Nghiên cứu tạo rễ tơ của cây hoàng liên gai (berberis juliane) cho mục tiêu nuôi cấy sinh khối dược liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2





LƯU VIẾT THỦY






NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ
CỦA CÂY HOÀNG LIÊN GAI (Berberis juliane)
CHO MỤC TIÊU NUÔI CẤY SINH KHỐI DƯỢC LIỆU







LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2014





BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2





LƯU VIẾT THỦY





NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ
CỦA CÂY HOÀNG LIÊN GAI (Berberis juliane)
CHO MỤC TIÊU NUÔI CẤY SINH KHỐI DƯỢC LIỆU

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số : 60 42 01 14



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Chu Hoàng Hà






Hà Nội, 2014




LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã hướng dẫn,
giúp đỡ tận tình để tôi hoàn thành luận văn này:
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người Thầy của tôi:
PGS. TS. Chu Hoàng Hà – Trưởng phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện
trưởng Viện Công nghệ sinh học, người Thầy đã định hướng nghiên cứu,
đồng thời cũng chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể
hoàn thành luận văn này.

Tôi xin được cảm ơn Cô giáo TS. Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng
Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện
cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2 đã tạo điều kiện cho chúng tôi được học tập tại trường. Tôi xin chân
thành cảm ơn thầy giáo TS. Nguyễn Văn Đính – CN Khoa Sinh – KTNN,
các thầy, cô giáo đang công tác tại Khoa Sinh – KTNN đã tận tình dạy dỗ
chúng tôi trong thời gian qua.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới sự giúp đỡ của CN Nguyễn Khắc
Hưng, Th.s Hoàng Đăng Hiếu cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ Tế
bào thực vật và phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh
học đã dành cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn.
Cảm ơn tất cả những người bạn cùng thực tập với tôi và các bạn lớp
Sinh học thực nghiệm K16, đặc biệt là bạn Phạm Văn Hoàng đã giúp đỡ rất
nhiều trong thời gian thực hiện đề tài.


Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân
thành tới những người thân trong gia đình và bạn bè – những người luôn động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.

Hà Nội, tháng 12 năm 2014
Học viên

Lưu Viết Thủy

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu tạo rễ tơ của cây Hoàng liên gai
(Berberis juliane) cho mục tiêu nuôi cấy sinh khối dược liệu” là công trình
nghiên cứu của tôi. Những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam đoan rằng
mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông
tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Tác giả

Lưu Viết Thủy


MỤC LỤC
I. MỞ ĐẦU 1
II. NỘI DUNG 6
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6
1.1. Tổng quan về cây Hoàng liên gai 6
1.1.1. Phân bố địa lý 6
1.1.2. Phân loại 6

1.1.3. Hình thái và đặc điểm sinh thái 7
1.1.4. Tác dụng dược lý của cây Hoàng liên gai. 8
1.1.5. Tính cấp thiết nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây Hoàng
liên gai 12
1.2. Tổng quan về nuôi cấy sinh khối rễ tơ 13
1.2.1. Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối tế bào 13
1.2.2. Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes 15
1.2.3. Cơ chế chuyển các gen vùng T – DNA vào tế bào thực vật 16
1.2.4. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ. 19
1.3. Các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị DNA vào việc xác định loài 23
Chương II: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. Vật liệu 26
2.2. Dụng cụ - hóa chất 26
2.3. Phương pháp nghiên cứu 26
2.3.1. Thu thập và nhận dạng loài bằng chỉ thị phân tử. 26


2.3.2. Phương pháp khử trùng hạt và đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro 28
2.3.3. Phương pháp chuyển gen thông qua A.rhizogenes 29
3.4. Kiểm tra hiệu quả chuyển gen thông qua biểu hiện tạm thời gen gus. 31
Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
3.1. Thu thập và nhận dạng loài Hoàng liên gai 33
3.1.1. Thu thập mẫu 33
3.1.2. Nhận dạng loài bằng so sánh hình thái 35
3.1.3. Nhận dạng loài bằng chỉ thị DNA 37
3.2. Kết quả khử trùng hạt và đưa mẫu Hoàng liên gai vào nuôi cấy in
vitro là nguyên liệu cho nuôi cấy mô tế bào và chuyển gen tạo rễ tơ. 45
3.3. Tối ưu hóa quy trình chuyển gen và tiến hành chuyển gen tạo rễ tơ
thông qua Agrobacterium rhizogenes. 47
3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen 47

3.3.2. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn Agrobacterium tới hiệu quả chuyển
gen 50
3.3.3.Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen 52
3.4. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen 54
III. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 61
PHỤ LỤC 69
Phụ lục 1: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG MS VÀ WPM 69
Phụ lục 2: KẾT QUẢ SO SÁNH TRÌNH TỰ DNA THÔNG QUA CÁC
MỒI CỦA SẢN PHẨM PCR 71


NHỮNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
A.rhizogenes
Agobacterium rhizogenes
A.tumefaciens
Agobacterium tumefaciens
AS
Acetosyringone
bp
Base pair
DNA
Desoxyribo nucleic acid
Gus
Escherichia coli – β – D – glucoronidase gene
GusA
β-glucuronidase
HLG1
Hoàng liên gai 1 (Berberis wallichiana DC.
1824)

HLG2
Hoàng liên gai 2 (Berberis julianae Schneid.
1913).
ITS
Internal Transcribed Spacer
kp
Kilobase pair
LB
Lauria Broth
MS
Murashige and Skoog
Ri-plasmid
Root inducing plasmid
Rol
Root locus
sp
Species
T- DNA
Transfer DNA)
TDZ
Thidiazuron
Vir
Virulence genes
YMB
Yeast Malnitol Broth



DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG BIỂU
1. Danh mục các hình ảnh

Hình 1.1: Cây Hoàng liên gai 6
Hình 1.2: Một số bênh ở thực vật gây ra bởi Agrobacterium sp. 15
Hình 1.3: Cấu trúc Ri - plasmid 16
Hình 1.4: Cơ chế chuyển gen của Agrobacterium sp 18
Hình 1.5. Các hệ rễ tơ được nuôi cấy 19
Hình 3.1: Hai loài Hoàng liên thu thập tại Vườn Quốc gia Hoàng liên 35
Hình 3.2. Kết quả khuếch đại và tách dòng đoạn gen ITS từ mẫu Hoàng liên
gai. 38
Hình 3.3. Cây phân loại xây dựng theo phương pháp NJ của chỉ thị trnL 41
Hình 3.4. Cây phân loại xây dựng theo phương pháp NJ của chỉ thị ITS. 44
Hình 3.5: Quá trình vào mẫu hạt Hoàng liên gai 47
Hình 3.6: Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen 49
Hình 3.7: Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng biểu hiện gen gus 51
Hình 3.8: Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chyển gen. 53
Hình 3.9: Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen. 56
Hình 3.10: Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai 58


2. Danh mục bảng biểu
Bảng 1.1: Một số loài thực vật được nuôi cấy rễ tơ để thu hoạt chất sinh học. . 21
Bảng 2.1: Thông tin các mồi sử dụng trong nghiên cứu 27
Bảng 3.1. Thông tin và kí hiệu mẫu Hoàng liên gai thu thập tại Sa Pa 33
Bảng 3.2. Thông tin các trình tự của 2 loài Hoàng liên gai nghiên cứu đăng ký
trên Genbank 34
Bảng 3.3: Đặc điểm hình thái hai loài Hoàng liên tại Sa pa - Lào Cai 35
Bảng 3.4: Đặc điểm phân biệt hai loài Hoàng liên 37
Bảng 3.5. Bảng hệ số sai khác xây dựng trên trình tự nucleotit của gen trnL 39
Bảng 3.6: Kết quả khử trùng hạt Hoàng liên gai 46
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen 48
Bảng 3.8: Kết quả ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến hiệu quả chuyển gen 50

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả
chuyển gen. 53
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu
quả chuyển gen 55
Bảng 3.11: Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai 57

1

I. MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Hoàng liên gai (hay Hoàng mù – Hoàng mộc) Berberis juliane là cây
thảo dược quý hiếm phân bố tại vùng Tây Bắc Việt Nam. Hoàng Liên gai
mọc nhiều tại Sa Pa - Lào Cai và một số tỉnh thuộc vùng Tây Nam Trung
Quốc. Hoàng liên gai là vị thuốc được sử dụng từ lâu trong các bài thuốc
Đông y chữa các bệnh tiêu hóa như: viêm ruột, tiêu chảy, lỵ, trĩ, viêm túi mật,
sốt cao, viêm gan, hoàng đản, viêm ngứa ngoài da, mụn nhọt Thân rễ
Hoàng liên gai chứa nhiều hợp chất alkaloid (5 - 8%), trong đó chủ yếu là
berberin. Ngoài ra trong thân rễ Hoàng liên gai còn có worenin, coptisin,
palmatin… Các alkaloid trong Hoàng liên gai chia thành 2 nhóm chính: các
alkaloid có nhân phenol và các alkaloid không có nhân phenol. Các thành
phần alkaloid của Hoàng liên gai đều chứa trong hầu hết các bộ phận của cây.
Tuy nhiên ở mỗi bộ phận lại có hàm lượng thay đổi, tùy theo mùa phát triển
của cây. Vào tháng 9 - 10, hàm lượng berberin ở thân rễ và rễ nhánh cao,
trong khi đó, vào khoảng tháng 10, hàm lượng alkaloid ở lá già trước khi rụng
cũng thường cao. Trong số các hợp chất alkaloid nói trên, berberin được y
học quan tâm đến nhiều nhất, sau đó là palmatin.
Hiện nay, số lượng cá thể Hoàng liên gai ngoài tự nhiên suy giảm mạnh
do bị khai thác quá mức. Hoàng liên gai được đưa vào danh sách các loài thực
vật đang nguy cấp trong Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá "đang
nguy cấp" (Bậc E) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý

hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính
phủ để nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại. Trước tình
hình trên, bên cạnh việc nghiên cứu các giá trị y dược của cây Hoàng liên gai
ở Việt Nam, cần đưa ra các phương pháp bảo tồn cũng như khai thác hiệu quả
2

cây Hoàng liên gai. Bên cạnh việc trồng bảo tồn ngoại vi (Ex situ) tại vườn
quốc gia Hoàng liên, việc ứng dựng các kỹ thuật công nghệ sinh học vào quá
trình bảo tồn và phát triển bền vững cây Hoàng liên gai theo hướng thu sinh
khối tế bào thực vật là một trong những yêu cầu cấp bách và cần thiết.
Cùng với xu hướng chung trên thế giới, hướng nghiên cứu công nghệ
sinh khối tế bào thực vật để sản xuất những sản phẩm thứ cấp đang bắt đầu
được quan tâm phát triển trong nước. Hiện có nhiều phương pháp nuôi cấy
sinh khối tế bào thực vật như: nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy huyền phù, nuôi cấy
rễ bất định… Các phương pháp nuôi cấy tế bào cho phép thu lượng lớn tế bào
trong thời gian nuôi cấy ngắn hơn, chất lượng đồng đều. Bên cạnh đó, sản
lượng ổn định do được nuôi cấy trong điều kiện in vitro, các yếu tố tác động
đến quá trình nuôi cấy đều được kiểm soát, không bị ảnh hưởng bởi các yếu
tố tự nhiên cũng như dịch bệnh.
Hiện nay, một số công trình nuôi cấy sinh khối tế bào được áp dụng
trên đối tượng Hoàng liên gai nhằm thu sinh khối tách chiết berberin ứng
dụng trong y dược. Đinh Thị Thu Hiền và công sự (2003) đã đưa ra qui trình
tái sinh cây Hoàng liên gai in vitro từ hạt. Cây Hoàng liên gai in vitro được sử
dụng làm nguyên liệu cho quá trình tạo và nuôi cấy sinh khối mô sẹo Hoàng
liên gai tạo hợp chất berberin với hàm lượng cao [1]. Lại Đức Lưu và công sự
(2013) ứng dụng kỹ thuật khí canh trong nghiên cứu nhân giống và thu sinh
khối rễ cây Hoàng liên gai. Nhóm tác giả đã thực hiện thu thập, đánh giá hàm
lượng berberin và tìm ra chế độ nuôi cấy cũng như môi trường dinh dưỡng
phù hợp cho sinh khối rễ Hoàng liên gai phát triển[4].
Tuy nhiên, quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm làm

giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy cần bổ sung các chất
điều hòa sinh trưởng vào trong môi trường nuôi cấy. Vấn đề này là một trong
3

những trở ngại lớn do tồn dư của các chất điều hòa sinh trưởng trong sinh
khối tế bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe người sử
dụng. Tuy nhiên, kỹ thuật nuôi cấy sinh khối rễ tơ ra đời giúp giải quyết các
vấn đề khó khăn của hướng nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật hiện tại.
Rễ tơ là một bệnh ở thực vật được gây ra quá trình tương tác giữa vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes và tế bào vật chủ. Rễ tơ có có khả năng sinh
trưởng nhanh, phát triển tốt trên môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh
trưởng và có thể nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây
chuyền sản xuất các hợp chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp.
Rễ tơ có thể sản xuất một lượng lớn các hợp chất thứ cấp và là cơ quan biệt
hóa nên rễ tơ có sự di tuyền ổn định hơn nuôi cấy tế bào huyền phù hay nuôi
cấy sinh khối mô sẹo.
Xuất phát từ các ưu điểm trên và do hợp chất dược lý quý của cây
Hoàng liên gai chủ yếu thu được từ rễ, tôi đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu
tạo rễ tơ của cây Hoàng liên gai (Berberis juliane) cho mục tiêu nuôi cấy
sinh khối dược liệu”. Công trình này được thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế
bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
2. Đối tượng nghiên cứu
Cây Hoàng liên gai (Berberis Juliane) thuộc chi Hoàng liên Berberis,
một loài thảo dược quý hiếm được sử dụng rộng rãi trong các bài thuốc y học
cổ truyền. Thành phần chủ yếu của Hoàng liên gai là berberin, một hoạt chất
được ứng dụng trong điều trị các bệnh về hệ tiêu hóa.
Mẫu vật nghiên cứu bao gồm quả, lá của cây Hoàng liên gai phân bố
trong tự nhiên được thu thập tại tại vườn quốc gia Hoàng liên, địa phận huyện
Sa Pa tỉnh Lào Cai.

