khảo sát tỷ lệ escherichia coli sinh men betalactamase phổ rộng và xác định kiểu gen ctxm từ gà khỏe tại tỉnh trà vinh

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y




NGUYỄN THỊ NGUYỆT














LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGÀNH THÚ Y

Cần Thơ, 2014



KHẢO SÁT TỶ LỆ ESCHERICHIA COLI SINH
MEN BETA-LACTAMASE PHỔ RỘNG
VÀ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CTX-M TỪ
GÀ KHỎE TẠI TỈNH TRÀ VINH



TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGÀNH THÚ Y

Cán bộ hướng dẫn Sinh viên thực hiện
Th.S BÙI THỊ LÊ MINH NGUYỄN THỊ NGUYỆT
MSSV: 3103042
Lớp: CN10Y4A1 – K36




KHẢO SÁT TỶ LỆ ESCHERICHIA COLI SINH
MEN BETA-LACTAMASE PHỔ RỘNG
VÀ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CTX-M TỪ
GÀ KHỎE TẠI TỈNH TRÀ VINH

Cần Thơ, 2014

i
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y
Đề tài “Khảo sát tỷ lệ dƣơng tính E. coli sinh men beta-lactamase phổ rộng và
xác định kiểu gen CTX-M từ gà khỏe tại tỉnh Trà Vinh” do sinh viên Nguyễn
Thị Nguyệt thực hiện tại phòng thí nghiệm vi sinh, Bộ môn Thú Y, Khoa Nông
Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ từ tháng 8/2014 đến
tháng 12/2014.


Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014 Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014
Duyệt Bộ Môn Cán bộ hƣớng dẫn

Th.S Bùi Thị Lê Minh


Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014
Duyệt Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

ii
LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian học tập và rèn luyện dưới mái trường Đại Học Cần Thơ nói chung,
khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng nói riêng. Thầy cô luôn gắn bó, nhiệt
tình dạy bảo và đã dành biết bao tâm huyết cho sự nghiệp trồng người, truyền dạy
cho chúng tôi nhiều điều quý báo cũng như kinh nghiệm nghề nghiệp để chúng tôi
làm hành trang vững bước vào đời. Hôm nay, ước mơ của chúng tôi đã thành sự
thật, với sự phấn đấu của bản thân cùng với sự tận tình giúp đỡ của thầy cô và
nguồn động lực của cha mẹ, tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Nay tôi không
biết nói gì hơn ngoài lời biết ơn thành kính nhất gửi đến những người đã quan tâm
lo lắng và giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
Xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, người đã có công nuôi dưỡng, dạy dỗ và luôn
tạo cơ hội cho tôi để tôi có được ngày hôm nay.
Xin chân thành cám ơn cô Bùi Thị Lê Minh, người đã hết lòng chỉ bảo, quan tâm
tôi trong suốt quá trình thực hiện hiện đề tài. Quý thầy cô Bộ môn Thú Y và Bộ
môn Chăn Nuôi đã tận tình truyền đạt kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báo,
lẫn nhận thức xã hội trong quá trình học tại trường. Cùng tất cả các anh chị cao học
K19, 20, các bạn Thú Y và Dược Thú Y K36, các bạn lớp Thú Y liên thông K38
cũng như các cô chú nuôi gà tại tỉnh Trà Vinh đã chia sẽ và giúp đỡ tôi trong quá
trình thực hiện đề tài.
Cuối lời xin chúc quý thầy cô cùng anh, chị, em và các bạn dồi dào sức khỏe và
thành đạt trong cuộc sống!

Nguyễn Thị Nguyệt







iii
TÓM LƢỢC

Qua việc lấy mẫu phân ở lỗ huyệt gà khỏe bằng kỹ thuật vô trùng tại năm địa điểm
của tỉnh Trà Vinh bao gồm huyện Cầu Kè, Tiểu Cần, Cầu Ngang, Càng Long và
TP. Trà Vinh, tổng số là 120 mẫu, đồng thời tiến hành khảo sát tỷ lệ dương tính E.
coli sinh men ESBL bằng phương pháp đĩa kết hợp và xác định kiểu gen CTX-M
bằng kỹ thuật PCR, từ tháng 8 đến tháng 12 năm 2014. Kết quả ghi nhận được gà
thịt 1 tuần tuổi ở huyện Cầu Kè và Tiểu Cần có tỷ lệ dương tính E. coli ESBL là
83,33% cao hơn so với huyện Cầu Ngang là 16,67%. Tương tự như trên tiến hành
trên gà thịt 1 tháng tuổi, tỷ lệ dương tính E. coli ESBL ở các huyện Cầu Kè, Tiểu
Cần, Cầu Ngang, Càng Long và TP. Trà Vinh lần lượt là 33,33%, 16,67%, 66,67%,
50% và 50%, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê. Đối với gà đẻ
thì tỷ lệ gà dương tính E. coli ESBL ở huyện Tiểu Cần và TP. Trà Vinh cùng là
91,67% chiếm tỷ lệ cao hơn so với huyện Cầu Ngang với tỷ lệ là 50%. Khi so sánh
tỷ lệ dương tính E. coli ESBL giữa các loại gà thì gà đẻ chiếm tỷ lệ cao nhất là
73,33%, thấp nhất là gà thịt chiếm tỷ lệ là 50%. Đồng thời tiến hành xác định kiểu
gen CTX-M trên 30 chủng E. coli ESBL phân lập từ các loại gà, kết quả có 24/30
(80%) chủng E. coli mang gen CTX-M mã hóa ESBL.

iv
Mục lục
Trang duyệt i
Lời cảm ơn ii
Tóm lược iii
Mục lục iv
Danh mục chữ viết tắt vi
Danh mục hình vii
Danh mục bảng viii
CHƢƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 2: CƠ SỞ LÝ LUẬN 2
2.1 Sơ lược về vi khuẩn Escherichia coli 2
2.1.1 Đặc điểm hình thái 2
2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy 3
2.1.3 Đặc tính sinh hóa 3
2.1.4 Sức đề kháng và các độc tố ở E. coli 4
2.2 E. Coli sinh men beta-lactamase phổ rộng 6
2.2.1 Men beta-lactamase phổ rộng 6

