NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký để PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID của lá, tâm SEN và các CHẾ PHẨM (TT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH



ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ



NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID
CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM


Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
Mã số: 62720410



TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC





Thành phố Hồ Chí Minh- Năm 2015


Công trình được hoàn thành tại:
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Người hướng dẫn khoa học :

1. PGS.TS. TRẦN HÙNG
2. PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN


Phản biện 1: PGS.TS. Trịnh Văn Quỳ
Hội Đồng Dược Điển Việt Nam

Phản biện 2: PGS.TS. Trần Việt Hùng
Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương

Phản biện 3: PGS.TS. Hoàng Minh Châu
Đại Học Y-Dược TP.HCM

Luận án được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án cấp Trường
Họp tại :…………………………………………………….
Vào lúc :……giờ………ngày…….tháng…….năm……….



Có thể tìm hiểu luận án tại :
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Khoa học Tổng hợp TP. Hồ Chí Minh
- Thư viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh

CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ

1. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn, Trần Hùng (2011), “Nghiên cứu thành phần
alkaloid trong tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn Nelumbonaceae)”, Tạp chí Y học Tp.HCM,
Tập 15 phụ bản của số 1, 2011, 606 - 611.
2. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn, Trần Hùng (2011), “Xây dựng qui trình định

lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn
Nelumbonaceae) bằng HPLC với đầu dò dãy diod quang”, Tạp chí Y học Tp.HCM, Tập 15 phụ
bản của số 1, 2011, 628 - 632.
3. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Lữ Thiện Phúc, Mạch Khắc Duy (2012), “Xây dựng qui trình định
lượng, định tính điểm chỉ một số alkaloid chính có trong tâm sen Việt Nam (Nelumbo nucifera
Gaertn) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang”, Tạp chí Y học thực
hành, số 852+853, 303-307.
4. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Thị Tường Vi, Nguyễn Thị Phương Cúc (2012), “Xây dựng
qui trình chiết cao chuẩn alkaloid lá sen (Nelumbo nucifera Gaertn)”. Tạp chí Y học thực hành,
số 852+853, 315-319.
5. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Thị Xuân Thương, Trần Hùng, Nguyễn Đức Tuấn (2012),
“Xây dựng quy trình định lượng đồng thời quercetin, kaempferol, catechin và quercetin 3-O-β-
D-glucuronid trong lá sen bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA”, Tạp chí Dược học số 3-
2012, 17-21.
6. Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann Stuppner
(2012), “Quantitative determination of phenolic compounds in Lotus (Nelumbo nucifera) leaves
by capillary zone electrophoresis”, Planta Medica, 78, 1796-1799.
7. Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann Stuppner
(2013), “Analysis of alkaloids in Lotus (Nelumbo nucifera) leaves by non aqueous capillary
electrophoresis using ultraviolett and mass spectrometric detection”, Journal of
Chromatography A, 1302, 174-180.
8. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Tô Yến Ngọc, Trần Hùng, Nguyễn Đức Tuấn (2013), “Xây dựng quy
trình định lượng đồng thời nuciferin, pronuciferin, o-nornuciferin và isoliensinin trong lá sen
bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA”, Tạp chí Dược học số 5-2013, 27-31.
9. Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann Stuppner
(2013), “Analysis of alkaloids in lotus (nelumbo nucifera gaertn.) embryo by non-aqueous
capillary electrophoresis using ultraviolet and mass spectrometric detection”, Proceeding of the
eighth Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, Ho Chi Minh city, Vietnam,
December 4-5, 2013, 316-321.
10. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Huỳnh Phương Thảo, Trần Hùng (2014). “Nghiên cứu phân lập các

alkaloid có tác dụng sinh học trong lá sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)”. Tạp chí Y học
thực hành, số 944-2014, 49-52.
1

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Đặt vấn đề
Cây Sen (Nelumbo nucifera Gaertn. Nelumbonaceae) là
cây thuốc quí, có giá trị sinh cao, đang được sử dụng phổ biến
dưới dạng thuốc hay thực phẩm chức năng để điều trị mất ngủ,
cao huyết áp, giảm cân, điều hòa đường huyết, Các hoạt tính sinh học
này đã được chứng minh liên quan đến sự hiện diện của thành phần
alkaloid và flavonoid có trong lá, tâm Sen.
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần
hóa học, tác dụng sinh học của lá và tâm Sen. Tuy nhiên,
các nghiên cứu về lĩnh vực kiểm nghiệm còn nhiều hạn chế mà nguyên
nhân chủ yếu là do hai thành phần có tác dụng sinh học chính trong lá,
tâm Sen là alkaloid và flavonoid vẫn chưa được nghiên cứu và
công bố toàn diện; chưa có công trình khoa học nào khẳng định chất
đánh dấu trong nguyên liệu và hoàn toàn chưa có chất đối chiếu
có nguồn gốc từ dược liệu này được phân phối trên thị trường.
Do đó, việc nghiên cứu về thành phần alkaloid và flavonoid,
phân lập và thiết lập các chất đối chiếu phục vụ cho việc định tính,
định lượng alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học trong lá, tâm Sen.
Nhằm nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của một dược liệu đang được
sử dụng rộng rãi, cũng như ứng dụng trong công tác đảm bảo
chất lượng dược liệu và các chế phẩm từ Sen là một việc làm cấp thiết.
Với những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng các phương
pháp sắc ký để phân tích thành phần alkaloid, flavonoid của lá, tâm
Sen và các chế phẩm” được thực hiện với các nội dung nghiên cứu sau:
1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các alkaloid, flavonoid từ

