Phân lập và thử tác dụng sinh học của một số nhóm chất của đan sâm

Bộ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
PHẠM THANH TÚ
PHÂN LẬP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC
• • •
CỦA MỘT SỐ NHÓM CHẤT CỦA ĐAN SÂM
( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỢC sĩ ĐẠI HỌC KHOÁ 1999 - 2004 )
- Ngưctí hướng dẫn : TS. Nguyễn Văn Đồng
- Nơi thực hiện : Bộ môn Hoá sinh
- Thời gian thực hiện : 16/02 — 22/05/2004
N tị? . /A
LỜ3 CÂmơR
í7«/ÍÁip
tiê n , em neùt hùụ iẢ lò n tị hìêt ổn iíĩií iÁe, l ê i th ít ụ ụ iáti —
QcV
Q lạu ụ ễ n (%)àn ^OỒttíẶ- Itq i i i ii th ỉ u/ it ũ t ận t ì n h h ưổ ttg d ẫ n em t r fìf tt j n t ế t
thòi gỉ an làm kittìá ỉitộti.
S n t <ritt trà n trạntỊ b à ij tó lồ n g eảm tin tâ i eáe ỉltà iỊ e& tre n q r$ ô
ntồn 7ft)fíá AÌntt ită tạ o itĩề u kiên o à giú p, ĩtđ em tm n q th à i ụ la n th ựe h iên
đ ề t à i t ạ i bộ m ồn.
ố m nũng, dùn ụửì Utí eảtn tín tố i eẵ& eán hở là m tĩiệe tạ i p itò ttạ Sinh
hfíú
- (Bênh
íùện 19-8, Íihtỉít í7ff?
m áu — (Bênh
tùịn (Qỉêl <ĩ)ứe, thư ũiên tùi
eủe. phồng, ban thuồe. QírƯồng. (\Đtti hjô4L ^Dứtíe 'X>à Q íềi.
(X)irt eẩnt ốn gia, iũnh oà eảe. hạn tkựe hiên đ ê tà i tạ i f áí' bồ ntồn
'Tôtìú lin h , Q.ìưđe íiệ ti tìủ ^Dttđe htìử eể tr u ụ ỉtt, những, ngxtòì đ ã động oìêtt
oà giúp i t è ’ e m r ù 't nítiều đ ê íttìàn th ành k lttiá lu ận.
Hà Nội, ngày 221512004

Sinh, tììĩn
('J)hụm <3,'hanh
Qít
CHÚ GIẢI CHỮVIẾT TẮT
ApoLp
CE
CH
CM
DĐVNIII
GK
GPO
HDL ( High density lipoprotein )
HMG-Co
: ApoLipoprotein
: Cholesterol ester
: Cholesterol
: Chymomicron
: Dược điển Việt Nam in
: Glycerol kinase
: Glycerol -3-phosphate oxydase
: Lipoprotein tỷ trọng cao
: |3- Hydroxyl |3- Methyl Glutaryl
Coenzym A
IDL (Intermediary density lipoprotein): Lipoprotein tỷ trọng trung bình
LDL ( Low density lipoprotein) : Lipoprotein tỷ trọng thấp
LPL : Lipoprotein lipase
POD : Peroxydase
TG : Triglycerid
VLDL (Very low density Lipoprotein : Lipoprotein tỷ trọng rất thấp
VXĐM : Vữa xơ động mạch

WHO ( World Health Qrganization) : Tổ chức y tế thế giới
A % : % thay đổi so với chứng
MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn đề

1
Phầnl Tổng quan

3
1.1. Tổng quan về Đan sâm 3
1.1.1. Đặc điểm dược liệu 3
1.1.2. Thành phần hoá học 3
1.1.3. Tác dụng sinh học 3
1.1.4. Một số bài thuốc và chế phẩm có Đan sâm 4
1.2. Tổng quan về Lipid 5
1.2.1. Thành phần và vai trò của lipid

5
1.2.2. Lipoprotein và vai trò vận chuyển lipid 6
1.2.3. Đại cương về bệnh tăng lipid máu

9
1.2.4. Các thuốc điều tiị tăng lipid máu

10
1.2.5. Mối quan hệ giữa tăng lipid máu và huyết khối
trong bệnh vữa xơ động mạch
12
Phần n : Thực nghiệm và kết quả 15

2.1. Nguyên vật liệu 15
2.1.1. Đan sâm 15
2.1.2. Lopid 15
2.2. Phương pháp thực nghiệm 16
2.2.1. Phương pháp xây dựng mô hình gây tăng
CH ngoại sinh trên chuột nhắt 16
2.2.2. Phương pháp thử tác dụng hạ lipid máu của thuốc trên
chuột nhắt được gây tăng CH 16
2.2.3. Phương pháp thử tác dụng của Đan sâm trên các chỉ số
đông máu 17
2.2.4. Kỹ thuật xét nghiệm các chỉ số 17
2.2.5. Phương pháp xử lý kết quả

22
2.3. Kết quả và bàn luận 23
2.3.1. Mô hình gây tăng CH ngoại sinh trên chuột nhắt
23
2.3.2. Tác dụng hạ lipid máu của thuốc trên chuột được gây
tăng CH máu 25
2.3.3 Tác dụng của Đan sâm trên các chỉ số đông máu 37
2.3.4. Nhận xét tổng quát và bàn luận 40
Phần ra : Kết luận và đề xu ất 42
ĐẶT VẤN ĐỂ
nhiều nhất là do bệnh tim (32%) mà chủ yếu là bệnh VXĐM [7]. Ở nước ta,
bệnh VXĐM với các biểu hiện lâm sàng như suy mạch vành, nhồi máu cơ tim,
nhồi máu não, đột tử đang có xu hướng tăng nhanh. Hội chứng tăng lipid máu
còn liên quan đến nhiều bệnh như đái tháo đường, hội chứng thận hư, thiểu
năng tuyến giáp, béo phì .Vì vậy, y học trong và ngoài nước rất quan tâm đến
thuốc hạ lipiđ máu.
Hiện nay, bên cạnh những loại thuốc có nguồn gốc hoá dược, ngành dược