2.2.2 Một số phương pháp phát hiện ESBL 8
2.3 Tình hình nghiên cứu E. Coli sinh men ESBL trên gà 9
2.4 Giới thiệu phương pháp PCR 11
2.4.1 Nguyên tắc chung 11
2.4.2 Thành phần phản ứng PCR 12
2.4.3 Các giai đoạn của phản ứng PCR 12
2.4.4 Kiểm tra kết quả PCR 14
2.4.5 Ứng dụng của phương pháp PCR 15
CHƢƠNG 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
3.1 Phương tiện nghiên cứu 16
3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu 16

v
3.1.2 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 16
3.2 Phương pháp nghiên cứu 16
3.2.1 Phương pháp lấy mẫu 16
3.2.2 Phương pháp phân lập E. Coli sinh men ESBL 17
3.2.3 Phương pháp xác định gen CTX-M mã hóa ESBL 19
3.3 Phương pháp xử lý số liệu 20
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21
4.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ hiện diện E. coli sinh men ESBL trên gà thịt 1
tuần tuổi 21
4.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ hiện diện E. coli sinh men ESBL trên gà thịt 1
tháng tuổi 22
4.3 Kết quả khảo sát tỷ lệ hiện diện E. coli sinh men ESBL trên gà đẻ 23
4.4 So sánh tỷ lệ hiện diện E. coli sinh men ESBL giữa các loại gà 25
4.5 Kết quả xác định gen CTX-M mã hóa men beta-lactamase phổ rộng 26
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 28
5.1 Kết luận 28
5.2 Đề nghị 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29
PHỤ CHƢƠNG 33










vi
DANH MỤC VIẾT TẮT

CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT ĐẦY ĐỦ
ESBL Extended Spectrum Beta Lactamase
ETEC Enterotoxigenic E. coli
EPEC Enteropathogenic E. coli
EIEC Enteroinvasive E. coli
VTEC Vasotoxin E. coli
APEC Avian Panthogenic E. coli
LT Heat Labile Enterotoxin
ST Heat Stable Enterotoxin
CRD Chronic Respiratory Disease
CLSI Clinical And Laboratory Standards Institute
Cz Ceftazidime/ Clavulanic acid
Ct Cefotaxime/ Clavulanic acid
kb Kilo base
bp Base pair

Da Dalton
TBE Tris-borate-EDTA
TAE Tris-acetate-EDTA
PCR Polymerase chain reaction
DNA Deoxyribo Nucleic Acid
TP Thành phố





vii
DANH MỤC BẢNG













Bảng
Tựa bảng
Trang
2.1

Các thông số điện di DNA bằng agarose gel
15
3.1
Thành phần phản ứng PCR
19
3.2
Trình tự các primer được sử dụng trong phản ứng PCR
19
3.3
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR dùng để xác định gen CTX-M
20
4.1
Tỷ lệ hiện diện E. coli sinh men ESBL trên gà thịt 1 tuần tuổi
21
4.2
Tỷ lệ hiện diện E. coli sinh men ESBL trên gà thịt 1 tháng tuổi
22
4.3
Tỷ lệ hiện diện E. coli sinh men ESBL trên gà đẻ
23
4.4
Kết quả phân lập E. coli sinh men ESBL hiện diện trên phân của
các loại gà khỏe
25

viii
DANH MỤC HÌNH

Hình Tựa hình Trang
2.1 Vi khuẩn E. Coli dưới kính hiển vi quang học 2

2.2 Phản ứng PCR – bước biến tính 12
2.3 Phản ứng PCR – bước bắt cặp của các mồi vào sợi khuôn 13
2.4 Phản ứng PCR – bước kéo dài chuỗi 13
2.5 Phản ứng PCR – sản phẩm DNA sau một chu kỳ 13
2.6 Sản phẩm cuối cùng của phản ứng PCR 13
3.1 Quy trình phân lập E.coli sinh men ESBL 18
4.1 Biểu đồ thể hiện tỷ lệ hiện diện E. coli ESBL trên gà đẻ tại
các huyện 24
4.2 Kết quả PCR của gen CTX-M trên gà thịt 1 tháng tuổi 27















1
CHƢƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Đối với Việt Nam, chăn nuôi gia cầm là một trong các ngành chăn nuôi quan trọng
góp phần vào sự tăng mạnh cơ cấu GDP. Theo kết quả điều tra sơ bộ tại thời điểm
1/4/2014 của Tổng cục Thống kê, tổng số gia cầm của cả nước là 314,4 triệu con và
có tốc độ tăng trưởng nhanh nhất trong 15 năm qua. Việc phát triển đàn gà một cách

nhanh chống như vậy nhằm tạo ra sản phẩm đáp ứng nhu cầu của thị trường thì vấn
đề về dịch bệnh là không thể tránh khỏi, trong đó E. coli là một trong những vi
khuẩn gây bệnh phổ biến nhất cho gia cầm. Tuy nhiên, hầu hết các chủng E. coli là
vô hại và sống phong phú trong hệ thống đường ruột của gia cầm khỏe mạnh
(Nguyễn Xuân Bình et al., 2002). Trong số những E. coli này thì E. coli sinh men
ESBL được xem là tình trạng đáng lo ngại nhất trong thời gian qua, vì chúng có khả
năng đề kháng lại các loại kháng sinh quan trọng thuộc nhóm beta-lactam bao gồm
penicillin và những cephalosporin thế hệ mới. Có nhiều nguyên nhân gây nên E.
coli sinh men ESBL hiện diện trên gà, trong đó quan trọng nhất vẫn là môi trường
chuồng trại (Hiroi et al., 2012). Mặt khác, tại Bắc Mỹ và Châu Âu, khoảng 50%
kháng sinh sản xuất ra được sử dụng để bổ sung vào thức ăn gia súc và gia cầm,
giúp phòng bệnh và tăng trọng mà không quan tâm đến trình trạng sức khỏe của
chúng. Điều này đã làm tăng trình trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn và
thông qua những thực phẩm có nguồn gốc từ động vật (thịt bò, thịt heo, thịt gà) sẽ
gây bệnh cho người (Lucianne et al., 2013). Theo nghiên cứu của EFSA (2011) cho
thấy sự hiện diện của E. coli sinh men ESBL có trong các loại thực phẩm trên với tỷ
lệ ngày càng tăng như ở Hà Lan có tỷ lệ E. coli sinh men ESBL trên thịt gà là
79,8% (71/89 mẫu) (Overdevest et al., 2011); nghiên cứu của Felix et al. (2013) về
Enterobacteria sinh men ESBL có trong phân gà khỏe với tỷ lệ là 72,5% (37/51
mẫu), trong đó vi khuẩn E. coli hiện diện nhiều nhất và kiểu gen mã hóa ESBL loại
CTX-M chiếm tỷ lệ cao nhất là 89% (66/74 chủng E. coli), với tỷ lệ nhiễm CTX-M
trong những năm gần đây cao hơn so với TEM và SHV. Như vậy một khi dịch bệnh
do E.coli sinh men ESBL gây ra thì việc điều trị kháng sinh tất yếu sẽ không mang
lại hiệu quả, gây tổn thất kinh tế nặng nề cho người chăn nuôi. Chính vì vậy mà việc
nghiên cứu về E. coli sinh men ESBL và kiểu gen CTX-M của chúng là rất cần
thiết. Với lý do trên và được sự hướng dẫn của Th.S Bùi Thị Lê Minh tôi thực hiện
đề tài “Khảo sát tỷ lệ Escherichia coli sinh men beta-lactamase phổ rộng và xác
định kiểu gen CTX-M từ gà khỏe tại tỉnh Trà Vinh”.
Mục tiêu của đề tài:
- Xác định tỷ lệ E. coli sinh men ESBL trên gà khỏe tại tỉnh Trà Vinh.

