Luận văn nghiên cứu tạo rễ tơ của cây hoàng liên gai (berberis juliane) cho mục tiêu nuôi cấy sinh khối dược liệu

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2
• • • •
Lưu VIẾT THỦY
NGHIÊN CỨU TẠO RẺ Tơ CỦA CÂY HOÀNG LIÊN GAI
(Berberỉs julỉane) CHO MỤC TIÊU NUÔI CÁY SINH KHÓI
DƯỢC LIỆU
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
• • •
Hà Nội, 2014
Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2
• • • •
Lưu VIẾT THỦY
NGHIÊN CỨU TAO RẺ Tơ CỦA CÂY HOÀNG LIÊN GAI
(Berberis juliane) CHO MỤC TIÊU NUÔI CẤY SINH KHỐI
Dược LIỆU
•
•
• Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Chu
Hoàng Hà Hà Nội, 2014
• Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã hướng
dẫn, giúp đỡ tận tình đế tôi hoàn thành luận văn này:
• Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người Thầy của
tôi: PGS. TS. Chu Hoàng Hà - Trưởng phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện
trưởng Viện Công nghệ sinh học, người Thày đã định hướng nghiên cứu, đồng
thời cũng chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thảnh
luận văn này.
• Tôi xin được cảm ơn Cô giáo TS. Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng
Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện cho
tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
• Cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học trường Đại học Sư
phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện cho chúng tôi được học tập tại trường. Tôi xin

chân thành cảm ơn thầy giáo TS. Nguyễn Văn Đính - CN Khoa Sinh - KTNN, các
thầy, cô giáo đang công tác tại Khoa Sinh - KTNN đã tận tình dạy dỗ chúng tôi
trong thời gian qua.
• Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới sự giúp đỡ của CN Nguyễn Khắc Hưng,
Th.s Hoàng Đăng Hiếu cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ Tế bào thực vật và
phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học đã dành cho tôi
trong suốt quá trình làm luận văn.
• Cảm ơn tất cả những người bạn cùng thực tập với tôi và các bạn lớp
Sinh học thực nghiệm KI 6, đặc biệt là bạn Phạm Văn Hoàng đã giúp đỡ rất nhiều
trong thời gian thực hiện đề tài.
• Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn
chân thành tới những người thân ừong gia đình và bạn bè - những người luôn
động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.
• Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Học viên
• Lưu Viết Thủy
• Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu tạo rễ tơ của cây Hoàng liên gai
(Berberis juliane) cho mục tiêu nuôi cấy sinh khối dược liệu” là công trình nghiên
cứu của tôi. Những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực
và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp
đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn
trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
• FT1 ĩ _ _ • 2.
• Tác gia
• Lưu Viết Thủy
• MỤC LỤC
I.
II
III. NHỮNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
IV. A.rhizogenes Agobacterium rhizogenes
V. A.tumefaciens Agobacterium tumefaciens

VI. AS Acetosyringone
VII. bp Base pair
VIII. DNA Desoxyribo nucleic acid
IX. Gus Escherichia coli - ß - D - glucoronidase gene
X. GusA ß-glucuronidase
XI. HLG1 Hoàng liên gai 1 (Berberis wallichiana DC.
XII. 1824)
XIII. HLG2 Hoàng liên gai 2 (.Berberis julianae Schneid.
XIV. 1913)7
XV. ITS Internal Transcribed Spacer
XVI. kp Kilobase pair
XVII. LB Lauria Broth
XVIII. MS Murashige and Skoog
XIX. Ri-plasmidRoot inducing plasmid
XX. Rol Root locus
XXI. sp Species
XXII. T- DNA Transfer DNA)
XXIII. TDZ Thidiazuron
XXIV. Vir Virulence genes
XXV. YMB Yeast Malnitol Broth
XXVI.DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG BIỂU
1. Danh mục các hình
ảnh ■
XXVII
XXVIII
2. Danh mục bảng biểu
XXIX.Bảng 1.1: Một số loài thực vật được nuôi cấy rễ tơ để thu hoạt chất sinh
học 21
XXX
XXXI

