Xây dựng phương pháp định lượng imipenem trong huyết tương bằng HPI

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
ự* Cũn
LƯƠNG QU ỐC HUY
XÂY DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
IMIPENEM TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ ĐẠI HỌC
KHOÁ 2002 - 2007
Người hướng dẫn : Th.s Nguvẽn Trung Hiếu
Nơi thực hiện : Bộ môn hoá phân tích
Phòng thí nghiệm trung tâm
Viện kiểm nghiệm
Thòi gian thực hiện : 01/2007- 05/2007
\ Ị ị
HÀ NỘI, THÁNí; 5 NAM 20(17 v;
Ì'-
j •
ị' ■ -T
£ Ờ Z < â c Á M Ơ 0 l
Sau thời gian hoàn thành luận văn của mình ,em xin bày tỏ lời biết ơn sâu
sắc và chân thành tơí Th.s Nguyễn Trung Hiếu, TS. Nguyễn Thị Kiều Anh,
Th.s Nguyễn Thị Hồng Thủy những người đã hướng dẫn và giúp đỡ em trong
việc thực hiện luận văn. Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các
cán bộ trong bộ môn hoá phân tích - độc chất,phòng thi nghiệm trung tâm đã
giúp đỡ em và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thànhkhóa luận .
Em cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các cán bộ phòng Dược lý - Viện
kiểm nghiệm đã giúp đỡ về hóa chất thiết bị cho em trong quá trình thực hiện
đề tài.
Nhân dịp này em cũng xin gửi lời cảm ơn đến nhà trường và các phòng
chức năng đã giúp đỡ em trong suốt năm năm học vừa qua, và trong thời gian
thực hiện khóa luận này .

Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2007
Sinh viên
Lương Quốc Huy
MỤC LỤC
Chữ viết tát
Đặt vấn đề 1
PHẨN 1: TỔNG Q U A N 3
1.1. Đại cương về Imipenem 3
1.1.1 Đặc điểm hoá lý của imipenem
3
1.1.2 Cơ chế tác dụng và dược động học 3
1.1.3 Chỉ định 5
1.1.4 Chống chỉ định 5
1.1.5 Liều lượng và cách dù n g 5
1.1.6 Tác dụng không mong muốn 6
1.1.7 Một số dạng bào chế 7
1.1.8 Những phương pháp định lượng imipenem bằng HPLC

9
1.2. Đại cương về H P L C 10
1.2.1 Khái niệm cơ b ả n 10
1.2.2 Nguyên tắc của phương pháp HPLC 10
1.2.3 Nguyên tắc cấu tạo máy sắc ký HPLC

10
1.2.4 Một số thông số đặc trưng của HPLC 11
1.2.5 Pha tĩnh trong H PLC 12
1.2.6 Pha động trong HPLC
13

1.2.7 Cách tính kết q u ả 14
PHẨN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

16
2.1. Nguyên vật liệu, phương pháp thực nghiệm và nội dung nghiên cứu

16
2.1.1 Thiết bị, hóa chất 16
2.1.2 Phương pháp, nội dung và đối tượng nghiên cứu nghiên cứu

17
2.1.2.1 Nội dung nghiên cứu 17
2.1.2.2 Đối tượng nghiên cứu 17
2.1.2.3 Phương pháp nghiên c ứ u 17
2.2. Kết quả thực nghiệm 20
2.2.1. Khảo sát và xây dựng phương pháp để định lượng imipenem trong
huyết tương 20
2.2.1.1. Lựa chọn cột chạy sắc ký 20
2.2.1.2. Lựa chọn thành phần pha động
20
2.2.1.3. Lựa chọn tốc độ dòng 21
2.2.1.4 Lựa chọn detector u v 22
2.2.2. Thẩm định phương pháp sắc k ý 23
2.2.2.ỉ. Xác định khoảng tuyến tính của phương pháp

23
2.2.2.2. Đánh giá độ đúng của phương pháp 25
2.2.2.3. Đánh giá độ chính xác của phương pháp

27

2.2.2.4. Giới hạn định lượng 28
2.2.2.5. Tính đặc hiệu của phương pháp 29
2.2.3 ứng dụng chương trình sắc ký để định lượng mipenem trong huyết
tương bệnh nhân sau khi tiêm truyền Tienam 500mg

