Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ chủng streptomyces 324

BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
Nguyễn Thị Thanh Dung
GÓP PHẤN
NGHIÊN cứu KHÁNG SINH
TỪ CHỦNG
STREPTOMYCES 324
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1997-2002)
Người hướng dãn: TS. CAO VĂN THU
ThS. KIỀU THỊ HỒNG
Nơi thực hiện : Bộ MÔN CÔNG NGHIỆP Dược
Thời gian thực hiện'. 3/2002-Ỗ/2002
Hà Nội, 05/2002
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với TS. Cao Văn Thu và
ThS. Kiều Thị Hồng. Những thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn tôi làm
khoá luận này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các cán bộ, kỹ thuật
viên trong bộ môn Công nghiệp Dược đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong
quá trình thực hiện khoá luận.
Với trình độ bản thân còn hạn chế và thời gian làm khoá luận
không nhiều, chắc chắn khoá luận còn nhiều thiếu sốt. Tôi rất mong
được các thầy cô và bạn bè đồng nghiệp góp ý kiến để khoá luận hoàn
thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà nội, ngày 10 tháng 5 năm 2002
Sinh viên
NGUYỄN THỊ THANH DUNG
MỤC LỤC
Đ ặt vấn đề Trang
Phần 1 Tổng quan ỹ

1.1 Kháng sinh 2
1.1.1 Định nghĩa 2
1.1.2 Phân loại 2
1.1.3 Sơ đồ sản xuất kháng sinh 3
1.2 Xạ khuẩn chỉ Streptomyces 4
1.2.1 Xạ khuẩn 4
1.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh lý xạ khuẩn chi Streptomyces 5
1.2.3 Phân loại Streptomyces 6
1.2.4 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 6
1.3 Cải tạo giông v s v 8
1.3.1 Mục đích 8
1.3.2 Các phương pháp cải tạo giống 8
1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 9
1.4.1 Lên men hề mặt 9
1.4.2 Lên men chìm 9
1.5 Tách chiết và tình chê 11
1.6 Một sô'thành tựu trong nghiên cứu kháng sinh 12
Phần 2 Thực nghiệm và kết quả 15
2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 15
2.1.1 Nguyên liệu 15
2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 18
2.2 Kết quả và nhận xét 25
Phần 3 Kết luận và đề xuất 38
3.1 Kết luận 38
3.2 Đề xuất 38
Tài liệu tham khảo
Phu luc
CHÚ GIẢI CHỮVIẾT TẮT
A
Agitation

ADN
Acid deoxyribonucleic
AIDS
Acquired immunodeficiency syndrome
As
Aspergillus niger
BC
Bacillus cereus ATCC 9946
BP
Bacillus pumilus ATCC10241
BS
Bacillus subtilis ATCC 6633
Cd
Candida albicans
D(mm)
Đường kính vòng vô khuẩn trung bình
dmhc
Dung môi hữu cơ
DO
Dissolved oxygen
E
Aeration
EC
Escherichia coli ATCC 25922
ELISA
Enzym linked immunosorbent assay
ha
hair
HIV
Human immunodeficiency virus

Pseu
Pseudomonas aeruginosa VM 201
Pro
Proteus mirabilis B V 108
MT
Môi trưòtig
MTdd
Môi trường dung dịch
N
Pha nước
s
Spirales
s
Sai sô chuẩn đã hiệu chỉnh
Sa
Saccharomyces cerevisiae
Sal Salmonella typhi DT 220
Shi Shigella flexneri DTI 12
sp spiny
sta Staphylococcus aureus ATCC1228
RA Retinaculiaperti
RF Rectiflexibiles
V Verticillati
v s v Vi sinh vật
wa warty
ĐẶT VẤN ĐỀ
■
Streptomyces là một chi xạ khuẩn được nhiều nhà khoa học trong và ngoài
nước quan tâm nghiên cứu, Các công trình nghiên cứu đã chứng minh: các loài
Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng có cấu trúc và