lá và tâm Sen bằng phương pháp sắc ký và phổ nghiệm.
2

2. Thiết lập và xây dựng tiêu chuẩn một số alkaloid, flavonoid có tác
dụng sinh học để dùng làm chất đối chiếu phục vụ cho công tác
kiểm nghiệm.
3. Xây dựng các qui trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời
một số alkaloid, flavonoid chính có trong lá, tâm Sen bằng phương
pháp HPLC và CE.
4. Áp dụng qui trình để đánh giá thành phần, hàm lượng các alkaloid
và flavonoid trong lá, tâm Sen được thu hái từ các tỉnh, thành khác
nhau và trong chế phẩm từ Sen có trên thị trường.
2. Tính cấp thiết của đề tài:
Lá và tâm Sen (Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae)
đã và đang được sử dụng rất phổ biến trên thị trường dưới dạng thuốc,
thực phẩm chức năng để điều trị hoặc hỗ trợ điều trị trong các bệnh lý
khó ngủ, béo phì, mỡ máu cao, cao huyết áp, loạn nhịp tim…
Tuy nhiên, công tác đảm bảo chất lượng cho nguồn nguyên liệu
và các chế phẩm này hiện vẫn chưa được thực hiện chặt chẽ mà nguyên
nhân là do các nghiên cứu toàn diện, chi tiết về hai thành phần chính
alkaloid, flavonoid còn rất hạn chế cũng như việc kiểm soát chất lượng
nguồn nguyên liệu thông qua việc định tính, định lượng các thành phần
đánh dấu sinh học này hầu như chưa được thực hiện vì sự khan hiếm
các chất đối chiếu từ dược liệu này. Do đó, việc nghiên cứu chiết xuất,
phân lập, xác định cấu trúc các nhóm alkaloid, flavonoid có tác dụng
sinh học trong lá, tâm Sen nhằm thiết lập các chất đối chiếu ứng dụng
cho việc nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của dược liệu Sen và các chế
phẩm từ Sen là rất cần thiết, có ý nghĩa khoa học và có giá trị thực tiễn.
3. Những đóng góp mới của luận án:
Luận án đã đạt được một số kết quả mới, đóng góp vào công trình

nghiên cứu cho cây Sen như sau:
3

3.1. Thành phần hóa học
Phân lập được 35 hợp chất (21 alkaloid và 14 flavonoid) với 28
cấu trúc được xác định từ lá và tâm Sen. Trong đó có:
- 02 alkaloid là hợp chất mới (EN-4 và EN-5), lần đầu tiên được
công bố phân lập từ thực vật, cấu trúc đã xác định và được đề nghị
đặt tên là isoliensinin N
2’
-oxyd và isoliensinin N
2
-oxyd.
- 05 hợp chất đã được công bố có trong những dược liệu khác nhưng
lần đầu tiên được phân lập từ cây Sen: 02 alkaloid (pronuciferin
N-oxyd và apoglaziovin); 03 flavonoid (calycosin, scutellarein
7-O-β-D-GlcA methyl ester, vitexin).
- 02 alkaloid lần đầu tiên được phân lập từ lá Sen (isoliensinin,
norarmepavin); 03 alkaloid (nuciferin, armepavin, norarmepavin)
và 03 flavonoid (isorhamnetin, quercitrin, quercetin 3-O-β-D-
GlcA) lần đầu tiên được công bố từ tâm Sen.
3.2. Thiết lập chất đối chiếu
Thiết lập 06 chất đối chiếu (nuciferin, o-nornuciferin, liensinin,
isoliensinin, neferin, quercetin 3-O-β-D-GlcA) Hiện tại, các CĐC này
đều chưa được phân phối bởi hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia.
3.3. Quy trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời các
alcaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen
Xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu 08 quy trình phân tích
đồng thời các alkaloid hay flavonoid bằng phương pháp HPLC-PDA
và CE-PDA-MS. Các quy trình này đều chưa được công bố bởi bất cứ

công trình nào trong nước và thế giới
Các qui trình định tính, định lượng sau khi thẩm định đã được áp
dụng để kiểm soát chất lượng 32 mẫu nguyên liệu lá Sen và 32 mẫu
nguyên liệu tâm Sen (Nelumbo nucifera) được thu hái vào mùa thu hái
4

khác nhau từ ba vùng miền khác nhau của Việt Nam cũng như các chế
phẩm bào chế từ lá, tâm Sen đang lưu hành trên thị trường.
Xây dựng được các sắc ký đồ, điện di đồ dấu vân tay bằng phương
pháp SKLM, HPLC-PDA, CE-PDA/MS giúp xác định đặc tính điểm
chỉ, nhận dạng lá, tâm Sen của từng vùng miền tại Việt Nam.
4. Bố cục luận án: có 131 trang chính: Đặt vấn đề (2); chương 1:
Tổng quan tài liệu (24); chương 2: Phương pháp nghiên cứu (22);
chương 3: Kết quả nghiên cứu (62), chương 4: Bàn luận (23); kết luận
(3); kiến nghị (1). Danh mục công trình (2); Tài liệu tham khảo (9).
NỘI DUNG LUẬN ÁN
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Thực vật học cây TNHC
Tên khoa học: Nelumbo nucifera Gaertn, họ Sen - Nelumbonaceae.
1.2. Hóa học về Sen
Có 15 alkaloid, 16 flavonoid trong lá Sen và 12 alkaloid, 4 flavonoid
trong tâm Sen đã được công bố. Các alkaloid này thuộc các khung
aporphin, proaporphin, benzylisoquinolin và bisbenzylisoquinolin.
Các flavonoid có khung euflavonoid và thuộc nhóm flavonol.
Các nghiên cứu về chiết xuất- phân lập- xác định cấu trúc
- Các alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen được chiết bằng phương
pháp: ngâm lạnh, ngấm kiệt, chiết hỗ trợ vi sóng, chiết siêu tới hạn.
- Các hợp chất tinh khiết được phân lập bằng các phương pháp sắc
ký: sắc ký pha thuận, rây phân tử, sắc ký ngược dòng tốc độ cao.
- Cấu trúc các hợp chất phân lập được biện giải bằng các phép

phổ nghiệm: UV, IR, MS, NMR.
Các nghiên cứu về định tính, định lượng Thành phần alkaloid,
flavonoid trong lá và tâm Sen: sử dụng các phương pháp
HPLC-PDA-MS/MS và CE-PDA.
5