4

3. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc tạo sinh khối cây
Hoàng liên gai làm nguyên liệu dược bằng công nghệ nuôi cấy rễ tơ.
4. Nội dung nghiên cứu
4.1. Thu thập và nhận dạng mẫu cây Hoàng liên gai bằng chỉ thị
phân tử.
- Tiến hành thu thập mẫu Hoàng liên gai phân bố tại Vườn Quốc gia
Hoàng Liên tại địa phận tỉnh Sa Pa, tỉnh Lào Cai.
- Nhận dạng các loài Hoàng liên gai thu thập được thông qua đặc
điểm hình thái.
- Sử dụng kỹ thuật DNA Barcoding nhằm nhận dạng các mẫu Hoàng
liên gai.
- Bước đầu đưa ra các chỉ thị đặc hiệu cho việc nhận dạng cây Hoàng
liên gai trong tự nhiên bằng phương pháp chỉ thị phân tử sử dụng kỹ thuật
DNA Barcoding.
4.2. Đưa mẫu cây Hoàng liên gai vào nuôi cấy in vitro.
Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu hạt Hoàng liên gai và kỹ thuật
nuôi cấy Hoàng liên gai in vitro tạo nguyên liệu cho các nghiên cứu chuyển
gen tạo rễ tơ.
4.3. Nghiên cứu tối ưu quy trình chuyển gen sử dụng Agrobacterium
rhizogenes, bước đầu tạo một số dòng rễ tơ Hoàng liên gai.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen
tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai qua phương pháp biểu hiện tạm thời với gen chỉ
thị GusA.
- Bước đầu tạo một số dòng rễ tơ Hoàng liên gai.
5

5. Phương pháp nghiên cứu

- Nghiên cứu ngoài thực địa: Đánh giá đặc điểm hình thái, phân bố,
điều kiện sinh sống của cây Hoàng liên gai tại địa phận Sa Pa – Lào Cai.
- Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm: Thực hiện các thí nghiệm
trọng điều kiện in vitro tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
6. Ý nghĩa khoa học
Việc xác định được chỉ thị phân tử đặc hiệu cho loài Hoàng liên gai sẽ
đưa ra cơ sở khoa học vững chắc cho việc nhận dạng loài Hoàng liên gai
trong tự nhiên cũng như các loài khác nhau trong chi Berberis.
Hoàn thiện quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai qua vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenese cung cấp cơ sở khoa học cho quá trình
chuyển gen tạo rễ tơ trên các đối tượng loài khác thuộc chi Hoàng liên
(Berberis)
Cung cấp cơ sở cho bảo vệ nguồn gen cây Hoàng liên gai trong tự
nhiên qua việc đáp ứng nguồn cung cấp ổn định sinh khối rễ tơ Hoàng liên gai
nuôi cấy in vitro
7. Ý nghĩa thực tiễn
Xây dựng quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai tạo tiền
đề cho nuôi cấy thu sinh khối rễ tơ trên qui mô bioreactor, nhằm thu lượng
lớn sinh khối Hoàng liên gai phục vụ cho các lĩnh vực y dược.



6

II. NỘI DUNG
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây Hoàng liên gai
1.1.1. Phân bố địa lý
Hoàng liên gai (Berberis juliane) là cây thảo dược phân bố nhiều tại

vùng Tây Bắc Việt Nam và Tây Nam Trung Quốc (tây Vân Nam, nam Tây
Tạng), nên Trung Quốc còn gọi Hoàng liên gai là Vân Nam Hoàng liên).
Hoàng liên gai nguyên gốc mọc ở tỉnh Lào Cai (huyện Sa Pa), trên dãy núi
cao Hoàng Liên Sơn, vùng núi cao từ 1000 – 2500m. Hoàng liên gai ưa đất
nhiều màu trên núi cao mưa nhiều ẩm ướt, lớp đất mùn ở trên càng dày càng
tốt, cây ưa mát lạnh, sợ nóng, khô, nơi trồng thích hợp là khe núi, sườn dốc,
đủ ánh sáng, thoát nước.
Hiện nay, Hoàng liên gai được trồng giữ giống tại Trạm dược liệu Sa
Pa (Lào Cai) nhằm bảo vệ nguồn gen, nghiên cứu các hình thức nhân và phát
triển giống cây trồng.
1.1.2. Phân loại
Giới : Thực vật - Plantate
Ngành: Ngọc Lan - Magnoliophyta
Lớp: Ngọc Lan - Magnoliopsida
Bộ : Mao lương - Ranunculales
Họ : Hoàng liên gai - Berberidaceae
Chi: Hoàng liên gai Berberis
Loài : Hoàng Liên gai
Berberis julianae Schneid. 1913








