Nghiên cứu định tính và định lượng đồng thời betamethason và dexclorpheniramin maleat trong viên nén cedesfarmin bằng phương pháp điện di mao quản

Bộ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
VƯƠNG THỊ VIỆT HỒNG
■ ■
NGHIÊN c ú u ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
BETAMETHASON VÀ DEXCLORPHENIRAMIN MALEAT
TRONG VIÊN NÉN CEDESFARNIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 2003 -2007)
Người hướng dẫn: TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
ThS. Tông Thị Thanh Vượng
Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá Phân tích
Trường Đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện: 01.2007 - 05
HÀ NỘI - 05.2007
LỜI CẢM ƠN
<
%fi.oá Cuận này được thực hiện và Hoàn thành tại 6ộ môn J-Coá
<Thân tích, Trường Đại dọc (Dược Hà Nội Lời ẩầu tiên tôi jận 6ày tỏ
Còng 6iết ơn sâu sắc tói TS.lĩiấi Nguyên 0~Cùng Tĩiu và TĩiS-'Tống Tñi
‘Thanh Vượng ẩã trực tiêị) hướng dan tôi thực hiện kỊioá Cuận nảy.
Đổng thời tôi củng J(in cám ơn sự giúp đõ của các thầy cô
giáo, cán 6ộ fịỹ thuật viên trong ỗộ môn J~Coá (Phẩn tích ẩẵ giúp tôi
hoàn thành Ñfioá [uận.
Tôi xin cầm ơn (Ban Çiàm diệu, các thầy cô giáo, kỹ thuật
viên, cán 6ộ công nhẩn viên các phòng 6an trong toàn trường da giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại Trường.
Cuối cùng tôi xịn cám ơn ßia (ñnh và Sạn 6è ấã Cuôn ấộng
viên fifiícÑ. tệ, giúp cfõ tôi tận tỉnh.
Hà mi, 19.0S.2007
Vương Thị Việt Jiông

MỤC LỤC
Trang
CÁC CHỮVIẾT TẮT 3
ĐẶT VÂN ĐỂ 4
P H Ầ NI- TỔNG QUAN 6
1.1. BETHAMETHASON 6
1.1.1. Công thức cấu tạo, một số tính chất và tác dụng dược lý 6
1.1.2. Các phương pháp định tính 7
1.1.3. Các phương pháp định lượng 7
1.2. DEXCLORPHENIRAMIN MALEAT 8
1.2.1. Công thức cấu tạo, một số tính chất và tác dụng dược lý 8
1.2.2. Các phương pháp định tính 9
1.2.3. Các phương pháp định lượng 10
1.3. VÀI NÉT VỀ ĐIỆN DI MAO QUẢN 10
1.3.1. Cơ chế của quá trình điện di trong mao quản 10
1.3.2. Điện di mao quản vùng 19
1.3.3. Một số ưu điểm của điện di mao quản 20
PHẦN 2 - THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 22
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHUƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u 22
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 22
2.1.2. Nội dung nghiên cứu 22
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu 22
2.1.4. Hoá chất, dụng cụ 23
2.2. KẾT QUẢ THựC NGHIỆM 24
2.2.1. Lựa chọn bước sóng làm việc 24
2.2.2. Lựa chọn điều kiện điện di 25
2.2.3. Chuẩn bị mẫu 25
2.2.4. Khảo sát khoảng tuyến tính 26
2.2.5. Xác định độ lặp lại của phương pháp trên chế phẩm viên nén 30
2.2.6. Định tính các chất trong mẫu thử 31

- 1 -
2.2.7. Xác định độ đúng của phương pháp 31
2.3. BÀN LUẬN 1 32
KẾT LUẬN 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO 35
- 2 -
CÁC CHỮVIẾT TẮT
CE Điện di mao quản
CZE Điện di mao quản vùng
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
UV-VIS Quang phổ tử ngoại khả kiến
ĐẶT VẤN ĐỀ
<
Sức khoẻ là vốn quý nhất của con người. Ngày nay nhu cầu chăm sóc
và bảo vệ sức khoẻ của nhân dân ngày một tăng. Cùng với sự phát triển
nhanh chóng của khoa học kỹ thuật, công nghệ bào chế các thuốc cũng
ngày càng phát triển. Yêu cầu về kiểm soát chất lượng cũng được đặt ra
ngày càng chặt chẽ hơn. Các thuốc có hơn một thành phần ngày càng trở
nên phổ biến trên thế giới cũng như ở Việt Nam, nhằm tăng cường tác dụng
điều trị và hạn chế tác dụng không mong muốn cho người sử dụng. Trong
các thuốc đa thành phần, có nhóm thuốc chống viêm-dị ứng đã được lưu
hành sử dụng từ lâu, các hoạt chất trong nhóm này có mặt rất nhiều trong
công thức thuốc đa thành phần. Một trong các dạng phối hợp có mặt trên thị
trường hiện nay là Cédesfamin của Công ty cổ phần Dược Đồng Nai có tác
dụng chống viêm, chống dị ứng đã được sản xuất vói công thức:
Betamethason 0,25 mg.
Dexcỉorpheniramin maleat 2 mg.
Để định tính và định lượng 2 thành phần hoạt chất trên trong các
dược điển thông dụng hiện hành [6, 14, 17, 18, 19] chủ yếu chỉ có các
chuyên luận cho thuốc chứa từng thành phần. Vì vậy các phương pháp định