31
2.3. Bàn luận 33
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 35
1. Kết luận 35
2. Đề xuất 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
CHỮ VIẾT TẮT
B.p Bristish Phamacopoeia
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High perfomance liquid chromatography)
MES Morphorlinoethanolsulforic acid(C6H12N 04.H20)
MOPS 3-[N-morpholino]propanesulfonic acid
MeCN Acetonitril
MeOH Methanol
RSD% Độ lệch chuẩn tương đối
X | 15 Giá trị trung bình
PL Phụ lục
PA Tinh khiết
u.s.p The United states pharmacopoeia
s Đô lêch chuẩn
ĐẬT VÂN ĐỂ
Sự ra đời của kháng sinh là một tiên bộ lớn của nền y dược học thế giới
trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Song cũng chính vl lợi ích đó mà việc sử
dụng kháng sinh trở nên không đúng mức và lạm dụng nhiều dẫn đến tình
trạnh kháng kháng sinh trở nên ngày càng cao[6]. Một số kháng sinh thông

dụng như penicillin, cloramphenicol, amoxicillin đã bị nhiều vi khuẩn
kháng lại.Trước tình trạng kháng kháng sinh ngày càng phổ biến, đòi hỏi các
nhà khoa học không ngừng nghiên cứu và đưa các loại kháng sinh mới có tác
dụng mạnh hơn vào sử dụng.
Imipenem là dẫn xuất của N-formidoyl. Imipenem là kháng sinh
thuộc nhóm carbapenem được xem là một trong những kháng sinh mới có
phổ tác dụng rộng cũng như tác dụng điều trị mạnh[8]. Trên thế giới đã có
nhiều nghiên cứu về sinh khả dụng, dược lâm sàng, dược động học của chế
phẩm imipenem. Đặc biệt người ta dựa vào nồng độ của imipenem trong
huyết tương bệnh nhân để điều chỉnh liều cho phù hợp với từng cá thể.
Trong khi đó ở Việt Nam imipenem tuy đã được đưa vào sử dụng nhưng
vãn còn rất hạn chế và còn chưa đạt được hiệu quả như mong muốn.
Nguyên nhân một phần là do chưa điều chỉnh được liều thích hợp với từng
cá thể.
Một số tài liệu nước ngoài như BP 2001, USP 29 đã có chuyên luận định
lượng imipenem trong chế phẩm. Trong thực tế, nếu áp dụng những phương
pháp này để định lương imipenem trong huyết tương thì pic của imipenem rất
khó tách ra khỏi các tạp chất khác trong huyết tương.
1
Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện khóa luận tốt
nghiệp “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng imipenem trong
huyết tương bằng HPLC ” với các mục tiêu sau:
4- Xây dựng phương pháp địmh lượng imipenem trong huyết tương
+ Úng dụng phương pháp để định lượng imipenem trong huyết tương
bệnh nhân lọc máu ngoài thận, đang điều trị tại Khoa điều trị tích cực ở bệnh
viện Bạch Mai.
2
PHẦN l:T ổN G QUAN
1.1. Đại cương về imipenem :
1.1.1. Đặc điểm hoá lý của imipenem :

* Cấu trúc hoá học của imipenem: [6] , [8], [17].
- Công thức cấu tạo của imipenem :
O H
[5R-[5a,6a(R*)]]-6-(l-Huydroxyethyl)[(iminomethyl)amino]ethyl]thio]-7-
0X0-1 -azabicyclo-[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid monohydrate.
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Imipenem
- Công thức phân tử : C|2H|7N3 0 4 S.H20
- Phân tử lượng :317,36
• Tính chất hoá lý: Bột tinh thể trắng ít tan trong nước ( l%o) và
methanol(2%o). Thực tế không tan trong ethanol.
1.1.2. Co chê tác dụng và dược động học của imipenem .
1.1.2.1. Co chê tác dụng.[8].
Imipenem là một kháng sinh có phổ rất rộng thuộc nhóm carbapenem
•Imipenem có cơ chế tác dụng giống với các kháng sinh nhóm beta-lactam. Nó
acyl hóa các D-Analin-transpeptidase (enzym vận chuyển peptid), làm các
enzym này không thể tham gia tạo thành liên kết chéo peptid để tạo thàng cầu
3
peptid (peptidoglycan) cần thiết cho sự vững chắc cho thành tế bào vi
khuẩn.Sự hình thành màng tế bào bị giám đoạn, vi khuẩn không thể tồn tại và
phát triển.Các enzym trên gọi là các protein gắn penicilin (P.B.P).
1.1.2.2. Tác dụng dược lý. [1].
Về lâm sàng imipenem được chứng minh có tác dụng với phần lớn các vi
khẩn Gram (+), Gram (-), vi khuẩn ưa khí và kị khí. Thông thường Imipenem
được sử dụng phối hợp với cilastatin, đây là chất ức chế sự phân huỷ của
imipenem bởi enzym dehdropeptidase có trong ống thận và tăng cường sự thu
hồi của thuốc này. Cilastatin không có tác dụng đối với beta-lactamase.
1.1.2.3. Dược động học .[1], [2], [6].
Hấp thu
Imipenem không hấp thu qua đường tiêu hoá, chỉ dùng tiêm tĩnh mạch
hoặc tiêm bắp. Khi tiêm truyền tĩnh mạch 500 mg imipenem trong 30 phút