- Xác định kiểu gen CTX-M mã hóa men ESBL trên gà khỏe tại tỉnh Trà Vinh.

2
CHƢƠNG 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN
2.1 Sơ lƣợc về vi khuẩn Escherichia coli
Theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2006), vi khuẩn Escherichia coli thuộc
lớp: Schyzomycetes, bộ: Eubacteriales, họ: Enterobacteriaceae, tộc: Escherichiae,
giống: Escherichia, loài: Escherichia coli.
Escherichia coli được gọi tắt là E.coli còn có tên là Bacterium coli commue được
ông Escherich phát hiện năm 1885 trong trường hợp tiêu chảy ở trẻ em.
E.coli là trực khuẩn ruột già, vi khuẩn này có mặt trong ruột hầu hết động vật, ở
phần cuối ruột non hay ruột già, ít khi có ở dạ dày hay phần trước ruột non của các
loài động vật như: chó, mèo, heo, bò, ngựa, gia cầm và người.
Vi khuẩn thường theo phân ra ngoài nên ta thường thấy vi khuẩn trong đất, nước,
không khí. Trong tự nhiên vi khuẩn sống được vài tuần đến vài tháng. Động vật non
cảm nhiễm đặc biệt với E.coli.
2.1.1 Đặc điểm hình thái
E.coli là trực khuẩn ngắn, Gram âm, bắt màu hồng, có hình dạng đồng nhất, không
có khả năng hình thành nha bào, kích thước 2-3 x 0,6 µm, hai đầu tròn, đứng riêng
lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn di động, có giáp mô thỉnh thoảng thấy bắt màu
lưỡng cực ở hai đầu (Hồ Thị Việt Thu và ctv., 2012).

( />mages.html)
Hình 2.1. Vi khuẩn E. coli dưới kính hiển vi quang học

3
2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy
Vi khuẩn E.coli là trực khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có thể nuôi cấy ở nhiệt
độ 37
0
C, pH= 7,2-7,4.(Nguyễn Như Thanh và ctv., 1997).
Mọc tốt trong môi trường dinh dưỡng thông thường và chịu được sự biến thiên nhiệt
độ từ 4 - 45
0
C. Trên môi trường thạch dinh dưỡng tạo khuẩn lạc tròn ướt, màu trắng
đục hơi lồi, để lâu có dạng khô rìa hơi nhăn.
Môi trường thạch thịt Pepton sau 18-24 giờ bồi dưỡng trong tủ ấm ở 37
0
C, chúng
mọc thành những khuẩn lạc ẩm ướt, ánh màu xám, kích thước trung bình, dạng tròn,
mặt khẩn lạc hơi lồi lên, có nếp nhăn và bề mặt láng.
Trên môi trường thạch máu: sau 24h ở 37
0
C hình thành khuẩn lạc màu sáng, có
chủng dung huyết

,
và có chủng không gây dung huyết.
Trên thạch gelatin không tan chảy, môi trường canh dinh dưỡng làm đục đều môi
trường, sau lắng xuống đáy có màu tro nhạt, đôi khi có màu xám, mùi trứng thúi.

Trên môi trường chuyên biệt Mac Conkey: vi khuẩn tạo khóm đỏ hồng nhờ vào sự
lên men đường lactose.
Trên môi trường Eosin methylen blue: tạo khuẩn lạc màu tím ánh kim.
Trên môi trường Kligler iron agar: lên men đường glucose và lactose (vàng/vàng),
sinh hơi, không sinh khí H
2
S.
Môi trường Brilliant green agar tạo khóm xanh lá mạ.
2.1.3 Đặc tính sinh hóa
E. coli lên men sinh hơi các loại đường glucose, maltose, galactose, levulose,
lactose, fruitose. Tất cả các E. coli đều lên men đường lactose nhanh và sinh hơi,
đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt E. coli và Salmonella (Nguyễn Như Thanh,
1997).
E. coli không sinh H
2
S, không tan chảy gellatin, không phân hủy đạm, hoàn nguyên
Nitrate thành Nitrite.
Để phân biệt E. Coli với vi khuẩn đường ruột khác, người ta thường sử dụng thử
nghiệm IMViC. Khi đó nếu là E. Coli thì sẽ cho kết quả là: Indol +, methylred +,
voges proskauer –, citrate – (FAO, 1992).
Trong đó, người ta sử dụng các loại môi trường như Trytone broth, MR-VP broth
và simmon‟s citrate agar để kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli này
(