đang tìm kiếm và thử nghiệm những dược liệu có tác dụng hạ lipid máu, nhằm
khắc phục nhược điểm của thuốc hoá dược là gây ra những tác dụng phụ nguy
hiểm khi sử dụng trong thời gian dài.
Đan sâm là một dược liệu của Trung Quốc đã được sử dụng rộng rãi tại
nhiều nước Châu Á như Trung Quốc, Việt Nam, Nhật Bản, Hàn QuỐc.Theo y
học cổ truyền, Đan sâm được dùng chữa các bệnh huyết ứ, tâm phiền mất ngủ,
can tỳ sưng to, mụn nhọt sưng đau Tuy nhiên cơ chế tác dụng của nó còn
chưa thật sáng tỏ.
Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành sơ bộ phân lập và thử tác dụng sinh
học của một số nhóm chất của Đan sâm vứi các mục tiêu sau :
- Xây dựng mô hình gây tăng CH ngoại sinh trên chuột nhắt trắng bằng cách
bổ xung vào khẩu phần ăn của chuột một loại thực phẩm giàu cholesterol
là óc lợn.
- Chiết xuất nhóm chất tan trong ethanol từ Đan sâm, sau đó thử tác dụng hạ
lipid máu của nhóm chất chiết được trên mô hình xây dựng được.
Hội chứng tăng lipid máu đã được khẳng định là yếu tố nguy cơ quan
trọng gây bệnh vữa xơ động mạch. Theo WHO, ở các nước phát triển, tử vong
1
Các chỉ số dùng để đánh giá là :
- Nồng độ CH toàn phần
- Nồng độ TG
- Nồng độ HDL-C
Thời gian Howell
Thời gian tiêu íibrin.
2
PHẦN I : TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Đan sâm :
Tên khoa học : Saỉvia miỉtỉorrhìia Bunge
Thuộc họ Hoa môi Lamiaceae ị Labiatae )
Đan sâm còn được gọi là huyết sâm, xích sâm, huyết căn, bôn mã thảo.

Vị thuốc Đan sâm ( Radix Salviae miltiorhizae ) là rễ phơi hay sấy
khô của cây Đan sâm.
Đan sâm vị đắng, tính hàn, vào hai kinh tâm, can.
1.1.1. Đặc điểm dược liệu [1]:
Đan sâm có rễ hình trụ, dài 10 - 25 cm, đường kính 0,8 - 1,5 cm, đầu
trên phình to. Mặt ngoài màu đỏ nâu hay đỏ gạch bẩn, có nhiều nếp nhăn dọc,
lộn xộn và còn vết tích của rễ con. Mặt cắt ngang có tầng sinh libe - gỗ mảnh,
ngoằn ngoèo, vùng gỗ rộng, chiếm gần 2/3 đường bán kính, bó gỗ màu trắng
ngà sắp xếp theo tia toả ra. VỊ hơi ngọt, sau đắng chát.
1.1.2. Thành phần hoá học [17y 25]:
- Phenol và acid phenolic : dansensu, acid rosmarinic, rosmarinic methyl
ester, các acid salvianolic A, B, c, G, acid lithospermic, lithospermic
dimethyl ester.
- Các hợp chất diterpen : tanshinon (I, IIA, IIB), methytanshinonat, miltirol,
salviol, íeruginol, danshenspriocetal lacton, cryptotanshinon,
przewaquinon (A, B), đanshenxinkun D, silvilenon
- Các thành phần khác : |3-sitosterol; vitamin E; các acid béo như : oleoyl
neocryptotanshinon và Oleoyl đanshenxinkun A.
1.1.3. Tác dụng sinh học:
1.1.3.1.Theo y học cổ truyền Đan sâm có [1,15,16]:
□ Công năng : khứ ứ, giảm đau, sinh tân, hoạt huyết, thông kinh, thanh
tâm, trừ phiền.
3
□ Chủ trị : kinh nguyệt không đều, kinh nguyệt bế tắc, hành kinh đau
bụng, huyết tích hòn cục, ngực bụng đau nhói, mụn nhọt sưng đau,
tâm phiền mất ngủ, đau thắt ngực, can tỳ sưng to.
□ Liều dùng : 9 - 15 g [1]. Tuy nhiên, trong nhiều tài liệu, chúng tôi
thấy có thể dùng Đan sâm với liều cao hơn : 20 - 30 g.
1.1.3.2. Theo y học hiện đại Đan sâm có tác dụng dược lý như sau [17,25,30]:
□ Trên hệ tim mạch :

