào.
TẠ THỊ DIỄM THU


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ
của nhiều cá nhân và tập thể. Luận văn hoàn thành, cũng là lúc tôi có cơ hội bày tỏ
lòng biết ơn chân thành:
TS. Nguyễn Hữu Hổ- Thầy đã hướng dẫn, động viên tôi từ ngày bắt đầu cho
đến lúc hoàn thành đề tài. Thầy đã truyền đạt cho tôi nhiều kinh nghiệm, đồng thời
Thầy cũng đã giúp tôi có tính nhẫn nại, kiên trì và lòng tâm huyết đối với lĩnh vực
nghiên cứu.
Thầy Lê Tấn Đức- đã tận tình chỉ dẫn, hỗ trợ kinh nghiệm và phương pháp
nghiên cứu để tôi hoàn thành tốt luận văn.
Các Thầy, Cô khoa Sinh, trường Đại học Sư phạm TP.HCM đã truyền đạt tri
thức và hướng dẫn tôi trong suốt khóa học.
Các anh chị, bạn bè đang làm việc và thực tập tại phòng Công Nghệ Gen,
Viện Sinh học Nhiệt đới đã chia sẻ, giúp đỡ trong thời gian cùng làm việc.
Ba Mẹ, anh chị đã luôn hỗ trợ, động viên tôi trong thời gian thực hiện luận
văn.
Ban Giám Hiệu và đồng nghiệp trường THPT Nguyễn Thái Bình (Tây Ninh)

đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi chuyên tâm vào việc nghiên cứu và hoàn thành
luận văn.
Tất cả các bạn đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến, chia sẻ và động viên trong thời
gian làm luận văn, trong công việc và trong cuộc sống.
Tạ Thị Diễm Thu


MỤC LỤC
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN......................................................................................... 3
1.1. GIỚI THIỆU CHI PANAX ................................................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm .......................................................................................................... 3
1.1.2. Phân bố ............................................................................................................ 3
1.1.3. Phân loại .......................................................................................................... 4
1.1.4. Thành phần hóa học .......................................................................................... 6
1.1.5. Tác dụng chính của sâm .................................................................................. 6
1.2. SÂM NGỌC LINH ................................................................................................ 9
1.2.1. Nguồn gốc và lịch sử phát hiện ....................................................................... 9
1.2.2. Đặc điểm sinh học và phân bố ....................................................................... 10
1.2.3. Phân bố .......................................................................................................... 12
1.2.4. Thành phần hóa học chính ............................................................................. 12
1.2.5. Tác dụng dược lý của sâm Ngọc Linh ........................................................... 18
1.3. PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT NHỜ VI KHUẨN
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS (A. TUMEFACIENS)................................. 21

1.3.1. Vi khuẩn A. tumefaciens ................................................................................ 22
1.3.2. Ti-plasmid của A. tumefaciens ....................................................................... 23
1.3.3. Cơ chế biến nạp T–DNA vào tế bào ký chủ .................................................. 25
1.3.4. Ứng dụng vi khuẩn A. tumefaciens trong chuyển gen thực vật ...................... 28
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN SAU KHI
CHUYỂN VÀO TẾ BÀO THỰC VẬT .................................................................... 29
1.4.1. Phương pháp thử in vitro khả năng kháng kháng sinh của mô chuyển gen ....... 29
1.4.2. Phương pháp hóa mô tế bào (Phương pháp thử GUS) .................................. 30
1.4.3. Phương pháp PCR (Polimerase Chain Reaction) .......................................... 30
1.5. GEN IPT (ISOPENTENYL TRANSFERASE) .................................................. 32
1.5.1. Một số nghiên cứu chuyển gen ipt ................................................................. 32


1.5.2. Cơ chế tác dụng của gen ipt ........................................................................... 33
1.6. NUÔI CẤY TẾ BÀO – SẢN XUẤT HỢP CHẤT THỨ CẤP ......................... 34
1.6.1. Hợp chất thứ cấp và nuôi cấy tế bào .............................................................. 34
1.6.2. Quy trình nuôi cấy tế bào sản xuất hợp chất thứ cấp ..................................... 35
1.6.3. Một số phương pháp tăng hiệu quả sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi
cấy mô, tế bào ............................................................................................................... 36
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...................................................... 38
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................................ 38
2.1.1. Mẫu cấy .......................................................................................................... 38
2.1.2. Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 .............................. 38
2.1.3. Enzyme cắt giới hạn ...................................................................................... 39
2.1.4. Mồi và thang chuẩn ....................................................................................... 39
2.1.5. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ....................................................... 40
2.1.6. Môi trường và điều kiện nuôi cấy .................................................................. 43
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 44
2.2.1. Thí nghiệm về nuôi cấy mô ........................................................................... 44
2.2.2. Thí nghiệm chuyển gen ................................................................................. 46

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 54
3.1. THÍ NGHIỆM VỀ NUÔI CẤY MÔ .................................................................. 54
3.1.1. Tạo mô sẹo từ lá sâm ex vitro và cuống lá sâm in vitro ................................ 54
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp 2,4-D và TDZ đến khả năng tăng sinh
khối mô sẹo lá sâm ....................................................................................................... 55
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi từ mô sẹo lá sâm ...........58
3.2. THÍ NGHIỆM CHUYỂN GEN ......................................................................... 66
3.2.1. Khảo sát nồng độ hygromycin thích hợp cho thí nghiệm chuyển gen .......... 66
3.2.2. Chuyển gen vào mô sẹo sâm Ngọc Linh nhờ vi khuẩn A. tumefaciens ........ 68
3.2.3. Kiểm tra sự hiện diện/biểu hiện của các gen chuyển ..................................... 73
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................................ 79
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 80
PHỤ LỤC
T
3