cho người trẻ và người trung niên, đạt đỉnh nồng độ huyết thanh 30-40 mg/lít.
Nồng độ này lớn hơn MIC 90 của phần lớn các vi khuẩn.
Phân bô
Imipenem khuyếch tán tốt vào trong nhiều mô cơ thể, vào nước bọt, đờm,
mô màng phổi, dịch khớp, dịch não tuỷ và mô xương. Vì đạt nồng độ tốt trong
dịch não tuỷ và có tác dụng tốt trong chống liên cầu khuẩn beta nhóm B và
Li.st.eria nên imipenem cũng có tác dụng tốt đối với viêm màng não và nhiễm
khuẩn ở trẻ sơ sinh.
Chuyển hoá
Imipenem chuyển hoá chủ yếu qua thận.
Thải trừ
Imipenem thải trừ qua màng lọc ở cầu thận và bài tiết ở ống thận -T|/2
khoảng 1 giờ. Nhưng kéo dài trong trường hợp suy giảm cho chức năng thận.
Người cao tuổi ( trên 70 tuổi ) thường bị giảm chức năng thận, do đó nên
dùng liều bằng 50% liều bình thường.
4
1.1.3. Chỉ định .[1], [2], [6].
*Loại thuốc tiêm bắp
- Bệnh đường hô hấp (viêm phế quản kịch phát, viêm phổi)
- Bệnh nội tâm(viêm ruột thừa hoại thư hay bị thủng ,viêm ruột thừa kèm
theo màng bụng )
- Bệnh da và cấu trúc da ( apxe,viêm tế bào ,loét da nhiễm khuẩn và vết
thương do tụ cầu vàng )
- Bệnh phụ khoa (viêm nội cơ tử cung )
*Loại thuốc tiêm tĩnh mạch (không dùng điều trị viêm màng não)
- Bệnh đường hô hấp dưới (tụ cầu vàng , E .coli)
- Bệnh đường tiểu tiện (biến chứng hay không ) như E.coli tụ cầu vàng
- Bệnh nội tâm (tụ cầu vàng )
- Bệnh phụ khoa (tụ cầu vàng )
- Bệnh nhiễm trùng huyết (tụ cầu vàng )