1.3. Tác dụng sinh học
Các tác dụng chính là an thần, hạ cholesterol, hạ đường huyết, hạ huyết
áp, loạn nhịp tim, kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxi hóa và
kích thích miễn dịch.
1.4. Phương pháp thiết lập chất đối chiếu: hướng dẫn của ASEAN.
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu: đối tượng nghiên cứu là các alkaloid và
flavonoid trong lá, tâm Sen.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phương pháp chiết xuất: Chiết ngâm lạnh, chiết với sự hỗ
trợ của sóng siêu âm: nghiên cứu các điều kiện dung môi,
tỷ lệ dung môi/dược liệu.
2.2.2. Phương pháp phân lập, xác định độ tinh khiết, cấu trúc hợp chất
tinh khiết: Sử dụng phương pháp sắc ký cột pha thuận, pha đảo
Sephadex LH-20, sắc ký lỏng bán điều chế, sắc ký phân bố
ly tâm nhanh. Xác định độ tinh khiết bằng phương pháp SKLM,
HPLC/PDA, quét nhiệt vi sai. Biện giải cấu trúc bằng phép phổ nghiệm:
UV, IR, MS, NMR.
2.2.3. Qui trình định tính, định lượng các alkaloid, flavonoid bằng
phương pháp HPLC, CE
Qui trình định lượng: phải đạt các yêu cầu về thẩm định theo
hướng dẫn của ICH.
- Quy trình xử lý mẫu: khảo sát quy trình chiết alcaloid và flavonoid
từ lá, tâm Sen (dung môi chiết, số lần chiết) và dung môi pha mẫu.

- Phương pháp HPLC: khảo sát thành phần pha động, tỷ lệ và pH pha
động, kỹ thuật rửa giải.
- Phương pháp CE: kỹ thuật điện di, dung dịch đệm (hệ đệm, nồng độ
đệm, pH dung dịch đệm ); loại chất diện hoạt, nồng độ chất
6

diện hoạt; điều kiện của đầu dò: bước sóng phân tích với đầu dò
PDA; kiểu ion hóa, áp suất khí bao, nhiệt độ buồng ion hóa, thế áp
dụng, chất lỏng bao với đầu dò MS.
Định tính điểm chỉ:
Phương pháp SKLM: khảo sát dung môi để xác định các đặc trưng cơ
bản của hai nhóm hoạt chất chính alcaloid và flavonoid của lá, tâm Sen
qua hệ số R
f
và màu sắc của các vết đặc trưng.
Phương pháp HPLC và CE: dựa trên sắc ký đồ (SKĐ), điện di đồ
(ĐDĐ) xác định thời gian lưu (t
R
-HPLC) hay thời gian dịch chuyển
(t
M
-CE) và diện tích đỉnh của các pic chính cũng như tỷ lệ diện tích pic
giữa các pic chính của alkaloid và flavonoid trong mẫu nguyên liệu.
2.2.4. Phương pháp thiết lập CĐC: Thực hiện theo hướng dẫn của
WHO, ASEAN, ấn bản về quy trình thiết lập CĐC.
2.2.5. Ứng dụng qui trình định tính, định lượng
Đánh giá đặc tính điểm chỉ và hàm lượng các alkaloid và flavonoid có
trong nguyên liệu lá, tâm Sen được thu hái từ những vùng thu hái khác
nhau về thổ nhưỡng, khí hậu và các chế phẩm thuốc hay thực phẩm
chức năng được bào chế từ hai nguyên liệu này.

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Chiết cao chiết toàn phần alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen
Chiết cao cồn: dược liệu được làm ẩm bằng dung môi khoảng 6 giờ.
Cho dung môi ngập dược liệu 1- 2 cm, ngâm khoảng 48 giờ. Rút dịch
chiết đến khi âm tính với thuốc thử (TT) Dragendorff và FeCl
3
1%. Tỷ
lệ dung môi/dược liệu là (10:1). Gộp dịch chiết, lọc và cô đến cao đặc.
Chiết flavonoid: cao cồn được acid hóa bằng H
2
SO
4
2% đến pH 1-2.
Loại tạp bằng n-hexan, sau đó lắc với ethyl acetat đến khi âm tính với
TT FeCl
3
1%. Gộp các dịch chiết ethyl acetat, thu hồi dung môi đến
cao đặc chứa flavonoid tủa F từ lá Sen và cao EF từ tâm Sen.
7

Chiết alcaloid: dịch acid sau khi chiết flavonoid được kiềm hóa bằng
amoniac 25% theo gradient pH. Lắc với cloroform đến khi âm tính với
TT Dragendorff, thu hồi dung môi đến cao đặc chứa alkaloid A1, A2,
A3 từ lá Sen và NP5, NP8, P và n-Bu từ tâm Sen tương ứng.
Từ tủa B thu được trong quá trình thu hồi dung môi để thu cao cồn
được acid hóa bằng H
2
SO
4
2% và cho phản ứng đặc hiệu với TT

Bertrand, tủa thu được rửa loại tạp lần lượt với CHCl
3
, EtOAc, sau đó
hòa trong NaOH 2% và chiết bằng CHCl
3
để thu cao N.
3.2 Phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao chiết lá, tâm Sen
Cao A2 và tủa F được tách phân đoạn bằng sắc ký cột chân không;
cao A3, cao N, NP5, NP8, EF được tách phân đoạn bằng cột pha thuận.
Các phân đoạn tinh khiết hơn thu được này được tiếp tục phân lập bằng
sắc ký cột Sephadex LH-20, sắc ký lỏng bán điều chế pha đảo, sắc ký
phân bố ly tâm nhanh để phân lập được 35 hợp chất với 28 cấu trúc
được biện giải và so sánh các dữ liệu phổ nghiệm UV, IR, MS, NMR.
với các tài liệu đã công bố như đã trình bày ở mục 3. Cấu trúc hóa học
và độ dịch chuyển hóa học của C, H của 16 alkaloid và 12 flavonoid
phân lập từ lá, tâm Sen được trình bày ở các Hình 3.7-3.15.