T
3

T
0

T3
0

T
0

T
0

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D:

2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

BA:

6-Benzylaminopurin

bp:

Base pair

cs.:

Cộng sự

dNTP:

Deoxyribonucleotide triphosphate

DNA:

Deoxyribonucleic acid

EDTA:

Ethylenediamine tetraacetic acid

EtBr:

Ethidium bromide

gus A:

Gen tạo enzyme β-D-glucuronidase

GUS:

Enzyme β-D-glucuronidase

hpt:

Gen tạo enzyme hygromycin phosphotransferase

HPT:

Enzyme hygromycin phosphotransferase

ipt:

Gen tạo enzyme isopentenyl transferase

IPT:

Enzyme isopentenyl transferase

kD:

Kilodalton

MS:

Môi trường Murashige and Skoog

RNA:

Ribonucleic acid

SH:

Môi trường Schenk và Hidebrandt

PCR:

Polymerase chain reaction

pVDH396:

Plasmid pVDH396

SAG:

Senescence-associated gene

SAG 12 -IPT:

Promoter SAG 12 -IPT

Taq:

Thermus aquaticus

TDZ:

Thidiazuron

Ti:

Tumor-inducing

X-gluc:

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide

Vir:

Gen gây độc (Virulence)

R

R

R

R

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Hệ thống phân loại các loài thuộc chi Panax ở châu Á và thế giới ..........5
Bảng 1.2. Hàm lượng một số saponin chính trong sâm (đã trừ độ ẩm)................... 13
Bảng 1.3. Hàm lượng saponin của sâm Ngọc Linh so với các loài Panax ............. 13
Bảng 1.4. Các saponin chính yếu trong thành phần saponin dẫn chất
protopanaxatriol ............................................................................................ 14
Bảng 1.5. Acid Oleanolic......................................................................................... 14
Bảng 1.6. Ocotillol ................................................................................................... 14
Bảng 1.7. Các axid béo được tìm thấy ..................................................................... 15
Bảng 1.8. Thành phần acid amin chủ yếu ................................................................ 16
Bảng 1.9. Các nguyên tố vi lượng ........................................................................... 17
Bảng 1.10. Vai trò các gen vir. ................................................................................ 25
Bảng 2.1. Kích thước thang λ-HindIII .................................................................... 40
Bảng 2.2. Kích thước thang 1 kb ............................................................................. 40
Bảng 2.3. Nồng độ 2,4-D và TDZ cho thí nghiệm tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc
Linh...................................................................................................................... 45
Bảng 2.4. Nồng độ NAA và BA cho thí nghiệm tạo chồi từ mô sẹo sâm Ngọc
Linh...................................................................................................................... 46
Bảng 2.5. Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR ................................................ 52
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ lên khả năng tăng sinh
hối của mô sẹo sâm Ngọc Linh ................................................................................ 55
Bảng 3.2. Kết quả tái sinh chồi sâm Ngọc Linh sau 12 tuần ................................... 58
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát nồng độ hygromycin .................................................... 67


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây sâm Ngọc Linh ................................................................................ 11
Hình 1.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đang bám vào tế bào thực vật ..... 22
Hình 1.3. Khối u ở thực vật do Agrobacterium tumefaciens gây ra ....................... 23
Hình 1.4. Sơ đồ gen của Ti–plasmid trong vi khuẩn A. tumefaciens ...................... 24

Hình 1.5. Acetosyringone giúp hoạt hóa vùng vir trong quá trình chuyển gen ...... 26
Hình 1.6. Trình tự biến nạp T-DNA vào tế bào ký chủ. ......................................... 27
Hình 1.7. Sơ đồ plasmid tái tổ hợp dựa trên nguyên tắc của Ti-plasmid. ............... 29
Hình 1.8. Sơ đồ tạo cytokinin trong thực vật dưới tác dụng của gen ipt................. 34
T
3

Hình 2.1. Sơ đồ plasmid pVDH396 mang gen chọn lọc kháng hygromycin .......... 38
Hình 2.2. Vị trí của gen hpt, gen ipt, gen gusA trong vùng T-DNA của plasmid
pVDH396 ................................................................................................................. 39
Hình 2.3. Vật liệu dùng nuôi cấy tạo mô sẹo .......................................................... 45
Hình 3.1. Mô sẹo của hai loại vật liệu dùng nghiên cứu sau 2 tháng nuôi cấy ....... 54
Hình 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ lên khả năng tăng sinh mô
sẹo sâm Ngọc Linh sau 8 tuần.................................................................................. 56
Hình 3.3. Chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần trên môi trường C1,
C2, C3, C4, C5 và C6 ............................................................................................... 60
Hình 3.4. Cận cảnh chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần trên môi
trường C1, C2, C3 .................................................................................................... 61
Hình 3.5. Cận cảnh chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần trên môi
trường C4, C5 và C6 ................................................................................................ 62
Hình 3.6. Sự hình thành và phát triển của phôi soma từ mô sẹo mảnh lá. .............. 63
Hình 3.7. Sự hình thành và phát triển của phôi soma từ mô sẹo cuống lá in vitro . 65