đặc điểm kháng khuẩn khác nhau, một số loài trong chi này còn có khả năng
sinh tổng hợp các chất chữa ung thư và điều trị HIV/AIDS.
Các nhà khoa học Việt Nam đã chứng minh rằng: xạ khuẩn Streptomyces
có mặt trong đất Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp các kháng sinh có tác
dụng tốt (ví dụ: dekamycin w ). Do đó, việc tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy
và lên men những loài thuộc chi này, nhằm thu được hiệu suất sinh tổng họfp
kháng sinh cao nhất đã được nhiều công trình nghiên cứu. Đồng thời, qui trình
chiết tách và tinh chế kháng sinh từ môi trưòng nuôi cấy cũng được nhiều nhà
nghiên cứu quan tâm.
Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường đại học Dược Hà Nội đã tiến hành
phân lập và nghiên cứu một số chủng Streptomyces có trong đất nông nghiệp
của tỉnh Thanh Hoá. Trong số đó, qua thử tác dụng sơ bộ, Streptomyces 324 là
một chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng và có
tiềm năng trong ứng dụng thực tế.
Từ những phân tích trên, khoá luận "Góp phần nghiên cứu kháng sinh
từ chủng Streptomyces 324” được tiến hành nghiên cứu với mục tiêu:
. - Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và sinh lý nhằm phần loại, xác định
tên khoa học của chủng Streptomyces 324.
- Chọn giống sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất bằng chọn lọc ngẫu nhiên
và đột biến cải tạo giống.
- Bước đầu nghiên cứu môi trường nuôi cấy và môi trường lên men.
- Bước đầu xây dựng qui trình chiết tách - tinh chế sản phẩm.
Phần 1:
TỔNG QUAN
1.1. Kháng sinh [1] [6] [9]
1.1.1. Định nghĩa:
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật (VSV)
hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm
hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định.
1.1.2. Phân loại kháng sinh:

Kháng sinh có thể được phân loại theo nguồn gốc, cơ chế tác dụng, cấu
trúc hoá học. Trong đó, phân loại theo cấu trúc hoá học được xem là phân loại
quan trọng nhất.
Theo cấu trúc hoá học, kháng sinh được phân loại thành 7 nhóm:
1. Nhóm ß-Lactam:
- Nhóm penicilin: penicilin V, penicillin G.
- Nhóm cephalosporin: ceftriaxon, Cefuroxim
- Các monobactam: aztreonam
- Các chất ức chế ß-lactamase : acid clavulanic
2. Nhóm Aminosid: Streptomycin, gentamycin
3. Nhóm Amphenicol: cloramphenicol, thiamphenicol
4. Nhóm Tetracyclin: tetracyclin, Oxytetracyclin, doxycyclin
5. Nhóm Macrolid: Erythromycin, spiramycin
6 . Nhóm Rifamicin: Rifampicin
7. Nhóm Quinolon: ciprofloxacin
1.1.3. Sơ đồ sản xuất kháng sinh:
Hình 7. Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh.
1.2. Xạ khuẩn chi Streptomyces [4] [12]
1.2.1. Xạ khuẩn (Actinomycetales):
• Đặc điểm chung:
Xạ khuẩn, còn gọi là khuẩn tia, phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên: đất,
bùn ao, nước và các chất thải hữu cơ. Xạ khuẩn là một lớp vi khuẩn nhưng lại
phát triển tạo sợi giống nấm mốc, là v s v hiếu khí.
Xạ khuẩn có một số đặc điểm sau;
- Đưòỉng kính sợi xạ khuẩn 0,5 - 5|Lim.
- Màng tế bào không có celullose, kitin.
- Phân chia tế bào theo kiểu phân bào vô tính.
- Không có giống đực và giống cái. v /
- Trên môi trường đặc: khuẩn lạc rắn chắc, xù xì, có màu hoặc
không màu.

- Nhuộm màu Gram(+).
• Phân loại:
Sơ bộ hệ phân loại các xạ khuẩn đến họ, riêng họ Streptomycetaceae
đến hai chi là Streptomyces và Micromonospora được trình bày ở hình 2.
Actinomycetales
▼
Actinoplanaceae Actinomycetaceae Streptomycetaceae
t
Streptomyces Micromonospora
Hình 2: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn
1.2.2. Đặc điểm hình thái và sinh lý của xạ khuẩn chỉ Streptomyces [4]
[ 11] [ 12]
• Khuẩn lạc:
- Bề mặt: khô, xù xì, được bao phủ bởi một lóp bột mịn như bụi phấn,
hoặc bởi những sợi nhỏ, bông như tơ.
- Khuẩn lạc có chân vững chắc, khó tách ra khỏi môi trường nuôi cấy.
• Khuẩn ty cơ chất:
- Mọc sâu vào trong môi trưòfng nuôi cấy, không phân cắt trong suốt
quá trình phát triển.
- Bề mặt nhẵn hoặc sần sùi.
• Khuẩn ty khí sinh:
- Khuẩn ty khí sinh rất phát triển là đặc điểm đặc trưng của chi
Streptomyces.
- Có đưòmg kính 1 -1,4 ịim.
• Chuỗi bào tử:
Được hình thành từ khuẩn ty khí sinh, có nhiều hình dạng khác nhau:
thẳng, uốn cong hoặc xoắn lò xo. Quá trình sinh bào tử bắt đầu bởi sự phân
mảnh: thành tế bào và màng tế bào chất đồng thời xuất hiện vách ngăn tiến
dần vào phía trong làm cho chuỗi bào tử phân cắt tạo thành một chuỗi bào tử
trần,bào tử nọ kế tiếp bào tử kia.