4
Môi trường Tryptone dùng để kiểm tra tính sinh Indole của vi khuẩn. Sau khi nhỏ
thuốc thử Kovacs‟ vào môi trường này, nếu trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng
đỏ thì phản ứng dương tính, ngược lại nếu vòng đỏ không xuất hiện thì phản ứng
âm tính.
Môi trường MR-VP với thuốc thử Methyl Red dùng để kiểm tra tính sử dụng đường

của vi khuẩn. Nhỏ một giọt thuốc thử vào môi trường này, nếu vòng đỏ xuất hiện
trên bề mặt môi trường là phản ứng dương tính và ngược lại.
Môi trường MR-VP với thuốc thử VP
1
và VP
2
dùng để kiểm tra tính di động và
kiểm tra tính sinh aceton của vi khuẩn. Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục
môi trường. Ngược lại. vi khuẩn không có khả năng di động thì chỉ thấy vi khuẩn
mọc ở đường que cấy, môi trường xung quanh trong. Trong môi trường này, sau khi
cho thuốc thử VP
1
, VP
2
vào nếu trên bề mặt môi trường có vòng đỏ thì chứng tỏ vi
khuẩn có khả năng sinh acetone và ngược lại.
Môi trường Simmon‟s Citrate dùng để kiểm tra khả năng sử dụng Citrate thay
nguồn Carbon của vi khuẩn. Trên môi trường này, vi khuẩn cho kết quả dương tính
khi màu của môi trường chuyển từ xanh lục sang xanh dương, nếu môi trường vẫn
giữ màu xanh lục được gọi là phản ứng âm tính.
2.1.4 Sức đề kháng và những độc tố ở E. coli
Cấu trúc kháng nguyên
Kháng nguyên O: người ta đã biết tới gần 160 yếu tố kháng nguyên O của E. coli.
Kháng nguyên K: Khoảng 100 yếu tố kháng nguyên K đã được xác định và được
chia thành ba loại: A, B và L, trong đó A dưới dạng vỏ quan sát được bằng kính
hiển vi quang học thông thường, B và L dưới dạng màng rất mỏng chỉ có thể quan
sát được nhờ kính hiển vi điện tử.
Kháng nguyên H: hơn 50 yếu tố kháng nguyên H đã được xác định ( Lê Thị Hạnh
Dung, 2012).
Tính chất gây bệnh

Sở dĩ vi khuẩn E. coli từ vai trò cộng sinh thường trực trong đường ruột trở thành vi
khuẩn gây bệnh là vì trong quá trình sống cá thể, vi khuẩn tiếp nhận được các yếu tố
gây bệnh, đó là yếu tố gây dung huyết, yếu tố cạnh tranh, yếu tố bám dính, yếu tố
độc tố đường ruột, yếu tố kháng kháng sinh. Các yếu tố gây bệnh này không được
di truyền qua DNA của chromosome, mà di truyền bằng plasmid, qua hiện tượng
trao đổi di truyền tiếp hợp. Chính những yếu tố gây bệnh này, đã giúp cho vi khuẩn
bám dính vào được tế bào nhung mao ruột non, xâm nhập vào thành ruột, từ đây vi

5
khuẩn thực hiện quá trình gây bệnh của mình, là sản sinh độc tố gây ra các triệu
chứng, phá hủy tế bào niêm mạc ruột, gây dung huyết, nhiễm độc huyết (Đậu Ngọc
Hào, 2011).
Theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2006), dựa vào vị trí gây bệnh các
E. coli có khả năng gây bệnh ở gia cầm được chia thành hai nhóm chính: thứ nhất là
nhóm gây bệnh đường ruột hay E. coli gây tiêu chảy, thứ hai là nhóm gây bệnh
ngoài đường ruột.
Các loại E. coli gây bệnh đường ruột (IPEC) bao gồm:
E. coli độc tố ruột: Enterotoxigenic E. coli (ETEC).
E. coli gây bệnh tích ở ruột: Enteropathogenic E. coli (EPEC).
E. coli xâm lấn ruột: Enteroinvasive E. coli (EIEC).
E. coli ngưng tập ruột: Enteroaggregative E. coli (EAEC).
E. coli bám dính phân tán: Diffusely adherent E. coli (DAEC).
E. coli gây xuất huyết ruột: Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC).
Hai loại E. coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là:
E. coli gây viêm màng não: Meningitidis-associated E. coli (MAEC).
E. coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu: Uropathogenic E. coli (UPEC).
Và một số nhóm khác như: Vasotoxin E. coli hay verotoxin (VTEC), APEC.
Enterotoxigenic E. coli (ETEC): đây là độc tố được nói đến nhiều nhất và nó được
xem là nguyên nhân gây tiêu chảy thông thường trên thú non (độc tố đường ruột),
có 2 loại:

LT (heat labile enterotoxin): độc tố đường ruột không chịu nhiệt.
ST (heat stable enterotoxin): là độc tố đường ruột chịu nhiệt.
Những động vật mang độc tố ETEC sản xuất LT và ST sẽ gây tiêu chảy trầm trọng
và kéo dài hơn những thú mà E. coli chỉ tạo được LT hay ST. Khả năng sinh
enterotoxin cũng có thể thay đổi nếu cấy chuyển nhiều, một số dòng sẽ mất khả
năng sinh enterotoxin.
Vi khuẩn E. coli gây bệnh trên gia cầm là nhóm APEC (Avian Pathogenic E. coli)
thuộc serotype O1, O2, O78 gây bệnh đường ruột là do kết hợp với nhiều yếu tố
ngoại cảnh và nhân tố mở đường (Lê Hồng Mận, 1999). Bệnh tiêu chảy do E. coli
thường xảy ra ở gà 1 – 10 ngày tuổi, kéo dài đến 9 tuần tuổi. Trong tự nhiên vi
khuẩn tồn tại khắp nơi nền chuồng, máng ăn, nước uống, chuồng trại ẩm thấp chật

6
chội, mật độ nuôi cao, biên độ nhiệt thường xuyên thay đổi, stress có thể là những
điều kiện phát sinh mầm bệnh. Nguồn lây bệnh chủ yếu là từ gà mẹ lây truyền qua
trứng (Hồ Thị Việt Thu và ctv., 2012), gà bệnh và gà khỏe mang trùng bài xuất
mầm bệnh ra môi trường nuôi nhốt, ngoài ra nguồn bệnh có thể do các loài gậm
nhấm lây truyền sang hoặc có thể từ công nhân mang mầm bệnh từ môi trường
ngoài vào (Nguyễn Xuân Bình, 2005).
Sức đề kháng
E. coli bị tiêu diệt ở nhiệt độ 55
0
C trong 1 giờ, 60
0
C trong 15-30 phút, 95% bị diệt ở
nhiệt độ đông lạnh trong 2 giờ. Trong tự nhiên có thể tồn tại từ vài tuần đến 1 tháng,
chủng độc lực cao có thể tồn tại trên 4 tháng.
Vi khuẩn này dễ dàng bị diệt bởi các chất sát trùng thông thường như: acid fenic,
HgCl
2