Hình 3.8. Kết quả thử hygromycin sau 8 tuần ......................................................... 68
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid pVDH396 ................................... 69
Hình 3.10. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen ipt ở plasmid tách chiết từ vi
khuẩn A. tumefaciens LBA4404 tạo được qua biến nạp .......................................... 70
Hình 3.11. Chọn lọc mô chuyển gen ....................................................................... 72
Hình 3.12. Thử nghiệm hóa mô GUS mô chuyển gen ............................................ 74

Hình 3.13. Ảnh chụp gel điện di sản phẩm PCR gen hpt (băng DNA 800 bp)....... 75
Hình 3.14. Ảnh chụp gel điện di sản phẩm PCR gen ipt (băng DNA 650 bp) ....... 76
Hình 3.15. Chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh chuyển gen ......................................... 78


1

MỞ ĐẦU
Một số loài thực vật họ Sâm (Araliaceae) nói chung, sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) nói riêng – giống đặc hữu của nước ta là các loài cây
dược liệu rất quý đối với nhiều nước trên thế giới đặc biệt đối với các nước châu Á
như Trung Quốc, Triều Tiên, Việt Nam,...; rễ sâm chứa nhiều hợp chất có tác dụng
dược lý quan trọng.
Sâm Ngọc Linh đã được chứng minh ngoài tác dụng bổ dưỡng còn có nhiều
tác dụng khác như kích thích hoạt động não bộ, nội tiết tố sinh dục, tạo hồng cầu,
kháng khuẩn đặc hiệu với chủng Streptococcus, chống oxy hóa, chống lo âu, chống
trầm cảm, bảo vệ gan, giảm cholesterol và lipid máu, hạ đường huyết, điều hòa tim
mạch, điều hòa miễn dịch và phòng chống ung thư.
Ngoài các nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn theo phương pháp truyền
thống, hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nói chung và biến nạp gen
nói riêng trong công tác giống sâm Ngọc Linh đã và đang được các nhà khoa học
trong và ngoài nước đặc biệt quan tâm.
Như chúng ta đã biết, ipt là gen mã hóa isopentenyl transferase - enzyme
quan trọng của con đường sinh tổng hợp cytokinin ở thực vật. Vai trò tích cực của
gen ipt trong cơ thể thực vật chuyển gen thể hiện tập trung ở một số điểm như: 1/
Làm chậm sự lão hóa, tăng sinh trưởng và năng suất, tăng độ bền của lá và hoa đối
với nhiều loại thực vật như Arabidopsis, thuốc lá, Petunia, bông cải, cải xà lách,
cúc; 2/ Ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp các chất thứ cấp - tăng
hàm lượng artemisinin ở cây Thanh hao chuyển gen; 3/ Làm tăng khả năng chịu hạn
khi gen ipt biến nạp được điều khiển bởi promoter đặc trưng P SARK (senescence

R

R

associated receptor protein kinase); 4/ Có thể ứng dụng tác động của gen này như
yếu tố chọn lọc in vitro – thay thế tác nhân chọn lọc khác. Với ý nghĩa nêu trên,
nghiên cứu biến nạp gen ipt là vấn đề cần được quan tâm.
Đến nay trên thế giới cũng như ở trong nước chưa ghi nhận được công trình
công bố kết quả nghiên cứu về biến nạp gen nói chung và biến nạp gen ipt nói riêng
trên đối tượng sâm Ngọc Linh.


2
Do vậy, đề tài “Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ipt (isopentenyl
transferase)vào mô sẹo sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”
được đặt ra với mục đích tạo được mô sẹo sâm Ngọc Linh mang gen ipt bằng kỹ
thuật biến nạp gen phục vụ cho mục đích nghiên cứu dài hạn về ảnh hưởng của gen
chuyển ipt đến khả năng tăng sinh tổng hợp các chất thứ cấp.
Mục tiêu của đề tài
Tạo được một số dòng mô sẹo sâm Ngọc Linh mang gen đích ipt qua biến
nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Giới hạn của đề tài
Đề tài chỉ tập trung nghiên cứu tạo ra dòng mô sẹo chuyển gen, bước đầu
đánh giá sự hiện diện và biểu hiện của các gen chuyển bằng thử nghiệm định tính
(thử GUS) và phương pháp sinh học phân tử (PCR). Chưa nêu nội dung phân tích
hàm lượng hợp chất thứ cấp.


3

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU CHI PANAX
1.1.1. Đặc điểm
Panax là chi thực vật có nhiều cây làm thuốc quan trọng, trong đó có họ Nhân
sâm. Đến nay đã biết 14 loài được công bố trên thế giới. Vùng phân bố của chi
Panax ở bắc bán cầu, từ trung tâm Hymalaya qua đông bắc Trung Quốc, vùng Viễn
đông nước Nga, Triều Tiên, Nhật Bản đến Bắc Mỹ…[5], [68]
Đặc biệt, ở Việt Nam năm 1973 đã phát hiện một loài Panax mọc hoang trên
diện tích rộng, ở độ cao 1.800 - 2.000m trên dãy Trường Sơn nam, đó là loài sâm
Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), còn gọi là sâm K5, sâm Ngọc Linh.
Ngoài ra, ở Việt Nam còn phát hiện loài sâm Vũ Diệp (Panax bipinatifidus) và sâm
Tam Thất (Panax pseudoginseng) ở các tỉnh miền núi phía Bắc giáp Trung Quốc.
Một số nghiên cứu các cây thuộc họ Nhân sâm có đặc điểm chung sau:
Về thành phần hóa học: hợp chất saponin thường được đánh giá là thành phần
hoạt chất chính của những cây thuộc họ Nhân sâm và được tập trung nghiên cứu để
xác định cấu trúc.
Về tác dụng dược lý: các tác dụng chính của những cây thuộc họ Nhân sâm là
tác dụng bổ, tăng lực, chống stress và một số tác dụng khác như giải độc gan; tác
dụng trên nội tiết tố; thận; cơ, xương, khớp,… [5], [6], [46]
1.1.2. Phân bố
Cho đến nay các nhà khoa học đã biết trên thế giới có khoảng 14 loài thuộc chi
Panax, phân bố: [71]
* Panax ginseng C.A. Mey. (Nhân sâm) = Panax schinseng Nees: loài hoang
dại, hiện nay rất hiếm, được trồng ở Đông Bắc, châu Á.
* Panax quingquefolium L. (Sâm Mỹ): mọc hoang và được trồng ở vùng Bắc
Mỹ.
* Panax trifoliatus L. (Dwarf ginseng, “Sâm lùn”): có ở Bắc Mỹ.
* Panax notoginseng F.H. Chen ex C.Y. Wu et K.M. Feng: phân bố của loài
hoang dai chưa rõ, đã được trồng ở Vân Nam, Trung Quốc.