• Bào tử:
- Cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn là bào tử trần. Có hình cầu,
hình bầu dục, hình que, hình trụ, Hình dạng và kích thước của bào tử có vai
trò quan trọng trong định tên Streptomyces.
- Bề mặt của bào tử có thể có các kiểu trơn, nhẵn (sm) hoặc xù xì (wa)
hoặc có gai (sp) hoặc có tóc (ha).
- Các bào tử tập hợp với nhau thành chuỗi có từ 3 - 10 bào tử hoặc nhiều
hơn.
• Khả năng tạo sắc tố của Streptomyces:
Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia thành 4 loại: sắc tố hoà tan,
sắc tố khuẩn ty cơ chất, melanin, sắc tố của khuẩn lạc.
1.2.3. Phân loại Streptomyces:
Chi Streptomyces bao gồm một số lượng lớn các xạ khuẩn có khả năng
sinh tổng hợp ra các kháng sinh có tác dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Có rất nhiều khoá phân loại Streptomyces khác nhauikhoá phân loại
Krasillnikov, Waksman, Gauze, Shirling & Gottlieb. Hội nghị "Vi sinh vật thế
giới lần X" (được tổ chức tại Mê-xi-cô vào năm 1970) chọn khoá phân loại
của E. B. Shirling và D. Gottlieb làm khoá phân loại chính để phân loại chi
Streptomyces và đặt tên là International Streptomyces Project (ISP). Khoá
phân loại ISP dựa trên các đặc điểm:
- Màu bề mặt khuẩn lạc.
- Bề mặt, hình dạng bào tử.
- Màu khuẩn ty cơ chất.
- Hình dạng chuỗi bào tử.
- Sự tiêu thụ nguồn carbon.
1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces
Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp các loại kháng sinh
• Nhóm aminoglycosid:
Kháng sinh Chủng Streptomyces sinh tổng hợp
Kanamycin

kanamyceticus
Neomycin
fradiae
Tobramycin tenebrarỉus
Streptomycin griseus
Paromomycin rỉmosus
Nhóm tetracyclin:
Kháng sinh Chủng Streptomyces sinh tổng hợp
Oxytetracyclin rimosus
Tetracyclin aureofaciens
Nhóm macrolid:
Kháng sinh
Chủng Streptomyces sinh tổng họrp
Erythromycin erythreus
Oleandomycin antibioticus
Spiramycin ambofaciens
Kháng sinh chống nấm
Kháng sinh
Chủng Streptomyces sinh tổng hợp
Nystatin noursei
Amphotericin B nodosus
Những kháng sinh khác:
Kháng sinh
Chủng Streptomyces sinh tổng hợp
Actinomycin antibioticus
chrysomallus
parallus
Viomycin A,B vinaceus
puniceus
1.3.Cải tạo giống v s v