I. MỞ ĐẦU
1. Đăt vấn đề
XXXII. Hoàng liên gai (hay Hoàng mù - Hoàng mộc) Berberỉs
juliane là cây thảo dược quý hiếm phân bố tại vùng Tây Bắc Việt Nam. Hoàng
Liên gai mọc nhiều tại Sa Pa - Lào Cai và một số tỉnh thuộc vùng Tây Nam
Trung Quốc. Hoàng liên gai là vị thuốc được sử dụng tò lâu trong các bài thuốc
Đông y chữa các bệnh tiêu hóa như: viêm ruột, tiêu chảy, lỵ, trĩ, viêm túi mật, sốt
cao, viêm gan, hoàng đản, viêm ngứa ngoài da, mụn nhọt Thân rễ Hoàng liên
gai chứa nhiều họp chất aỉkaloid (5 - 8%), trong đó chủ yếu là berberin. Ngoài ra
trong thân rễ Hoàng liên gai còn có worenin, coptỉsin, paỉmatin Các alkaloid
trong Hoàng liên gai chia thành 2 nhóm chính: các aỉkaloid có nhân phenol và
các aỉkaỉoid không có nhân phenol. Các thành phần alkaloỉd của Hoàng liên gai
đều chứa ừong hầu hết các bộ phận của cây. Tuy nhiên ở mỗi bộ phận lại có hàm
lượng thay đổi, tùy theo mùa phát triển của cây. Vào tháng 9-10, hàm lượng
berberin ở thân rễ và rễ nhánh cao, ừong khi đó, vào khoảng tháng 10, hàm lượng
alkaỉoid ở lá già trước khi rụng cũng thường cao. Trong số các họp chất alkaỉoid
nói trên, berberỉn được y học quan tâm đến nhiều nhất, sau đó là palmatin.
XXXIII. Hiện nay, số lượng cá thể Hoàng liên gai ngoài tự nhiên suy
giảm mạnh do bị khai thác quá mức. Hoàng liên gai được đưa vào danh sách các
loài thực vật đang nguy cấp ừong Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá
"đang nguy cấp" (Bậc E) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp,
quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của
Chính phủ để nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại. Trước tinh
hình trên, bên cạnh việc nghiên cứu các giá tri y dược của cây Hoàng liên gai ở
Việt Nam, cần đưa ra các phương pháp bảo tồn cũng như khai thác hiệu quả cây
Hoàng liên gai. Bên cạnh việc trồng bảo tồn ngoại vi (Ex sỉtu) tại vườn quốc gia
Hoàng liên, việc ứng dựng các kỹ thuật công nghệ sinh học vào quá trình bảo tồn
7
và phát triển bền vững cây Hoàng liên gai theo hướng thu sinh khối tế bào thực
vật là một trong những yêu cầu cấp bách và cần thiết.

XXXIV. Cùng với xu hướng chung trên thế giới, hướng nghiên cứu
công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất những sản phẩm thứ cấp đang bắt
đầu được quan tâm phát triển trong nước. Hiện có nhiều phương pháp nuôi cấy
sinh khối tế bào thực vật như: nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy huyền phù, nuôi cấy rễ
bất định Các phương pháp nuôi cấy tế bào cho phép thu lượng lớn tế bào ừong
thời gian nuôi cấy ngắn hơn, chất lượng đồng đều. Bên cạnh đó, sản lượng ổn
định do được nuôi cấy ừong điều kiện ỉn vitro, các yếu tố tác động đến quá trình
nuôi cấy đều được kiểm soát, không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố tự nhiên cũng
như dịch bệnh.
XXXV. Hiện nay, một số công trình nuôi cấy sinh khối tế bào được
áp dụng ừên đối tượng Hoàng liên gai nhằm thu sinh khối tách chiết berberỉn ứng
dụng trong y dược. Đinh Thị Thu Hiền và công sự (2003) đã đưa ra qui trình tái
sinh cây Hoàng liên gai ỉn vitro tò hạt. Cây Hoàng liên gai in vitro được sử dụng
làm nguyên liệu cho quá trình tạo và nuôi cấy sinh khối mô sẹo Hoàng liên gai tạo
họp chất berberỉn với hàm lượng cao [1]. Lại Đức Lưu và công sự (2013) ứng
dụng kỹ thuật khí canh ừong nghiên cứu nhân giống và thu sinh khối rễ cây
Hoàng liên gai. Nhóm tác giả đã thực hiện thu thập, đánh giá hàm lượng berberin
và tìm ra chế độ nuôi cấy cũng như môi trường dinh dưỡng phù hợp cho sinh khối
rễ Hoàng liên gai phát triển[4].
XXXVI. Tuy nhiên, quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật
nhằm làm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy cần bổ sung các
chất điều hòa sinh trưởng vào trong môi trường nuôi cấy. vấn đề này là một trong
những trở ngại lớn do tồn dư của các chất điều hòa sinh trưởng trong sinh khối tế
bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe người sử dụng. Tuy
8
nhiên, kỹ thuật nuôi cấy sinh khối rễ tơ ra đời giúp giải quyết các vấn đề khó khăn
của hướng nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật hiện tại.
XXXVII. Rễ tơ là một bệnh ở thực vật được gây ra quá trình tương tác
giữa vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes và tế bào vật chủ. Rễ tơ có có khả năng
sinh trưởng nhanh, phát triển tốt trên môi trường không bổ sung chất điều hòa

sinh trưởng và có thể nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong
dây chuyền sản xuất các hợp chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học tái tổ họp.
Rễ tơ có thể sản xuất một lượng lớn các họp chất thứ cấp và là cơ quan biệt hóa
nên rễ tơ có sự di tuyền ổn định hơn nuôi cấy tế bào huyền phù hay nuôi cấy sinh
khối mô sẹo.
XXXVIII. Xuất phát từ các ưu điểm ừên và do họp chất dược lý quý của
cây Hoàng liên gai chủ yếu thu được từ rễ, tôi đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu
tạo rễ tơ của cây Hoàng liên gai (Berberis juliane) cho mục tiêu nuôi cấy sinh
khối dược liệu”. Công trình này được thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào
Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.
2. Đổi tượng nghiên cứu
XXXIX. Cây Hoàng liên gai (.Berberis Juliane) thuộc chi Hoàng liên
Berberis, một loài thảo dược quý hiếm được sử dụng rộng rãi trong các bài thuốc
y học cổ truyền. Thành phần chủ yếu của Hoàng liên gai là berberin, một hoạt
chất được ứng dụng trong điều ừị các bệnh về hệ tiêu hóa.
XL. Mau vật nghiên cứu bao gồm quả, lá của cây Hoàng liên gai phân
bố ừong tự nhiên được thu thập tại tại vườn quốc gia Hoàng liên, địa phận huyện
Sa Pa tỉnh Lào Cai.
3. Mục đích nghiên cứu
XLI. Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc tạo sinh khối
cây Hoàng liên gai làm nguyên liệu dược bằng công nghệ nuôi cấy rễ tơ.
9
4. Nội dung nghiên cứu
4.1. Thu thập và nhận dạng mẫu cây Hoàng liên gai bằng chỉ thị phân
tử.
- Tiến hành thu thập mẫu Hoàng liên gai phân bố tại Vườn Quốc gia Hoàng
Liên tại địa phận tỉnh Sa Pa, tỉnh Lào Cai.
- Nhận dạng các loài Hoàng liên gai thu thập được thông qua đặc điểm hình
thái.