8







9

3.3 Thiết lập chất đối chiếu (CĐC)
3.3.1. Xây dựng qui trình xác định độ tinh khiết của nguyên liệu

thiết lập CĐC
Các alkaloid, flavonoid được lựa chọn để thiết lập CĐC là những
hợp chất đại diện, chiếm hàm lượng lớn trong cây, khối lượng phân lập
được nhiều (> 500 mg) với độ tinh khiết sắc ký cao (> 95%) để thiết
lập CĐC. 06 nguyên liệu được chọn để thiết lập CĐC: nuciferin, 2-O-
nornuciferin, isoliensinin, liensinin, neferin, quercetin 3-O-β-D-GlcA.
Bảng 3.49. Kết quả khảo sát hàm ẩm bằng phương pháp TGA và
điểm nóng chảy, độ tinh khiết bằng phương pháp DSC (n=3).
Tên CĐC
Điểm nóng chảy
TB (
o
C)
Độ tinh khiết
TB (%)
Hàm ẩm
TB (%)
Nuciferin
163,0
99,64
0,415
O-nornuciferin
173,5


97,65
0,542
Isoliensinin
70,5
97,91

0,392
Liensinin
74,5


98,84
0,186
Neferin
93,0
99,91
0,825
Quercetin-3-O-β-D-GlcA
147,0
100,0
1,007
Xác định độ tinh khiết bằng HPLC/PDA
Dựa trên cấu trúc hóa học của các hợp chất nghiên cứu, khảo sát các
thông số: bản chất pha tĩnh, pha động, pH, nhiệt độ, tốc độ dòng, bước
sóng phát hiện, nhằm tìm ra các điều kiện sắc ký thích hợp xác định độ
tinh khiết sắc ký các mẫu nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu.
Bảng 3.50. Tóm tắt điều kiện sắc ký thích hợp kiểm tra độ tinh khiết
HPLC-PDA của 06 CĐC.
Tên CĐC
Pha tĩnh
Pha động
ACN-TEA 0,1%
Nhiệt độ
cột
(
o

C)
λ
(nm)
F
(ml/phút)
Nuciferin
Gemini C18
(150 mm x
4,6; 5µm)
52:48
30
272
1,0
2-O-
nornuciferin
50:50
272
1,0
Isoliensinin
64:36
285
0,8
Liensinin
64:36
285
0,8
Neferin
60:40
285
0,8

10

Quercetin 3-
O-β-D-glcA
ACN- acid
formic 0,1 %
(20:80)
254
1,0
Xác định tính phù hợp hệ thống: các thông số sắc ký đều đạt yêu cầu
qui định sau 06 lần tiêm liên tiếp, quy trình đạt tính phù hợp hệ thống.
Thẩm định quy trình xác định độ tinh khiết sắc ký các nguyên liệu
làm CĐC bằng HPLC
Tính đặc hiệu: SKĐ mẫu trắng không có tín hiệu tại vị trí thời gian lưu
của pic chính trên SKĐ mẫu thử CĐC.
Bảng 3.52. Kết quả xác định tính tuyến tính, miền giá trị, độ đúng,
độ chính xác của qui trình phân tích các nguyên liệu thiết lập CĐC.
Yêu cầu
thẩm định
1
2
3
4
5
6
Phương trình hồi qui
y=
1907x
y=
7148x

y=
10225x
y=
6201x
y=
1046x
y=
1325x
Hệ số tương quan
0,9995
0,9992
0,9990
0,9989
0,9997
0,9994
Khoảng tuyến tính
15,63-1000 (µg mL
-1
)
Độ chính xác trong ngày
RSD (%) (n=6)
0,76
1,23
1,84
0,52
0,98
0,53
Độ đúng
*
(n=9)

98,7-
102,3
101,5-
103,6
99,8-
102,8
98,3-
103,5
97,6-
102,2
98,8-
103,4
*: Tỉ lệ hồi phục trung bình (%).
(1)
: nuciferin;
(2)
: 2-O-nornuciferin;
(3)
: isoliensinin
(4)
:
liensinin;
(5)
: neferin;
(6)
: quercetin-3-O-D-GlcA.
Nhận xét: Quy trình xác định độ tinh khiết 06 nguyên liệu làm chất đối
chiếu bằng phương pháp HPLC có tính đặc hiệu, miền giá trị rộng,
độ chính xác và độ đúng cao. Do đó có thể áp dụng quy trình này để
tiến hành xác định độ tinh khiết của các nguyên liệu thiết lập CĐC.

Kiểm tra độ tinh khiết sắc ký 06 nguyên liệu thiết lập CĐC
Bảng 3.53. Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký (%) các nguyên liệu
thiết lập CĐC.
Tên CĐC
Độ tinh khiết TB (%)
HPLC/PDA
RSD
(n=3)
Tạp
(%)
Nuciferin
99,20
0,79 %
0,38
O-nornuciferin
96,60
1,36 %
2,86
Isoliensinin
96,80
2,02 %
2,81
11

Liensinin
96,10
1,15 %
3,71
Neferin
96,03

1,34 %
1,82
Quercetin 3-O-β-D-GlcA
98,01
0,64 %
1,58
3.2.2. Xây dựng TCCS đánh giá nguyên liệu thiết lập CĐC
Dự kiến TCCS của các nguyên liệu làm chất đối chiếu hóa học là các
hợp chất tự nhiên đặc trưng chiết ra từ dược liệu gồm các chỉ tiêu, mức
chất lượng đề nghị và phương pháp thử được tóm tắt trong Bảng 3.54.
Bảng 3.54. Tóm tắt chỉ tiêu chất lượng và phương pháp thử các CĐC.
Chỉ tiêu
Mức chất lượng đề nghị
Phương
pháp thử
1. Tính chất
Dạng vô định hình, màu sắc, mùi vị, độ tan.
.