Hình 1.1: Cây Hoàng liên gai
7

1.1.3. Hình thái và đặc điểm sinh thái
- Đặc điểm hình thái: Cây bụi, cao 2 - 3 m; thân và rễ có màu vàng
đậm; phân cành nhiều; có gai chia thành 3 nhánh, mọc dưới các túm lá. Lá
mọc vòng 3 - 7 cái, cuống lá ngắn; phiến lá cứng, thuôn, nhọn 2 đầu, hơi
bóng ở mặt trên, kích thươc lá khoảng 3 - 9 cm x 1,2 - 2,5 cm, mép lá có
răng cưa nhỏ, đều và nhọn.
Hoa nhiều, gồm 10 - 30 mọc ở giữa các túm lá. Hoa nhỏ, có cuống dài 1-
1,3 cm, màu vàng, mẫu 3; tổng bao 3, hình mác rộng. Đài hoa, hình trứng
ngược xếp thành 2 vòng, những vòng trong lớn hơn vòng ngoài. Cánh hoa,
nhỏ hơn đài, hình trứng thuôn, đỉnh lõm, gốc có 2 tuyến nhầy. Nhị hoa, ngắn
hơn cánh hoa; bao phấn hình trứng. Bầu hình trụ, hơi phình ở giữa noãn[2].
Quả hình trứng thuôn, dài 0,5 cm; đầu nhuỵ tồn tại rõ; khi chín màu tím đen,
hơi có phấn trắng. Hạt, gần hình trụ, màu nâu nhạt.
- Đặc điểm sinh thái:Mùa hoa tháng 3-4 quả tháng 4-10 (11). Khối
lượng 1.000 hạt: 20,12 gam; tỷ lệ nảy mầm của hạt khi gieo 38,1%; thời gian
nảy mầm từ 38-60 ngày. Cây con nảy mầm từ hạt trong tự nhiên quan sát
được vào tháng 4 và 5. Có khả năng tái sinh sau khi bị chặt phát. Cây ưa ẩm,
chịu bóng khi còn nhỏ, sau ưa sáng; thích nghi với vùng có khí hậu á nhiệt
đới núi cao. Thường mọc rải rác ở rừng cây bụi núi đá vôi, ở độ cao 1500 –
1600 m.
- Tình trạng: Phân bố hẹp, số lượng cá thể hiện có không nhiều; Điểm
phân bố ở núi Hàm Rồng đã bị tàn phá (còn vài cây); Điểm ở Ô Quí Hồ đang
bị đe doạ (gần nơi khai thác đá). Đã từng bị khai thác thu mua, nguy cơ bị
tuyệt chủng cao[2],[7],[8]

8

1.1.4. Tác dụng dược lý của cây Hoàng liên gai.
Theo Đông y, Hoàng liên gai vị đắng, lạnh; có tác dụng tả hóa giải độc,
thanh tâm nhiệt, táo tỳ thấp, trị tiêu hoá không tốt, viêm ruột, hạ lỵ, đau bụng

nôn mửa, trị đau mắt đỏ, tổn thương mí mắt; tiết tả ra máu mủ lâu ngày, trừ
thuỷ, lợi xương ích mật, mồm miệng bị nhiệt lở loét…
Còn theo y khoa hiện đại, thành phần hoá học có trong Hoàng liên gai
gồm 7 loại alkaloid, chủ yếu là chất berberin, panmatin, coptisin, worenin,
columbamin. Berberin là thành phần chủ yếu trong cây Hoàng liên gai. Tác
dụng chính của berberin là chống các loại vi khuẩn, ký sinh trùng đường ruột
gây hại cho cơ thể mà không ảnh hưởng tới hoạt động của các vi sinh vật có
lợi của đường tiêu hóa. Berberin còn được bào chế thành thuốc nhỏ mắt điều
trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do các yếu tố kích ứng từ môi trường hoặc do
đau mắt hột gây nên. Berberin có khả năng ngăn ngừa sự lây lan của nấm, bột
nhiễm nấm, chống lại tác hại của vi khuẩn tả, E.Coli. Khi dùng kết hợp với
kháng sinh thì berberin còn có khả năng hạn chế lại tác dụng không mong
muốn của các loại kháng sinh là diệt hệ vi sinh vật có lợi trong hệ tiêu hóa [2].
Ở một số nước công nghiệp phát triển, Berberin được sản xuất với quy
mô lớn bằng phương pháp công nghệ sinh học nuôi cấy mô. Berberin có tác
dụng kháng khuẩn với shigella, tụ cầu và liên cầu khuẩn. Những năm gần
đây, một số nghiên cứu mới nhất ở nước ngoài đã xác định berberin có tác
dụng chống lại nhiều loại vi khuẩn gram dương, gram âm và các vi khuẩn
kháng axit. Ngoài ra, nó còn có tác dụng chống lại một số nấm men gây bệnh
và một số động vật nguyên sinh.
Đặc biệt khi dùng berberin điều trị các nhiễm trùng đường ruột sẽ
không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột.
Các nghiên cứu gần đây cũng chứng minh: Khi dùng một số thuốc kháng sinh
9