- Sử dụng kỹ thuật DNA Barcoding nhằm nhận dạng các mẫu Hoàng liên
gai.
- Bước đầu đưa ra các chỉ thị đặc hiệu cho việc nhận dạng cây Hoàng liên
gai trong tự nhiên bằng phương pháp chỉ thị phân tử sử dụng kỹ thuật
DNA Barcodỉng.
4.2. Đưa mẫu cây Hoàng liên gai vào nuôi cấy in vitro.
XLII. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu hạt Hoàng liên gai và kỹ
thuật nuôi cấy Hoàng liên gai in vitro tạo nguyên liệu cho các nghiên cứu chuyển
gen tạo rễ tơ.
4.3. Nghiên cứu tối ưu quy trình chuyển gen sử dụng Agrobacterium
rhizogenes, bước đầu tạo một số dòng rễ tơ Hoàng liên gai.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen tạo rễ
tơ ở cây Hoàng liên gai qua phương pháp biểu hiện tạm thời với gen chỉ thị
GusA.
- Bước đầu tạo một số dòng rễ tơ Hoàng liên gai.
5. Phương pháp nghiên cứu
- Nghiên cứu ngoài thực địa: Đánh giá đặc điểm hình thái, phân bố, điều
kiện sinh sống của cây Hoàng liên gai tại địa phận Sa Pa - Lào Cai.
- Nghiên cứu trong phòng thỉ nghiệm: Thực hiện các thí nghiệm trọng điều
kiện in vitro tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
1
0
6. Ý nghĩa khoa học
XLIII. Việc xác định được chỉ thị phân tử đặc hiệu cho loài Hoàng liên gai
sẽ đưa ra cơ sở khoa học vững chắc cho việc nhận dạng loài Hoàng liên gai trong
tự nhiên cũng như các loài khác nhau trong chi Berberis.
XLIV. Hoàn thiện quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai qua
vi khuẩn Agrobacterium rhizogenese cung cấp cơ sở khoa học cho quá trình
chuyển gen tạo rễ tơ trên các đối tượng loài khác thuộc chi Hoàng liên (Berberis')

XLV. Cung cấp cơ sở cho bảo vệ nguồn gen cây Hoàng liên gai trong tự
nhiên qua việc đáp ứng nguồn cung cấp ổn định sinh khối rễ tơ Hoàng liên gai
nuôi cấy in vitro
7. Ý nghĩa thực tiễn
XLVI. Xây dựng quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai tạo
tiền đề cho nuôi cấy thu sinh khối rễ tơ ừên qui mô bỉoreactor, nhằm thu lượng
lớn sinh khối Hoàng liên gai phục vụ cho các lĩnh vực y dược.
1
1
II. NỘI DUNG Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tẳng quan về cây Hoàng liên gai
1.1.1. Phân bố địa lý
XLVII. Hoàng liên gai (Berberis julỉane) là cây thảo dược phân bố
nhiều tại vùng Tây Bắc Việt Nam và Tây Nam Trung Quốc (tây Vân Nam, nam Tây
Tạng), nên Trung Quốc còn gọi Hoàng liên gai là Vân Nam Hoàng liên). Hoàng liên
gai nguyên gốc mọc ở tỉnh Lào Cai (huyện Sa Pa), trên dãy núi cao Hoàng Liên
San, vùng núi cao từ 1000 - 2500m. Hoàng liên gai ưa đất nhiều màu trên núi cao
mưa nhiều ẩm ướt, lớp đát mùn ở trên càng dày càng tốt, cây ưa mát lạnh, sợ nóng,
khô, nơi trồng thích hợp là khe núi, sườn dốc, đủ ánh sáng, thoát nước.
XLVIII. Hiện nay, Hoàng liên gai được ừồng giữ giống tại Trạm dược
liệu Sa Pa (Lào Cai) nhằm bảo vệ nguồn gen, nghiên cứu các hình thức nhân và
phát triển giống cây trồng.
1.1.2. Phân ỉoại Giới: Thực vật -
Plantate Ngành: Ngọc Lan -
Magnoliophyta Lớp: Ngọc Lan -
Magnoliopsida Bộ : Mao lương -
Ranunculales Họ : Hoàng liên gai -
Berberidaceae Chi: Hoàng liên gai
Berberis Loài: Hoàng Liên gai
XLIX. Berberis juỉỉanae Schneid. 1913