, formol trong 5 phút, có khả năng chịu đựng được các yếu tố lý hóa cao hơn
các vi khuẩn khác như Salmonella, Shigella (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên,
2006).
Nơi cư trú chính của E. coli thường ở phần sau của ruột, chúng theo phân của người
hay gia súc, gia cầm đào thải ra ngoài. E. coli xuất hiện và sinh sống rất sớm ở
đường ruột người và động vật chỉ vài giờ sau khi sinh và tồn tại đến khi con vật
chết.
Theo Nguyễn Như Thanh (2001) các chủng E. coli không gây bệnh mà chỉ khi các
điều kiện nuôi dưỡng, chăm sóc, vệ sinh thú y kém và trên cơ sở mắc kế phát sau
các bệnh ký sinh trùng, bệnh virus, bệnh CRD dẫn đến sức chống đỡ của con vật
suy giảm thì vi khuẩn E. coli trở nên cường độc và có khả năng gây bệnh.
Theo Lê Văn Năm (2010) thời gian nung bệnh có thể từ vài ngày tới vài tuần tùy
thuộc vào độc lực và số vi khuẩn gây nhiễm, sức đề kháng, điều kiện chuồng trại,
thức ăn, nước uống. Trường hợp gà bị CRD kết hợp với E. coli thì sẽ gây viêm túi
khí nặng, fibrin hoặc fibrin mủ, viêm màng bao tim và màng quanh gan, trên gà đẻ
thì có casein bao phủ lên buồng trứng ( Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010).
2.2 E. coli sinh men beta-lactamase phổ rộng
E. coli là vi khuẩn phổ biến nhất trong hệ vi khuẩn Enterobacteria và nó cũng là vi
khuẩn sinh men ESBL nhiều nhất ở người cũng như động vật. Bên cạnh đó, có
nhiều báo cáo về E. coli ESBL được phân lập từ người và những thức ăn có nguồn
gốc từ động vật đã được công bố ở khắp nơi trên thế giới (Mesa et al., 2006).
2.2.1 Men beta-lactamase phổ rộng

7
Men beta-lactamase phổ rộng (ESBL) được tìm thấy lần đầu tiên năm 1983 tại Đức,
thường gặp trong các chủng đường ruột đặc biệt là Klebsiella spp, E. coli…khi các
chủng vi khuẩn sinh ESBL thì đồng nghĩa với việc chúng kháng lại rất nhiều các
kháng sinh, đặc biệt là nhóm cephaslosporin. Việc sử dụng kháng sinh trong chăn
nuôi đã tác động vào tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn. Tại Bắc Mỹ và
Châu Âu, khoảng 50% kháng sinh sản xuất ra được sử dụng trong thức ăn gia súc

và gia cầm. Phần lớn lượng kháng sinh này được sử dụng như là hoạt chất phụ trợ
trong thức ăn để phòng bệnh và tăng trọng, bất chấp trình trạng sức khỏe của gia súc
và gia cầm. Điều này đã làm tăng trình trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn
như salmonella, E.coli, và thông qua thực phẩm sẽ gây bệnh trên người (Lucianne
et al., 2013).
Theo Philippon et al. (1989), men beta-lactamase phổ rộng – extended spectrum
beta-lactamse (ESBL) có nguồn gốc từ sự đột biến của các men beta-lactamase
nguyên thủy như: TEM, SHV, CTX-M… (TEM, SHV…là tên viết tắc
của các beta-lactamase được tìm thấy đầu tiên. Ví dụ như TEM là tên của một cô
gái người đến từ Hy Lạp mà người ta đã phân lập được chủng E. coli đầu
tiên có beta-lactamase), thường gặp trong các chủng vi khuẩn đường ruột đặc
biệt là Klebsiella spp, E. coli… bản chất hoạt lực của ESBL chính là khả năng
thủy phân các cephalosporin trừ cephamycin, các penicillin trừ temocyllin, thủy
phân aztreonam và monobactam. Nhóm carbapenem như imipenem, meropenem,
ertapenem… đều bền vững với ESBL. Với các biến thể khác nhau của các gen mã
hóa ESBL thì chúng có hoạt lực khác nhau với các cephalosporin. Chẳng hạn như
TEM-3 và đa số SHV đều có hoạt lực mạnh chống lại cefotaxime và ceftazidime.
Trong khi đó với các biến thể khác (khác biệt về trình tự acid amin bị thay thế) như
TEM-10 và TEM-26 ít có hoạt lực chống lại cefotaxime và ceftriaxone… Trái lại,
đa số men CTX-M có hoạt lực mạnh chống lại cefotaxime và ceftriaxone. Người ta
thấy rằng một số chủng vi khuẩn có ESBL nhưng vẫn nhạy cảm với một số kháng
sinh cephalosporin trên kết quả kháng sinh đồ. Tuy nhiên trong lâm sàng nếu chúng
ta dùng các cephalosporin đó để điều trị cho người bệnh thì vẫn thường bị thất bại.
Plasmid mang gen ESBL tương đối lớn khoảng 80Kb hoặc lớn hơn, đều đặc biệt
là trên plasmid đó thường có một số các gen kháng kháng sinh khác, do đó tạo nên
hiện tượng đồng kháng rất nguy hiểm. Đồng kháng thường hay gặp trong các
chủng có men beta-lactamase phổ rộng là kháng aminoglycosid, fluoroquinolon,
tetracylin, chloramphenicol và sulfamethoxazol-trimethoprime.
Có nhiều lớp ESBL với các biến thể khác nhau nhưng hay gặp nhất là các lớp sau:

8
 TEM (A): là các đột biến TEM penicilinase, có nguồn gốc không rõ, chúng có
trên 100 biến thể.
 SHV (A): các đột biến penicilinase, ở Klebsiella pneumoniae thì xuất phát từ
nhiễm sắc thể, chúng có trên 50 biến thể.
 CTX-M: có 40 biến thể trong 5 phân lớp, các phân lớp đều xuất phát từ nhiễm
sắc thể rồi chuyển động nhờ các trình tự chèn.
 VEB, PER, OXA-15 là những lớp ít gặp hơn và có rất ít biến thể < 3 biến thể.
Trong đó, CTX-M là loại gen phổ biến nhất, là nhóm mới của ESBL, được tìm thấy
lần đầu tiên tại Nam Mỹ, Đức và Pháp, nó có cơ chế kháng lại cefotaxime, trong khi
TEM và SHV lại kháng với ceftazidime hơn là cefotaxime (Spyros et al., 2004;
Rossolini et al., 2008).
Các gen mã hóa ESBL được nằm trên plasmid, chúng có thể dễ dàng truyền giữa
các chủng với nhau, mang thêm sự đề kháng đối với những kháng sinh khác như là
fluoroquinolone, aminoglucoside và sulfonamide, góp phần vào kiểu hình đa kháng
ở vi khuẩn (Lucianne et al., 2013).
2.2.2 Một số phƣơng pháp phát hiện ESBL
Theo Nguyễn Sâm (2009) đánh giá về một số phương pháp phát hiện beta-
lactamase phổ rộng, bao gồm một số phương pháp sau đây:
ChromID ESBL agar
Môi trường ChromID ESBL do hãng Bio-Merieux (Pháp) sản xuất, đã được nhiều
nước trên thế giới sử dụng. Đây là môi trường được khuyến cáo thông dụng để sàng
lọc các vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae sinh ESBL. Việc xác định vi khuẩn
sinh ESBL đặc biệt quan trọng trong việc phòng và giám sát dịch tễ bệnh nhiễm
khuẩn. Sử dụng môi trường ChromID ESBL giúp nhanh chống sàng lọc các vi
khuẩn sinh ESBL.
Nguyên lý: Môi trường chứa kháng sinh Cefpodoxime. Nếu vi khuẩn sinh ESBL sẽ
kháng với Cefpodoxime và có khả năng phát triển trên môi trường ChromID ESBL
tạo thành các khuẩn lạc có màu sắc khác nhau, đặc trưng cho một số loài vi khuẩn.
Đối với E. coli thì khuẩn lạc có màu hồng hoặc màu đỏ rượu vang.

Phương pháp đĩa đôi
Phương pháp đĩa đôi được các nhà nghiên cứu người Pháp tiến hành cuối những
năm 1980. Sau được tác giả người Anh David M Livermore và các cộng sự đã tiếp
tục nghiên cứu và đề xuất thêm một số tiêu chuẩn kỹ thuật cho thử nghiệm. Viện

9
chuẩn thức các xét nghiệm lâm sàng (Anh quốc) đã sử dụng phương pháp đĩa đôi để
khẳng định vi khuẩn sinh ESBL.
Nguyên lý: Các ESBL có khả năng phân hủy các Cephalosporin phổ rộng nhưng bị
ức chế bởi clavulanic acid, dẫn đến xuất hiện vùng ức chế vi khuẩn xung quanh
khoanh giấy kháng sinh Amoxicillin và mở rộng vùng ức chế giao thoa giữa
Amoxicillin với Ceftazidime và Cefotaxime.
Băng giấy E-test ESBL
Băng giấy E-test là thanh plastic mỏng, kích thước 5x60mm, một mặt không thấm
nước, một mặt được tẩm kháng sinh với các nồng độ khác nhau. Băng giấy E-test
ESBL là một loại băng E-test đặc biệt, có một phần chứa các nồng độ kháng sinh
Cephalosporin phổ rộng được pha loãng từ thấp đến cao, tính bằng µg/ml, phần còn
lại chứa Cephalosporin phổ rộng kết hợp clavulanic acid (Cz, Ct).
Nguyên lý: ESBL bị ức chế bởi clavulanic acid nên E.coli và K. Pneumoniae sinh
ESBL sẽ có vùng ức chế vi khuẩn ở phần chứa kháng sinh kết hợp clavulanic acid,
phần còn lại không chứa chất ức chế dẫn đến kháng sinh bị ESBL phân hủy nên
vùng ức chế vi khuẩn nhỏ hơn hoặc không có vùng ức chế do vi khuẩn không bị
kháng sinh ức chế hoặc chỉ bị ức chế ở nồng độ kháng sinh cao.
Phương pháp đĩa kết hợp: Sử dụng một khoanh kết hợp cephalosporin với
clavulanic acid 30µg và một khoanh cephalosporin 30µg. Nếu đường kính ức chế ở
khoanh kết hợp lớn hơn khoanh còn lại 5mm thì kết luận vi khuẩn ESBL (+).
2.3 Tình hình nghiên cứu E. coli sinh ESBL trên gà
Trên thế giới có đã có rất nhiều nghiên cứu về E.coli sinh men ESBL trên nhiều đối
tượng khác nhau, trong đó gà là một trong những đối tượng được nghiên cứu phổ
biến nhất, cụ thể là:

Một nghiên cứu của Daniela et al. (2009) về việc xác định tỷ lệ E. coli sinh men
ESBL trên mẫu phân gà thịt khỏe tại Bồ Đào Nha, kết quả thu được có 42,1%
(32/76mẫu) dương tính với E. coli sinh men ESBL.
Theo Dhanji, Murphy et al. (2010) đã phân lập E. coli sinh men ESBL trên thịt gà
sống nhập khẩu từ Nam Mỹ vào nước Anh. Kết quả có 62/210 mẫu dương tính với
E. coli sinh men ESBL, trong đó thu được 141 chủng E. coli. Trong số các chủng
này có 30% sản sinh nhóm 2 CTX-M ESBLs, 27% sản sinh nhóm 8 CTX-M
ESBLs, 42% sản sinh CMY-type AmpC enzymes và 1% sản xuất một nhóm 2
CTX-M cùng với một enzyme CMY; không có E. coli nào sản xuất CTX-M-15
ESBL và dòng vô tính ST131.

10
Overdevest et al. (2011) đã xác định tỷ lệ và những đặc tính các gen beta lactamase
phổ rộng của vi khuẩn E. coli ở người và thịt gà bán lẻ tại Netherlands. Kết quả cho
thấy những gen ESBL phổ rộng được tìm thấy ở thịt gà chiếm một tỷ lệ cao là
79.8% (71/89 mẫu). Phân tích di truyền cho thấy rằng những gen ESBL trên thịt gà
và người là giống nhau. Những phát hiện này đưa ra rằng sự có mặt phong phú của
các gen ESBL ở chuỗi thức ăn có thể có một ảnh hưởng sâu rộng vào sự chọn lọc
cho việc điều trị nhiễm khuẩn trong tương lai được gây ra bởi vi khuẩn gam âm nói
chung và vi khuẩn E. coli nói riêng.
Để cung cấp dữ liệu về sự nguy hiểm đến sức khỏe cộng đồng của vi khuẩn
Salmonella và E. coli ở trong thực phẩm, Maria et al. (2013) đã nghiên cứu thấy sự
xuất hiện và đặc tính của E. coli và Salmonella sinh men ESBL/pAmpC trong 430
mẫu thịt bò, thịt heo và thịt gà được nhập khẩu vào Thụy Điển. Trong đó kết quả về
tỷ lệ xuất hiện của E. coli sinh men ESBL trên thịt gà tại Nam Mỹ, Châu Âu và Đan
Mạch lần lượt là 95% (41/43 mẫu), 61% (27/44 mẫu) và 15% (7/46 mẫu); gen
CTX-M-2 và CTX-M-8 là các gen trội ở E. coli có trong thịt gà Nam Mỹ, trong khi
gen CMY-2 và CTX-M-1 chiếm ưu thế hơn ở Châu Âu. Qua kết quả nghiên cứu
cho thấy thịt nhập khẩu vào Thụy Điển, đặc biệt là thịt gà là một nguồn thực phẩm
có thể lây truyền E. coli sinh men ESBL /pAmpC cho người.