4
* Panax pseudo-ginseng Wall. subsp. Pseudo-ginseng Hara: mọc hoang dại,
rất hiếm, được tìm thấy ở phía đông dãy Himalaya.
* Panax japonicus C.A. Mey. (Panax pseudo-ginseng Wall. subsp. Japonicus
(Meyer) Hara): mọc hoang dại ở Nhật Bản và miền Nam Trung Quốc.
* Panax japonicus C.A. Mey. var. maijor (Burk.) C.Y. Wu et K.M. Feng
(Panax pseudo-ginseng Wall var. maijor (Burk.) Li.): mọc hoang dại ở miền Nam
Trung Quốc.
* Panax japonicus C.A. Mey. var. angustifolius (Burk.) Chen et Chu: mọc
hoang ở miền Nam Trung Quốc.
* Panax japonicus C.A. Mey. var. bipinatifidus (Seem.) C.Y. Wu et K.M.
Feng: mọc hoang ở miền Nam Trung Quốc.
* Panax zingiberensis C.Y. Wu et K.M. Feng: mọc hoang ở miền Nam Trung
Quốc.
* Panax stipuleanatus H. Tsai et K.M. Feng: mọc hoang ở miền Nam Trung
Quốc từ Vân Nam đến Tây Tạng và miền Bắc Việt Nam.
* Panax pseudo-ginseng Wall. subsp. Himalaycus Hara: mọc hoang ở phái
Đông dãy Himalaya.
* Panax sp.: gồm mẫu C (thu hái ở Chame, Nepal) và mẫu G (thu hái ở
Ghorapani, Nepal): mọc hoang ở miền Trung Nepal.
* Panax vietnamensis Ha et Grushv.: mọc hoang và được trồng ở hai tỉnh Kon
Tum và Quảng Ngãi.
1.1.3. Phân loại
Đã có một số nghiên cứu về thực vật của các loài thuộc chi Panax. Và gần đây
nhất là hệ thống phân loại của Jun Wen (2001) thống kê 12 trong số 14 loài và dưới
loài của chi Panax đã được đề cập ở trên. [71]


5

Bảng 1.1. Hệ thống phân loại các loài thuộc chi Panax ở châu Á và thế giới
H.L. Li
(1942)
P. schinseng
Nees

H. Hara
C. Hoo
(1970)
(1973)
P. ginseng C.A. P. ginseng
Mey.
C.A. Mey.

C.Y. Wu et al
(1973)
P. ginseng
C.A. Mey.

P.Pseudoginseng
Wall.

P.Pseudoginseng
Wall.
Subsp.
Pseudoginseng

P. Pseudoginseng
Wall.
Var.

Pseudoginseng

P.Pseudoginseng P. Pseudoginseng
Wall.
Wall.

Var.
Notoginseng
(Burk.) Hoo et
Tseng
Var. japonicus

Var.
Notoginseng
(Burk.) Chen

Var. Notoginseng
F.H. Chen

P. japonicus
C.A. Mey.

P. japonicus
C.A. Mey.

Subsp.
japonicus

Var.
Wanggianus

(Sun) Hoo et
Tseng

Var. major
(Burk.) Li

Var.
Angustatus
(Makino) Hara
Subsp.
Himalaycus
Hara

Var. elagantior
(Burk.) Wu et
Feng

Jun Wen
(2001)
P. ginseng
C.A. Mey.

P. Wanggianus
S.C. Sun

Var. major
(Burk.)

Var.
Angustifolius

(Burk.) Li

P. Bipinnatifidus
Seem.
Var. Angustifolius
(Burk.) Jun
Wen

P.
Stipuleanatus
Tsai et Feng
P.
Zingiberensis
C.Y. Wu et
K.M. Feng

P. Stipuleanatus
Tsai et Feng
P. Zingiberensis
C.Y. Wu et K.M.
Feng
P. trifolius L.
P. Quinquefolius
P. Vietnamensis
Ha et Grushv.


6
1.1.4. Thành phần hóa học
Saponin và polyacetylen là hai nhóm hoạt chất chính có trong chi Panax.