1
2
1.1.3. Hình thái và đăc điểm sinh thái
- Đặc điểm hình thái: Cây bụi, cao 2 - 3 m; thân và rễ có màu vàng đậm;
phân cành nhiều; có gai chia thành 3 nhánh, mọc dưới các túm lá. Lá mọc
vòng 3-7 cái, cuống lá ngắn; phiến lá cứng, thuôn, nhọn 2 đầu, hơi bóng ở
mặt trên, kích thươc lá khoảng 3 - 9 cm X 1,2 - 2,5 cm, mép lá có răng cưa
nhỏ, đều và nhọn.
L. Hoa nhiều, gồm 10-30 mọc ở giữa các túm lá. Hoa nhỏ, có cuống
dài 1- 1,3 cm, màu vàng, mẫu 3; tổng bao 3, hình mác rộng. Đài hoa, hình trứng
ngược xếp thành 2 vòng, những vòng ừong lớn hơn vòng ngoài. Cánh hoa, nhỏ
hơn đài, hình trứng thuôn, đỉnh lõm, gốc có 2 tuyến nhầy. Nhị hoa, ngắn hơn cánh
hoa; bao phấn hình trứng. Bầu hình trụ, hơi phình ở giữa noãn[2]. Quả hình trứng
thuôn, dài 0,5 cm; đầu nhuỵ tồn tại rõ; khi chín màu tím đen, hơi có phấn trắng.
Hạt, gần hình trụ, màu nâu nhạt.
- Đặc điểm sinh thải.'Mùa hoa tháng 3-4 quả tháng 4-10 (11). Khối lượng
1.000 hạt: 20,12 gam; tỷ lệ nảy mầm của hạt khi gieo 38,1%; thời gian nảy
mầm từ 38-60 ngày. Cây con nảy mầm từ hạt trong tự nhiên quan sát được
vào tháng 4 và 5. Có khả năng tái sinh sau khi bị chặt phát. Cây ưa ẩm,
chịu bóng khi còn nhỏ, sau ưa sáng; thích nghi với vùng có khí hậu á nhiệt
đới núi cao. Thường mọc rải rác ở rừng cây bụi núi đá vôi, ở độ cao 1500 -
1600 m.
- Tình trạng: Phân bố hẹp, số lượng cá thể hiện có không nhiều; Điểm phân
bố ở núi Hàm Rồng đã bị tàn phá (còn vài cây); Điểm ở Ô Quí Hồ đang bị
đe doạ (gàn nơi khai thác đá). Đã từng bị khai thác thu mua, nguy cơ bị
tuyệt chủng cao[2],[7],[8]
1.1.4. Tác dụng dược lý của cây Hoàng liên gai.
LI. Theo Đông y, Hoàng liên gai vị đắng, lạnh; có tác dụng tả hóa giải
độc, thanh tâm nhiệt, táo tỳ thấp, trị tiêu hoá không tốt, viêm ruột, hạ lỵ, đau bụng
1

3
nôn mửa, trị đau mắt đỏ, tổn thương mí mắt; tiết tả ra máu mủ lâu ngày, trừ thuỷ,
lợi xương ích mật, mồm miệng bị nhiệt lở loét
LII. Còn theo y khoa hiện đại, thành phàn hoá học có trong Hoàng liên
gai gồm 7 loại aỉkaỉoid, chủ yếu là chất berberin, panmatin, coptỉsin, worenin,
columbamỉn. Berberỉn là thành phần chủ yếu trong cây Hoàng liên gai. Tác dụng
chính của berberỉn là chống các loại vi khuẩn, ký sinh trùng đường ruột gây hại
cho cơ thể mà không ảnh hưởng tới hoạt động của các vi sinh vật có lợi của
đường tiêu hóa. Berberỉn còn được bào chế thành thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết
mạc, đau mắt đỏ do các yếu tố kích ứng từ môi trường hoặc do đau mắt hột gây
nên. Berberỉn có khả năng ngăn ngừa sự lây lan của nấm, bột nhiễm nấm, chống
lại tác hại của vi khuẩn tả, E.Coli. Khi dùng kết họp với kháng sinh thì berberin
còn có khả năng hạn chế lại tác dụng không mong muốn của các loại kháng sinh
là diệt hệ vi sinh vật có lợi trong hệ tiêu hóa [2].
LIII. Ở một số nước công nghiệp phát triển, Berberỉn được sản xuất với
quy mô lớn bằng phương pháp công nghệ sinh học nuôi cấy mô. Berberin có tác
dụng kháng khuẩn với shỉgella, tụ cầu và liên cầu khuẩn. Những năm gần đây,
một số nghiên cứu mới nhất ở nước ngoài đã xác định berberin có tác dụng chống
lại nhiều loại vi khuẩn gram dương, gram âm và các vi khuẩn kháng axit. Ngoài
ra, nó còn có tác dụng chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật
nguyên sinh.
LIV. Đặc biệt khi dùng berberin điều trị các nhiễm trùng đường ruột sẽ
không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở một. Các
nghiên cứu gần đây cũng chứng minh: Khi dùng một số thuốc kháng sinh nếu
phối hợp với berberin sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng
sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột. Bởi vậy, berberin đang được chú ý phát
triển ở nhiều nước.
1
4
LV. Thông thường, khi nhắc đến berberin, hầu hết chúng ta đều nghĩ