tính, định lượng dạng bào chế đa thành phần phải qua nhiều công đoạn xử
lý mẫu tốn kém hoá chất và thời gian.
Trong Tiêu chuẩn cơ sở của chế phẩm này, phương pháp HPLC đã
được Công ty cổ phần Dược Đổng Nai chọn làm phương pháp định lượng
[8]. Các phương tiện phân tích ngày càng đa dạng với những ưu việt mới.
Điện di mao quản là một trong những phương tiện phân tích cho thấy có
nhiều ưu điểm trong sử dụng. Với mục đích tìm một phương pháp đơn giản
hơn, tiết kiệm, ít gây độc hại, tốn ít hoá chất và dung môi, chúng tôi tiến
hành đề tài “Nghiên cứu định tính và định lượng đồng thời Betamethason và
Dexclorpheniramin maleat trong viên nén Cédesfarnin bằng phương pháp
điện di mao quản”. Đề tài có các mục tiêu cụ thể sau:
- 4 -
1. Xây dựng chương trình điện di thích hợp để có thể định tính và định
lượng đồng thời Betamethason và Dexclorphenimmin maleat.
2. Áp dụng chương trình điện di đã xây dựng để định tính và định
lượng các hoạt chất trong viên nén Cédesỷarnin có trên thị
trường.
PHẦN I
TỔNG QUAN
1.1. BETHAMETHASON [1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19]
1.1.1. Công thức cấu tạo, một sô tính chất và tác dụng dược lý:
Công thức phân tử: C22H29F0 5
Khối lượng mol: 392,46
Tên khoa học: 9 fluoro-ỉlfĩ,17,21 trihydro-16fi methyl pregna- 1,4 diene-
3,20- dione
Tên khác: Beta dexamethasone
Tính chất:
Bột kết tinh trắng, hoặc gần như trắng. Thực tế không tan trong nước,
hơi tan trong ethanol, tan trong methanol, rất khó tan trong methyl clorid.
Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng: [2, 7]

Betamethason là một corticosteroid tổng hợp, có tác dụng
glucorticoid rất mạnh và kéo dài. Betamethason có tác dụng chống viêm,
chống thấp khớp và chống dị ứng.
Chỉ định: Trong nhiều bệnh như thấp khớp, bệnh Colagen, dị ứng,
bệnh ngoài da, bệnh nội tiết, bệnh ở mắt, hô hấp, máu, ung thư và nhiều
bệnh khác có đáp ứng với liệu pháp corticosteroid.
Liều dùng: Người lớn uống 0,5-5 mg/ ngày
Chống chỉ định: Bệnh nhân bị tiểu đường, tâm thần, loét dạ dày và
- 6 -
hành tá tràng, trong nhiễm khuẩn và vi rút, trong nhiễm nấm toàn thân và
người quá mẫn cảm với Betamethason. 1
Tác dụng không mong muốn: Giống như các corticosteroid khác bao
gồm: rối loạn về nước và điện giải, cơ xương, tiêu hoá, da, thần kinh, nội
tiết, mắt, chuyển hoá và tâm thần.
Các dạng bào chế:
Viên nén 0,25 và 0,5 mg (Biệt dược Celeston); ống tiêm 4mg/mL;
thuốc mỡ nhỏ mắt, nhỏ tai, mỡ gel dùng ngoài [11].
1.1.2. Các phương pháp định tính: [6, 8,11,12,13,14,17,18,19]
Đo phổ hồng ngoại
Đo góc quay cực: [a]^=+118° 4- +126°
Sắc ký lớp mỏng:
-Bản mỏng Silicagen GF 254.
- Dung môi triển khai:
Nước- methanol- ether- methylen clorid (1,2 : 8 : 15 : 7)
Hỗn hợp dung môi cloroíorm- diethylamin
Hỗn hợp butanol bão hòà nước : toluen : ether (5:10: 85)
- Phun hiện màu bằng H2SO4/ ethanol (1/2) hoặc soi dưới đèn
365nm so sánh với vết chuẩn
Đo phổ tử ngoại
Phản ứng với phenyl hydrazin/H2S04 thu được dẫn chất hydrazol hấp