- Làm giãn các động mạch và tĩnh mạch nhỏ, mao mạch, tăng tuần hoàn vi
mạch.
- Làm giảm mức độ nhồi máu cơ tim, có tác dụng bảo vệ trong chứng thiếu
máu cơ tim cục bộ.
- Bảo vệ cơ tim, chống lại những rối loạn về chức năng và chuyển hoá gây ra
bởi thiếu hụt 0 2.
- Làm giảm CH và TG trong huyết tương và được sử dụng rộng rãi như một
yếu tố chống CH.
- Ổn định màng hồng cầu, làm tăng sức kháng của hồng cầu, chống huyết
khối.
- Chống oxy hoá, loại bỏ các gốc tự do có hại cho cơ thể, ức chế sự oxy hoá
LDL
□ Trên hệ thần kinh TW : có tác dụng an thần, giảm đau.
□ Tác dụng bảo vệ gan : dịch chiết nước nóng của Đan sâm có tác dụng làm
giảm xơ gan trên chuột gây xơ gan thực nghiệm bằng carbon tetraclorid
(Cơ4) hoặc bằng cách thắt ống đẫn mật và biệt hoá.
□ Tác dụng kháng khuẩn : dịch chiết Đan sâm hay tanshinon I và IIA có tác
dụng ức chế nhiều vi khuẩn như : Staphilococci, E. Coli, vi khuẩn lỵ, vi
khuẩn thương hàn và có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn lao.
1.1.4. Một số bài thuốc và chế phẩm có Đan sâm [17,18]:
□ Chữa bệnh mạch vành :
4
- Bài “ Bệnh mạch vành số 11” : Xuyên khung; Đan sâm; Hồng hoa; Xích
thược; Giáng hương.
- Bài “ Phúc phương đan sâm” : Đan sâm; Giáng hương.
- Bài “ Sinh mạch phiến” : Nhân sâm; Tam thất; Đan sâm; Hổ phách; Mạch
môn; Ngũ vị tử.
□ Phòng và điều trị nhồi máu cơ tim :
- Bài “ Khang tâm mạch hợp tễ” : Hoàng kỳ; Đẳng sâm; Hoàng tinh; Đan
sâm; Uất kim; Xích thược.

- Bài “ Đan sâm thư tâm phiến” : chỉ dùng một vị Đan sâm.
□ Ngoài ra Đan sâm còn được dùng trong trong các bài thuốc chữa viêm gan
mạn tính, bệnh về đường hô hấp, viêm cơ tim do viras.
Một số bài thuốc đã được bào chế dưới dạng thuốc tiêm, dùng để tiêm
truyền tĩnh mạch.
□ Hiện nay trên thị trường có biệt dược “ Thiên sứ hộ tâm đan” (Angel
cardiotonic) do tập đoàn dược phẩm Tianjin Tian Shi Li (Trung Quốc) sản
xuất chứa Đan sâm, Tam thất, Bomeol.
1.2. Tổng quan về Lỉpid :
1.2.1. Thành phần và vai trồ của Lipid [4,10,11]:
Trong cơ thể người và động vật, lipid có hai vai trò chính là cung cấp,
dự trữ năng lượng và tham gia cấu tạo tế bào. Ngoài ra lipid còn có vai trò bảo
vệ, điều hoà thân nhiệt, hấp thu và vận chuyển những chất tan trong dầu như:
vitamin A, D, E, K và tạo nên các hợp chất hoạt động sinh học như vitamin D3
, các hormon steroid. Các phân tử lipid đơn giản thường gặp trong máu là các
acid béo tự do, triglycerid (TG), các sterid (gồm cholesterol tự do (CH) và
cholesterol ester (CE) ), các phospholipid.
Trong cơ thể, các lipid được phân bố thành 3 khu vực :
- Khu vực các lipid cấu trúc, gồm các lipid có ở màng các tế bào, chủ yếu là
các phospholipid và CH.
5
- Khu vực lipid dự trữ chủ yếu là các TG trong các mô mỡ.
- Khu vực các lipid lưu hành : chủ yếu là dạng Lipoprotein trong máu.
1.2.2. Lỉpoprotein và vai trò vận chuyển lipid [4,12]:
Lipid vận chuyển được trong huyết tương là nhờ liên kết với protein có tên là
ApoLipoprotein (ApoLp) hay Apoprotein. Phức hợp này được gọi là
Lipoprotein.
1.2.2.1. Cấu trúc và phân loại Lipoprotein :
□ Cấu trúc:
Lipoprotein (Lp) được Macheboeuf mô tả vào năm 1929. Lp có dạng

gần hình cầu, đường kính từ 100 - 800 A°. Phần lõi gồm TG và CE không
phân cực, phần vỏ gồm phospholipid, các CH tự do và ApoLp. Chính phần
vỏ phân cực này đảm bảo tính hoà tan của phân tử Lp trong huyết tương.
Các ApoLp có cấu trúc peptid, quy định bản chất và số lượng các lipid
kết hợp, có vai trò chất nhận diện cho các thụ thể màng tế bào và có chức
năng điều hoà hoạt tính các enzym tham gia chuyển hoá của các Lp, là
các coíactor của 1 số enzym. Các ApoLp được đặt tên theo chữ cái in hoa:
A, B, c cho các ApoLp chính và D, E cho các ApoLp ít hơn. ApoLp A, c
có các nhóm phụ AI, An và Q, cn, CIII. ApoLp B có 2 phân tử là B48,
B100. ApoLp có 3 dạng là E2, E3, E4.
□ Phân loại:
Theo các phương pháp tách, người phân thành 2 loại:
6
Phân loại theo điện di (4 loại ) Phân loại theo tỷ trọng bằng siêu ly tâm ( 5 loại )
Lp không di chuyển
Chylomicron (CM) d < 0,94
Pre - p - Lipoprotein
Lp tỷ trọng rất thấp ( VLDL) 0,94 < d < 1,006
p - Lipoprotein
Lp tỷ trọng trung bình ( IDL) 1,006 < d < 1,019
Lp tỷ trọng thấp ( LDL ) 1,019 < d < 1,063
a - Lipoprotein
Lp tỷ trọng cao ( HDL) 1,063 < d < 1,210
1.2.2.2. Chuyển hoá và vai trò của Lipoprotein :
□ Chyỉomicron (CM):
CM là những phần tử lipid chứa dưới 2% protein ( ApoLp B48, c, E ) và
ít nhất 85% TG, 5 - 10% phospholipid và 6 - 9% CH. Chúng được tạo ra
trong nội mô ruột và có vai trò vận chuyển TG, CH của thức ăn theo hệ thống
bạch huyết vào đại tuần hoàn. Trong máu, CM tương tác với Lipoprotein
lipase (LPL) ở mao mạch nội mô để thuỷ phân TG thành acid béo tự do, các