1.3.1. Mục đích
Các v s v phân lập được từ cơ chất tự nhiên thường có hoạt tính thấp. Vì
vậy, để đạt được hiệu suất cao trong sản xuất công nghiệp, ngoài nghiên cứu
môi trường nuôi cấy và lên men, cần phải cải tạo giống với mục đích sau:
- Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
- Cải tạo các đặc tính lên men: rút ngắn thời gian lên men, tạo ít bọt
- Chỉ sinh tổng hợp một sản phẩm để chiết tách, tinh chế thuận lợi hơn.
- Sinh tổng hợp được sản phẩm mới.
1.3.2. Các phương pháp cải tạo giống [4] [5] [6] [9]
• Đột biến tự phát:
Trong tự nhiên, tất cả các v s v đều chịu sự phát sinh đột biến tự phát
với tần số đột biến khác nhau, cần chọn lấy các cá thể có đặc tính sinh tổng
hợp kháng sinh tốt nhất để nghiên cứu.
• Đột biến nhân tạo:
Đột biến nhân tạo là đột biến xuất hiện dưới tác dụng của các tác nhân
gây đột biến (tia X, ánh sáng uv , HN0 2 )- Tác nhân gây đột biến là nhân tố
làm tăng tần số đột biến (từ 10 - 100.000 lần) Các tác nhân trên khi sử dụng
với liều lượng thích hợp sẽ giết chết hầu hết các v sv , những cá thể sống sót
sẽ có sự biến đổi ở nhiễm sắc thể, làm thay đổi tính trạng dẫn đến làm mất khả
năng tạo kháng sinh (đột biến âm tính) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp
kháng sinh (đột biến dương tính).
- Tác nhân đột biến là tia tử ngoại
Khi chiếu ánh sáng u v, ADN là một trong những thành phần
mẫn cảm nhất. Dưới tác dụng của ánh sáng u v , trong phân tử cytosine, liên
kết c= c của mạch vòng gắn thêm phân tử nước. Còn trong phân tử thymine,
liên kết c= c của mạch vòng bị đứt, nối 2 phân tử thymine tạo thymine
dimer.Sau khi chiếu ánh sáng u v lên tế bào, nếu để ngoài ánh sáng thường thì
xảy ra hiện tượng quang phục hoạt làm quá trình đột biến không có ý nghĩa.
Ngoài ra, các yếu tố nhiệt độ, pH, thành phần môi trường nuôi cấy,
trạng thái sinh lý của v sv cũng ảnh hướng đến hiệu quả đột biến của ánh

sáng u v.
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh [6] [7] [9] [10]
Lên men sinh tổng hợp kháng sinh là quá trình nuôi cấy v sv trong môi
trường dinh dưõng. Điều kiện lên men quyết định hiệu suất của sinh tổng hợp
kháng sinh. Vì vậy, cần nghiên cứu tối ưu hoá để lựa chọn nhiệt độ, áp suất
trong, thời gian, tốc độ khuấy thích hợp. Có hai kiểu lên men tuỳ theo vị trí
phát triển của v sv trong môi trường nuôi cấy.
1.4.1. Lên men bề mặt:
Lên men bề mặt là kiểu lên men mà v sv phát triển trên bề mặt môi
trưòỉng. v sv hấp thụ các chất dinh dưõfng, sử dụng oxy không khí để hô hấp.
Vì vậy, bề mặt của môi trường phải rộng, lớp môi trường không quá sâu (5 -
lOcm), ưu điểm của lên men bề mặt là đơn giản, dễ thực hiện. Tuy nhiên, do
hiệu suất thấp nên chỉ áp dụng phương pháp này trong nghiên cứu cải tạo
giống trong phòng thí nghiệm.
1.4.2. Lên men chìm:
• Đặc điểm:
Lên men chìm là kiểu lên men mà v s v phát triển trong không gian ba
chiều của môi trường lỏng.
Hình 3 giới thiệu sơ đồ lên men chìm.
Hình 3: Sơ đồ quá trình lên men chìm
Giống v sv dùng trong quá trình lên men phải là các tế bào sinh dưỡng
đang ở giai đoạn phát triển mạnh và có khả năng đồng hoá vật chất cao nhất.
Vì vậy, trước khi lên men phải có giai đoạn tạo giống. Giống v sv được tạo ra
qua các cấp nhân giống kế tiếp nhau.
Giống cấp 1: Nuôi cấy trong bình nón 500ml, trên máy lắc.
Giống cấp 2: Nuối cấy trong bình 501.
Giống cấp 3: Nuôi cấy trong bình 1 - 5m^.
Tỷ lệ giống trong môi trường lên men: 1 - 10%. Qui mô giống phụ
thuộc vào qui mô của bình lên men.
ưu điểm của lên men chìm: Hiệu suất sinh kháng sinh cao, sử dụng