1.1.4.1. Hợp chất saponin [1], [5], [6], [7], [80], [81]
Saponin còn gọi là saponin glycoside hay saponoside do chữ Latinh “sapo” có
nghĩa là xà phòng (vì tạo bọt như xà phòng), là một nhóm glycoside lớn, gặp rộng
rãi trong thực vật. Mỗi một saponin đều có hai phần: sapogenin (aglycon) và đường.
Phần sapogenin có thể là một chất steroid hay triterpenoid. Phần đường thường là
glucose, galactose, pentose hay metyl pentose.
Saponin được xem là thành phần hoạt chất chính trong các loài sâm. Các nhà
khoa học đã chiết tách và xác định cấu trúc của hơn 100 saponin từ các loài Panax
L. có thành phần chính là các saponin triterpenoid tetracylic nhóm dammaran, gọi
chung là glycoside.
1.1.4.2. Hợp chất polyacetylene [1], [6], [81], [94], [113]
Polyacetylene được phát hiện trong sâm Triều Tiên và những năm 60 và phát
hiện thấy có tác dụng phòng chống ung thư vào những năm 80 của thế kỷ 20. Cấu
tạo của polyacetylen thường là các hydrocacbon mạch thẳng có 17 hoặc 18 carbon
có gắn với các nhóm chất liên kết. Đó là đặc điểm của đa số hợp chất có chứa một
đầu là nhóm 3-hydroxyl (hoặc 3-oxo) heptadeca-1-en-4,6-diyn, đầu còn lại là chuỗi
C 7 H 15 .
R

R

R

R

Việc nghiên cứu những hợp chất polyacetylen trong các cây họ Nhân sâm đã
cho thấy chúng thể hiện một số đặc tính sinh học như: kháng nấm, kháng khuẩn,
kháng viêm, kháng ngưng tập tiểu cầu, độc tế bào và kháng ung thư.
1.1.5. Tác dụng chính của sâm
Sâm Triều Tiên nói riêng và Nhân sâm nói chung có vai trò quan trọng trong

dự phòng và điều trị các bệnh mãn tính như: bệnh tiểu đường, ung thư, sơ vữa động
mạch, huyết khối, lipid máu, cao huyết áp, thiểu năng tuần hoàn não,… do có tác
dụng tăng cường thể lực và gia tăng sức đề kháng của cơ thể. [6], [53]


7
1.1.5.1. Tác dụng tăng lực, phục hồi sức [37], [90], [93]
Bột chiết sâm Triều Tiên và các ginsenosid chính như G-Rg1, G-Rb1 làm thay
đổi các thông số sinh hóa trong máu liên quan đến chuyển hóa năng lượng trong quá
trình vận động như làm tăng hàm lượng glucose, giảm hàm lượng glycogen trong
máu (do tăng dự trữ glycogen trong gan), giảm acid béo tự do, giảm hàm lượng
triglyceride, giảm hàm lượng acid lactic và acid pyruvic. Điều này cho thấy bột
chiết sâm Triều Tiên làm thay đổi cơ chế hằng định nội môi về năng lượng trong
quá trình vận động theo chiều hướng làm gia tăng khả năng sinh hóa của cơ xương,
oxy hóa acid béo tự do sản sinh năng lượng vận động thay cho glucose.
1.1.5.2. Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương
Sâm Triều Tiên thể hiện tác dụng lên hệ thần kinh theo hai hướng là kích thích
hoặc ức chế tùy theo thành phần ginsenosid và trạng thái bệnh lý. Takagi và cộng sự
đã chứng minh rằng các saponin thuộc nhóm protopanaxadiol mà tiêu biểu là GRb1 hoặc hỗn hợp saoponin có G-Rb1 và G-Rc thể hiện ức chế hệ thần kinh trung
ương, trong khi các saponin thuộc nhóm protopanaxatriol, tiêu biểu là G-Rg1 và
những hợp chất tan trong lipid thể hiện tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương,
chống mệt mỏi. [37], [71], [81], [90]
Sâm Mỹ còn có tác dụng điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, G-Rb1 và G-Rg1
đóng vai trò chủ yếu trong tác dụng này. [127]
1.1.5.3. Tác dụng cải thiện trí nhớ
Bột chiết hồng sâm Triều Tiên có tác dụng cải thiện rõ khả năng học tập- ghi
nhớ do hoạt chất G-Rg1 quyết định, nhất là những tổn thương trong hoạt năng não
bộ liên quan đến tuổi già. [38], [69]
1.1.5.4. Tác dụng đáp ứng thích nghi và chống stress
Tác dụng dược lý quan trọng của sâm Triều Tiên là duy trì sự hằng định nội

môi, đưa về bình thường những trạng thái sinh lý bất thường của cơ thể do stress
gây ra. G-Rg1 thuộc nhóm protopanaxatriol saponin là hoạt chất có tác dụng quyết
định chống stress của sâm Triều Tiên. Cơ chế tác động chống stress có liên quan