acid béo này được oxy hoá để hấp thu ở mô cơ và mô mỡ. Qua quá trình trên,
CM biến dần thành CM tồn dư ít TG và giàu CE hơn, đến gan sẽ được thâu
tóm và tiêu hoá trong lysosom cho CH tự do. CH này có thể được sử dụng
tham gia tổng hợp màng, tạo muối mật, sản xuất Lp, dự trữ ở gan.
□ Lipoprotein tỷ trọng rất thấp (VLDL):
VLDL được tổng hợp từ gan và ruột, có khoảng 12% protein ( ApoLp
B100, c, E) và 88% lipid, chủ yếu là TG nội sinh và một phần CH. Vì vậy
vai trò chính của VLDL là vận chuyển TG nội sinh. VLDL cũng được LPL
thuỷ phân bớt TG làm cho kích thước VLDL giảm dần và được gọi là VLDL
tồn dư hoặc IDL. Khoảng một nửa số IDL được chuyển hoá ở gan, phần còn
lại tiếp tục mất dần TG để trở thành LDL.
7
□ Lipoproteỉn tỷ trọng thấp (LDL):
LDL có 25% protein ( chủ yếu là ApoLp B100) và 75% lipid ( chủ yếu là
CH nội sinh). LDL vận chuyển CH tới mô và tương tác với receptor-LDL trên
màng tế bào. Các hạt LDL được tế bào thâu tóm và giải phóng CH, được dùng
làm nguyên liệu tổng hợp steroid tham gia thành phần màng tế bào. Các tế bào
thâu tóm LDL nhờ các receptor - LDL.
* Receptor - LDL :
Receptor - LDL được nghiên cứu chi tiết bửi Brown và Goldstein ( giải
Nobel 1985 ), đó là một chuỗi peptid gồm 822 acid amin, một phần xuyên
màng. Phần - NH2 tận cùng ở ngoài màng tế bào tương tác với LDL, còn phần
- COOH nằm trong bào tương và cho phép LDL hoà nhập với lysosom.
Receptor - LDL có hầu khắp mọi tế bào, đặc biệt ở tế bào thâu tóm CH.
Receptor - LDL có thể gắn nhiều loại Lp : LDL, IDL và HDL.Ở gan, nếu có
nhiều receptor - LDL, đa số các hạt IDL được loại khỏi máu và chỉ một số ít
chuyển thành LDL. Nếu có ít receptor - LDL, sự phân giải IDL ở gan sẽ ít
hơn và lượng lớn hơn IDL sẽ chuyển thành LDL. Như vậy nếu lượng receptor
- LDL giảm thì lượng LDL trong máu sẽ tăng và thoái hoá của chúng sẽ chậm
lại.

* Điều hoà receptor - LDL : Mọi tế bào đều có thể tự điều hoà sản xuất CH
theo nhu cầu. Khi nhu cầu cao (thời kỳ phát triển, tổng hợp acid mật, tổng hợp
hormon steroid ) tế bào tăng tổng hợp receptor để tăng nhận CH từ bên ngoài
vào. Ngược lại tổng hợp receptor giảm khi thừa CH. Sự điều hoà này theo cơ
chế kiểm soát ngược, tránh cho tế bào không quá tải CH và giữ cho hàm
lượng CH trong tế bào hằng định.
□ Lỉpoproteỉn tỷ trọng cao (HDL):
HDL được tổng hợp ở gan và ruột, có tỷ lệ protein khoảng 50% bao gồm
chủ yếu là ApoLp AI, ngoài ra con có An, c, D, E và khoảng 50% lipid, gồm
phospholipid (30%), CH (18%), TG (2%). Lượng CH trong HDL được gọi là
8
CH tốt vì CH được HDL vận chuyển từ các tế bào ngoại vi về gan để thải ra
ngoài bằng đường mật. Trong VXĐM, HDL có vai trò bảo vệ.
1.2.3. Đại cương về bệnh tăng lipid máu [3y 8,13]:
Tăng lipid máu là tình trạng tăng CH và / hoặc tăng TG.
1.2.3.1. Bệnh căn của tăng lipid máu :
Có nhiều nguyên nhân gây tăng lipid máu, thường được chia thành 2 loại:
□ Tăng lipid máu nguyên phát: do di truyền. Mức độ tăng thường rất cao do
khuyết tật di truyền về chuyển hoá hay vận chuyển lipid.
□ Tăng lipid máu thứ phát: là các trường hợp tăng lipid do một số bệnh tật,
do thuốc hay do lối sống. Thiểu năng tuyến giáp, hội chứng thận hư, chế
độ ăn nhiều mỡ bão hoà và CH có thể góp phần làm tăng CH máu. Ăn
nhiều mỡ, nhiều gluciđ, uống nhiều rượu, lối sống tĩnh tại làm tăng hàm
lượng TG. Đái tháo đường là nguyên nhân phổ biến gây tăng TG huyết.
Tình trạng này nặng thêm nếu kèm theo béo phì. Một số thuốc, đặc biệt là
thuốc điều trị tăng huyết áp có thể làm biến đổi hàm lượng lipid; thuốc lợi
niệu thiazid, một số thuốc chẹn p làm tăng CH máu toàn phần, LDL, TG và
làm giảm HDL.
1.2.3.2. Các typ tăng lipid máu :
Năm 1967, Fredricson đã dựa vào điện di và siêu ly tâm để phân thành 5