nếu phối hợp với berberin sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc
kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột. Bởi vậy, berberin đang được
chú ý phát triển ở nhiều nước.
Thông thường, khi nhắc đến berberin, hầu hết chúng ta đều nghĩ ngay
đến tác dụng hữu hiệu của nó trên đường tiêu hóa. Nhưng nhiều nghiên cứu

gần đây cho thấy, hoạt chất này còn đóng một vai trò quan trọng trong việc
giảm cholesterol, ngăn ngừa bệnh mạch vành và cải thiện chức năng tim. Các
nhà khoa học phát hiện hoạt chất berberin có vai trò tích cực trong việc bảo
vệ thành mạch, ngăn ngừa hình thành mảng xơ vữa. Do nó tác động lên lớp
nội mạc mạch máu (lóp lót trong lòng mạch máu) và lớp tế bào cơ trơn thành
mạch nên làm tăng độ đàn hổi và dẻo dai cho thành mạch; ngăn chặn phản
ứng viêm, chống lại việc hình thành mảng xơ vữa từ những giai đoạn đầu tiên.
Berberin tạo được mối quan tâm với các nhà dược học trong chuyển
hóa lipid thông qua quá trình ức chế tổng hợp Cholesterol và Triglycerid tại
gan. Thực tế, từ năm 2004, nhiều nước phương Tây đã ứng dụng berberin
trong điều trị tăng lipid máu (mỡ trong máu). Các nghiên cứu đã đánh giá
hiệu quả của hoạt chất này tương đương với statin - một nhóm thuốc hạ mỡ
máu phổ biến hiện nay. Đồng thời, việc kết hợp berberin với simvastatin
trong điều trị mỡ máu giúp giảm đáng kể nồng độ LDL-c máu, Cholesterol
toàn phần cũng như Trigicerid, hơn hẳn so với việc sử dụng Simvastatin đơn
độc.
Bên cạnh những tác dụng trên mạch máu, nhiều nghiên cứu đã chứng
minh vai trò của berberin trong việc tăng cường sự dẻo dai của trái tim.
Nghiên cứu được thực hiện tại Trung Quốc đã mở ra hy vọng mới cho những
người bệnh mắc chứng phì đại cơ tim và suy tim mạn tính bởi hoạt chất này
có khả năng ức chế phì đại cơ tim, cải thiện các chỉ số về sức co bóp, khả
năng giãn nở của cơ tim và điều chỉnh hoạt động của thần kinh giao cảm tại
tim.
10

Một nghiên cứu khác tại Trung Quốc trên bệnh nhân suy tim sung
huyết hoặc thiếu máu cơ tim vô căn cho thấy, việc bổ sung hoạt chất này vào
phác đồ điều trị chuẩn có sự cải thiện đáng kể chức năng thất trái, tăng khả
năng hoạt động thể lực, biểu hiện khó thở, mệt mỏi cũng cải thiện rõ rệt.
Từ những kết quả khả quan bước đầu, hiện berberin vẫn là đích đến

của nhiều nghiên cứu để ứng dụng sản xuất thuốc điều trị bệnh tim mạch
trong tương lai. Việc sử dụng berberin đơn độc cho bệnh tim mạch vẫn còn
trong quá trình thử nghiệm và cần có khuyến cáo từ các nhà dược học trên thế
giới.
Khi nghiên cứu tác dụng dược lý của họ Hoàng liên, các nhà khoa học
đã chứng minh được vai trò của họ Hoàng liên trong việc điều trị một số loại
bệnh như:
+ Tác dụng kháng khuẩn: Hoàng liên và 1 trong các hoạt chất của nó là
berberin, có phổ kháng khuẩn rộng trong thí nghiệm. Có tác dụng ức chế
mạnh đối với Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis và
Staphylococcus aureus. Thuốc có tác dụng ức chế mạnh đối với khuẩn gây lỵ
nhất là Shigella dysenteriae và S.flexneri. Thuốc có hiệu quả hơn thuốc Sulfa
nhưng kém hơn Streptomicine hoặc Chloramphenicol. Thuốc không có tác
dụng đối với Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella
paratyphi. Nước sắc Hoàng liên có hiệu quả đối với 1 số vi khuẩn phát triển
mà kháng với Streptomicine, Chloramphenicol và Oxytetracycline
hydrochloride. Nhiều báo cáo khác cho thấy độ hiệu quả khác biệt của Hoàng
liên đối với vi trùng lao, nhưng không có tác dụng giống như thuốc INH. Hoạt
chất kháng khuẩn của Hoàng liên thường được coi là do berberin. Khi sao lên
thì lượng berberin kháng khuẩn thấp đi.
11