8
đến trung khu điều hòa nhiệt độ và sự tạo thành chất hóa học trung gian histamin
của vùng dưới đồi. [90], [115]
1.1.5.5. Tác dụng chống oxy hóa và chống lão hóa
Các ginsenosid thuộc nhóm panaxatriol như G-Rb1, G-Rb2 và ginsenosid
thuộc nhóm panaxadiol như G-Rg1 được chứng minh là những chất có tác dụng
chống oxy hóa điển hình của sâm Triều Tiên. Dịch chiết nước hồng sâm Triều Tiên
uống dài ngày có tác dụng kéo dài thời gian sống, giảm hàm lượng cholesterol,
glucose, TBARS (sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào), gia tăng
hoạt năng của các enzyme chống oxy hóa nội sinh như superoxyd dismutase (Cu,
Zn-SOD và Mn-SOD), catalase, glutathione peroxydase trong gan. [53], [82]
1.1.5.6. Tác dụng bảo vệ gan
Sâm Triều Tiên có tác dụng bảo vệ gan theo cơ chế tác dụng chống oxy hóa.
Các chất điển hình có tác dụng bảo vệ gan: 20(S)-ginsenosid-Rh2, 20(R)ginsenosid-Rg3 và prosapogenin của 20(R)-ginsenosid-Rh2 và 20(S)-ginsenosidRs. [5], [113]
1.1.5.7. Tác dụng điều hòa miễn dịch
Dịch chiết nước rễ sâm Triều Tiên làm gia tăng sự tạo thành kháng thể sơ cấp
và thứ cấp in vitro, làm tăng hoạt tính của IgM, IgG và tế bào K (natural killer
cells), làm gia tăng sự sản sinh interferon, tế bào lympho.
Bột chiết hồng sâm Triều Tiên (liều uống 50 - 500mg/kg thể trọng) có tác
dụng kích thích không đặc hiệu đáp ứng miễn dịch. [87], [98]
1.1.5.8. Tác dụng chống ung thư
Tác dụng gia tăng hoạt năng của tế bào K là một trong những cơ chế tác dụng
chống ung thư của sâm Triều Tiên. Bột chiết hồng sâm Triều Tiên và phân đoạn
polysaccharid thể hiện tác dụng kháng ung thư, giảm tần suất và ức chế sự tăng sinh
các khối u. [69], [94]

1.1.5.9. Tác dụng trên hệ tim mạch và huyết áp
Dịch chiết hồng sâm Triều Tiên (liều 200- 500mg/kg thể trọng) và các
ginsenosid chính như G-Rg1 và G-Rb1 có tác dụng cải thiện sự tuần hoàn máu gây


9
bởi nhiệt độ quá lạnh hoặc bởi norepinephrin, làm giảm suy tim thực nghiệm gây
bởi adriamycin. Bột hồng sâm 1,5-6g/ ngày x 2lần trong 3-24 tháng làm gia tăng sự
co bóp cơ tim, giãn mạch ngoại biên, cải thiện những thông số huyết động của tim,
rõ nhất là ở người cao tuổi. Ngoài ra, dịch chiết methanol của hồng sâm Triều Tiên
(liều 200mg/kg thể trọng) có tác dụng gia tăng tuần hoàn máu trong gan, lách, màng
nhày dạ dày, thận. [37], [57], [114]
* Ngoài những tác dụng chính trên, Nhân sâm còn có tác dụng hạ cholesterol
và lipid máu, giảm đau, giải độc, kích thích ăn ngon, làm sáng mắt, kéo dài tuổi thọ,
điều hòa nội tiết tố sinh dục,… [56], [114]
1.2. SÂM NGỌC LINH
1.2.1. Nguồn gốc và lịch sử phát hiện [5], [17], [132]
Trước khi có sự phát hiện từ phía các nhà khoa học, sâm Ngọc Linh đã được
các đồng bào dân tộc thiểu số Trung Trung Bộ Việt Nam, đặc biệt là dân tộc Xê
Đăng, sử dụng như một loại củ rừng, mà họ gọi là củ ngải rọm con hay cây thuốc
giấu, chữa nhiều loại bệnh theo các phương thuốc cổ truyền. Sâm Ngọc Linh sống
trên vùng núi cao thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam. Theo những thông tin
lưu truyền trong cộng đồng các dân tộc thiểu số của hai tỉnh này về một loại củ quý
hiếm trên núi Ngọc Linh có tác dụng tốt đối với sức khỏe con người và do nhu cầu
của kháng chiến, ngành dược khu Trung Trung Bộ quyết phải tìm ra cây sâm chi
T
5

T
5

T
5

Panax tại miền Trung.
T
5

Năm 1973, khu Y tế Trung Trung bộ cử một tổ 4 cán bộ đi điều tra tìm cây
sâm theo hướng chân núi Ngọc Linh thuộc huyện Đắc Tô tỉnh Kon Tum. Với sự hỗ
T
5

T
5

trợ của cán bộ địa phương, đến 9 giờ sáng ngày 19 tháng 03 năm 1973, ở độ cao
1800 mét so với mặt biển, đoàn đã phát hiện hai cây sâm đầu tiên và ngay buổi
chiều cùng ngày đã phát hiện được một vùng sâm rộng lớn thuộc phía Tây núi Ngọc
Linh. Sau 15 ngày nghiên cứu toàn diện về hình thái, sinh thái, quần thể, quần lạc,
phân bố, di cư và phát tán, đã xác định núi Ngọc Linh là quê hương của cây sâm
mới, đặc biệt quý hiếm. Thời điểm này cây sâm phát hiện được đặt tên là “sâm đốt
trúc” với tên khoa học với tên khoa học sơ bộ được xác định là Panax articulates


10
L., họ Nhân sâm (Araliaceae). Từ đó cây sâm này được nghiên cứu nhiều về đặc
điểm hình thái, phân tích thành phần hóa học, tác dụng dược lý,…
Trải qua hơn 30 năm, sâm Ngọc Linh hay sâm Việt Nam, một loài sâm đặc
hữu của nước ta đã được thế giới biết đến với tên khoa học là Panax vietnamensis