- Bệnh xương và khớp (tụ cầu vàng )
- Bệnh da và cấu trúc da (tụ cầu vàng )
- Bệnh màng trong tim ( tụ cầu vàng sản sinh ra penicillinase )
1.1.4 Chống chỉ định.[l], [2].
Qúa mẫn với imipenem hoặc các thành phần khác.
1.1.5 Liều lượng, cách dùng.[l], [2], [6], [8].
1.1.5.1. Liều lượng.
*Người lớn
• Tiêm truyền tĩnh mạch
- Nhiễm khuẩn từ nhẹ đến vừa: 250 - 500 mg, cứ 6 - 8 giờ một lần (1- 4 g
mỗi ngày ).
- Nhiễm khuẩn nặng với nhưng vi khuẩn chỉ nhạy cảm mức độ vừa ; lg
cứ 6 - 8 giờ một lần . Liều tối đa hàng ngày 4g hoặc 50 mg/kg thể trọng.
Tiêm truyền liều 250 - 500 mg trong 20 - 30 phút; tiêm truyền liều lg trong
5
40-60 phú t.
• Tiêm bắp
- Chỉ áp dụng với nhiễm khuẩn nhẹ từ nhẹ đến vừa: 500 - 700 mg/lần,cứ
12 giờ một lần (Ghi chú: liều 750 mg được dùng cho những nhiễm khuẩn
trong ổ bụng và những nhiễm khuẩn nặng hơn đường hô hấp , da và phụ
khoa).
- Không dùng tổng liều tiêm bắp lớn hơn 1.500 mg một ngày ; cần tiêm
sâu trong khối cơ lớn .
* Trẻ em (dưới 12 tu ổ i)
Độ an toàn và hiệu lực không được xác định đối với trẻ em, thực tế đã sử
dụng cho trẻ em có hiệu quả với liều 12- 25 mg/kg thể trọng. Thường dùng
imipenem tiêm tĩnh mạch với liều: 12 -25 mg/kg thể trọng.
1.1.5.2 Cách dùng.
- Imipenem dùng để tiêm tĩnh mạch, không được dùng để tiêm trực tiếp.
Phải pha lượng thuốc chứa trong lọ với 100 ml dung dịch tiêm truyền; Nồng

độ cuối cùng không được quá 5 mg/ml; Tiêm truyền trong 30 - 60 phút; Cần
theo dõi xem có bị co giật không.
- Nếu có buồn nôn và/hoặc nôn trong khi dùng thuốc phải giảm tốc độ
truyền.
- Trong trường hợp suy thận điều chỉnh liều như sau: Độ thanh thải
creatinin 30 - 70 ml/phút sử dụng 50% liều thường dùng; Độ thanh thải
creatinin20ml/phút sử dụng 25% liều thường dùng .
Cho một liều bổ sung sau khi thẩm tách máu.
1.1.6. Tác dụng không mong muốn (ADR).[1], [2], [6].
ADR thường gặp nhất là buồn nôn và nôn. Co giật có thể xảy ra, đặc biệt
khi dùng liều cao cho người bệnh có thương tổn ở hệ thần kinh trung ương và
người suy thận. Người bệnh dị ứng với những kháng sinh beta-lactam khác có
thể có phản ứng mẫn cảm khi dùng imipenem.
6
• Thường gặp : ADR > 1/100
Tiêu hoá: Buồn nôn , nôn ,ỉa chảy .
Cục bộ : Viêm tĩnh mạch .
• ít gặp : 1/100 > ADR >1/1000
- Tim mạch: Hạ huyết áp, đánh trống ngực .
- Thần kinh trung ương: Cơn động kinh.
- Da: Ban đỏ.
- Tiêu hoá: Viêm đại tràng màng giả .
- Huyết học: Giảm bạch cầu trung tính (Gồm cả mất bạch cầu h ạ t), tăng
bạch cầu ái toan, thiếu máu thử nghiệm Coombs (+), giảm tiểu cầu ,tăng thời
gian prothrombin.
- Gan: Tăng phosphatase kiềm và bilirubin.
- Cục bộ: Đau ở chỗ tiêm.
- Thận : Có thể tăng ure và creatinin huyết.
1.1.7 Một sô dạng bào chế trên thị trường.[2], [8], [17].
Cũng giống như thienamycin, imipenem bị dehdropeptidase-i(DHP-l)

do thận tiết ra phân hủy nhanh nên luôn được phối hợp với cilastatin natri,
có công thức cấu tạo như sau:
Cilastatin là chất ức chế DHP-1, giữ hoạt tính, đồng thời tăng tái hấp thu
imipenem ở ống thận. Phối hợp thường theo tỉ lệ 1:1.
H /COONa
H CHFS-CH2 CH^C^C H
. c c h 2 c h 2
7
Bảng 1.1. Một số dạng bào chế trên thị trường của Imipenem
Dạng bào chê
Tên biệt dược/Nước sản
xuất
Hàm lượng
Lọ bột pha tiêm
(Imipenem/cilastatin)
Tienam/Pháp
250mg/250mg
Lọ bột pha tiêm
(Imipenem/cilastatin)
Tienam/Pháp
500mg/500mg
Lọ bột pha tiêm bắp
(Imipenem/cilastatin)
Primaxin/Mỹ
500mg/500mg
Lọ bột pha tiêm bắp
(Imipenem/cilastatin)
Primaxin/Mỹ
750mg/750mg
Lọ bột pha tiêm tĩnh mạch