2. Hàm ẩm
Không quá 1%
3. Định tính
Nhóm I: Phổ IR

Phải có các dao động đặc trưng theo cấu trúc hóa học
của các nguyên liệu dùng thiết lập chất đối chiếu.
Nhóm II:
Nhiệt độ nóng chảy

và năng suât
quay cực.
Điểm nóng chảy phải nằm trong khoảng điểm chảy
lí thuyết của chất đó ± 1
o
C hoặc phù hợp với điểm
chảy trong bộ dữ liệu chuẩn.
Giá trị NSQC phải nằm trong khoảng lý thuyết của
chất đó ± 2
o
C hoặc phù hợp với NSQC trong
bộ dữ liệu chuẩn.
Theo
TCCS
PL- 3.11

Nhóm III: UV, MS,
NMR
Dữ liệu phổ UV phải có các λ
max
đặc trưng và
MS phải có số khối đặc trưng của chất.
Dữ liệu phổ NMR (
13
C,
1
H, COSY, HSQC, HMBC)
phù hợp với bộ dữ liệu chuẩn, dữ liệu phổ đã công
bố.

4. Định lượng
Không được thấp hơn 95 % tính theo chế phẩm
nguyên trạng.
5. Tạp chất
Không được vượt quá 5 % tính theo chế phẩm
nguyên trạng, loại những pic có S/N < 2/1.
3.2.3 Đánh giá đồng nhất lọ
Mỗi lọ được đóng 10 mg, tổng số lọ đóng 30 lọ. Sau khi đóng, các ống
được bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8
o
C. Số lọ đánh giá: 6 lọ. Mỗi lọ được
phân tích 2 lần trên cùng một phương pháp đã được thẩm định. Kết quả
được trình bày ở Bảng 3.55.


12

Bảng 3.55. Kết quả đánh giá đồng nhất lọ sau khi đóng gói của các CĐC
Nhận xét: Độ lặp lại tương đối của hàm lượng giữa các lọ trong một lô
sản xuất đều có RSD dưới 1,0%. Do đó, các lọ thành phẩm của lô sản
xuất có hàm lượng đồng nhất. Từ đó kết luận điều kiện đóng gói ổn định
và phù hợp.
3.2.4. Đánh giá liên phòng thí nghiệm
Các lọ CĐC được đánh giá tại 2-3 phòng thí nghiệm đạt GLP hoặc
ISO 17025:
- Khoa Thiết lập chất chuẩn & Chất đối chiếu - Viện Kiểm
nghiệm thuốc Tp. HCM (PTN-1).
- Khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm - Viện Kiểm nghiệm thuốc
Tp. HCM (PTN-2).
- Trung tâm kiểm nghiệm thuốc- mỹ phẩm- thực phẩm

Tp. Cần Thơ (PTN-3).
Mỗi PTN nhận 6 lọ chất đối chiếu và quy trình phân tích. Độ đồng nhất
liên PTN được đánh giá bằng phép thống kê ANOVA một yếu tố trên
18 kết quả định lượng của 2-3 PTN tham gia đánh giá.
Bảng 3.56. Kết quả đánh giá liên PTN bằng thống kê Anova của các
nguyên liệu thiết lập CĐC.

CĐC
Mẫu thử
1
2
3
4
5
6
RSD
Nuciferin
Lọ số
5
10
15
20
25
30

Hàm lượng %
99,41
98,65
99,27
99,35

99,43
99,32
0,3%
2-O-
nornuciferin
Lọ số
35
40
45
3
5
50

Hàm lượng %
96,79
96,84
96,75
96,83
96,78
96,85
0,4%
Isoliensinin
Lọ số
2
4
6
8
10
12

Hàm lượng %
96,99
96,56
97,08
96,97
97,05
96,34
0,2%
Liensinin
Lọ số
14
18
22
26
32
44

Hàm lượng %
96,27
97,25
96,28
96,30
96,28
96,26
0,4%
Neferin
Lọ số
9
11
13

17
19
23

Hàm lượng %
95,50
96,97
95,43
95,41
95,38
96,20
0,7%
Quercetin 3-
O-β-D-GlcA
Lọ số
25
27
29
31
33
36

Hàm lượng %
97,91
98,10
98,86
97,90
97,87
97,86
0,5%

13

CĐC
F
tn

F
lt

Nhận xét
Nuciferin
2,39
3,68
Kết quả trung bình của ba
PTN giống nhau
2-O-nornuciferin
2,68
Isoliensinin
3,47
Liensinin
1,66
Neferin
0,20
Quercetin 3-O-β-D-glcA
0,52
Nhận xét: các giá trị F
tn
của các CĐC đều nhỏ hơn F
lt
= 3,682. Do đó,

độ tinh khiết sắc ký của các CĐC không phụ thuộc vào PTN tham gia
đánh giá. Các lọ CĐC đồng nhất về độ tinh khiết sắc ký và hàm lượng
(%) của các nguyên liệu thiết lập CĐC không phụ thuộc vào PTN
tham gia đánh giá.
3.2.5. Xác định giá trị ấn định và giá trị công bố
Bảng 3.57. Kết quả giá trị ấn định của các CĐC sau khi đóng gói
STT
Nguyên liệu thiết lập CĐC
Hàm lượng (%) công bố
trên nhãn theo nguyên trạng
1
Nuciferin
99,34
2
O-nornuciferin
96,54
3
Isoliensinin
96,72
4
Liensinin
96,23
5
Neferin
95,94
6
Quercetin 3-O-β-D-GlcA
97,88
Nhận xét: 06 nguyên liệu dùng thiết lập CĐC đủ điều kiện để đăng ký
chuẩn quốc gia với hàm lượng được xác định trên 95% ở tất cả các mẫu

tính theo hiện trạng, các CĐC bảo quản các ở nhiệt độ 2- 8
o
C,
tránh ánh sáng.
3.3. Xây dựng qui trình định tính điểm chỉ, định lượng alkaloid,
flavonoid trong lá và tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA và
CE-PDA/MS
3.3.1. Qui trình chiết alkaloid, flavonoid toàn phần có trong mẫu
nguyên liệu lá Sen hoặc tâm Sen: alkaloid thực hiện theo Sơ đồ chiết
3.2; flavonoid thực hiện theo Sơ đồ chiết 3.3.
14