+ Tác dụng kháng virus: Thí nghiệm trên phôi gà chứng minh rằng
Hoàng liên có tác dụng đối với nhiều loại virus cúm khác nhau và virus
Newcastle .
+ Tác dụng chống nấm: Trong thí nghiệm, nước sắc Hoàng liên có tác
dụng ức chế nhiều loại nấm. Nước sắc Hoàng liên và berberin tương đối có
tác dụng mạnh diệt Leptospira.
+ Tác dụng chống ho gà: Kết quả nhiều nghiên cứu về tác dụng của
Hoàng liên đối với ho gà có khác nhau. Một nghiên cứu cho thấy trong thí

nghiệm tập trung Hoàng liên ức chế sự phát triển của Hemophilus pertussis
cao hơn Streptomycine hoặc Chloramphenicol, ít nhất là thuốc có tác dụng
lâm sàng. Tuy nhiên, nghiên cứu khác trên heo Hà Lan, cho uống Hoàng liên
thì lại không làm giảm tỉ lệ tử vong.
+ Tác dụng hạ áp: Chích hoặc uống dịch chiết berberin cho mèo, chó
và thỏ đã được gây mê và chuột không gây mê thấy huyết áp giảm. Liều
lượng bình thường, hiệu quả không kéo dài, liều lập lại cho kết quả không cao
hơn. Hiệu quả này xẩy ra dù tác dụng trợ tim ảnh hưởng đến lượng máu tim
gây nên bởi liều thuốc này. Huyết áp giảm dường như liên hệ với việc tăng
dãn mạch, cũng như có sự gia tăng đồng bộ ở lách, thận và tay chân.
+ Tác dụng nội tiết: Berberin cũng có tác dụng kháng Adrenaline. Thí
dụ: đang khi berberin làm hạ áp thì phản xạ tăng – hạ của Adrenalin giảm rất
nhiều nhưng phụ hồi lại nhanh. Berberin cũng dung hòa sự rối loạn của
Adrenaline và các hợp chất liên hệ.
+ Tác dụng đối với hệ mật: Berberin có tác dụng lợi mật và có thể làm
tăng việc tạo nên mật cũng như làm giảm độ dính của mật. Dùng berberin rất
hiệu quả đối với những bệnh nhân viêm mật mạn tính.
12

+ Tác dụng đối với hệ thần kinh trung ương: Berberin dùng liều nhỏ có
tác dụng kích thích vỏ não, trong khi đó, liều lớn lại tăng sự ức chế hoạt động
của vỏ não.
+ Tác dụng kháng viêm: Lịch sử nghiên cứu chất Granulomas gây ra
bởi dầu cotton trên chuột nhắt cho thấy chất berberin làm gia tăng đáp ứng
kháng viêm của thể. Chất Ethanol chiết xuất của Hoàng liên có tác dụng
kháng viêm khi cho vào tại chỗ, nó làm cho chất Granulomas co lại. Hiệu quả
này giống như tác dụng của thuốc Butazolidin. ( />thuoc-vi-thuoc/278-cay-thuoc-vi-thuoc/934-hoang-lien.html)
1.1.5. Tính cấp thiết nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây
Hoàng liên gai
Hoàng liên gai có nhiều đặc tính quý hiếm, các hợp chất chiết xuất từ

Hoàng liên gai có khả năng ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y dược. Mặt
khác, số lượng cá thể Hoàng liên gai trong tự nhiên đang suy giảm mạnh. Bên
cạnh đó, đặc tính sinh trưởng và phát triển chậm, khó nuôi trồng khiến cho
việc tái sinh Hoàng liên gai trong tự nhiên trở nên khó khăn. Do đó cần quản
lý và sử dụng các phương pháp khoa học để khai thác bền vững nguồn tài
nguyên này.
Hoàng liên gai được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh
giá "đang nguy cấp" (Bậc E) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng
nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày
30/3/2006 của Chính phủ để nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích
thương mại. Bảo vệ những cá thể còn sót lại ở núi Hàm Rồng. Trồng được
bằng hạt hay cành chiết. Khuyến khích người dân trồng làm hàng rào vườn và
nương rẫy. Trồng bảo tồn ngoại vi (Ex situ) ở vườn Trạm nghiên cứu trồng
cây thuốc Sapa (Viện Dược liệu) [2],[7].Trước tình hình trên, cần sớm nghiên
13

cứu áp dụng kỹ thuật nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật tạo nguồn nguyên liệu
ổn định, đáp ứng yêu cầu làm thuốc.
1.2. Tổng quan về nuôi cấy sinh khối rễ tơ
1.2.1. Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối tế bào
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật đóng góp nhiều cho tiềm năng khai
thác các hợp chất có giá trị trong y học mà chỉ có thể có ở thực vật. Vài năm
trở lại đây, những hoạt chất sinh học từ thực vật được sử dụng như một nguồn
dược liệu giá trị. Những chất này thường được sản xuất với một lượng rất nhỏ
trong tế bào thực vật [5]. Để đáp ứng nhu cầu về dược phẩm, các nhà khoa
học đã đưa giải pháp nuôi cấy sinh khối (biomass) tế bào thực vật, nhằm thu
hoạt chất dược với trữ lượng lớn.
Phương pháp này hoạt động trên cơ sở về tính toàn thể của tế bào.
Phương diện về di truyền cũng như hóa sinh của tế bào thực vật khi gặp điều
kiện tương ứng sẽ biểu hiện các tính trạng như một cá thể hoàn chỉnh. Có