triệt để môi trường dinh dưỡng, thiết bị lên men dễ cơ giới hoá, tự động hoá,
tiết kiệm mặt bằng và tốn ít nhân công.
Nhược điểm: Yêu cầu phải có thiết bị chuyên dùng do đó chi phí đầu tư
lớn.
• Phân loai:
* Lên men gián đoạn:
Lên men gián đoạn là một quá trình kín. Trong thời gian lên men,
không có bất cứ một tác động nào ngoại trừ việc cung cấp oxy, chất phá bọt,
điều chỉnh pH. Trong lên men gián đoạn, v sv phát triển qua bốn pha: pha
tiềm tàng, pha luỹ thừa, pha dừng, và pha suy tàn, Trong công nghiệp, quá
trình lên men kết thúc phụ thuộc vào việc sinh tổng hợp hoạt chất dừng lại ở
pha nào trong chu kỳ sinh trưcmg của vsv , hoặc khi việc sinh tổng hợp hoạt
chất đã bị chậm lại, nếu tiếp tục lên men sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế.
* Lên men có bổ sung’.
Nồng độ cao của một số chất (glucose, các hợp chất nitơ ) ức chế việc
tạo ra sản phẩm trao đổi thứ cấp trong quáttình trao đổi chất. Vì vậy, trong
phương pháp bổ sung, khi bắt đầu lên men, các thành phần đó được đưa vào
vói nồng độ thấp và được bổ sung vào trong hệ thống trong quá trình lên men.
1.5. Tách chiết và tinh chế [2] [3] [6] [7] [8] [9] [10]
Kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp, do đó kết thúc quá trình lên
men, kháng sinh có thể nằm trong sinh khối hoặc trong dịch lên men, vì vậy
phải chiết tách để lấy kháng sinh.
Hai phương pháp tách hay được dùng để tách hỗn hợp đồng nhất:
• Phương pháp chia cắt pha: là phương pháp đi từ một hỗn hợp đồng nhất
(một pha) tách thành hỗn hợp không đồng nhất (hai pha)
• Phương pháp chuyển pha: dùng một dung môi hoặc hệ dung môi thích
hợp để chuyển một chất từ pha này sang pha khác. Trong nhóm này
phưofng pháp chiết và phưoíng pháp sắc ký hay được sử dụng.
* Phương pháp chiết:
- Nguyên tắc: Dựa vào sự khác biệt hệ số phân bố của chất tan

trong hai pha không đồng tan.
- Phân loại:
+ Chiết đơn (chiết một lần).
+ Chiết lặp (chiết nhiều lần).
+ Chiết ngược dòng.
* Phương pháp sắc ký:
Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành
phần trong một hỗn hợp. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau
của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau:
pha tĩnh và pha động.
1.6. Một số thành tựu trong nghiên cứu kháng sinh [13] [14] [15]
1.6.1. Kháng sinh mới: Kháng sinh actinohivin chống H N từ xạ khuẩn
Glycoprotein gp 120/gp41 của HIV-1 khi liên kết với các thụ thể của tế
bào sẽ tạo thành cầu nối trung gian cho sự dung hợp giữa virus và màng tế
bào. Actinohivin là một kháng sinh có cấu trúc protein gồml 14 acid amin, cấu
trúc gấp nếp 3 đoạn. Mô hình thử là các dòng tế bào tái tổ hợp: HeLa/T-
env/Tat và HeLa/CD4/Lac-Z cho hình thành hợp bào dòng T; HeLa/M-env-
Tat và H0S/CD4/CCR%/Lac-Z cho hình thành dòng hợp bào M. Khi nuôi cấy
chung các dòng tế bào này, sự hình thành hợp bào xảy ra sau 8 h và tăng dần
cho đến 30h. Actinohivin ức chế sự hình thành hợp bào T & M với nồng độ ức
chế 50% IC 50 tương ứng là 60 và 700 nM. Hơn nữa, actinohivin còn thể hiện
hoạt tính kháng HIV mạnh đối với các chủng HIV-1 T & M và HIV-2 với IC
50 =2-1 lOnM. Actinihivin có khả năng liên kết với chuỗi saccarit của nhiều
glycoprotein khác nhau. Để xác định tính đặc hiệu của liên kết actinohivin và
carbohydrat, tiến hành kiểm tra với nhiều glycoprotein có số liên kết nitơ khác
nhau bằng phưoíng pháp phân tích ELISA. Kết quả là actinohivin có ái lực với
các glycoprotein có nhiều oligosacarit. Những nghiên cứu này cung cấp nhiều
thông tin qúy báu cho liệu pháp chữa trị cũng như cho những nghiên cứu tiếp
theo để từng bước khống chế căn bệnh thế kỷ này.
1.6.2 Kháng sinh adrỉamycin, 14 hydroxyl daunomycin kháng u từ chủng