thụ ở bước sóng 419nm
Phản ứng với H2SO4 có màu đỏ tối, pha loãng vói nước mất màu.
1.1.3. Các phương pháp định lượng: [6,12, 13,14,17, 18, 19]
1.1.3.1. Phương pháp đo quang [14]
Phương pháp này dựa vào khả năng hấp thụ bức xạ u v của
Betamethason trong alcol. Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch chứa
Betamethason ờ cực đại hấp thụ tương ứng với các muối khác nhau (bảng
1.1). Tính nồng độ Betamethason theo hệ số hấp thụ riêng tương ứng hay so
sánh vói chuẩn.
Phương pháp này cũng được Dược điển Việt Nam III dùng trong
-7-
chuyên luận Betamethason valerat.
Bảng, Ị.1 - Cực đại hấp thụ và hệ số hấp thụ riêng của một sô' muối của
Betamethason
Hợp chất
^max (nm)
A(l%,lcm)
Betamethason 238,5
395
Betamethason acetat 240
350
Betamethason dipropionat
240
305
Betamethason natri phosphat 241
297
Betamethason valerat 240
325
1.1.3.2. PhươngphápHPLC: [8, 9, 19]
Theo ƯSP 29 [19], định lượng Betamethason sử dụng cột LI (4,6mm

X 25cm), pha động là nước: acetonitril (63 : 37), detertor uv 240nm, tốc độ
dòng l,0ml/phút. Định lượng bằng so sánh với chất chuẩn hay chất nội
chuẩn. Các chất nội chuẩn được sử dụng có thể là propyl paraben, methyl
testosteron tuỳ theo dạng muối.
1.2. DEXCLORPHENIRAMIN MALEAT [1, 3, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 18, 19]
1.2.1. Công thức cấu tạo, một sô tính chất và tác dụng dược lý:
ch3
,COOH
'COOH
N
I
CH3
Công thức phân tử: CI6H19C1N2.C4H40 4
Khối lượng mol: 390,9.
Tên khoa học: (+)-2 {p-Chỉoro-a Ị2-(dimethylamino) ethyl}benzyl]
pyridine maleate.
Tính chất:
Bột kết tinh trắng, không mùi, là đồng phân hữu tuyền của
Clorpheniramin (racemic). Độ chảy: 110- 115°c. Dễ tan trong nước (1/1,1),
alcol (1/2), cloroform (1/1,7), rất ít tan trong ether, tan troilg methanol và
methyl clorid.
Dung dịch nước có phản ứng acid với quỳ pH = 4-5
Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng:
Dexclopheniramin maleat là thuốc kháng histamin HI
Cơ chế tác dụng: Dexclorpheniramin maleat đối kháng cạnh tranh với
histamin tại receptor H I của tế bào đích, vì vậy nó ngăn được tác dụng của
histamin lên tế bào đích, ngăn chặn các biểu hiện dị ứng.
Tác dụng mạnh hơn Clorpheniramin maleat 2 lần với cùng liều
lượng, do đồng phân tả tuyền không có tác dụng, có giới hạn an toàn cao.
Chỉ định: Chống dị ứng như viêm mũi dị ứng, mày đay, ban da, dị

ứng do thức ăn, thuốc, dị ứng với máu huyết thanh Ngoài ra
Dexclorpheniramin maleat còn được dùng rộng rãi phối hợp điều trị ho.
Tác dụng không mong muốn: tác dụng phụ ít và nhẹ. Không nên
dùng trong các hoạt động cần sự nhanh nhẹn vì thuốc gây buồn ngủ
Liều dùng: + Người lớn 2mg/lần X 4-6 lần/ngày
+ Trẻ em (dưới 12 tuổi) Img/lần X 3-6 lần/ ngày
Các dạng bào chế:
Viên nén dạng phối hợp vối một số hoạt chất khác.
1.2.2. Các phương pháp định tính: [14,19]
Đo phổ IR so với IR chuẩn
Đo phổ tử ngoại: dung môi là nước
Đo năng suất quay cực: [a]o= +220° 4- +230°
Độ chảy: 110- 115°c
Sắc ký lớp mỏng:
Bản mỏng Silicagen F254.
Dung môi khai triển:
nước:acid formic khan: methanol:diisopopyl ether (3:7:20:70).
Soi ở đèn tử ngoại 254 nm
-9 -
1.2.3. Các phương pháp định lượng: [14,19]
1.2.3.1. 'Các phương pháp hoá học:
Định lượng trong môi trường khan: dùng acid acetic khan, chỉ thị là
tím tinh thể [19].
Định lượng bằng HCIO4 0,1N (acid pecloric) cho đến màu xanh hoặc
xác định điểm kết thúc bằng phương pháp đo thế [14].
1.2.3.2. Phương pháp HPLC: [8, 9]
Cột LRP 18 (4x 250mm; 10|_im)
Tốc độ dòng: 1,7 mL/phút
Detector UV: 240nm
Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng

Thể tiêm sắt ký: 20 |iL
1.3. VÀI NÉT VỀ ĐIỆN DI MAO QUẢN: [4, 10, 15]
1.3.1. Cơ chê của quá trình điện di trong mao quản:
Điện di mao quản là một kỹ thuật tách phân tích được Việt hoá từ
thuật ngữ Capillary Electrophoresis, thường được gọi tắt là CE.
Nguyên tắc của quá trình tách trong điện di mao quản là dựa trên cơ
sở tính chất điện di khác nhau của các phần tử chất tan. Quá trình này xẩy
ra trong mao quản trên nền của dung dịch chất điện ly có pH thích hợp,
dưới tác dụng của một điện trường E xác định đặt vào hai đầu mao quản.
Cơ chế của điện di là sự di chuyển của các phần tử chất tan trong
mao quản dưới tác dụng của lực điện trường nhất định (.Electric Field
Force, được viết tắt là EFF) và tính chất của dòng chảy điện thẩm (Electro-
Osmotic Flow, được viết tắt là EOF). EOF là một ỉoại của dòng chảy khối
của chất lỏng trong mao quản. Nó có quan hệ mật thiết với lớp điện tích
trên thành mao quản. EOF sẽ quyết định thời gian tồn tại của chất tan trong
mao quản. Nó tồn tại bao trùm lên dòng di chuyển của chất tan, nghĩa là
chất tan di chuyển trong dòng này [15].
Hình 1.1 - Sự di chuyển của ion và phân tử trong mao quản
Thế tạo ra điện trường E đặt vào hai đầu mao quản được dùng trong
kỹ thuật CE ỉà rất lớn, thông thường từ 10 - 30 kV. Chính lực điện trường
này làm động lực cho các phần tử chất tan di chuyển theo một hướng nhất
định và các chất có điện tích và độ lớn khác nhau sẽ di chuyển với các tốc
độ khác nhau. Do đó mà tạo nên sự tách của các chất phân tích.
Mao quản sử dụng trong CE thường có độ dài từ 25 đến 100 cm,
đường kính trong (id) 25 - 100 Ịim. Loại mao quản có đường kính trong
khoảng 50 - 75um là thích hợp nhất vì hiệu ứng nhiệt nhỏ, dễ khống chế
nhiệt độ mao quản. Mao quản được chế tạo từ nhiều vật liệu khác nhau,
nhưng phổ biến nhất là silica nung chảy ựused silica). Trên thực tế hầu hết
các nghiên cứu đã thực hiện bằng CE cho tới nay đều tiến hành trên loại
mao quản này. Đây cũng là loại mao quản chúng tôi sử dụng trong nghiên

cứu của mình. Do đó chúng tôi sẽ trình bày kỹ cơ chế của quá trình điện di
xảy ra với mao quản silica nung chảy[4],[10].
1.3.1.1. Dòng điện thẩm:
Dòng điện thẩm (EOF) được Việt hoá từ thuật ngữ Electro-osmotic
flow hoặc Electroendosmotic flow. Trong CE dòng điện thẩm EOF là một
thành phần cơ bản tạo nên sự di chuyển của toàn bộ dung dịch trong mao
quản bắt nguồn từ điện tích bề mặt của thành trong mao quản.
❖ Nguồn gốc EOF:
Khi điện di với mao quản silica, các nhóm silanol (SiOH) ở trên thành
mao quản sẽ giải phóng ra H+ vào dung dịch và bề mặt thành mao quản sẽ
-11 -
mang điện tích âm. Quá trình giải phóng H+ phụ thuộc vào hằng số cân
bằng K, Với mao quản silica, khó xác định chính xác trị số K, nhưng thực
nghiệm chỉ rõ dòng EOF có giá trị đáng kể khi pH dung dịch trên 4. Các
vật liệu không ion hoá như Teflon dùng làm mao quản cũng cho dòng EOF
vì nó hấp phụ các anion [4].
Hình 1.2 - Dòng EOF trong mao quản silica [15]
a) Bề mặt mao quản silica tích điện âm (SiO )
b) Các cation hydrat hoá tập trung gần bê mặt mao quản.
c) Khối dung dịch trong mao quản di chuyển về catocl dưới tác dụng của điện
trường (dòng EOF).
Vì bề mặt thành trong mao quản mang điện tích âm, nên đối ion (chủ
yếu là cation) do lực hút tĩnh điện sẽ tạo thành một lớp điện kép để cân
bằng điện tích và tạo nên một hiệu điện thế ở vùng sát thành mao quản gọi
là thế Zeta (Q. Khi có áp thế vào mao quản, các cation trong lớp điện kép
khuếch tán sẽ di chuyển về phía catod. Nhưng các cation này bị solvat hoá
- 12-
nên kéo theo cả khối dung dịch trong mao quản về catod. Sự di chuyển của
khối dung dịch trong mao quản silica dưới tác dụng của điện trường gọi là
dòng điện thẩm EOF.