ngay đến tác dụng hữu hiệu của nó trên đường tiêu hóa. Nhưng nhiều nghiên cứu
gần đây cho thấy, hoạt chất này còn đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm
cholesterol, ngăn ngừa bệnh mạch vành và cải thiện chức năng tim. Các nhà khoa
học phát hiện hoạt chất berberỉn có vai trò tích cực ừong việc bảo vệ thảnh mạch,
ngăn ngừa hình thành mảng xơ vữa. Do nó tác động lên lớp nội mạc mạch máu
(lóp lót ừong lòng mạch máu) và lớp tế bào cơ trơn thành mạch nên làm tăng độ
đàn hổi và dẻo dai cho thành mạch; ngăn chặn phản ứng viêm, chống lại việc hình
thành mảng xơ vữa từ những giai đoạn đàu tiên.
LVI. Berberin tạo được mối quan tâm với các nhà dược học trong chuyển
hóa lipid thông qua quá trình ức chế tổng họp Cholesterol và Triglycerid tại gan.
Thực tế, từ năm 2004, nhiều nước phương Tây đã ứng dụng berberỉn ừong điều
trị tăng lipid máu (mỡ ừong máu). Các nghiên cứu đã đánh giá hiệu quả của hoạt
chất này tương đương với statin - một nhóm thuốc hạ mỡ máu phổ biến hiện nay.
Đồng thời, việc kết hợp berberin với simvastatin trong điều trị mỡ máu giúp giảm
đáng kể nồng độ LDL-C máu, Cholesterol toàn phàn cũng như Trỉgicerỉd, hơn
hẳn so với việc sử dụng Simvastatin đơn độc.
LVII. Bên cạnh những tác dụng trên mạch máu, nhiều nghiên cứu đã
chứng minh vai trò của berberỉn trong việc tăng cường sự dẻo dai của trái tim.
Nghiên cứu được thực hiện tại Trung Quốc đã mở ra hy vọng mới cho những
người bệnh mắc chứng phì đại cơ tim và suy tim mạn tính bởi hoạt chất này có
khả năng ức chế phì đại cơ tim, cải thiện các chỉ số về sức co bóp, khả năng giãn
nở của cơ tim và điều chỉnh hoạt động của thần kỉnh giao cảm tại tim.
LVIII. Một nghiên cứu khác tại Trung Quốc trên bệnh nhân suy tim sung
huyết hoặc thiếu máu cơ tim vô căn cho thấy, việc bổ sung hoạt chất này vào
phác đồ điều trị chuẩn có sự cải thiện đáng kể chức năng thất ừái, tăng khả năng
hoạt động thể lực, biểu hiện khó thở, mệt mỏi cũng cải thiện rõ rệt.
LIX. Từ những kết quả khả quan bước đầu, hiện berberỉn vẫn là đích đến
1
5
của nhiều nghiên cứu để ứng dụng sản xuất thuốc điều trị bệnh tim mạch trong

tương lai. Việc sử dụng berberin đơn độc cho bệnh tim mạch vẫn còn trong quá
trình thử nghiệm và càn có khuyến cáo từ các nhà dược học trên thế giới.
LX. Khi nghiên cứu tác dụng dược lý của họ Hoàng liên, các nhà khoa
học đã chứng minh được vai trò của họ Hoàng liên trong việc điều trị một số loại
bệnh như:
LXI. + Tác dụng kháng khuẩn: Hoàng liên và 1 trong các hoạt chất của
nó là berberin, có phổ kháng khuẩn rộng trong thí nghiệm. Có tác dụng ức chế
mạnh đối với Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis và
Staphylococcus aureus. Thuốc có tác dụng ức chế mạnh đối với khuẩn gây lỵ
nhất là Shigella dysenterỉae và s.flexneri. Thuốc có hiệu quả hơn thuốc Sulfa
nhưng kém hơn Streptomỉcỉne hoặc Chloramphenicol. Thuốc không có tác dụng
đối với Shigella sonneỉ, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella paratyphi.
Nước sắc Hoàng liên có hiệu quả đối với 1 số vi khuẩn phát triển mà kháng với
Streptomicine, Chloramphenicol và Oxytetracyclỉne hydrochloride. Nhiều báo
cáo khác cho thấy độ hiệu quả khác biệt của Hoàng liên đối với vi trùng lao,
nhưng không có tác dụng giống như thuốc INH. Hoạt chất kháng khuẩn của
Hoàng liên thường được coi là do berberỉn. Khi sao lên thì lượng berberin kháng
khuẩn thấp đi.
LXII. + Tác dụng kháng virus: Thí nghiệm trên phôi gà chứng minh rằng
Hoàng liên có tác dụng đối với nhiều loại virus cúm khác nhau và virus
Newcastle.
LXIII. + Tác dụng chổng nấm: Trong thí nghiệm, nước sắc Hoàng liên có
tác dụng ức chế nhiều loại nấm. Nước sắc Hoàng liên và berberỉn tương đối có
tác dụng mạnh diệt Leptospira.
LXIV. + Tác dụng chổng ho gà: Kết quả nhiều nghiên cứu về tác dụng của
1
6
Hoàng liên đối với ho gà có khác nhau. Một nghiên cứu cho thấy trong thí
nghiệm tập trung Hoàng liên ức chế sự phát triển của Hemophilus pertussis cao
hơn Streptomycỉne hoặc Chloramphenicol, ít nhất là thuốc có tác dụng lâm sàng.