(Imipenem/cilastatin)
Primaxin/Mỹ 250mg/250mg
Lọ bột pha tiêm tĩnh mạch
(Imipenem/cilastatin)
Primaxin/Mỹ 500mg/500mg
8
1.1.8. Một sô phương pháp định lượng Imipenem bằng HPLC. [11],
[14], [15], [17], [16].
Bảng 1.2. Những phương pháp định lượng Imipenem bằng HPLC.
STT
Tài liệu
trích dãn
Dung dịch hoà tan Cột sắc ký
Thành phần pha động
Detector
u v
1
BP2001 [11] Acetonnitril
:K2HP04
(0,7 : 99,3)
pH =6,8
- Acetonnitril :
K2H P04(0,7:99,3)
- C18 (250 X 4,6mm), 5|JTn
254 nm
2
[16]
- Acid boric pH7,2.;
- C|g(250 X 4,6mm), 5|j.m
298nm

3
[14]
- MeOH: Acid boric(3:97)
pH6,0
- C|g(250 X 4,6mm), 5|um
298nm
4
u.s.p 29 [17] Saline;NaHC03
0,1%; Đệm
phosphate pH6,0.
(20:5:75)
- Natrihexansulfunat
0,25%; Đệm phosphate
pH6,8.(80:20).
- C18 (250 X 4,6mm), 5um
254nm
5
Methods for
pharmaceutical
analysis [15].
- MeCN: MeOH : M OPS
(0,4:0,5:99,1) Điều chỉnh
pH7,0 bằng NaOH.
- C18 (250 X 4,6mm), 5|Lim
250nm
9
1.2. Đại cương về HPLC. [3], [4], [5], [7], [12], [13], [17].
1.2.1 Khái niệm cơ bản.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao hay còn gọi là sắc ký lỏng cao áp ra đời vào
cuối những năm 60. Đó là phương pháp hoá lý dùng dùng để tách các chất dựa

vào ái lực khác nhau của các chất với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan
với nhau, một pha động và một pha tĩnh. Pha động là chất chảy qua cột với tốc
độ nhất định, pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới
dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất
mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Qúa trình
SK có thể xảy ra theo các cơ chế sau:
+sắc ký trao đổi ion.
+ Sắc ký phân bố.
+ Sắc ký rây phân tử.
+ Sắc ký hấp phụ.
1.2.2 Nguyên tắc của phương pháp HPLC
Qúa trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và
phân bố của các chất tan giữa hai pha luôn tiếp xúc và không hòa tan vào
nhau; Pha tĩnh và pha động. Dung dịch các chất phân tích khi vào cột sẽ được
hấp phụ hay liên kết với pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất
cần phân tích. Khi pha động dịch chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc
ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột. Tùy theo bản chất của
pha tĩnh, bản chất của chất tan bản chất của dung môi mà quá trình rửa giải
tách được các chất ra khỏi cột sắc ký . Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được
phát hiện bởi detector và được chuyển qua bộ xử lý kết qủa. Kết quả cuối cùng
được đưa qua máy in hoặc hiển thị trên màn hình. Nếu ghi qúa trình sắc ký
của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ có một sắc ký đồ gồm nhiều píc.
1.2.3 Nguyên tắc cấu tạo của máy sác ký HPLC
Máy sắc ký HPLC đầy đủ gồm 6 bộ phận chính sau:
10
Bỏ phán chứa pha đỏng: Pha động sau khi pha được đựng trong bộ
phận chưa pha động trước khi vào máy.
Bơm cao áp : Để bơm pha động vào cột và thực hiện quá trình sắc ký.
Bơm này phải được điều chỉnh áp suất để tạo ra được những tốc độ nhất định
qua cột phù hợp với qúa trình sắc ký.