typ. Sau đó WHO đã tách typ n thành 2 typ là Ha và nb. Từ năm 1970, đây
được coi là phân loại quốc tế :
□ Typ I : Tăng CM máu hay tăng TG ngoại sinh
□ Typ Ha: Tảng CH huyết gia đình hay tăng CH nguyên phát.
□ Typ nb : Tăng lipid máu hỗn hợp gia đình
□ Typ m : Rối loạn Lp máu
□ Typ IV : Tăng TG máu nội sinh
□ Typ V : Tăng TG máu hỗn hợp hay tăng lipid máu hỗn hợp.
9
Năm 1971, De Gennes đề nghị một cách phân loại đơn giản hom, chỉ
dựa trên các thành phần CH và TG máu :
□ Tăng CH máu đơn thuần
□ Tăng TG máu đơn thuần
□ Tăng lipid máu hỗn hợp ( cả CH và TG )
1.2.4. Các thuốc điều trị bệnh tâng lipid máu:
Khi bị tăng lipid máu, bao giờ cũng phải sử dụng liệu pháp không dùng
thuốc trước bao gồm : chế độ ăn, chế độ tập luyện, sinh hoạt, ngừng các thuốc
gây tăng lipid máu. Phải điều trị các bệnh gây tăng lipid máu thứ phát. Chỉ
dùng thuốc khi đã sử dụng liệu pháp không dùng thuốc trong 2 - 3 tháng mà
không có hiệu quả, CH > 6,5 mmol/1 và / hoặc TG > 2,3 mmol/1. Trong khi
dùng thuốc, cần duy trì chế độ ăn bệnh lý và 2 - 3 tháng phải xét nghiệm lại
các thông số.
Các thuốc điều trị bệnh tăng lipid máu bao gồm các nhóm sau :
1.2.4.1. Thuốc hoá dược :
□ Nhựa trao đổi ion : Cholestyramin và Coỉestipol.
Đây là nhựa liên kết với acid mật. Sau khi uống, các nhựa liên kết vói acid
mật trong ruột thành một phức hợp không hấp thu được, acid mật bị tăng đào
thải. Khi tăng đào thải acid mật, gan tăng tổng hợp CH để chuyển thành acid
mật và tăng tổng hợp receptor-LDL nhằm tăng cường thu gom LDL từ máu,
do đó làm hạ CH và LDL.

□ Acid nicotỉnic và dẫn chất: Acid nicotinic, Mesoinositol hexanicotinat,
Ethanolamin N-oxỵnicotinat.
Người ta thường không dùng acid nicotinic đơn thuần mà dùng dạng
ester giải phóng dần acid nicotinic.
Với liều cao 2 - 6 g/ngày, acid nicotinic làm giảm CH và TG máu do
ức chế quá trình tiêu lipid ở các tổ chức mỡ, giảm lượng acid béo cần thiết
cho gan tổng hợp Lp, ức chế tổng hợp CH thông qua tác động đến men
10
HMG-CoA reductase, tăng quá trình oxy hoá CH và thoái giáng CM,
VLDL do hoạt hoá LPL. Kết quả là giảm CH và TG, giảm LDL, VLDL và
tăng HDL-C.
□ Acid íibric và dẫn chất: Cỉoýỉbrat, Ciprofibrat, Bezafĩbrat, Fenofibrat,
Gemfibrozil.
Các chất này được dùng khá phổ biến. Các íibrat làm giảm dòng acid
béo về gan, qua đó giảm tổng hợp VLDL, làm tăng LPL, làm giảm oxy hoá
LDL. Có tác dụng hạ cả CH và TG.
□ Các thuốc ức chế enzym HMG - CoA reductase (các statỉn) :
Atorvastatin, Fluvastatin, Pravastatin, Simvastatin.
Các statin ức chế men HMG - CoA reductase là một loại enzym có vai
trò chuyển HMG - CoA thành mevalonat trong con đường tổng hợp CH
nội sinh. Do thiếu CH nội sinh, tế bào tăng tổng hợp receptor - LDL để
tăng tiếp nhận LDL dẫn đến làm giảm LDL trong máu. Như vậy, các statin
làm hạ CH và LDL là chính, làm tăng nhẹ HDL, giảm nhẹ hay vừa phải
TG, giảm oxy hoá LDL.
□ Probucol:
Có tác dụng hạ CH. Probucol còn có tác dụng ngăn cản quá trình oxy
hoá của LDL, qua đó làm giảm nguy cơ VXĐM.
□ Các acid béo không no : bao gồm các acid béo không no trong dầu
thựcvật và acid eicosapentaenoic, acid docohexa-enoic thuộc họ omega-3
lấy từ cá biển.