Tuy nhiên, nghiên cứu khác trên heo Hà Lan, cho uống Hoàng liên thì lại không
làm giảm tỉ lệ tử vong.
LXV. + Tác dụng hạ áp: Chích hoặc uống dịch chiết berberin cho mèo,
chó và thỏ đã được gây mê và chuột không gây mê thấy huyết áp giảm. Liều
lượng bình thường, hiệu quả không kéo dài, liều lập lại cho kết quả không cao
hơn. Hiệu quả này xẩy ra dù tác dụng trợ tim ảnh hưởng đến lượng máu tim gây
nên bởi liều thuốc này. Huyết áp giảm dường như liên hệ với việc tăng dãn mạch,
cũng như có sự gia tăng đồng bộ ở lách, thận và tay chân.
LXVI. + Tác dụng nội tiết: Berberỉn cũng có tác dụng kháng Adrenaline.
Thí dụ: đang khi berberin làm hạ áp thì phản xạ tăng - hạ của Adrenalin giảm rất
nhiều nhưng phụ hồi lại nhanh. Berberỉn cũng dung hòa sự rối loạn của
Adrenaline và các hợp chất liên hệ.
LXVII. + Tác dụng đối với hệ mật: Berberỉn có tác dụng lợi mật và
có thể làm tăng việc tạo nên mật cũng như làm giảm độ dính của mật. Dùng
berberỉn rất hiệu quả đối với những bệnh nhân viêm mật mạn tính.
LXVIII. + Tác dụng đối với hệ thần kinh trung ương: Berberỉn dùng
liều nhỏ có tác dụng kích thích vỏ não, trong khi đó, liều lớn lại tăng sự ức chế
hoạt động của vỏ não.
LXIX. + Tác dụng kháng viêm: Lịch sử nghiên cứu chất Granulomas gây
ra bởi dầu cotton ừên chuột nhắt cho thấy chất berberin làm gia tăng đáp ứng
kháng viêm của thể. Chất Ethanol chiết xuất của Hoàng liên có tác dụng kháng
viêm khi cho vào tại chỗ, nó làm cho chất Granulomas co lại. Hiệu quả này giống
như tác dụng của thuốc Butazolidin. ( />1
7
thuoc-vi-thuoc/278-cay-thuoc-vi-thuoc/934-hoang-lien.hừnl)
1.1.5. Tính cấp thiết nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây
Hoàng liên gai
LXX. Hoàng liên gai có nhiều đặc tính quý hiếm, các hợp chất chiết xuất
tò Hoàng liên gai có khả năng ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y dược. Mặt
khác, số lượng cá thể Hoàng liên gai ừong tự nhiên đang suy giảm mạnh. Bên

cạnh đó, đặc tính sinh trưởng và phát triển chậm, khó nuôi trồng khiến cho việc
tái sinh Hoàng liên gai trong tự nhiên trở nên khỏ khăn. Do đó cần quản lý và sử
dụng các phương pháp khoa học để khai thác bền vững nguồn tài nguyên này.
LXXI. Hoàng liên gai được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp
đánh giá "đang nguy cấp" (Bậc E) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng
nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CPngày 30/3/2006
của Chính phủ để nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại. Bảo vệ
những cá thể còn sót lại ở núi Hàm Rồng. Trồng được bằng hạt hay cành chiết.
Khuyến khích người dân trồng làm hàng rào vườn và nương rẫy. Trồng bảo tồn
ngoại vi (Ex situ) ở vườn Trạm nghiên cứu trồng cây thuốc Sapa (Viện Dược liệu)
[2],[7].Trước tình hình trên, cần sớm nghiên cứu áp dụng kỹ thuật nuôi cấy sinh
khối tế bào thực vật tạo nguồn nguyên liệu ổn định, đáp ứng yêu cầu làm thuốc.
1.2. Tổng quan về nuôi cấy sinh khối rễ tơ
1.2.1. Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối tế bào
LXXII. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật đóng góp nhiều cho tiềm
năng khai thác các hợp chất có giá trị trong y học mà chỉ có thể có ở thực vật. Vài
năm ừở lại đây, những hoạt chất sinh học từ thực vật được sử dụng như một
nguồn dược liệu giá trị. Những chất này thường được sản xuất với một lượng rất
nhỏ trong tế bào thực vật [5]. Để đáp ứng nhu cầu về dược phẩm, các nhà khoa
học đã đưa giải pháp nuôi cấy sinh khối (biomass) tế bào thực vật, nhằm thu hoạt
1
8
chất dược với trữ lượng lớn.
LXXIII. Phương pháp này hoạt động trên cơ sở về tính toàn thể của tế
bào. Phương diện về di truyền cũng như hóa sinh của tế bào thực vật khi gặp điều
kiện tương ứng sẽ biểu hiện các tính trạng như một cá thể hoàn chỉnh. Có nhiều
nghiên cứu cho thấy sản phẩm trao đổi chất được sản xuất theo phương pháp sinh
khối cho chất lượng cũng như số lượng cao hơn ở cá thể cây hoàn chỉnh. Các
nhóm chất thường được sản xuất theo phương pháp này là các alkaloid, tinh dầu
và hợp chất glycosỉd. Các loại vật liệu được nuôi cấy có thể là: tế bào đơn, mô