Thế Zeta C, được xác định chủ yếu bằng điện tích bề mặt của thành
mao quản. Điện tích phụ thuộc vào pH, vì vậy trị số EOF thay đổi theo pH.
Ở pH càng cao, các nhóm silanol mất proton H+ càng nhiều nên trị số dòng
EOF càng lớn. Phụ thuộc vào điều kiện điện di cụ thể, với pH trong khoảng
2-12 dòng EOF có thể thay đổi.
Ngoài pH dung dịch điện di, dòng EOF sẽ thay đổi khi:
- Lực ion của dung dịch tăng lên, làm giảm thế Zeta nên dòng EOF giảm.
- Trong một số trường hợp dung dịch đệm nước có thêm một số dung dịch
hữu cơ như methanol, acetonitril (để hoà tan chất phân tích), hằng số điện
môi của dung dịch điện di giảm xuống kéo theo sự giảm của dòng EOF.
❖ Hai đặc điểm của EOF:
* Đặc điểm đầu tiên của dòng EOF là tạo nên một dòng chuyển khối
phẳng trong mao quản. Bởi vì lực tạo ra sự di chuyển của EOF phân bố
đồng nhất dọc theo mao quản, cho nên không có sụt áp trong mao quản:
dòng đồng nhất từ đầu này đến đầu kia của mao quản. Nếu dùng bom đẩy
dung dịch như trong LC thì dòng chảy sẽ có dạng parabol (do hiệu ứng
thành: các phân tử giữa dòng di chuyển với tốc độ cực đại, các phân tử gần
thành di chuyển với tốc độ chậm hơn nhiều và dần tới có tốc độ bằng 0).
Tuy nhiên tính chất tạo dòng chuyển khối phẳng của dung dịch điện
di chỉ xuất hiện khi đường kính trong mao quản (dị) < 200 |im. Nếu đường
kính trong của mao quản vượt quá xa 200 ¡am thì sức căng bề mặt khổng
đủ tạo ra sự di chuyển đồng nhất giữa phần chất lỏng ở giữa và ở gần thành
mao quản.
* Đặc điểm thứ hai của dòng EOF là đưa tất cả các tiểu phân có mặt
trong dung dịch điện di (bất kể có điện tích hay không) di chuyển theo cùng
một hướng. Với điều kiện thông thường (thành mao quản tích điện âm),
dòng này di chuyển về catod. Các anion cũng sẽ di chuyển về phía catod vì
- 13-
tốc độ EOF lớn hom nhiều so vói tốc độ điện di.
Cạtion di chuyển nhanh nhất do lực điện di và EOF cùng hướng, tiếp

theo là các chất không mang điện tích di chuyển theo EOF nhưng không
tách khỏi nhau được. Cuối cùng là anion. Trên điện di đồ thứ tự rửa giải
theo thời gian như sau: cation có điện tích lớn kích thước nhỏ ra trước nhất,
anion có điện tích lớn và kích thước nhỏ ra cuối cùng.
EOF là một trong các thông số cơ bản quyết định quá trình điện di, vì
vậy cần phải được kiểm soát. Ở pH cao, EOF có thể quá lớn làm cho quá
trình rửa giải các chất khỏi mao quản xẩy ra quá nhanh khi chưa kịp tách
khỏi nhau. Ngược lại ở pH thấp, thành mao quản mang điện tích âm có thể
hấp phụ cation nhờ lực hút tĩnh điện. Điều đó có thể gây khó khăn khi điện
di tách protein base. Trong một số kỹ thuật CE thường cần giảm EOF.
Để kiểm soát dòng điện thẩm người ta thường tìm cách thay đổi điện
tích bề mặt mao quản hoặc độ nhót của dung dịch điện di. Có thể thống kê
một số yếu tố làm tăng EOF:
- Tãng thế áp vào hai đầu mao quản.
- Tăng pH của dung dịch điện di (trong khoảng 2-12).
- Tăng nhiệt độ điện di.
- Giảm nồng độ các chất trong dung dịch (giảm lực ion).
Ngoài ra thay đổi thành mao quản có thể gây ra giảm, loại trừ hoặc
đổi chiều của EOF. Trên hình 1.3 mô tả rửa giải theo thứ tự: cation, các
chất trung hoà, cuối cùng anion. Nếu bây giờ cần phân tích anion, thời gian
rửa giải có thể giảm xuống bằng cách đổi chiều EOF và đổi cực của thế áp
mao quản. Thứ tự rửa giải sẽ là: anion, các chất trung hoà, rồi đến cation.
Để làm đổi chiều EOF, người ta thường thêm vào dung dịch một
+
+
+
Hình 1.3 - Thứ tự rửa giải trên điện di đồ
♦> Kiểm soát EOF:
-

14
-
muối alkyl amoni bậc 4. Đầu thân nước mang điện tích dương sẽ cố định
với nhqm SiO' của thành mao quản nhờ tương tác ion. Phần sơ nước của
hydrocarbon sẽ liên kết (tương tác sơ nước) với các phân tử muối alkyl
amoni tự do. Đầu mang điện tích dương của muối này sẽ hút các anion của
dung dịch. Các anion hydrat hoá này sẽ di chuyển về phía anod kéo toàn bộ
khối dung dịch trong mao quản đi theo, tạo ra EOF di chuyển về phía anod.
-

—

»
■EOF
Hình 1.4 - Đổi chiều EOF nhờ các chất hoạt động bề mặt cation.
Các muối alkyl amoni bậc 4 thường dùng cho đổi chiều EOF là:
Cetyl trimetyl amoni bromid (CTAB) hoặc clorid (CTAC), Tetradecyl
trimetyl amoni bromid (TTAB). Ngoài ra có thể dùng dietylen triamin
(DETA).
1.3.1.2. Các thông số phân tích của CE:
**** Thời gian di chuyển tM {migration times):
Thòi gian cần thiết để một chất tan di chuyển từ khi đưa vào mao
quản đến thời điểm được phát hiện bởi detector được gọi là thời gian di
chuyển tM.
Quãng đường di chuyển là chiều dài hiệu dụng của mao quản. Đó là
độ dài từ điểm tiêm mẫu đến điểm phát hiện. Tốc độ di chuyển gồm hai
thành phần:
- Tốc độ điện di của ion: vep = ụ ep.E = Mcp-—
'ề
- 15-

- Tốc độ điện thẩm, tốc độ EOF: veo = ụeo.E = Meo.—
L
I ■ I
Thời gian di chuyển của ion chất tan sẽ là:
_ / _ / l.L
M V ep + v ea ~ ÌMep + M e o)-E ÌM ep + M e o)-V
trong đó: / : chiều dài hiệu dụng của mao quản (cm).
V : thế áp vào 2 đầu mao quản có chiều dài là / (cm).
Ịj.ep+ |iC(,=|Lia : linh độ biểu kiến.
*t* Tốc độ di chuyển:
Tốc độ di chuyển của một ion v¡ được xác định bằng:
V , = M ' P - E
Hep : linh độ điện di của ion chất tan (cm2/(V.s)).
E : cường độ điện trường (V/cm).
Linh độ |aep là cơ sở tách bằng điện di, phụ thuộc vào nhiều yếu tố của
môi trường điện di, thể hiện ở:
- Lực điện Fe gây ra sự chuyển động của các ion: Fe= q.E
- Lực ma sát của môi trường điện di cho ion dạng hình cầu:
Fị= -6 71 T| r¡ v¡
trong đó: t ị: độ nhót củ a dung dịch trong m ao quản.
r¡ và v¡: bán kính và tốc độ di chuyển của ion.
dấu (-) thể hiện lực Ff ngược chiều với Fe (qui ước lấy dấu +).
Quá trình điện di đạt trạng thái ổn định khi hai lực trên (Fe và Ff )
bằng nhau: qE =6 7t T| r¡ v¡
Số đĩa lý thuyết của cột mao quản: N - = - f—
2 DL 2D
D: Hệ số khuếch tán của chất phân tích di chuyển ra khỏi cột với thời
gian t.
**** Độ phân giải của hai chất (R): R = ^ ^
M

với Ah=H2-Hj m = ^ÌM2+Mi)
16-
I.3.I.3. Phân loại CE
TỊieo cơ chế, bản chất và đặc điểm của sự tách trong mao quản mà
người ta thường phân chia thành các loại hay các kiểu khác nhau như trong
bảng 1.2.
Bảng 1,2 - Một sô' kiểu điện di và cơ chê tách
Kiểu điện di
Cơ chế tách
1. Điện di mao quản vùng CZE
(capillary zone electrophoresis)
Linh độ khác nhau của
các ion trong dung dịch
tự do.
2. Sắc ký điện động mixen MEKC
(micellarelectrokinetic chromatography)
Tương tác sơ nước/ion
với hạt mixen trong dung
dịch
3. Điện di mao quản gel CGE
(capillary gel electrophoresis)
Kích thước và điện tích
(molecular sieve)
4. Điện sắc ký mao quản CEC
(capillary electrochromatography)
Sự phân bố và linh độ
khác nhau của các chất.
1.3.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng:
*1* Điện thế:
Thời gian phân tích sẽ tỷ lệ nghịch với điện thế đặt vào hai đầu mao

quản. Tuy nhiên nếu tăng điện thế lên quá cao sẽ sinh hiệu ứng Joule tạo ra
gradient nhiệt trong mao quản và dẫn đến thay đổi độ nhớt ở từng vùng
trong mao quản làm cho các phân tử ngay cả của một chất tan cũng di
chuyển không đồng nhất dẫn đến sự khuếch tán khác nhau và làm mở rộng
vùng mẫu.
*** Nhiệt độ:
Ảnh hưởng chính của nhiệt độ là làm thay đổi vận tốc và độ dẫn điện
của đệm. Trong một số trường hợp nếu nhiệt độ trong mao quản tăng là
nguyên nhân làm thay đổi cấu tạo của protein, làm thay đổi thời gian điện
di và hiệu quả phân tích.
♦♦♦ Cột mao quản:
Kích thước của cột mao quản (chiều dài và đường kính) ảnh hưởng
đến thời gian tách và hiệu quả phân tích. Nếu tăng cả hai yếu tố là chiều dài
hiệu dụng và chiều dài cột mao quản có thể làm giảm điện trường và tăng
thời gian phân tích.
*1* Dung dịch đệm:
• Loại đệm và nồng độ: Đệm thích hợp cho CE là đệm có tác dụng tốt
nhất trong dẫy đệm đã chọn và giảm thấp nhất sự sinh nhiệt trong đệm.
• pH: pH của đệm có thể tác dụng lên khả năng phân tích và làm thay đổi
EOF. Tăng pH của đệm thường gây tăng EOF.
• Dung môi hữu cơ: Dung môi hữu cơ có thể làm tăng khả năng tan của
một số chất tan trong đệm. Khi thêm dung môi hữu cơ vào trong đệm
thường làm giảm EOF.
1.3.1.5. Thiết bị CE:
1
rỶ7
ị ị ị
Ị Capillary
thermostatíìng
1. Điều nhiệt mao quản,

Vial !
caro
(thermostatted)
2
2. Dung dịch mẫu,
3. Dung dịch đệm,
Buffer replenishment
t
4. Dung dịch đệm dự trữ,
5. Detector (DAD).
4
Hình 1.5 - Sơ đồ hệ thống điện di
- 18-
Sơ đồ một hệ thống điện di mao quản như trong hình 1.5, thường
gồm cáp bộ phận sau: I
- Bộ phận buồng điện cực, các điện cực và bình điện cực
- Nguồn cấp thế cao một chiều (10-30 kV) biến thiên được.
- Cột tách- mao quản.
- Bộ phận nạp mẫu vào mao quản.
- Bộ phận phát hiện chất (detector).
- Bộ phận ghi sắc đổ (computer).
- Bộ phận điều nhiệt cho mao quản.
1.3.2. Điện di mao quản vùng :
1.1.2.1. Cơ sở điện di mao quản vùng :
Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis - CZE) là
phương pháp phân tích cơ bản nhất của kỹ thuật CE, do tính đơn giản của
cơ chế tách và tính linh hoạt của nó. Phương pháp này có phạm vi ứng dụng
rộng trong việc tách và phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau, bao gồm
các amino acid, các peptid, các hợp chất cấu tạo ion, các hợp chất đổng
phân không gian và nhiều loại hợp chất có khả năng ionic hoá [10].

Đây là phương pháp tách dựa trên sự di chuyển của chất tan có điện
tích trong điện trường với tốc độ khác nhau tuỳ thuộc vào độ linh động điện
di của chúng. Độ linh động điện di là đại lượng phụ thuộc vào điện tích ion,
chính xác hơn là tỷ lệ giữa điện tích và khối lượng của ion, bán kính của
ion, trạng thái của ion như mức độ ion hoá, trạng thái liên kết với các đối
ion. Do đó độ linh động điện di phụ thuộc vào hằng số điện môi, pH, độ
nhớt của dung dịch Khi ta đặt một điện áp cao vào hai đầu của mao quản,
các tiểu phân tích điện sẽ bắt đầu di chuyển, tất nhiên là về phía điện cực
trái dấu. Các ion có độ linh động điện di cao hơn sẽ di chuyển nhanh hơn,
hình thành các vùng các ion có độ linh động điện di tương tự nhau. Mặt
khác khi đặt một điện áp cao vào hai đầu của mao quản, ở một vùng pH đủ
lớn, sẽ hình thành một dòng điện thẩm.
Trong mao quản silic dòng này hướng về phía cực âm (catod). Do
các ion dương có cùng hướng với dòng này cho nên tốc độ được tăng thêm,
- 19-
các ion âm do không cùng hướng với dòng điện di thẩm thấu cho nên di
chuyển,chậm lại và nếu không vượt được nó thì cũng bị cuốn đi về phía cực
âm. Các phân tử không tích điện sẽ di chuyển cùng tốc độ với dòng điện
thẩm.
LrUC
ị 1 *
J**J. * *
% ^ ' , V ' . ì
V i J ^ '■'S* ' ’u i ỉ w ^
í
\ \ * * ' ^
1 >y
r 'r’ị
• 9
•

t
* J \
Hình 1.6 - Quá trình tách các chất trong CZE
CZE là mô hình phân tích đơn giản nhất của CE. Hệ thống phân tích
CZE cũng chính là cơ sở xuất phát cho các kỹ thuật CE khác. Từ xuất phát
điểm là một mao quản với một dung dịch đệm nhất định (hay còn gọi là
dung dịch điện ly nền - Background Electrolyte Solution), người sử dụng
chỉ cần thêm vào một hay nhiều chất phụ gia (modifier) thích hợp là có thể
chuyển sang các kỹ thuật điện di khác. Tùy thuộc vào chất phụ thêm vào có
nhiều kỹ thuật CE khác nhau.
1.3.2.2. ứng dụng của CZE :
Hiện nay CZE đã được ứng dụng tương đối nhiều trong lĩnh vực sinh-
y học, đặc biệt là lĩnh vực tách và phân tích các chất peptid, protein, các
amino acid và glycoprotein.
1.3.3. Một số ưu điểm của điện di mao quản:
Điện di mao quản có một số ưu điểm sau:
- Có hiệu lực tách các chất rất cao trong mao quản silica nung chảy
hay ống Teflon (có đường kính trong 25-lOOịim).
- Số đĩa lý thuyết N của cột tách là rất lớn, thông thường N từ 105 đến
106 nên cho kết quả tách tốt những hợp chất phức tạp.
- Thời gian tách ngắn hơn so với các loại sắc ký HPLC trên cùng loại
đối tượng mẫu.
- Lượng (thể tích) mẫu cần là rất nhỏ, thường là từ 5-50 nL cho một
lần bơm mẫu vào cột tách. <
- Có nhiều kiểu tách theo CE, nên khả năng ứng dụng thực tế là rất
rộng rãi và đa dạng.
- Sự tách được thực hiện chủ yếu trong môi trường nước với sự có
mặt của chất điện ly nên không tốn nhiều dung môi hữu cơ và rất kinh tế.
- Quá trình phân tích không phức tạp (tương tự như trong HPLC).
- Có khả năng tự động hóa trong tách và phân tích hàng loạt.

Tuy nhiên do đặt một điện thế cao vào hai đầu mao quản do đó sinh ra
hiệu ứng nhiệt Joule dẫn đến sự giãn rộng pic. Vì vậy phải khống chế nhiệt
độ của mao quản để đảm bảo thu được kết quả phân tích tốt nhất.
PHẦN 2
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QỨẢ
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúư:
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu:
Đối tượng nghiên cứu là chế phẩm dạng viên nén có chứa 2 thành
phần là Betamethason và Dexclorpheniramin maleat.
Cụ thể là viên nén Cédesfamin của công ty cổ phần Dược Đồng Nai,
số lô sản xuất: 021005, ngày sản xuất: 130905. Hạn dùng: 1007
Công thức viên:
2.1.2. Nội dung nghiên cứu:
- Khảo sát các điều kiện để xây dựng phương pháp định tính, định
lượng đồng thời Betamethason và Dexclorpheniramin maleat bằng điện di
mao quản.
- Áp dụng phương pháp xây dựng được để định tính và định lượng 2
thành phần trên trong viên nén.
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu:
- Chọn bước sóng và điều kiện định lượng thích hợp.
- Chọn vùng nồng độ có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và các
giá trị đo được.
- Kiểm tra sự phù hợp, độ lặp lại, độ đúng của phương pháp.
- X ử lý thống kê dữ liệ u thực ng hiệm đo được bằng phần m ềm trên
máy tính để nhận xét và rút ra kết luận. Một số đại lượng cần được tính toán
trong xử lý thống kê số liệu thực nghiệm:
Dexclorpheniramin maleat 2 mg
Betamethason
Tá dược vừa đủ
0,25mg

ỉ viên
Giá trị trung bình: X
/=1
n
- 2 2 -
Độ lệch chuẩn: s =
t k - x Ỵ
7=1 ________
Phương sai: s2 =
(n-1)
±(X,-XÌ
/ = 1
Sai số chuẩn: Si-\ =
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = = X100
X
Sai số tương đối: £•(%) = a—^ X100
X
2.1.4. Hoá chất, dụng cụ:
2.1.4.1. Thuốc thử - Hoá ch ất:
- Methanol: loại HPLC- Merck (Germany)
- Natri tetraborat (Budapets-Hunggary)
- Nước cất chạy điện di
- Dexclorpheniramin maleat: chuẩn làm việc của Viện kiểm nghiệm hàm
lượng 100%.
- Betamethason: chuẩn làm việc của Viện kiểm nghiệm hàm lượng 100,4%
2.1.4.2 Thiết bị - dụng cụ:
- Máy điện di mao quản Hewlett Packard 3D CE của Bộ môn Hoá Phân tích,
Trường Đại học Dược Hà Nội.
- Máy quang phổ Beckman DƯ-640 spectrophotometer (Mỹ).
- Máy lọc nước siêu sạch Elga (Anh).

- Đầu lọc đường kính lỗ lọc 0,2|am.
- Cân phân tích Satorius (Đức).
- Máy siêu âm Branson (Mỹ).
- Máy lắc Labinco (Hà Lan).
- Máy đo pH Meter - Jenway.
- Autopipet 10 -100 JJ.1; 100 - 1000 fAl.
- Dụng cụ thuỷ tinh, ống nghiệm, bình định mức.
-23-