Kola et al. (2012) tiến hành phân lập 199 mẫu thịt gà tại Đức, trong đó thu được
71/81 chủng là E. coli sinh men ESBL chiếm 93,83%.
Theo Mahboube Bagheri et al. (2014) đã phân lập được 31/204 chủng E. coli dương
tính với ESBL từ 102 thân thịt gà giò được giết mổ ở Iran. Trong đó có 27/31 chủng
mang gen TEM chiếm tỷ lệ là 87,1% và 4/31 chủng mang gen SHV với tỷ lệ là
12,9%.
Một nghiên cứu của Randall et al. (2010) thì tỷ lệ E. coli mang gen CTX-M được
phân lập từ mẫu phân trực tràng của gà ở nước Anh là 54,5%.
Nghiên cứu của Horton et al. (2011) về E. coli sinh men ESBL mang gen CTX-M ở
trâu bò, gà và heo. Kết quả cho thấy tỷ lệ E. coli mang gen CTX-M trên gà là
46,88% (15/32 mẫu).
Felix et al. (2013) với kết quả là 89% (66/74 mẫu) E. coli ESBL mang gen loại
CTX-M khi nghiên cứu về Enterobacteria sinh men ESBL có trong phân gà khỏe
với tỷ lệ là 72,5% (37/51 mẫu).
Theo nghiên cứu của Cindy et al. (2013) cho thấy những E. coli sinh men ESBL
này ngoài hiện diện trong cơ thể gà, chúng còn có mặt trong môi trường chuồng
trại, thức ăn, nước uống, chất độn chuồng của gà.

11
Một nghiên cứu của Hiroi et al. (2012) về các yếu tố xuất hiện E. coli ESBL ở gà
giò tại Nhật Bản, kết quả cho rằng chuồng trại nuôi gà là yếu tố quan trọng cho sự
xuất hiện vi khuẩn E. coli ESBL.
Theo Lucianne et al. (2013) thì báo cáo đầu tiên về vi khuẩn sinh men ESBL là ở
Châu Âu. Về mặt này, ở Tây Ban Nha các chủng E. coli được phân lập từ mẫu phân
của gia cầm khỏe và bệnh là các ESBL loại CTX-M-14, CTX-M-9 và SHV-12. Gen
mã hóa CTX-M-1 cũng được tìm thấy ở các chủng E. coli hiện diện trong phân gà
khỏe tại Pháp. Ở Trung Quốc có các gen như là TEM-57, CTX-M-14, CTX-M-24
và CTX-M-65. Ở Hàn Quốc phát hiện các gen CTX-M-3 và CTX-M-14 ở lò mổ gia
cầm. Thịt gà sống nhập khẩu vào nước Anh từ các nước như Argentina, Chile và
Brazil thì phát hiện các gen CTX-M-2 và CTX-M-8. Qua đó cho thấy gen CTX-M

rất phổ biến và chúng đã lan tỏa ra nhiều nơi trên thế giới.
Tại Việt Nam, các nghiên cứu về E.coli sinh ESBL cũng đã thực hiện, tuy nhiên
cũng chưa thật nhiều nghiên cứu về vấn đề này trên gà, chủ yếu tiến hành trên
người như nghiên cứu của Nguyễn Tuấn Minh (2008) tìm thấy tì lệ vi khuẩn sinh
ESBL gây nhiễm khuẩn hô hấp ở bệnh nhân thở máy là 20,63% trong đó E.coli
chiếm 5,48% và chúng kháng 100% với kháng sinh nhóm Cephalosporin; theo
nghiên cứu của Phạm Ngọc Kiếu et al. (2012) đã phân lập được 148 chủng vi khuẩn
từ các mẫu bệnh phẩm (mủ, nước tiểu, máu, phân, đàm, dịch khác) thì tỷ lệ vi khuẩn
Gram âm sinh ESBL là 33,1%, trong đó chiếm tỷ lệ cao nhất là E.coli và
Enterobacter. Như vậy, việc tiến hành nghiên cứu trên gà về chủng E.coli sinh men
ESBL là việc cần thiết nên làm trong tương lai để cho thấy tỷ lệ E.coli sinh ESBL ở
Việt Nam so với các quốc gia trên thế giới cũng như những ảnh hưởng của chúng
đối với sức khỏe con người.
2.4 Giới thiệu phƣơng pháp PCR
Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
polymerase) được phát minh bởi K.Mullis và cộng sự vào năm 1985. Đây là kỹ
thuật invitro cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong thời
gian ngắn. Đoạn DNA được khuếch đại được nhận dạng nhờ cặp primer đặc hiệu
thường có chiều dài khoảng 18 – 30 nucleotide (Chu Hoàng Mậu, 2005).
2.4.1 Nguyên tắc chung
PCR là kỹ thuật khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu invitro do sự xúc tác
của enzyme DNA polymerase. Sự khuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình
nhiệt lặp lại (có thể từ 30 – 40 lần) gồm đun nóng (95
0
C), làm nguội (60 – 65
0
C), và
ủ dài ở 72
0
C. Trong dung dịch có các primer (thường có 2 primer) bắt cặp bổ sung ở

12
hai đầu mạch đơn tương ứng. Tất cả DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một
mạch DNA mới từ mạch khuôn mẫu đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên
biệt. Mồi là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu
của mạch khuôn. DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành được mạch mới.
Mồi xuôi tác động lên sợi DNA theo chiều 3‟ – 5‟. Mồi ngược tác động theo chiều
5‟ – 3‟(Lò Thanh Sơn, 2009).
2.4.2 Thành phần phản ứng PCR
Thành phần của một phản ứng PCR bao gồm: khuôn mẫu (đoạn DNA cần khuếch
đại, không cần độ tinh sạch cao), cặp primer (để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp
DNA), polymerase chịu nhiệt (Taq – polymerase) giúp chịu được nhiệt độ biến tính
và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng, dNTPS (các loại
nucleotide triphosphate), dung dịch đệm, ion Mg và nước khử ion.
2.4.3 Các giai đoạn của phản ứng PCR
Theo Chu Hoàng Mậu (2005) một phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ
nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính:
Nhiệt độ được đưa lên 94-95
0
C, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi
DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy các phân tử DNA mạch kép bị tách ra, tạo nên các sợi
đơn dùng để làm khuôn tổng hợp sợi mới.