Str. peucetius var. caesỉus
Daunomycin là 1 kháng sinh thuộc nhóm anthracyclin được chiết từ môi
trường nuôi cấy Streptomyces peucetius. Cấu trúc của daunomycin là một a-
glycosid của daunozamin và daunomicinon (có 4 vòng là dẫn chất có màu của
anthraquinon). Daunomycin được chỉ định trong bệnh bạch cầu cấp tính, đặc
biệt là ở trẻ em. Chủng sinh tổng hợp daunomycin Streptomyces peucetius có
đặc điểm: khuẩn ty khí sinh phát triển yếu, có màu trắng hoặc đỏ; khuẩn ty cơ
chất màu vàng chanh, vàng da cam hoặc nâu đỏ; khi nuôi cấy trên môi trường
hữu cơ hình thành sắc tố màu đỏ sáng. Khi đột biến bằng tác nhân N-nitroso-
N- methyl urethan tạo được biến chủng caesius có khuẩn ty khí sinh phát triển
mạnh, màu xanh xám; khuẩn ty cơ chất màu đỏ sẫm; sắc tố hoà tan từ màu
vàng đến cam hay tím. Biến chủng này có khả năng sinh tổng họfp một hợp
chất mới có cấu trúc gần giống daunomycin đó là adriamycin.
Adriamycin là một kháng sinh nội bào, quá trình tách chiết bao gồm chiết
bằng dung môi, sắc ký cột cellulose và kết tinh dưới dạng hydroclorid.
Adriamycin hydroclorid tan trong nước, ethanol không tan trong dung môi
hữu cơ không phân cực, dung dịch adriamycin có màu da cam ở pH acid, da
cam đỏ ở pH trung tính, tím xanh ở pH > 9. Khi thuỷ phân adriamycin bằng
acid yếu (HCl 0,1N ở 100°c trong 15 phút), thì thu được aglycon là
adriamycinon và một đường amin. Những nghiên cứu hoá trị liệu cho thấy,
adriamycin kìm hãm sự phát triển của ung thư biểu mô, có khả năng ức chế
mạnh sacom và ung thư tuỷ ác tính Oberling - Guerin - Guerin. Chỉ số điều trị
của adriamycin có nhiều triển vọng hơn của daunomycin.
1.6.3. Phương pháp nâng cấp trong sản xuất Milbemycin:
Milbemycin là một kháng sinh thuộc nhóm macrolid có tác dụng trên
hầu hết các loại giun, đặc biệt trên giun chỉ. Được chiết từ môi trường nuôi
cấy Streptomyces hygrocopicus subsp. aurecolacrimosus. Quá trình sinh tổng
hợp milbemycin bị ảnh hưcmg bỏd các yếu tố; oxy hoà tan (DO); độ nhớt môi
trường, sinh khối, khả năng tiêu thụ carbon .Các thông số vật lý: nhiệt độ (T),
áp suất (I), tốc độ khuấy (A), cấp khí (E) ảnh hưởng đến DO và hiệu suất sinh

tổng hợp kháng sinh. Để nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số vật lý đến
hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh, sử dụng sáu phưomg pháp: CMA (thay đổi
A); CMB (thay đổi lần lượt E, A); CMC (thay đổi lần lượt T, I, E, A); CMD
(thay đổi lần lượt T, E, A, I); CME (thay đổi lần lượt I, T, E, A); CMF (thay
đổi lần lượt I, E, A, T) để kiểm soát DO.
Kết quả áp dụng các phương pháp so với phương pháp CMA trên qui
mô lên men phòng thí nghiệm và công nghiệp cho thấy phương pháp CMF
cho kết quả tốt nhất nên CMF được áp dụng vào qui mô công nghiệp.
Phần 2
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
■ ■
2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu:
• Chủng xạ khuẩn:
Chủng Streptomyces 324 do phòng thí nghiệm Vi sinh - Kháng sinh Bộ
môn Công nghiệp Dược,Trường đại học Dược Hà nội cung cấp.
• Giống vi sinh vật kiểm định:
Giống v s v kiểm định do Bộ môn Công nghiệp Dược cung cấp
- Vi khuẩn Gram(-):
Escherichia coli ATCC25922 (EC)
Proteus mirabilis BV 108 (Pro)
Shigella flexneri D T 112 (Shi)
Salmonella typhi DT 220 (Sal)
Pseudomonas aeruginosa VM201 (Pseu)
- Vi khuẩn Gram(+):
Staphylococcus aureus ATCC1228 (Sta)
Bacillus pumilus ATCC 10241 (BP)
Bacillus subtilis ATCC6633 (BS)
Bacillus cereus ATCC 9946 (BC)
- Nấm men:

Candida albicans (Cd)
Saccharomyces cerevisiae (Sa)
- Nấm mốc đen:
Aspergillus niger (As)
• Các môi trưòng sử dụng:
Thành phần (%) được ghi ờ bảng 1
ÌO
fi
5*
OX
I
u
y
c
pC
a
pC
f i
/Ç5
i:
H
?
I
2
p
§
<N
(N
ro
o

m
o'
CO
m
o'
m
o
in
o"
CO
rv
CO
o'
m
m
(N
<N
m
m
vn
o
in
o"
m
o'
in
o'
(N
o'
(N

o"
(N
o'
(N
o'
o'
(N
<N
o'
o'
m
o'
CO
o'
(N
rs
(N
o'
!3
'S
§
¥
H
s
H
s
'<§
t
c
/C3

(N
(N
(N
o
Q
(N
o'
(N
o'
(N
ỒỌ
<o-
c
Sể
I
p
o
5
a
<o
00
c
o
u
2
Ü
I
p
<o*
•4-J

o
Ổ
Ç
o
S-
Cu
ò
ẫ
ui
U
ó
05
i
§
in
o"
U-)
vn
c5
(N
O
o
(N
VO
r-"
I
rs
s
(N
r-"

ò
(N
K
i
o
r-"
o
o"
Q
O
o
o"
o
Q
in
in
CN
o
Q
Q
Q
(N
r-"
I
(N
(N
O
o
O
o

<N
r-*
(N
I
00
_#N
vo
(N
Ọ
Q
00
O
o
O
o
<N
O
rv
o,
œ
t
ể
/D
|£
£
(N
PÜ
r-
ế
6b

g
(D
o
U
'i
Ể
+ Môi trưcmg Sabouraud: Glucose 2%, peptonl%, nước vđ lOOml,
pH 6,0 - 6,5.
+ Môi trường Sabouraud đặc: Glucose 2%, peptonl%, thạch 1,8%,
nước vđ lOOml, pH 6,0 - 6,5.
+Môi trường phân loại theo ISP(ký hiệu từ môi trường ISPl đến ISP9)
Muối vi lượng: FeS04.7H2Ơ 0,lg; MnCl2 .4H2O 0,lg; ZnS04.7H2Ơ
0,lg; nước cất l.OOOml; pH = 7,0 - 7,2.
-ISPl: Tryptone 5,0g; cao nấm men 3,0g; nước cất l.OOOml
-ISP2: Cao nấm men 4,0g; dịch chiết Malt 10,Og; glucose 4,0g; nước
cất l.OOOml; pH = 7,3; thạch 20,Og.
-ISP3: Yến mạch 20,Og; thạch 18,Og; nước l.OOOml; pH = 7,2.
-ISP4: Tinh bột 10,Og; K2HPO4 l,Og; MgS04.7H2Ơ l,Og; NaCl l,Og;
(NỈỈ4)2S0 4 2,0g; CaCOj 2,0g; dung dịch muối vi lượngl,Oml; thạch 20,0g;
nước cất l.OOOml; pH 7,0 - 7,4.
-ISP5: L-asparagine l,Og; glycerin 10,Og; K2HPO4 l,Og; dung dịch
muối vi lượng l,Oml; thạch 20,0g; nước cất l.OOOml; pH = 7,0 - 7,4
-ISP6 :
+Dung dịch A: Pepton 30g; acid citric 0,384g; FeS0 4 .7 íỈ2 0 0,556g;
NH4OH 25% 0,264g; Na2S2Ơ3 lOml; K2HPO4 Ig; nước cất l.OOOml
+ISP6 : Dung dịch A 36,Og; cao nấm men l,Og; nước cất l.OOOml; thạch
15g; pH 7,0-7,2.
-ISP7: Glycerin 15,Og; L-tyrosine 0,5g; L-asparagine l,Og; K2HPO4
0,5g; MgS0 4 .7 H2 0 0,5g; NaCl 0,5g; FeS0 4 .7 H2 0 0,01g; dung dịch muối vi
lượng l,Oml; thạch 20,Og; nước cất l.OOOml; pH = 7,2 - 7,4.