Ha et Grushv. Tên khoa học này do Hà Thị Dung và Grushvistky I. V.đặt, được
công bố nǎm 1985 tại Viện thực vật Kamarov (Liên Xô cũ).
1.2.2. Đặc điểm sinh học và phân bố
1.2.2.1. Đặc điểm hình thái [5], [6], [7], [17]
Sâm Ngọc Linh là cây thảo, sống lâu năm nhờ thân rễ, cao khoảng 40 - 80 cm,
đôi khi trên 1m.
Thân rễ nạc, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài 30 - 40cm, có thể hơn, mang
nhiều rễ nhánh và củ, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh hàng năm để lại, mặt ngoài
màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối đuôi đôi khi có một củ hình cầu. Thân rễ
còn mang nhiều rễ phụ, ở cây hoang dại, thân rễ là phần phát triển mạnh nhất chứa
chất dự trữ, hoạt chất. Hình dạng thay đổi, rễ củ ở cây sâm hoang dại phát triển có
dạng con quay, hình trụ, có màu vàng nhạt mang nhiều rễ con với những vàm
ngang. Đối với sâm trồng, rễ củ rất phát triển, tăng trưởng hàng năm rất rõ rệt, có ba
dạng chính: dạng củ cà rốt, con quay và dạng bó củ.
Thân khí sinh mảnh, thẳng màu xanh hay hơi tím, mọc thẳng, mang 2- 4 lá kép
chân vịt mọc vòng, mỗi lá kép có 5 lá chét hình trứng ngược hoặc hình mác, dài 1014cm, rộng 3- 5cm, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành mũi nhọn, mép khía răng
nhỏ.
Hoa tự, cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có cuống dài 10- 20cm có thể
kèm 1- 4 tán phụ hay 1 hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính. Mỗi tán 60- 100 hoa,
cuống hoa ngắn 1- 1,5cm, lá đài 5, cánh hoa 5, vàng nhạt, nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi
nhụy. Đài có 5 răng dài, nhị 5, chỉ nhị hình sợi, bầu 1 ô với một vòi nhụy.
Lá kép, chân vịt mọc vòng với 3- 5 nhánh lá, cuống lá kép, mang 5 lá chét, lá
chét phiến bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, có lông ở cả hai mặt.


11
Quả hạch, hình trứng, khi chín có màu đỏ hay vàng nhạt, sau chuyển màu đen,
hạt hình thận màu trắng, bề mặt hạt có nhiều chỗ lồi lõm, có vân, quả mọc tập trung
ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8- 1cm và rộng khoảng 0,5 - 0,6cm, mỗi quả chứa
một hạt, một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây khoảng 10 đến 30 quả.

Mùa hoa: tháng 4– tháng 6, mùa quả: tháng 7– tháng 9.

a

b

Hình 1.1. Cây sâm Ngọc Linh.
a.: Cây sâm ngoài tự nhiên, b.: Cây sâm trồng trong vườn
( />1.2.2.2. Đặc điểm sinh thái
Sâm Ngọc Linh là loại cây thân thảo ưa ẩm và ưa bóng, sinh trưởng ở độ cao
từ 1200 – 2100m so với mặt biển, mọc rải rác hay tập trung thành từng đám nhỏ
dưới tán rừng. Môi trường rừng nơi có sâm mọc luôn ẩm ướt, thường xuyên có mây
mù, nhiệt độ khoảng 15- 180C, lượng mưa khoảng 3000mm/ năm. Đất rừng ở đây
P

P

được tạo thành do lá cây mục lâu ngày, có màu nâu đen, tơi xốp, hàm lượng mùn
cao và chứa nhiều nước.
Sâm Ngọc Linh sinh trưởng mạnh trong mùa xuân hè. Mùa hoa quả từ tháng 5tháng 10, cây ra hoa quả tương đối đều hàng năm. Sau khi quả chín rụng xuống đất,
tồn tại qua mùa đông khoảng 4 tháng và sẽ nảy mầm vào đầu mùa xuân năm sau,
sâm có khả năng tái sinh tự nhiên từ hạt khá tốt.
Sâm có phần thân trên mặt đất lụi hàng năm, để lại các vết sẹo rõ. Mỗi năm từ
đầu mầm thân rễ (kể cả phần thân rễ phân nhánh) chỉ mọc lên một thân mang lá.
Căn cứ vào vết sẹo trên thân rễ để tính tuổi của sâm. [7], [17], [22]


12
1.2.3. Phân bố
Trong số hơn mười loài và dưới loài đã biết của chi Panax, ở Việt Nam có ba

loài mọc tự nhiên và một loài là cây nhập trồng. Sâm Ngọc Linh được phát hiện sau
cùng vào 1973. Đến 1985 được công bố là hoàn toàn mới đối với khoa học. Đến
nay sâm Ngọc Linh chỉ mới được phát hiện ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh
Quảng Nam và Kon Tum.
Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai của Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107o50’–
P

P

108o7’ kinh tuyến Đông và từ 15o0’– 15o10’ vĩ tuyến Bắc, đỉnh cao nhất là Ngọc
P

P

P

P

P

P

Linh cao 2598m. Những điểm vốn trước đây có sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độ
cao khoảng 1500m- 2200m, chủ yếu tập trung ở 1800– 2000m, thuộc địa bàn của
hai huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam). Về giới hạn cũng
như phân bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh hiện nay đã có nhiều thay đổi. [17]
1.2.4. Thành phần hóa học chính
1.2.4.1. Hợp chất saponin
Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây sâm
Ngọc Linh cũng như của các loài sâm khác trên thế giới. Các saponin dammaran

được xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh học. [68]
Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ) chứa 49 hợp chất saponin, gồm 25
saponin đã biết và 24 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vina-ginsenosid-R1R24.
Phần trên mặt đất có 19 saponin damaran đã được phân lập, gồm 11 saponin
đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới đặt tên là vinaginsenosid-L1-L8. [5], [16], [17]