Giai đoạn 2: Giai đoạn bắt cặp:
Sau khi hai sợi DNA tách ra, nhiệt độ sẽ được hạ đến 45
0
C – 65
0
C là nhiệt độ thích
hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào 2 đầu của đoạn DNA đích.

Hình 2.2. Phản ứng PCR – bước biến tính (theo Chu Hoàng Mậu, 2005)
„

„
\
„
„
„
5’
3’
3’
5’

13

Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài:
Nhiệt độ giai đoạn này được tăng lên 72
0
C giúp DNA polymerase tổng hợp sợi mới.
Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA – polymerase và chiều dài đoạn
DNA cần khuếch đại.







Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một đoạn DNA khuôn được nhân lên
thành hai, các đoạn DNA được nhân bản trong mỗi chu kỳ lại được coi là DNA
khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo. Chính vì vậy sau n chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra
2n đoạn DNA giống đoạn DNA khuôn ban đầu.








Hình 2.3. Phản ứng PCR – bước bắt cặp của các mồi vào sợi khuôn
(theo Chu Hoàng Mậu, 2005)
Hình 2.4. Phản ứng PCR – bước kéo dài chuỗi ( theo Chu Hoàng Mậu, 2005)
Hình 2.5. Phản ứng PCR – sản

phẩm DNA sau một chu kỳ (theo
Chu Hoàng Mậu, 2005)
Hình 2.6. Sản phẩm cuối cùng của
phản ứng PCR (theo Chu Hoàng
Mậu, 2005)


14
2.4.4 Kiểm tra kết quả PCR
Sản phẩm của phản ứng PCR sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di.
Nguyên tắc chung
Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của
điện trường, hay nói cách khác là kỹ thuật phân chia các phân tử DNA, RNA,
protein dựa trên các đặc điểm vật lý như khối lượng hay điện tích thực của chúng.
Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển về
cực dương hoặc cực âm tùy theo điện tích của chúng. Protein có điện tích thực hoặc
âm hoặc dương, còn acid nucleic là một phân tử tích điện âm, vì vậy chúng có thể
dịch chuyển qua bản gel từ cực âm sang cực dương dưới tác dụng của điện trường.
Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn
đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc
polyacrylamide gel. Tuy nhiên, kỹ thuật điện di trên giá rắn (agarose hoặc
polyacrylamide) được sử dụng phổ biến nhất. Kỹ thuật này sử dụng một dung dịch
đệm để dẫn điện và tạo điện trường đều, một bản gel để phân tách các phân tử và
các chất nhuộm khác nhau để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di.
Trong đó, polyacrylamide gel được dùng để phân tách các phân tử protein và các
phân tử DNA có chiều dài <1kb, còn agarose gel phân tách hiệu quả các phân tử
DNA hoặc RNA có kích thước từ 20bp-20kb.
Nguyên lý của việc điện di DNA: là khi ở trong điện trường do tích điện âm nên các
phân tử DNA dịch chuyển về phía anode và với tốc độ dịch chuyển của chúng khác
nhau phụ thuộc vào khối lượng phân tử. Kết quả là từ một điểm chung các đoạn

DNA khác nhau dịch chuyển về một hướng tạo thành một lane và trên lane đó có
các đoạn DNA khác nhau phân bố ở các vị trí khác nhau tương ứng với độ lớn của
chúng (Phạm Hồng Sơn, 2006).
Điện di agarose gel
Agarose có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da, là một trong hai thành phần
chính của agar chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30%.
Agarose là một polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ
nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose.
Agarose gel là một chất trong suốt hoặc trong mờ, tạo thành khi hỗn hợp agarose và
nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100
0
C và sau đó được làm lạnh, dạng
gel xuất hiện ở khoảng 40-45
0
C. Bản chất quá trình đông lại của agarose là phản
ứng trùng hợp gắn nhiều gốc monomer tạo thành polymer nhờ nhiệt độ. Các chuỗi

15
polymer liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích thước
các mắc lưới tùy thuộc vào nồng độ agarose và phản ứng polymer hóa.
Trên cùng một bản gel, các phân tử nucleic acid có khối lượng và điện tích khác
nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của hệ điện di trong một
điện trường có điện thế và cường độ thích hợp. Tốc độ dịch chuyển của các phân tử
trong gel phụ thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện
trường, Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện phân tử DNA người ta nhuộm
bằng ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào các base của phân tử DNA và phát
quang dưới tia tử ngoại. Như vậy dễ dàng cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA
trên gel (Chu Hoàng Mậu, 2005).
Đối với gel polyacrylamide, các phân tử được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và
vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phòng xạ tự ghi. Tùy thuộc kích

thước DNA mà người ta chọn loại gel, nồng độ gel, loại đệm (TBE hay TAE) (Lò
Thanh Sơn, 2009).
Bảng 2.1: Các thông số điện di DNA bằng agarose gel (Phạm Hồng Sơn, 2006).
2.5.6 Ứng dụng của phƣơng pháp PCR
Phương pháp PCR có giá trị ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực như: khảo cổ
học, sinh học, pháp y, y học, nông nghiệp,… Trong chăn nuôi phương pháp PCR
dùng phát hiện các gen có ưu thế về giống tốt, về năng suất sinh sản hoặc xác định
giới tính khi truyền cấy phôi… Riêng trong lĩnh vực thú y, PCR được ứng dụng rất
nhiều trong chẩn đoán xác định tác nhân gây bệnh là vi khuẩn, virus,… và kỹ thuật
PCR còn phục vụ lĩnh vực nghiên cứu điều chế vaccine.



Hàm lượng agarose (%) trong gel
Kích thước DNA mạch thẳng (kb) sử
dụng có hiệu quả
0,3
60-5
0,6
20-1
0,7
10-0,8
0,9
7-0,5
1,2
6-0,4
1,5
4-0,2
2,0
3-0,1