Làm giảm tổng hợp VLDL.
Tác dụng phụ của nhóm thuốc hoá dược:
- Rối loạn tiêu hoá : buồn nôn, ỉa chảy, đầy bụng gặp ở hầu hết các nhóm
thuốc.
- Tình trạng huỷ cơ vân (rhabdomyolyse) gặp ở nhóm statin, đặc biệt nghiêm
trọng khi phối hợp vói íibrat, acid nicotinic và một số thuốc khác.
11
- Ngoài ra còn gặp một số tác dụng phụ khác như: đau đầu, chóng mặt, trầm
cảm (các statin), tăng bilirubin, transaminase tạm thời (fibrat và acid
nicotinic).
1.2.4.2.Thuốc đông dược:
□ Bidentin : dạng viên nang, chứa hỗn hợp saponin chiết xuất từ rễ ngưu tất
do Viện dược liệu sản xuất.
- Tác dụng : giảm CH huyết ở bệnh nhân có CH huyết cao. làm giảm tỷ lệ p/a
Lp ở bệnh nhân có tỷ lệ này cao, giảm huyết áp ở người tăng huyết áp.
□ Cholestan : chứa cao nghệ, do Xí nghiệp dược phẩm TW 25 sản xuất.
- Tác dụng : giảm CH
□ Ruvỉntat: dạng viên nén bao đường, thành phần gồm có hoa hoè, rễ dừa
cạn, rễ ngưu tất, câu đằng, râu ngô, mã đề, muồng trâu, vông nem do
Trang tâm Sâm và Dược liệu TP Hồ Chí Minh sản xuất.
- Tác dụng : hạ huyết áp, hạ CH máu
1.2.5. Mối quan hệ giữa tăng ỉipid máu và huyết khối trong bệnh vữa xơ
động mạch [3,4]:
1.2.5.1. Khái quát về quá trình đông máu và chống đông máu :
Đông máu và chống đông máu là hai quá trình phức tạp mà cả hai cùng
xảy ra song song tiến triển với hai mục đích rất khác nhau: đông máu nhằm
mục đích cầm máu khi chảy máu ; chống đông máu nhằm mục đích ngăn cản
đông máu tràn lan, tiêu cục máu để lưu thông máu khi mạch đã phục hồi.
□ Quá trình đông máu :
Quá trình đông máu là chuỗi các phản ứng dây truyền, nhiều sản phẩm

của phản ứng trước trở thành xúc tác cho phản ứng sau. Phản ứng cuối cùng là
sự biến đổi íibrinogen ( một protein hoà tan trong huyết tương) thành íibrin (
một protein không hoà tan trong huyết tương ) có dạng sợi liên kết vói nhau
thành mạng lưới, ôm lấy các tế bào máu thành cục máu đông. Cục máu đông
12
nút vào chỗ mạch bị tổn thương để chống chảy máu (cùng với các yếu tố co
mạch và co sợi huyết). Cố 13 yếu tố tham gia quá trình đông máu.
□ Quá ừình tiêu ýibrìn :
Bên cạnh những cơ chế hình thành cục máu đông cũng có những cơ chế
tiêu cục máu đông gọi là quá trình tiêu íĩbrin. Quá trình này cùng với các chất
chống đông máu làm thành hệ thống chống đông máu, luôn cân bằng với hệ
thống đông máu, để chống lại đông lan toả khi đã hình thành cục máu đông,
và thông mạch khi các tổn thương mạch máu đã được phục hồi, làm cho máu
được lưu thông. Hiện tượng tiêu cục máu đông là quá trình tiêu fìbrin dưới tác
dụng của plasmin. Plasmin có tác dụng thuỷ phân liên kết peptid của íibrin,
làm tan cục máu đông. Sự hình thành plasmin cũng là một chuỗi các phản ứng
phức tạp, được khởi đầu bằng cách hoạt hoá plasminogen.
1.2.5.2. Quan hệ giữa tăng lipid máu - huyết khối - VXĐM :
Một trong những hậu quả nghiêm trọng của tăng lipid máu là bệnh
VXĐM. Khả năng gây VXĐM có liên quan trực tiếp tới nồng độ LDL trong
máu. Các hạt LDL chui vào lớp dưứi nội mạc, ở đó bị oxy hoá, dễ dàng được
monoơỷl- đại thực bào thu gom do chúng có rất nhiều receptor dọn rác
(scavenger receptor) là loại chỉ nhận biết LDL biến đổi và thu nhận một cách
không giới hạn. Những tế bào này cuối cùng quá tải lipid và trở thành những
tế bào bọt. Tế bào có bọt còn có thể hình thành do thâu tóm các cục máu
đông. Các tế bào bọt là một trong những chặng đầu tiên hình thành bản
VXĐM. Các bản VXĐM tạo nên các thương tổn trong lòng mạch, làm calci
lắng đọng và loét. Bất cứ một thương tổn nào ở nội mô do bất cứ nguyên nhân
nào, cũng làm tăng độ dính tiểu cầu ở chỗ đó. Huyết khối tiểu cầu bám chặt
vào nội mô và được một lớp íĩbrin phủ lên, dần dần hợp nhất với mảng vữa xơ

sẩn có, làm cho màng này dầy lên. Các vi ti huyết khối tiểu cầu có thể gây
đông máu tại chỗ làm thành máu cục. Những mảnh máu cục này có thể tung
đi khắp nơi theo dòng máu và gây tắc mạch.
13
Chính vì vậy, một trong những cơ chế phòng ngừa VXĐM là hạn chế sự
tạo thành tế bào có bọt. Các thuốc hạ lipid máu, chống đông máu, chống oxy
hoá đều góp phần làm giảm sự biến đổi của LDL, qua đó làm giảm sự hình
thành tế bào bọt.
14
PHẦN n : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên vật liệu:
2.1.1. Đan sâm:
Rễ phơi hay sấy khô của cây Đan sâm Saỉvia mìỉtiorrhỉia ( Lamiaceae )
Dược liệu được mua tại phố Lãn Ông, được xác định đúng tên, loài, bộ phận
dùng và được xử lý theo tiêu chuẩn DĐVN m [1].
□ Chế biến dịch sắc 3 : 1 (1 ml dịch sắc tương đương với 3g dược liệu khô):
Dược liệu được thái thành phiến mỏng, điều chế thành cao 3: 1 bằng
phương pháp sắc [6].
□ Chế biến dịch chiết cồn :
Xay nhỏ Đan sâm thành bột, rây qua rây 24. Dùng dung môi EtOH 90° ,
chiết bằng phương pháp ngâm lạnh, theo chuyên luận cồn thuốc[l]. Loại
dung môi bằng phương pháp cất quay tới khi còn 1/10 thể tích thì tiếp tục
bốc hơi dung môi bằng cách thuỷ đến khi thu được cao đặc (1 g cao đặc
tương đương 25,86 g dược liệu khô).
□ Pha chế dịch thuốc Đan sâm :
Cao Đan sâm 3 : 1 được pha loãng bằng NaQ 0,9% để được dịch thuốc Đan
sâm có nồng độ 2,5% (g/dl).
2.1.2. Lopid ( Gemfibrozil) viên nang 300 mg do Parke - Davis (Thái Lan)
sản xuất:
□ Tác dụng dược lý, liều dùng [2]:

- Gemfibrozil là một chất tương tự acid íìbric không có halogen và là thuốc
chống tăng lipid huyết. Gemfibrozil làm giảm nồng độ LP giàu TG như
VLDL, tăng nhẹ HDL và có tác dụng khác nhau trên LDL.
- Liều dùng : người lổn 600 mg ngày 2 lần.
15
2.2. Phương pháp thực nghiệm :
2.2.1. Phương pháp xây dựng mô hình gây tăng CH ngoại sinh trên chuột
nhắt:
- Dựa trên mô hình gây tăng CH ngoại sinh trên chuột cống của Ruegamen,
TS. Nguyễn Văn Đồng đã xây dựng thành công mô hình gây tăng CH trên
chuột nhắt bằng chế độ ăn giàu CH (bổ sung CH nguyên chất và mỡ vào thức
ăn của chuột) [19].
- Nay chúng tôi tiếp tục cải tiến mô hình trên bằng cách thay CH nguyên chất
bằng óc lợn vái liều 2g/con/ngày (tương đương 0,044 g CH).
❖ Bố trí thực nghiệm :
Thí nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt chủng Swiss, giống đực, khoẻ
mạnh, do Viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp. Sau 7 ngày nuôi ở điều kiện bình
thường, loại đi những con bất thường và tiến hành cho chuột ăn chế độ giàu
CH. Khẩu phần ăn cho 1 con/ 1 ngày như sau :
Cơm: 10 g
Bột cá : 0,5 g
Óc lợn : 2 g
Dầu cọ : 0,1 ml (« 0,095 g)
Nước uống tự do
Tại các thời điểm ngày 0 (T0), ngày thứ 3 (T3), ngày thứ 5 (T5), ngày thứ
7(T7) và ngày thứ 10 (T10) lấy máu tĩnh mạch cổ chuột để xác định chỉ số
CHjp bằng phương pháp Ilca [5]. Mỗi thòi điểm lấy 5 mẫu.
2.2.2. Phương pháp thử tác dụng hạ lỉpid máu của thuốc trên chuột nhắt
được gây tăng CH :
Chúng tôi tiến hành thử tác dụng của thuốc trên mô hình trên với các lô

được chia như sau :
❖ Lô 1 : Lô chứng (n=30) : Ản theo chế độ gây tăng CH máu như
trên.
16
❖ Lô 2 : Lô dùng Lopid (n=tl5) : Ăn theo chế độ như lô 1 và thêm 2,4
mg Lopid cho 1 con/ngày.
❖ Lô 3 : Lô dùng dịch sắc Đan sâm (n=15) : Ăn theo chế độ như lô 1 và
thêm 0,027 ml dịch sắc (tương đương 0,08 g dược liệu khô) cho 1
con/ngày.
❖ Lô 4 : Lô dùng dịch chiết cồn Đan sâm (n=15) : Ản theo chế độ như lô 1
và thêm 3,2 mg dịch chiết cồn ĐS dưới dạng cao đặc (tương đương 0,08 g
dược liệu) cho 1 con/ngày.
Tại các thời điểm T7, T10, T20 chuột được lấy máu tĩnh mạch cổ, tách lấy
huyết thanh để định lượng các chỉ số : CH toàn phần; TG; HDL-C. Mỗi thời
điểm lấy 5 mẫu ở mỗi lô. Các xét nghiệm được thực hiện tại phòng Sinh hoá -
Bệnh viện 19-8, trên máy Autohumanlyzer 900 splus, sử dụng hoá chất là bộ
KIT của hãng Human (Đức).
2.2.3. Phương pháp thử tác dụng của Đan sâm trên các chỉ số đông máu :
Chúng tôi tiến hành thử thuốc trên huyết tương người. Huyết tương được
lấy từ máu người bình thường cho máu tại bệnh viện Việt Đức. Sử dụng 2 chỉ
số là xác định thời gian Howell và thời gian tiêu íibrin. Mỗi chỉ số tiến hành
trên 15 mẫu huyết tương.
2.2.4. Kỹ thuật xét nghiêm các chỉ số :
2.2.4.1. Xác định chỉ số CH toàn phần :
Định lượng CH theo phương pháp CHOP - PAP.
❖ Nguyên lý chung : CH được xác định sau khi thuỷ phân và oxy hoá bởi
enzym. chất chỉ thị quinoneimin được tạo thành từ hydrogen peroxiđ và 4-
aminophenazon với sự có mặt của phenol và peroxidase.
❖ Phản úng xảy ra :
Cholesterolesterase

CE + H2O
-► CH + acid béo
Cholesteroloxydase
CH + 0 2 ^ cholesten-3 one + H20 2
POD
2H20 2 + 4-amino-phenazone + phenol

► quinoniemine + 4H20
Tiến hành:
^XỊTiành phần Thuốc thử
CH chuẩn Huyết thanh
Mẫu
(Ml)
(pl)
(Ml)
Trắng 1000
-
-
Chuẩn 1000 10 -
Thử 1000
-
10
Trộn đều, ủ ở 3
7 0 c / 5 phút. Đo độ hấp thụ của mẫu chuẩn và mẫu thử ỏ
bước sóng 500 ran, so sánh với mẫu trắng. Từ đó tính được nồng độ CH.
2.2A.2. Xác định chỉ số TG :
Định lượng TG theo phương pháp GPO - PAP.
□ Nguyên lý chung :
TG được xác định sau khi đã thuỷ phân bằng lipase. Chất chỉ thị
quinoniemine được tạo thành từ hydrogen peroxid, 4-aminoantipyrin và 4-

clorophenol dưới sự xúc tác của POD.
□ Phản ứng:
lipase
TG glycerol + aciđbéo
GK
Glycerol + ATP

► glycerol 3-phosphat + ADP
GPO
Glycerol 3-phosphat + 0 2 dihydroxyacetone phosphate + H20 2
POD
H20 2 + 4-aminoantipyrine + 4-chlorophenol

^uinoneimine +HC1 + H20
□ Tiến hành:
phần Thuốc thử TG chuẩn
Huyết thanh
Mẫu
(nl)
(nl)
(nl)
Trắng
1000
-
-
Chuẩn 1000 10
-
Thử 1000
-
10

Trộn đều, ủ ở 37 0 c / 5 phút. Đo độ hấp thụ của mẫu thử, mẫu chuẩn ở
bước sóng 500 nm, so sánh vói mẫu trắng. Từ đó tính được nồng độ TG.
2.2.43. Xác định chỉ số HDL :
□ Nguyên lý chung : chylomicron, VLDL, LDL được kết tủa bằng acid
phosphotungstic và magnesium clorid. HDL không bị tủa sẽ được định
lượng theo phương pháp CHOP - PAP như với CH.
□ Tiến hành:
- Kết tủa : huyết thanh được trộn kỹ với dung dịch dùng để tủa theo tỷ 1: 2 (
huyết thanh : dung dịch ). Để 10 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm tốc độ
4000 V / phút trong 10 phút. Tách lấy phần dung dịch phía trên, loại bỏ
cặn.
- Định lượng HDL :
phần Thuốc thử HDL chuẩn
HDLthử
Nước cất
Mẫu
(nl)
(nl)
(nl) (nl)
Trắng 1000
-
-
100
Chuẩn
1000 100
-
-
Thử
1000
-

100
-
Trộn đều, ủ ở 37 °c / 5 phút. Đo độ hấp thụ của mẫu thử và mẫu chuẩn ở
bước sóng 500 nm, so sánh với mẫu trắng. Tính ra nồng độ HDL-C.
19
2.2.4.4. Xác định thời gian Howell ( thời gian phục hồi calci):
Nguyên lý chung:
Khi thêm ion calci vào huyết tương lấy từ máu đã được chống đông bằng
natri citrat, quá trình đông máu sẽ được khởi động. Thcd gian từ khi cho ion
calci tới khi cục đông hình thành có cùng ý nghĩa với thời gian đông máu,
phản ánh hoạt tính đông máu nội sinh của huyết tương. Đây là một xét nghiệm
đơn giản, nhạy hơn thời gian máu đông Lee - White.
Tiến hành:
- Lấy huyết tương giàu tiểu cầu : máu được chống đông bằng natri citrat
3,8% theo tỷ lệ 9 : 1 ( máu : natri citrat). Ly tâm với tốc độ 500 v/phút
trong 5 phút.
Mẫu Chứng
Thử
Thành phần (ml) (ml)
Huyết tương giàu tiểu cầu 0,2 0,2
Nad 0,9%
0,05
-
Dịch thuốc ĐS 2,5%
-
0,05
Trộn đều, ủ ở 37 °c / 15 phút
Thêm 0,2 ml Cad2 0,025 M vào mỗi ống chứng và ống thử. Khởi động
đồng hồ bấm giây ngay khi thả dung dịch Caơ2. Cứ 20 giây nghiêng nhẹ ống
nghiệm để xác định thời điểm cục đông hình thành.

2.2A.5. Xác định thời gian tiêu íĩbrin ( Phương pháp Milstone & Buckell)
❖ Nguyên lý chung :
Trong môi trường acid nhẹ, euglobulin trong huyết tương (bao gồm hầu hết
các yếu tố đông máu và tiêu íibrin) được kết tủa, ly tâm loại bỏ dịch trong ( có
các chất ức chế tiêu íibrin ). Hoà tan tủa euglobulin bằng dung dịch đệm
20