Van tiêm m ẫu: Để tiêm mẫu phân tích vào cột tách với những lượng
mẫu nhất định trong quá trình sắc ký.
c ỏ t sầc ký: Thường được làm bằng thép không rỉ, có nhiều kích thước
khác nhau, song nói chung cột thường có chiều dài từ 10 - 25 cm, đưòng kính
trong từ 2 - 5 mm.
Detetor: Là thiết bị phát hiện các chất phân tích sau khi di qua cột.
Nguyên lý hoạt động của detetor ƯV-VIS dựa trên nguyên lý của phương
pháp đo quang phổ hấp thụ. Ngoài ra các phương pháp: đo khúc xạ vi sai,
huỳnh quang, điện hóa cũng được ứng dụng để phát hiện.
Máy ghi: Để ghi tín hiệu đo dưới dạng píc.
1.2.4 Một sô thông sô đặc trưng của HPLC.
- Thời gian lưu tr ị phút) Là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống
sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh của píc.
So sánh thời gian lưu của mẫu chẩn và mẫu thử làm trong cùng điều kiện ta
sẽ định tính được chất đó .
- Thời gian chết t0 (phút): Là thời gian lun của chất không bị lưu giũ' (tức
là chất có tốc độ trung bình của các phân tử dung môi khi đi qua cột).
- Số đĩa lý thuyết N : Biểu thị hiệu lực cột sắc ký :
4-
2
\ "
2
K
N =
r
Hoặc N = 1 6
Hoặc N = 5 ,5 4
_cob _
_ ^0,5 _
Trong đó:

11
ổị (độ lệch chuẩn ): Độ rộng nửa píc tại các điểm uốn tương ứng.
cơữ 5 (Độ rộng píc ở nửa chiều cao ) = 2,354(5,
Cởh ( Đ ộ rộng đáy píc).
Nếu gọi L là chiều cao của cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết được
tính bằng công thức : H = L/N.
- Độ phân giải Rs :Là đại lượng do mức độ tách hai chất trên cùng một cột SK
để tách riêng hai chất, Rs không nhỏ hơn 1,5.
- Chiều cao píc hay diện tích píc của mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng
điều kiện cho ta tính được hàm lượng hoạt chất có trong mẫu th ử .
1.2.5 . Pha tĩnh HPLC
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có
nhiều thành phần. Nó là một chất rắn xốp có kích thức hạt rất nhỏ, đường kính
cỡ 3 - 10 |j.m, diện tích bề mặt riêng từ 50 - 500m2/g-
*Phân loại
• Căn cứ vào bản chất của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta chia
nó thành nhiều loại hấp thụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử. Tương ứng
với các loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc ký riêng trong kỹ thuật
• Căn cứ vào trạng thái rắn hay lỏng của pha tĩnh, người ta chia nó làm
hai loại, nếu pha tĩnh là chất răn ta có sắc ký lỏng - rắn (LSC), nếu pha tĩnh là
chất lỏng ta có sắc ký lỏng - lỏng (LLC).
• Căn cứ vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động , ta có các loại: sắc
ký pha thuận, sắc ký pha đảo.
• Căn cứ cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, người ta chia nó làm
2 (>„ )
hoặc R s —
HPLC.
12
hai loại là xốp toàn phần hạt và xốp bề mặt hạt.
* Điều kiện đối với một pha tĩnh

• Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký.
• Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều
kiện sắc ký nhất định.
• Tính chất bề mặt phải ổn định đặc biệt là đặc trưng xốp của nó.
• Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
• Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất.
1.2.6. Pha động trong HPLC
Pha động là dung môi để rửa giải chất tan (chất cần phân tích) ra khỏi cột
tách để thực hiện một quá trình sắc ký. Đây là một yếu tố rất linh động và dễ
dàng thay đổi. Nó có thể là một dung môi hay hỗn hợp nhiều dung môi trộn
lẫn với nhau theo những tỷ lệ nhất định. Nó cũng có thể là muối chứa các chất
đệm, chất tạo phức Đối với mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi rửa giải
riêng để có được hiệu quả phân tách tốt nhất.
Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc ký của
một hỗn hợp mẫu. Nó quyết định thời gian lưu giữ các chất mẫu và hiệu quả
sự tách sắc ký. Pha động có thể ảnh hưởng đến:
• Độ chọn lọc của hệ pha.
• Thời gian lưu giữ của chất tan.
• Hiệu lực của cột tách .
• Độ phân giải của chất trong pha tĩnh.
• Độ rộng và cân đối của píc sắc ký.
* Điêu kiện đôi với pha động
• Phải trơ đối với pha tĩnh.
• Hòa tan được chất cần phân tích.
• Bền vững theo thời gian.
13
• Có độ tinh khiết cao.
• Phải nhanh đạt được các cân bằng trong quá trình sắc ký.
• Phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích.
• Có tính kinh tế và không quá hiếm.

* Các yếu tố chính cẩn lưu ỷ khi lựa chọn pha động
• Bản chất của dung môi lựa chọn làm pha động.
• Thành phần các chất tạo ra pha động.
• Tốc độ dòng pha động.
• pH của pha động (đặc biệt chú ý ở sắc ký trao đổi ion và sắc ký cặp
ion).
1.2.7. Cách tính kết quả trong phương pháp HPLC
'Phương pháp chuẩn ngoại :
- Chuẩn hoá một điểm : Nồng độ chất phân tích được xác định bằng cách so
sánh đáp ứng ( diện tích hoặc chiều cao của píc ) của chất đó trong dung dịch
thử và dung dịch chẩn tiến hành phân tích ở cùng điều kiện.
- Chẩn hoá nhiều điểm: Lập mối quan hệ giữa đáp ứng y(diện tích hoặc chiều
cao píc ) và lượng chất X trong dãy dung dịch chuẩn. Tính kết quả của chất
phân tích trong dung dịch thư dựa trên đồ thị của mối quan hệ giữa y và X.
Yêu cầu đáp ứng cua dung dịch thử phải nằm trong khoảng đáp ứng của dãy
dung dịch chuẩn.
*Phương pháp chuẩn nội:
Dung dịch thử và dung dịch chuẩn được chuẩn bị từ mẫu thử và mẫu chuẩn có
chứa chất phân tích và được thêm cùng một lượng xác định chất chuẩn nội(
chất thứ h a i).
- Chuẩn hoá một điểm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử được tính bằng
cách so sánh tỷ số chiều cao hay diện tính píc của chất phân tích với chuẩn nội
trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
14
- Chuẩn hoá nhiều điểm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử được tính toán
dựa vào đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ chất phân tích và tỉ lệ
giữa chiều cao hay diện tích píc của chất phân tích và chất chuẩn nội trong
dung dịch chuẩn.
■'Phương pháp chuẩn hoá diện tích :
Hàm lượng phần trăm chất cần định lượng được tính bằng cách lấy phần

trăm diện tích píc của chất đó chia cho tổng diện tích các píc trừ píc dung
môi, thuốc thử và píc nhỏ hơn giới hạn phát hiện.
+ Trong phân tích sinh học người ta hay sử dụng cách tính kết quả theo
phương pháp chuẩn hoá nhiều điểm có cùng chất chuẩn nội.
15
PHẦN 2 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM VÀ NỘI
DUNG NGHIÊN cứu.
2.1.1 Hoá chất, thiết bị.
2.1.1.1 Hóa chất.
- Tienam chuẩn (Merck): Chất chuẩn hàm lượng 100%.
- Acid boric HPLC.
- Natrihydroxit (PA).
- Morpholinoeethanolsulfonic acid (MES) .PA.
- Methanol HPLC(Merck).
- Nước siêu sạch dùng cho HPLC.
2.1.1.2. Thiết bị.
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao: spectra SESTYM
(Thermo Finnigan)
- Máy ly tâm Jouan (Pháp)
- Máy ly tâm lạnh.
- Cân phân tích Sartorius (Đức)
- Tủ lạnh sâu(T=-50°C) Frigo (Đan Mạch)
- Máy siêu âm Bransonic (USA)
- Máy khuấy từ Ikamag
- Máy đo pH Netrolin(Đức)
- Autopipet 1- 10//1, 10 - 100//1, 100 - 1000//1.
- Các dụng cụ thuỷ tinh chính xác và trang thiết bị có trong
phòng thí nghiệm
- Giấy lọc dung môi 0,45|Lim.

- Màng lọc 0,2 |Lim.
16
2.1.2 Phương pháp, nội dung và đối tượng nghiên cứu.
2.1.2.1 Nội dung nghiên cứu
a/ Khảo sát điều kiện sắc ký:
• Lựa chọn cột sắc ký
• Lựa chọn pha động
• Lựa chọn tốc độ dòng
• Lựa chọn bước sóng.
b/ Thẩm định phương pháp sắc ký .
• Khảo sát khoảng tuyến tính.
• Độ chính xác của phương pháp.
• Độ đúng của phương pháp
• Tính đặc hiệu của chương trình sắc ký
• Giới hạn định lượng
2.1.2.2. Đối tượng nghiên cứu.
Huyết tương của bệnh nhân lọc máu ngoài thận, sử dụng imipenem, đang
điều trị tại Khoa điều trị tích cực ở bệnh viện Bạch Mai.
2.1.2.3. Phương pháp nghiên cứu.
a. Định lương Imipenem trong huyết tương.
Sử dụng phương pháp HPLC .
b. Phương pháp xử lý mẫu.
Imipenem dễ bị thủy phân trong dung dịch hòa tan do đó cần thêm
chất ổn định MES với nồng độ 0,5M.
- Pha dung dịch ổn định MES 0,5M.
Cân chính xác khoảng 2,66g MES pha thành 25 ml trong bìnhđịnh
mức bằng nước cất siêu sạch.Sau đó dùng NaOH điều chỉnh đến pH6,0.
17
* Quy trình xử lý Imipenem trong huyết tương trắng
Hình 2.1: Sơ đồ xử lý ỈMl trong huyết tương trắng

*Quy trình chiết xuất Imipenem trong máu bệnh nhân
Lấy khoảng 4 ml máu của bệnh nhân có tiêm truyền Tienam vào ống
chứa EDTA. Lắc nhẹ sau đó ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút rồi hút
lấy 1,0 ml huyết tương đem xử lý tiếp theo sơ đồ sau:
18
1,0 mlMES 0,5M + lắc
xoáy 30” (1000v/phút)
Ly tâm ở 4°c/
lỏphút
15000vòng/phút
Lọc qua màng
0,2 jLi m
Hình 2.2: Sơ đồ chiết xuất IMI trong huyết tươnq người.
c.sử dụng phép thống kê để xử lý số liệu thu được
Gía trị trung bình:
x = - ± x ,
n ,=|
- Độ lệch chuẩn:
s
s
- Độ lệch chuẩn tương đối: R SD % = ^ X100%
- Sai số chuẩn
V
n
số tương đối
•(% )
ta X S L X 100
X
Trong đó a là hệ số tin cậy , Xị là kết quả xác định lần thứ i; n là số lần xác
đinh.

19
2.2. KẾT QUẢ THựC NGHIỆM
2.2.1 Khảo sát và xây dựng điều kiện sắc ký để định lượng imỉpenem
trong huyết tương.
- Pha dãy dung dịch imipenem chuẩn .
Cân chính xác khoảng 500g Imipenem chuẩn pha thành 25ml trong bình
định mức bằng nước cất siêu sạch ta sẽ được dung dịch Imipenem chuẩn với
nồng độ 20|ig/10|ul(C]).Từ C| tiến hành pha loãng bằng MES thành các dung
dịch c2; c3; C4; C5 Vơí các nồng độ tương ứng như sau: 10,0;5,0; 1,0; 0,1
|ig/10|jl Cách pha như sau:
Bảng 2.1: Cách pha các dung dịch Imipenem chuẩn
MES 0,5M
c,
c 2
c3 c 4
c 2
2501 |ul 250|Lil
c 3
250|il
250^1
Q
400|Lil lOOịlll
Q
450|lx1
50fil
Sau đó tiến hành chuẩn bị mẫu phân tích theo sơ đồ sau: Như vậy khi thêm
10/71 các chuẩn Q ; C2;C3;C4; C5 Vào các 5 ống nghiệm chứa Iml huyết tương
ta sẽ lần kượt có các mẫu thử với nồng độ tương ứng là:20; 10; 5,0; 1,0; 0,1
ng/lml .Tiến hành xử lý mẫu theo hình 2.1
2.2.1.1. Lựa chọn cột chạy sắc ký

Qua nghiên cứu trên nhiều tài liệu và điều kiện hiện có chúng tôi đã sử
dụng cột Novapak CI8 (4,6mm X 150mm) đường kính hạt 5|j,m để nghiên cứu.
2.2.1.2. Lựa chọn thành phần pha động.
- Thêm 10|Lil imipenem nồng độ 20 |ug/ml vào l,0ml huyết tương + 1,0 ml
MES; Xử lý mẫu theo hình 2.1 sau đó tiến hành chạy sắc ký với thành phần
pha động như sau:
20