13
Bảng 1.2. Hàm lượng một số saponin chính trong sâm (đã trừ độ ẩm) [5]
Nguyên liệu

Hàm lượng saponin chính (%)
G-Rb1

GRd

G-Ry1

R2

Tổng cộng

Đầu mầm

0.943

0.898

1.359

2.859

6.059

Sâm 2 tuổi

0.979

0.426

1.235

1.868

4.236

Sâm 3 tuổi

0.846

0.678

1.419

2.409

5.352

Rễ củ 4 tuổi

0.818

0.396

1.696

3.141

6.051

Rễ củ 5 tuổi

1.721

0.518

2.219

3.816

8.674

Rễ củ 6 tuổi

1.824

0.632

2.285

4.166

9.474

1.518

1.778

2.432

2.946

8.674

1.565

0.981

1.652

4.276

8.494

2.716

0.840

3.648

5.342

12.546

Thân rễ 4
tuổi
Thân rễ 5
tuổi
Thân rễ 6
tuổi

Bảng 1.3. Hàm lượng saponin của sâm Ngọc Linh so với các loài Panax [5]
Loại aglycon

Panax
ginseng

Panax

Panax

Panax

notoginseng quinquefolius vietnamensis

20(S)–ppd

2.9

2.1

2.7

3.1

20(S)–ppt

0.6

2.4

1.2

2.0

Ocotillol

–

–

0.04

5.6

Oleanolic acid

0.02

–

0.07

0.09

Hiệu suất toàn

3.5

4.5

4.0

10.8

phần (%)
(Ghi chú: 20(S)-ppd: 20(S)-protopanaxadiol; 20(S)-ppt: 20(S)-protopanaxatriol)


14
Bảng 1.4. Các saponin chính yếu trong thành phần saponin dẫn chất
protopanaxatriol [5]
Kiểu

R1

R2

G-ReI

(I)

-H-

-Glc2-Rha

-Glc-

0.17

20-glc-G-Rf

(I)

-H-

-Glc2-Glc

-Glc-

0.01

G-Rg 1 *

(I)

-H-

-Glc2-Glc

-Glc-

1.37

G-Rh 1

(I)

-H-

-Glc-

-H-

0.008

N-R 1 *

(I)

-H-

-Glc2-Xyl

-Glc-

0.36

N-R 6

(I)

-H-

-Glc-

-Glc6-

0.01

G-R 4

(I)

-Glc2-Glc

-H-

-Glc-

0.004

G-R 12

(K)

-H-

-Glc-

-H-

0.005

G-R 15

(J)

-H-

-Glc-

-Glc-

0.003

G-R 17

(K)

-H-

-Glc-

-Glc-

0.002

G-R 18

(K)

-H-

-Glc-

-Glc-

0.002

G-R 19

(L)

-Glc2-Glc

-H-

-Glc-

0.006

Tên
P

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

P

P

R3

R

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

R

P

P

Hiệu suất (%)

Bảng 1.5. Acid Oleanolic [5]
Tên

Kiểu

R1

R2

Hiệu suất (%)

G-R 0

(O)

-Glc2-Glc

-Glc-

0.038

H-Ma

(O)

-Glc2-Glc-Ara(p)

-Glc-

0.05

R

R

P

P

P

P

Bảng 1.6. Ocotillol [5]
Kiểu

R1

R2

(M)

-Glc-

-CH 3

0.065

(M)

-Glc2-Rha

-CH 3

0.005

M-R 1 *

(M)

-Glc2-Glc

-CH 3

0.14

M-R 2 *

(M)

-Glc2-Xyl

-CH 3

5.29

G-R 1

(M)

-Glc2-Rha-Ac 6

-CH 3

0.033

G-R 2

(M)

-Glc2-Xyl-Ac 4

-CH 3

0.014

Tên
PG-RT 4
R

24(s)-PGF 11

R

P

Hiệu suất (%)
R

P

R

R

R

R

R

R

R

R

P

P

P

P

R

P

R

P

P

R

P

R

R

R


15
G-R 6

(M)

Glc

-CH 3

0.006

G-R 14

(M)

-Glc2-Xyl

-CH 2 OH

0.02

G-R 10

(N)

-Glc-

-CH 3

0.007

R

R

R

P

P

R

R

R

R

1.2.4.2. Hợp chất polyacetylen
Có 7 hợp chất đã được phân lập, 5 hợp chất đã được xác định cấu trúc với
panaxynol và heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol là 2 polyacetylen chính yếu.
Hai hợp chất mới là 10 acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và heptadeca1,8(E),10(E)-trien-4-6-diyn-3,10-diol. [16]
1.2.4.3. Thành phần acid béo
Bảng 1.7. Các axid béo được tìm thấy [5]
STT

Số carbon của hợp chất

%

1

8C

Vết

2

10 C

Vết

3

11 C

Vết

4

12 C

0.22

5

13 C

0.31

6

14 C

1.33

7

15 C

0.40

8

15 C1=

0.31

9

16 C

29.12

10

16 C1=

Vết

11

17 C

1.13

12

17 C1=

Vết

13

18 C

4.48

Acid stearic

14

18 C1=

13.26

Acid oleic

15

18 C2=

40.04

Acid linoleic

16

18 C3=

2.61

Acid linolenic

17

20 C

1.51

P

P

P

P

P

P

Tên

Acid palmitic