3.3.2. Thăm dò điều kiện sắc ký thích hợp
Qui trình định lượng đồng thời 07 alkaloid trong lá Sen bằng
CE-PDA-MS
Điều kiện điện di thích hợp: mao quản silica nung chảy, 62 cm x50 µm
i.d, đệm amoni acetat 100 mM trong MeOH/ACN/Nước (70/25/5) với
0,6 % acetic băng, nhiệt độ mao quản 30
o
C; điện thế 25 kV, bước sóng
phát hiện 225 nm, kiểu tiêm thủy động học. Thứ tự các pic: caaverin
(1), isoliensinin (2), armepavin (3), nor-armepavin (4), nuciferin (5),
2-O-nornuciferin (6), pronuciferin (7).
Qui trình định lượng đồng thời 08 flavonoid trong lá Sen bằng
phương pháp CE-PDA
Mẫu dịch chiết alkaloid lá Sen NN-1
a
Mẫu hỗn hợp chuẩn 7 alkaloid
15

Điều kiện điện di thích hợp: mao quản silica nung chảy, 62 cm x 50
µm i.d, dung dịch đệm borax 30 mM hòa tan trong ACN-H
2
O (85:15)
điều chỉnh pH 8.0 bằng acid boric 5%, nhiệt độ mao quản 30
°
C, điện
thế 30 kV; bước sóng phát hiện: 210 nm, kiểu tiêm thủy động học.
Thứ tự các pic: 1: catechin, 2: isorhamnetin, 3: kaempferol, 4: rutin, 5:
isoquercitrin, 6: hyperoside, 7: quercetin, 8: quercetin 3-O-β-D-GlcA.

Qui trình định lượng đồng thời 04 alkaloid trong lá Sen bằng
HPLC-PDA
Điều kiện sắc ký thích hợp: cột Phenomenex Gemini RP-C18 (150 mm
x 4,6 mm, 5 μm), pha động: ACN – dung dịch TEA 0,1% được điều
chỉnh đến pH 8,5 bằng dung dịch acid acetic 30%, thể tích tiêm mẫu
20 μl, bước sóng phát hiện: 272 nm. Chương trình mẫu kiểu gradient.

Qui trình định lượng đồng thời 06 flavonoid trong lá Sen bằng
phương pháp HPLC-PDA
nuciferin


2-
O
-nornuciferin


isoliensinin

pronuciferin

16

Điều kiện sắc ký thích hợp: cột Phenomenex Synergi RP-Fusion
(250 mm x 4,6 mm, 4 μm), pha động: ACN- acid formic 0,1% được
điều chỉnh đến pH 8,5 bằng dung dịch acid acetic 30%, thể tích tiêm
mẫu 20 μl, bước sóng phát hiện: 254 nm. Chương trình mẫu gradient.

Qui trình định lượng đồng thời 09 alkaloid trong tâm Sen
bằng phương pháp CE-PDA-MS
Điều kiện điện di thích hợp: mao quản silica, 62 cm x 50 µm i.d, đệm
amoni acetat 100 mM trong MeOH/ACN/Nước (70/25/5) với 0,6%
acetic băng; nhiệt độ mao quản 30
o
C, điện thế 25 kV, bước sóng phát
hiện 225 nm. Tên pic theo thứ tự 1: neferin, 2: liensinin, 3: isoliensinin,
4: nor-armepavin, 5: armepavin, 6: nuciferin, 7: isoliensinin N
2’
-oxid,
8: isoliensinin N
2’
-oxid, 9: pronuciferin .

isorhamnetin

kaempferol

quercetin

catechin
Quercetin
-3-O-D-gln
Rutin
Mẫu thử tâm Sen (NN-1a)
Mẫu hỗn hợp 09 chuẩn alkaloid
17

Qui trình định lượng đồng thời 06 flavonoid trong tâm Sen bằng
phương pháp CE-PDA
Điều kiện điện di thích hợp: mao quản silica (62 cm x 50 µm i.d);
dung dịch đệm borax 50 mM hòa tan trong ACN-H
2
O (25:75) điều
chỉnh pH 8.5 bằng acid boric 5%, nhiệt độ mao quản 30
°
C, điện thế
30 kV, bước sóng phát hiện 210 nm. Thứ tự các pic (1: isorhamnetin,
2: calycosin, 3: quercetin 3-O-β-D-glucuronid, 4: scutellarein 7-O-β-
D-glucuronid metyl ester, 5: vitexin, 6: quercitrin.

Qui trình định lượng đồng thời 07 alkaloid trong tâm Sen bằng
phương pháp HPLC-PDA
Điều kiện sắc ký thích hợp: cột Phenomenex Synergi RP-Fusion (250
mm x 4,6 mm, 4 μm), pha động: ACN –TEA 0,1% được điều chỉnh
đến pH 9,0 bằng dung dịch acid acetic 10%, thể tích tiêm mẫu 20 μl,
bước sóng phát hiện 282 nm. Mẫu theo chương trình gradient:
Qui trình định lượng đồng thời 06 flavonoid trong tâm Sen bằng
phương pháp HPLC-PDA
Điều kiện sắc ký thích hợp: cột Phenomenex Synergi RP-Polar (250
x 4,6 mm; 4 μm), thể tích tiêm mẫu 20 μL, bước sóng phát hiện: 254
nm, nhiệt độ cột 35
o
C, ACN- Acid formic 0,1% theo
chương trình gradient.
18

3.3.3. Khảo sát tính phù hợp hệ thống: các quy trình đạt yêu cầu.
3.3.3.4.Thẩm định quy trình phân tích: tiến hành theo hướng dẫn
của ICH. Tất cả 8 quy trình đều đạt yêu cầu của tính đặc hiệu; tính
tuyến tính (R
2
≥ 0,999); độ chính xác (RSD của các kết quả định lượng
≤ 3,56%); độ đúng với tỷ lệ phục từ 90-107%
Error! Reference source not found.