nhiều nghiên cứu cho thấy sản phẩm trao đổi chất được sản xuất theo phương
pháp sinh khối cho chất lượng cũng như số lượng cao hơn ở cá thể cây hoàn
chỉnh. Các nhóm chất thường được sản xuất theo phương pháp này là các
alkaloid, tinh dầu và hợp chất glycosid. Các loại vật liệu được nuôi cấy có thể
là: tế bào đơn, mô sẹo, protoplast hoặc nuôi cấy rễ.
Cho đến nay, rất nhiều hoạt chất nguồn gốc thực vật có giá trị kinh tế
cao là sản phẩm của nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật: Các hoạt chất dùng
trong dược phẩm như caffein thu được từ nuôi cấy tế bào Coffea arabica [26],
betalain từ mô sẹo của cải đường, berberine từ cây Coptis Japonica (loài cây
này phải trồng từ 4 - 6 năm mới thu được hàm lượng berberine đáng kể trong
rễ, trong khi hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần nuôi cấy bằng sinh
khối tế bào thực vật)[27].
14

Các hoạt chất dùng trong thực phẩm: các chất tạo màu (anthocyanin,
crocin), các chất tạo mùi (vani, mùi hành và mùi tỏi). Một số chất khác như:
shikonin (chất có khả năng diệt khuẩn), paclitaxel (sản phẩm của nuôi cấy
sinh khối tế bào thông đỏ), nuôi cấy sinh khối tế bào bằng hệ thống bioreactor
10.000 lít trong sản xuất reserpine (alkaloid chiết xuất từ cây Ba gác có tác
dụng chữa bệnh cao huyết áp và rối loạn tuần hoàn máu) có thể sản xuất được
3.500 kg resperin trong thời gian 30 ngày nuôi cấy.
Đinh Thị Thu Hiền và cộng sự (2003) đã nghiên cứu thành công quy
trình nhân nhanh sinh khối mô sẹo của cây Hoàng liên gai nhằm sản xuất
nguồn dược liệu berberine, thay thế nguồn tự nhiên đang ngày càng khan
hiếm. Với quy trình này, sau khoảng 3 - 4 tuần nuôi cấy mô của cây Hoàng
liên gai, có thể thu được một lượng mô lớn gấp hàng chục lần lượng ban
đầu[1].
Tuy nhiên trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật các
chất điều hòa sinh trưởng thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy
nhằm làm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy. Việc làm

này sẽ dẫn tới có sự tồn dư của các chất điều hòa sinh trưởng trong sinh khối
tế bào nuôi cấy gây ảnh hưởng đến ức khỏe người sử dụng và tính an toàn của
sản phẩm. Tuy nhiên, vấn đề này có thể khắc phục được thông qua nuôi cấy
sinh khối từ rễ tơ, bởi rễ tơ có khả năng sinh trưởng cao và đặc biệt có thể
sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung các chất điều
hòa sinh trưởng [17].
15

1.2.2. Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – Phương pháp tạo rễ
tơ ở tế bào thực vật.

Hình 1.2: Một số bênh ở thực vật gây ra bởi Agrobacterium sp.
a)Agrobacterium sp. b) Bệnh khối u ở thực vật, c) Bệnh rễ tơ ở thực vật
Agrobacterium sp. thuộc nhóm vi khuẩn đất, gram âm, được biết đến từ
rất lâu trong nông nghiệp với vai trò là vi khuẩn cố định đạm, cung cấp nguồn
nitơ cho cây trồng. Agrobacterium được phân loại dựa trên những căn bệnh
mà chúng gây ra trên thực vật hai lá mầm. Agrobacterium gồm 4 nhóm chính:
Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rubi là hai nhóm gây bệnh khối u
(crowwn gall) ở thực vật; nhóm Agrobacterium rhizogenes gây bệnh mọc rễ
tơ (hairy roots) tại các vết thương của cây; nhóm Agrobacterium radiobacter
không gây bệnh trên thực vật[10]. Trong những thập kỉ gần đây thì các nhà
khoa học đã chú ý đến vai trò của hai loài vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
và Agrobacterium tumefaciens trong mục đích chuyển gen vào thực vật.
Chúng được xem như là các “kĩ sư trao đổi chất”, được áp dụng để chuyển
gen vào tế bào thực vật nhằm mục đích đẩy mạnh quá trình sinh tổng hợp ra
các hợp chất thứ cấp cần thiết. Khả năng gây bệnh của Agrobacterium sp đã
được chứng minh là do sự có mặt của pTi (plasmid tumor induction) ở
Agrobacterium tumefaciens và pRi (plasmid root induction) ở Agrobacterium
rhizogenes.