sẹo, protoplast hoặc nuôi cấy rễ.
LXXIV. Cho đến nay, rất nhiều hoạt chất nguồn gốc thực vật có giá
trị kinh tế cao là sản phẩm của nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật: Các hoạt chất
dùng trong dược phẩm như caffein thu được từ nuôi cấy tế bào Coffea arabica
[26], betalain từ mô sẹo của cải đường, berberine từ cây Coptis Japonica (loài
cây này phải trồng tò 4 - 6 năm mới thu được hàm lượng berberỉne đáng kể trong
rễ, trong khi hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần nuôi cấy bằng sinh khối tế
bào thực vật) [27].
LXXV. Các hoạt chất dùng trong thực phẩm: các chất tạo màu
(anthocyanỉn, crocỉn), các chất tạo mùi (vani, mùi hành và mùi tỏi). Một số chất
khác như: shikonin (chất có khả năng diệt khuẩn), paclỉtaxel (sản phẩm của nuôi
cấy sinh khối tế bào thông đỏ), nuôi cấy sinh khối tế bào bằng hệ thống bioreactor
10.000 lít trong sản xuất reserpine (alkaloid chiết xuất từ cây Ba gác có tác dụng
chữa bệnh cao huyết áp và rối loạn tuần hoàn máu) có thể sản xuất được 3.500 kg
resperin trong thời gian 30 ngày nuôi cấy.
LXXVI. Đinh Thị Thu Hiền và cộng sự (2003) đã nghiên cứu thành
công quy trình nhân nhanh sinh khối mô sẹo của cây Hoàng liên gai nhằm sản
xuất nguồn dược liệu berberỉne, thay thế nguồn tự nhiên đang ngày càng khan
hiếm. Với quy trình này, sau khoảng 3-4 tuần nuôi cấy mô của cây Hoàng liên
1
9
gai, có thể thu được một lượng mô lớn gấp hàng chục lần lượng ban đầu[l].
LXXVII. Tuy nhiên trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực
vật các chất điều hòa sinh trưởng thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy
nhằm làm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy. Việc làm này sẽ
dẫn tới có sự tồn dư của các chất điều hòa sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi
cấy gây ảnh hưởng đến ức khỏe người sử dụng và tính an toàn của sản phẩm. Tuy
nhiên, vấn đề này có thể khắc phục được thông qua nuôi cấy sinh khối tò rễ tơ,
bởi rễ tơ có khả năng sinh trưởng cao và đặc biệt có thể sinh trưởng, phát triển tốt
trên môi trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng [17].

LXXVIII. Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes -
Phương pháp tạo rễ tơ ở tế bào thực vật
LXXIX.
LXXX.
LXXXI.
LXXXII.
LXXXIII.
LXXXIV.
LXXXV.
LXXXVI. Hình 1.2: Một số bênh ở thực vật gây ra bởi Agrobacterium sp.
a)Agrobacterium sp. b) Bệnh khối u ở thực vật, c) Bệnh rễ tơ ở thực vật
LXXXVII. Agrobacterium sp. thuộc nhóm vi khuẩn đất, gram âm, được
biết đến từ rất lâu ừong nông nghiệp với vai ữò là vi khuẩn cố định đạm, cung cấp
nguồn nitơ cho cây ừồng. Agrobacterium được phân loại dựa trên những căn bệnh
mà chúng gây ra trên thực vật hai lá mầm. Agrobacterium gồm 4 nhóm chính:
Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rubi là hai nhóm gây bệnh khối u
(crowwn gaỉỉ) ở thực vật; nhóm Agrobacterium rhizogenes gây bệnh mọc rễ tơ
{hairy roots) tại các vết thương của cây; nhóm Agrobacterium radiobacter không
gây bệnh trên thực vật[10]. Trong những thập kỉ gần đây thì các nhà khoa học đã
chú ý đến vai trò của hai loài vi khuẳn Agrobacterium rhừogenes và
Agrobacterium tumefaciens trong mục đích chuyển gen vào thực vật. Chúng được
2
0
< .
/
xem như là các “kĩ sư trao đổi chất”, được áp dụng để chuyển gen vào tế bào thực
vật nhằm mục đích đẩy mạnh quá trình sinh tổng hợp ra các hợp chất thứ cấp cần
thiết. Khả năng gây bệnh của Agrobacterium sp đã được chứng minh là do sự có
mặt của pTi (pỉasmiđ tumor induction) ở Agrobacterium tumefaciens và pRi
(pỉasmid root induction) ở Agrobacterium rhizogenes.

2
1
LXXXVIII. Agrobacterium rhizogenes, tên khoa học khác là Rhizobium
rhizogenes, là một loài vi khuẩn đất gram âm, thuộc họ Rhizobiaceae nằm trong
bộ Rhizobiales cổ định đạm. Chúng có khả năng nhận biết được các phân tử tín
hiệu từ các tế bào thực vật bị tổn thương và tấn công vào vị trí đó [12],[36].
1.2.3. Cơ chế chuyển các gen vừng T - ĐNA vào tế bào thực vật
LXXXIX. Khi các vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes nhiễm vào viết
thương của thực vật thì chúng sẽ chuyển gen của chúng vào các tế bào thực vật tại vị
trí đó. Các gen được chuyển từ Agrobacterium rhizogenes vào bộ gen của tế bào
thực vật được gọi tên là T- DNA {transfer DNA). T-DNA sau khi chuyển vào thì sẽ
được gắn ổn định vào bộ gen của thực vật. Tuy nhiên các gen mã hóa T-DNA có
nguồn gốc từ vi khuẩn nhưng nó có mang các trình tự điều tiết ở Eukaryote nên có
thể biểu hiện được trong tế bào thực vật. Vùng T-DNA này ừong một plasmid lởn
của Agrobacterium rhizogenes và plasmid này được đặt tên là Rỉ-plasmid (root
inducing plasmid) do Â.rhizogenes có khả năng cảm úng tạo rễ bất định [23].
XC. Ori
gin of
(«plKition
XCI.
2
2
I.
II. Hình 1.3: Cấu trúc Ri - plasmid
XCII. Ri-plasmid được chia thành 2 nhóm chính là agropine và
mannopine, vi khuẩn A.rhỉzogenes chứa Ri-plasmid thuộc loại agropine được sử
dụng chủ yếu cho quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật để cảm ứng tạo rễ tơ.
Ri- plasmid được chia thành nhiều vùng như vùng gây độc (gọi tắt là vùng vir-
vỉrulence)), vùng chuyển gen (T-DNA), vùng orì (vùng mã hóa chức năng tái bản
và khởi điểm tái bản), vùng phiên mã chỉ có đoạn T-DNA của plasmid mới

được chuyển vào bộ gen của thực vật và sự chuyển gen này thông qua sự hỗ ừợ
bởi các đoạn gen trong vùng vir của Ri-plasmid. Vùng vir chiếm khoảng 35 kb
trong Ri-plasmid và mã hóa 6 locus phiên mã cho các proteỉn (vir A, B, c, D, F,
G ), có chức năng quan trọng trong quá trình chuyển gen [30]. Sự phiên mã của
vùng vir được cảm ứng với nhiều hợp chất thuộc nhóm phenoỉ, điển hình là
acetosyringone - họp chất liên quan được xác định là có vai trò làm tăng tần số
của quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium ở nhiều loài thực vật. Nhiều
loại đường cũng đóng vai trò như chất bổ trợ hoạt động cho acetosyringone để
cảm ứng sự biểu hiện của gen vir ở mức độ cao [29].
XCIII.Nhìn chung cơ chế quá trình xâm nhiễm và cơ chế phân tử của quá
trình vận chuyển T-DNA vào tế bào vật chủ của vi khuẩn A.tume/aciens và
Ả.rhizogenes được chứng minh là tương tự nhau [36]. Tuy nhiên sự hình thành
khối u ở vi khuẩn A.tume/aciens do gen mã hóa sinh tổng hợp auxin quy định.
Trong khi đó, các gen mã hóa sinh tổng họp auxỉn ở vi khuẩn A.rhỉzogenes có vai
ừò rất nhỏ ừong quá trình hình thành rễ tơ ở thực vật
XCIV. [12],[36].
2
3
XCV. T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropỉne bao gồm 2 vùng chính là
vùng biên trái Tl-DNA và biên phải Tr-DNA. Hai vùng này đều có kích thước
khoảng 15 - 20 kb và được xen kẽ bởi 1 đoạn DNA, đoạn DNA này sẽđược
chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ. Vùng Tr-DNA mang các gen mã hóa sinh
tổng họp auxỉn (tms 1 và tms2), vùng Tl-DNA bao gồm 18 khung dọc (ORFs),
trong đó có 4 locus 10, 11, 12 và 15 mã hóa cho rolA, B, c và D (root locus), Các
Ri-plasmid của các chủng A.rhizogenes thuộc nhóm mannopỉne, cucumopine và
mỉlimopỉne chứa vùng T-DNA đơn, có cấu trúc giống vùng Tl-DNA của các
chủng thuộc nhỏm agropine nhưng khuyết gen roỉD [16]. Các gen rolA, roỉB và
rolc đóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật. Sự
biểu hiện đồng thời của 3 gen này gây lên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị
xâm nhiễm. Các rễ tơ này có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh hơn rất

nhiều so với rễ bình thường. Trong 3 gen rol ừên, gen roiB đóng vai trò quan
trọng hơn cả, khi gen roỉB được biểu hiện, mô tế bào thực vật đã cảm ứng tạo
kiểu hình rễ tơ, trong khi đó bất hoạt gen rolB không tạo được kiểu hình rễ tơ
[11].
2
4
r 7
>
Hình 1.4: Cơ chê chuyên gen của Agrobacterium sp (nguôn : www.zbook.vn)
III.
XCVI.
1.2.4. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ.
XCVII. Rễ tơ là tên gọi dùng để chỉ các rễ bất định được sản sinh ra
mạnh mẽ tại vị trí bị nhiễm bởi vi khuẩn A.rhizogenes. T-DNA từ A.rhizogenes sau
khi chuyển vào tế bào thực vật thì chúng sẽ được gắn vào bộ gen của thực vật, từ đó
tế bào thực vật sẽ làm nhiệm vụ biểu hiện các gen roỉ và gen awe ( tổng hợp ra các
IAA) làm tăng khả năng tạo các lông rễ một cách mạnh mẽ ngay tại vị trí bị tổn
thương ở mô thực vật đó. số lượng các lông rễ được tạo ra khá nhiều, phát triển
thành một hệ thống lông rễ, hay còn gọi là hệ thống rễ tơ [36].
XCVIII.
1. Rễ tơ Beta vulgaris phát triển trên môi trường agar
2. Rễ tơ của cây đậu phộng (Arachis hỵpogaea)
3. Rễ tơ ơ. glabra nuôi trong môi trường lỏng
4. Nuôi cấy rễ tơ G.ệỉabra bằng hệ thống bioreactor (a); thu hoạch sinh khối rễ
sau 30 ngày nuôi cay (b,c)
2
5
IV.
V. Hình 1.5. Các hệ rễ tơ được nuôi cấy