.
3.4. Ứng dụng các qui trình định tính, định lượng để phân tích
đồng thời các alkaloid, flavonoid có trong các mẫu nguyên liệu và
chế phẩm từ lá, tâm Sen
Áp dụng định tính và định lượng đồng thời 07 alkaloid trong lá Sen và
09 alkaloid tâm Sen bằng phương pháp CE-PDS/MS; 08 flavonoid
trong lá Sen và 06 flavonoid tâm Sen bằng CE-PDA; 04 alkaloid trong
lá Sen và 07 alkaloid tâm Sen; 06 flavonoid trong lá Sen và 06
flavonoid tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA có trong 32 mẫu
nguyên liệu lá, tâm Sen loài Nelumbo nucifera được thu hái vào mùa
thu hái khác nhau từ ba vùng miền khác nhau của Việt Nam.
Bảng 3.68. Kết quả xác định hàm lượng các alkaloid (mg/100 mg) có
trong các mẫu nguyên liệu lá Sen loài Nelumbo nucifera bằng
phương pháp CE-PDA/MS và HPLC-PDA.
Alkaloid
Phư
ơng
phá
p
Mẫu lá Sen loài N. Nucifera
NN-1
a
NN-1
b
NN-2
a
NN-2
b
NN-3
a

NN-3
b
caaverin
CE
0,09
(2,16)
0,06
(1,82)
-
-
0,03
(3,29)
0,02
(2,31)
iso-liensinin
CE
0,17
(1,52)
0,12
(1,34)
0,20
(1,45)
0,12
(1,89)
0,11
(2,43)
0,08
(1,45)
HP
LC

0,15
(2,05)
0,11
(1,12)
0,18
(1,45)
0,10
(1,64)
0,10
(0,76)
0,06
(0,98)
armepavin
CE
0,19
(1,33)
0,17
(2,34)
0,09
(2,21)
0,06
(1,76)
0,13
(2,36)
0,07
(1,67)
nor-armepavin
CE
0,17
(2,52)

0,15
(2,12)
0,15
(2,32)
0,13
(2,60)
0,20
(2,14)
0,17
(3,40)
nuciferin
CE
0,52
(3,21)
0,44
(2,57)
0,60
(3,45)
0,48
(2,80)
0,44
(3,56)
0,34
(3,42)
19

HP
LC
0,50
(1,42)

0,43
(2,02)
0,55
(1,15)
0,42
(2,05)
0,38
(3,09)
0,28
(1,23)
2-O-nor
nuciferin
CE
0,21
(2,15)
0,13
(3,48)
0,14
(3,62)
0,07
(3,21)
0,16
(3,21)
0,03
(2,45)
HP
LC
0,23
(2,56)
0,09

(1,78)
0,15
(2,04)
0,07
(1,98)
0,15
(2,14)
0,08
3,25)
pro-
nuciferin
CE
0,10
(2,34)
0,06
(3,75)
0,06
(3,21)
0,03
(3,22)
0,01
(3,12)
-
HP
LC
0,11
(1,52)
0,07
(2,15)
0,09

(1,26)
0,03
(1,63)
0,02
(2,32)
-
Bảng 3.70. Kết quả xác định hàm lượng các flavonoid (mg/100 mg) có
trong mẫu nguyên liệu lá Sen loài Nelumbo nucifera bằng phương pháp
CE-PDA và HPLC-PDA.

Flavonoid

Mẫu lá Sen loài N. Nucifera
NN-1
a
NN-1
b
NN-2
a
NN-2
b
NN-3
a
NN-3
b
catechin
CE
0,16
(2,46)
0,09

(1,89)
0,21
(3,15)
0,13
(3,05)
0,09
(5,09)
0,05
(2,38)
HPLC
0,15
(1,86)
0,10
(1,53)
0,19
(1,92)
0,04
(1,65)
0,07
(1,49)
-
isorhamnetin
CE
0,08
(1,56)
0,03
(1,69)
-
-
-

-
HPLC
0,09
(3,08)
0,04
(2,87)

-
-
-
-
kaempferol
CE
0,14
(1,78)
0,11
(2,12)
-
-
-
-
HPLC
0,14
(3,09)
0,12
(2,82)
-
-
-
-

rutin
CE
0,19
(2,50)
0,02
(4,14)
0,13
(2,32)
0,08
(2,67)
0,18
(3,14)
0,15
(3,45)
HPLC
0,17
(1,62)
0,06
(1,76)
0,11
(2,43)
0,05
(2,05)
0,19
(3,12)
0,10
(1,86)
isoquercitrin
CE
0,31

(3,24)
0,26
(4,57)
0,33
(3,96)
0,21
(2,80)
0,39
(3,56)
0,12
(4,43)
hyperin
CE
0,35
(2,15)
0,27
(3,48)
0,46
(3,65)
0,28
(3,23)
0,53
(3,22)
0,23
(3,45)
quercetin
CE
0,09
(2,34)
0,04

(3,75)
0,08
(3,24)
0,03
(3,20)
0,21
(4,12)
0,12
(3,78)
HPLC
0,14
(2,42)
0,08
(4,32)
0,09
(1,84)
0,03
(2,17)
0,18
(4,05)
0,09
(2,75)
quercetin 3-
O-β-D-GlcA
CE
1,68
(1,45)
1,34
(2,16)
1,30

(1,78)
0,54
(0,97)
0,80
(2,31)
0,44
(0,75)
HPLC
1,60
(1,63)
1,23
(1,97)
1,34
(1,86)
0,55
(1,91)
0,76
(1,54)
0,41
(1,39)
Σ