-ISP9:* A: Các nguồn đường đã tiệt trùng:
1. D-Glucose 5. I - inositol
2. Saccarose 6 . D-mannitol
3. D - xylose 7. D - fructose
4. L-arabinose
8.
9.
Rhamnose
Raffinose
ễ i
*B (Dung dịch muối Pridham và Gottlieb): CUSO4.5 H2O 0,64g;
FeS0 4 .7 H2Ơ 0,1 Ig; MnCl2.4 H2 0 0,79g; ZnS0 4 .7 H2Ơ 0,15g; Nước cất
l.OOOml
*c (Môi trường thạch - muối khoáng): (NH4)2S0 4 2,64g; KH2PO4 2,38g;
KH2PO4.3 H2O 5,65g; MgS0 4 .7 H2 0 l,00g; dung dịch muối B l,00ml; thạch
15,Og; nước cất l.OOOml; pH = 6 ,8 - 7,0
*D ISP 9: Môi trường (C) sau khi tiệt trùng để nguội tới 60°c thì cho lần
lượt các nguồn đường vào, sao cho nồng độ đường trong môi trường là 1%.
• Dung môi đã sử dụng:
- Cloroform d = 1,470 - 1,480 t°s = 60 - 62°c.
- Butyl acetat d= 0,880 - 0,885 t V l 17 - 118®c.
- n- Butanol d = 0,810 t®s = 116 - 118®c.
-Ethanol d = 0,789 - 0,791 t°s=78,3°c.
-Ethyl acetat d = 0,902 t°s= 77°c.
-Methanol d = 0,791 - 0,793 t°s= 64,5'^c.
• Vật liệu dùng trong sắc ký:
- Dung môi chạy sắc ký: là các dung môi trên
- Bản mỏng sắc ký: silicagel 60 ^254 ,Merck.
- Thuốc thử hiện màu: dung dịch 10% của H2SO4 98% trong cồn 90°.
• Tác nhân đột biến:

-Ánh sáng u v (Ằ=254nm) nguồn phát Toshiba 60W.
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu.
• Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán:
* Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy
v s v kiểm định. Kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường
thạch sẽ ức chế sự phát triển của v sv kiểm định tạo thành các vòng
vô khuẩn.
* Tiến hành:
- Chuẩn bị môi trường kiểm định:
v s v kiểm định trước khi thử được cấy vào MT7dd (ủ ở 37°c trong 18 -
24h đối với vi khuẩn) và môi trường Sabouraud ( ủ cấy ở 30°c trong 18 - 24h
đối với nấm men ). Sau đó chuẩn bị nhũ dịch v sv kiểm định có nồng độ 10® -
10^ tế bào/ml. Nhũ dịch v s v kiểm định được cho vào MT7 (đối với vi khuẩn),
và môi trường Sabouraud đặc (đối với vi nấm) với tỷ lệ V:V = 2,5 :100. Lắc
đều. Đổ vào các đĩa Petri với thể tích 20ml/l đĩa,
- Đưa mẫu thử vào môi trưcmg kiểm định:
Có ba cách đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định: đặt khoanh giấy
lọc, đục lỗ thạch, đặt khối thạch,
+ Đặt khoanh giấy lọc; khoanh giấy lọc (đường kính 6 mm) đã
tẩm kháng sinh được đặt lên bề mặt môi trường kiểm định.
+ Đục lỗ thạch: nhỏ mẫu thử (dịch lên men hoặc dịch chiết nước)
vào các lỗ đã được đục trên môi trường kiểm định.
+ Đặt khối thạch: đặt khối thạch có chứa kháng sinh lên bề mặt
môi trưòfng kiểm định.
- Nuôi cấy: các đĩa Petri có mẫu thử được nuôi cấy ở nhiệt độ 37*^c
(đốivới vi khuẩn) hoặc 30°c (đối với vi nấm) trong 18 - 24 giờ.
Mỗi mẫu được thử trên 3 đĩa đối với một loại v sv . Đo đường kính
vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Pamer có độ chính xác 0,02mm. Kết quả được
đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn , xử lý theo công thức:
Ẻ A

izl

s = \ ^


n \ n-\

5 =
n
Với: Dị là các đường kính vòng vô khuẩn đo được.
D là đường kính vòng vô khuẩn trung bình,
n là số thí nghiệm song song,
s là sai số chuẩn có hiệu chỉnh.