3,14
2,08
2,26
0,89
1,01
0,72
20

Chương 4: BÀN LUẬN

4.1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các alkaloid,
flavonoid từ lá và tâm Sen
Chiết xuất: Trong quá trình phân lập alkaloid lá, tâm Sen,
khi chiết phân bố với CHCl
3
(ở pH ≥ 8) để thu tủa alkaloid toàn phần sẽ
gặp rất nhiều khó khăn do hiện tượng tạo quá nhiều nhũ. Đây là một trở
ngại rất lớn trong quá trình nghiên cứu. Để khắc phục, thử nghiệm
khảo sát với hai phương pháp chiết đặc hiệu hơn cho alkaloid bằng cách
cho tạo cặp ion với một acid màu hữu cơ như Helianthin và chọn phương
pháp tạo tủa alkaloid với thuốc thử Bertrand. Phương pháp thứ 2 đã cho
hiệu quả rất tốt khi thu đặc hiệu hơn tất cả alkaloid từ kém phân cực đến
rất phân cực, sạch tạp cũng như tránh được khó khăn của việc tạo nhũ
khi chiết với dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm.
Phân lập: Kết quả nghiên cứu của luận án cũng đã sử dụng các
phương pháp sắc ký khác nhau với nhiều loại pha tĩnh khác nhau như:
silica gel; Sephadex LH-20; silica gel ghép C-18, C-8; trao đổi cation
cho việc phân lập các alakloid, flavonoid trong lá, tâm Sen. Đặc biệt,
phương pháp sắc ký phân bố ly tâm nhanh (FCPC) lần đầu tiên được sử
dụng để phân lập hai alkaloid mới EN-4 và EN-5 (có độ phân cực mạnh)
từ tâm Sen. Hai pha không đồng tan thích hợp được lựa chọn là
CHCl
3
-MeOH-TEA 0,2 % (12:5:3) với pha động là pha dưới và
pha tĩnh là pha trên, giúp phân lập thành công hai gen-alkaloid này.
Bên cạnh đó, trong quá trình nghiên cứu đã thu được isoliensinin
(EN-1: 17,6 g) bằng phương pháp kết tinh ở pH và nhiệt độ phù hợp
trong quá trình chiết phân bố lỏng-lỏng theo gradient pH nguyên liệu

tâm Sen. Phương pháp này rất đơn giản, dễ thực hiện, thu được lượng
21

nhiều và tinh chế lại cho độ tinh khiết cao mà khi phân lập bằng các
phương pháp sắc ký gần như không thực hiện được ở qui mô PTN.
Xác định cấu trúc: Luận án đã góp phần xây dựng các bộ dữ liệu
phổ học gồm phổ UV, IR, MS, NMR của 16 alkaloid, 12 flavonoid từ
lá và tâm Sen, cơ sở dữ liệu phổ học quan trọng cho các công trình
nghiên cứu thành phần hóa học của cây Sen và chỉ ra những dấu hiệu
đặc biệt giúp dễ dàng định danh các alkaloid thuộc bốn khung aporphin,
proaporphin, bisbenzylisoquinolin, benzylisoquinolin và flavonoid
nhóm flavonol, phân biệt các chất trong cùng khung.
4.2. Qui trình định tính và định lượng alkaloid, flavonoid trong
lá, tâm Sen
Các nghiên cứu định tính, định lượng trong luận án đã sử dụng
hai phương pháp phân tích hiện đại là LC và CE ghép nối với đầu dò
PDA hay MS cho kết quả với độ tin cậy, tính đặc hiệu, độ chính xác,
độ nhạy cao (ng/mL-pg/mL) và không có sự khác biệt nhiều về kết quả
nghiên cứu giữa hai phương pháp
Việc phát triển phương pháp phân tích được thực hiện theo hướng
dẫn của ICH và dựa trên sự hiểu biết về tính chất lý hóa của thành phần
phân tích alkaloid, flavonoid cũng như bản chất pha tỉnh, pha động trong
sắc ký và điện di để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tách (As và
Rs) trong sắc ký như: loại dung môi, tỉ lệ dung môi pha động, pH, điều
nhiệt cho cột, bước sóng phân tích,…hay sự tách trong điện di mao quản
như: loại dung dịch đệm, nồng độ, pH của dung dịch đệm, dung môi bổ
trợ (ACN, MeOH, THF…), bản chất và nồng độ chất diện hoạt,
điện thế áp dụng, nhiệt độ mao quản,,…
4.3. Ứng dụng qui trình định lượng để xác định chất lượng nguồn
nguyên liệu và các chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen

22

Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng các alkaloid, flavonoid có
trong lá, tâm Sen vào mùa thu hái Sen (tháng 6-9 trong năm) cao hơn
nghịch mùa thu hái (các tháng còn lại trong năm), kết quả này góp phần
khẳng định thời gian thu hái Sen theo dân gian là hoàn toàn phù hợp.
Điều kiện thổ nhưỡng và khí hậu khác nhau của các vùng thu hái
(miền Nam nóng ẩm, mưa nhiều vùng đất phù sa; miền Trung nóng khô,
đất cát biển; Cao Nguyên Trung Bộ khí hậu mát đến lạnh và miền Bắc
chủ yếu lạnh, khô ) ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng các alkaloid,
flavonoid có trong lá, tâm Sen. Góp phần đưa ra các chỉ dẫn cho việc
trồng trọt cũng như việc thu hái lá, tâm Sen để thu được thành phần
alkaloid, flavonoid mong muốn với chất lượng tốt nhất.

KẾT LUẬN
Luận án đã hoàn thành các mục tiêu đề ra ban đầu:
1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc alkaloid, flavonoid
Luận án đã phân lập được 35 hợp chất: 21 alkaloid và 18 flavonoid.
Từ lá Sen: 10 alkaloid: nuciferin, 2-O-nornuciferin, caaverin,
asimilobin, apoglaziovin, norarmepavin, armepavin, pronuciferin,
pronuciferin N-oxid, isoliensinin; 08 flavonoid: quercetin,
isoquercitrin, quercetin 3-O-β-D-GlcA, hyperin, isorhamnetin,
kaempferol, rutin, catechin.
Từ tâm Sen: 11 alkaloid: isoliensinin, liensinin, neferin, isoliensinin
N
2’
oxid, isoliensinin N
2
oxid, norarmepavin, armepavin, N-methyl
coclaurin, lotusin, nuciferin, pronuciferin; 06 flavonoid: calycosin,

isorhamnetin, vitexin, scutellarein 7-O-β-D-GlcA methyl ester,
quercitrin, quercetin 3-O-β-D-GlcA.
Trong số 28 cấu trúc được xác định này có: