Khoá luận tốt nghiệp bước đầu nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống lan đai châu đỏ (rhynchostylis gigantea) bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN
PHAN THỊ HIÈN LƯƠNG
“BƯỚC ĐÀU NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN
NHANH GIỐNG LAN ĐAI CHÂU ĐỎ
(RHYNCHOSTYLIS GIGANTEA) BẰNG CÔNG NGHỆ
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO”
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC • • • •
Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC
Hà Nội, 2015
Trong suốt quá trình tìm hiểu và nghiên cứu khóa luận, nhận được sự giúp
đỡ, chỉ bảo tận tình của Th.s Phan Thị Thu Hiền và TS. Nguyễn Như Toản,
em đã từng bước tiến hành nghiên cứu khóa luận này với đề tài “Bước đầu
nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống lan Đai châu đỏ (Rhynchostylỉs gigantea) bằng
công nghệ nuôi cấy mô tế bào”.
Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Th.s Phan Thị Thu Hiền và T.s Nguyễn
Như Toản. Các thầy cô trong tổ di truyền của Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã tạo
điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng em xin được chân thành gửi lời cảm ơn tới gia đình, tập thể, bạn bè, những
người đã động viên, giúp đỡ tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá
trình thực hiện đề tài.
Một lần nữa, em xin được chân thành cảm ơn tất cả!
Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên
Phan Thị Hiền Lưong
Để đảm bảo tính trung thực của khóa luận, tôi xin cam đoan:
Khóa luận “Bước đầu nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống lan Đai châu đỏ
(Rhynchostylis gigantea)” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự
hướng dẫn của ThS. Phan Thị Thu Hiền và TS. Nguyễn Như Toản. Các kết quả trình bày
trong khóa luận là trung thực và chưa được công bố ttong bất kỳ công trình nào trước đây.
LỜI CẢM
ƠN
Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Phan Thị Hiền Lương
CÁC CHỬ VIẾT TẤT TRONG LUẬN VĂN
BAP : 6-Benzyl Amino Purin
Cs : Cộng sự
NN : Nhân nhanh
NAA : Naphythyl Acetic Acid
MS : Murashige và Skoog
THT : Than hoạt tính
TR : Tạo rễ
IBA : 3-Indol Butyric Acid
2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxy Acetic Acid
LỜI CAM
ĐOAN
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cây hoa Lan (Orchidaceae) là một giống cây cảnh được nhiều người ưa
chuộng, không những bỏi yẻ đẹp quý phái của chúng, mà còn bỏi công dụng
chữa bệnh của một số giống. Nghề trồng lan cũng đem lại lợi nhuận khá cao.
Ngày nay Phong lan đã được xuất khẩu và lưu thông như một ngành
thương mại và nhanh chóng lan rộng trên phạm vi toàn thế giới. Nên việc
trồng hoa lan đã đem lại hiệu quả kinh tế thiết thực và đã thu hút được nhiều
người tham gia.
Trên thế giói chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) có khoảng 1400 loài, chủ
yếu phân bố ở Đông Nam Á và các đảo thuộc Philippine, Malaysia, Indonesia,
Papua New Guinea, Đông Bắc Australia. Ở Việt Nam có 107 loài và 1 thứ,
phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven biển
[20] . Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân khác nhau, đến nay nhiều loài
đã bị tuyệt chủng hoặc bị đe dọa. Một số loài nằm trong danh mục Đỏ
của “Sách đỏ Việt Nam”, trong đó có loài lan Thạch hộc (Dendrobium
nobỉle Lỉndl) phân bố ở vùng trung du miền núi phía Bắc Việt Nam

[11]. Để bảo tồn và phát triển loài lan quý hiếm này, không còn cách
nào khác là phải tiến hành nhân giống và nuôi ttồng chúng ở quy mô
lớn. Nguyễn Tiến Bân, 2007, [2], Dương Đức Huyến, 2007,[11].
Dựa ừên cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi đã
tiến hành nghiên cứu xây dựng và phát triển quy trình
nhân nhanh giống lan Đai châu đỏ. Giống lan Đai châu đỏ
có tên khoa học: (Rhynchostylỉs gigantea), thuộc họ: Phong lan
(Orchidaceac). Lan Đai châu đỏ có nguồn gốc từ miền tây nam
Trung Quốc - là cây thân thảo, có thể trồng ở ngoài trời
và cả trong bóng râm làm cây cảnh hoa. Cuống hoa mọc từ
Cây lan Đai châu đỏ ưa thích khí hậu
4
nóng ẩm, yêu cầu ánh nắng đày đủ, tuy nhiên càn đặt cây vào nơi mát mẻ vào
mùa hè. Cây lan Đai châu đỏ thích hợp trồng khắp mọi nơi.
Giống lan Đai châu đỏ phân bố ngày càng hẹp, vì vậy cần nhân nhanh để
lưu trữ nguồn gen, phục vụ cho sản xuất đáp ứng nhu cầu thị hiếu của con
người.
Xuất phát tò những lý do trên tôi tiến hành thực hiện đề tài “Bước đầu
nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống lan Đai châu đỏ (Rhynchostylis
gigantea) bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào”.
2. Muc tiêu của đề tài
Nhân nhanh thành công giống lan Đai châu đỏ (Rhynchostylis gigantea)
bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào.
3. Ý nghĩa
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu sẽ đưa ra được một biện pháp kỹ thuật nhân giống hoa
lan Đai châu đỏ bằng phương pháp in vitro. Đánh giá được tác động của một
số chất điều tiết sinh trưởng trong nhân giống hoa lan Đai châu.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sản xuất được cây con sinh trưởng phát triển tốt, đồng đều và sạch bệnh

vói khối lượng lớn, kịp thời phục yụ cho sản xuất. Thuận lọi cho việc áp dụng
các biện pháp kỹ thuật trong giai đoạn sản xuất hoa thực phẩm, từ đó kích
thích sản xuất hoa phát triển.
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Nguồn gốc xuất xứ, ví trí và phân loại của cây hoa lan
1.1. Nguồn gốc và vị trí phân loài
5
1.1.1. Nguồn gốc
Từ thời cổ xưa con người đã sớm thưởng thức cái đẹp của thiên nhiên.
Hoa đã đi vào cuộc sống như một nét đẹp không thể thiếu trong các ngày lễ
tết, hội hè, đình đám, trang hoàng nhà cửa
Ngày nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã hội, nhu cầu về
hoa trên thế giới nói chung và cả nước ta nói riêng tăng nhanh hơn bao giờ hết,
hoa tươi trở thành loại sản phẩm mang lại giá trị kinh tế cao và chiếm vị trí đặc
biệt trong thị trường hàng hóa nông nghiệp trên thế giới. Thị trường hoa tươi
tập trung ở các nước có nền công nghiệp phát triển cao: Hà Lan; Pháp; Anh;
Nhật; Ý; Mỹ
Cây hoa lan (Orchidaceae) được biết đến đầu tiên ở Phương Đông, nói
về hoa lan là phải nói đến người Trung Hoa, họ đã biết về lan vào khoảng
2500 năm về trước tức là thời đại của Đức Khổng Tử (551 - 479 TCN).
Theo tác giả Bretchacidon thì từ đòi vua Thần Nông (2800 TCN) một số loài
lan rừng này đã được dùng để làm thuốc chữa bệnh. Chính vẻ đẹp kiêu sa và
hương thơm quyến rũ của nó kết hợp với công dụng chữa bệnh nên loài hoa
này đã nhanh chóng xuất hiện ở Châu Âu. Pharatus (376 - 285 TCN) được coi
là cha đẻ của ngành lan học, vì ông là người đầu tiên dùng từ Orchids để chỉ 1
loài hoa lan củ tròn. Sau đó là Linrieatis (1707 - 1778) và Bron (1773 - 1858)
là những người đầu tiên phân biệt rõ ràng họ lan với các họ thực vật khác.
Nhưng người đặt nền tảng cho môn học về hoa lan là Joanlind (1779 - 1858).
Vào năm 1936 ông đã công bố tài liệu (A Tabules View of the tubes of
orchidea) để sắp xếp loài và chi họ lan. Tên họ lan do ông đưa ra vẫn dùng cho

đến ngày nay [9].
Ở Việt Nam nghiên cứu về lan ở buổi đầu chưa được rõ rệt. Người ta
không biết chính xác nhưng có lẽ người đầu tiên khảo sát về lan là người tuyên
6
giáo Bồ Đào Nha Joanisde Lourceiro, ông đã mô tả cây lan Việt Nam trong
cuốn “Flora de cochinchinensis” (1789), chỉ sau khi người Pháp đến Việt Nam
thì mới có những công trình nghiên cứu công bố đáng kể là Guillaumin, tác giả
đã mô tả 101 chi gồm 750 loài lan cho cả 3 nước Đông Dương trong bộ “Thực
vật chí Đông Dương” do Lecomle chủ biên, xuất bản từ năm 1932 - 1934 theo
Phạm Hoàng Hổ (1999). Ở Việt Nam có tới 755 loài lan [7].
1.1.2. Phân loai
thưc vât • • •
Qua quá trình nghiên cứu và phân loại trong hệ thống phân loại thực vật,
cây hoa lan thuộc:
Giới: Thực vật (Plantae)
Ngành: Hạt kín (Mangoliophvaatjh)
Lớp: Một lá mầm (Monocotyledoneae)
Bộ: Măng tây (Asparagales)
Họ: Phong lan (Orchỉdaceae)
Chi: Hoàng thảo (Dendrobium). [21]
Theo những nghiên cứu trước đây họ phong lan được chia làm 3 họ phụ.
Tuy nhiên những phân tích gần đây nhất cho thấy có thêm 3 họ phụ của họ
phong lan. Vậy đến nay họ Phong lan chia thành 6 họ phụ: Apostasỉscỉdeae;
Orchỉdadae; Cypripedicidea; Epỉdendroideae; Neotrìcideae và Vandoỉdeae.
7
Theo thống kê sơ bộ mới đây của giáo sư Leonid V.A very anov thì ở Việt
Nam có khoảng 152 chi, 897 loài. Với số lượng như vậy cũng đã cho ta thấy
sự phong phú của họ lan ở Việt Nam. Trong công tác chọn giống cây
trồng,việc phân loại các đơn vị dưới loài là rất quan trọng, tuy nhiên công việc
này cũng gặp nhiều khó khăn đối với họ lan.

1.1.3. Giới thiệu chung về lan Đai châu đỏ (Rhynchostylis gigantea)
Lan Đai châu đỏ (Rhỵnchostylis gỉgantea) thường được gọi là Ngọc
điểm đai châu (chuỗi hạt châu) mà người bình dân gọi tắt là đai châu, đuôi
chồn hay gọi là lan me (vì thường mọc trên cây me tại Sài Gòn). Hơn nữa lại
nở vào mùa xuân cho nên có thêm tên gọi là Nghinh Xuân. Cây lan này thường
có 5 - 8 lá dài từ 20 - 30 cm, rộng 4-7 cm, màu xanh vàng có những sọc trắng
và những chấm tím. Cây lớn và khỏe mạnh có thể ra tới 3 - 4 chùm hoa cong
và dài từ 15 - 30 cm, hoa to chừng 3 cm.
Lan Đai châu đỏ (Rhynchostylis gigantea) thuộc Họ Phong lan
(Orchidaceac), bộ Măng tây (Asparagales), lớp Một lá mầm
(Monocotyledoneae). Chúng là những cây thân cứng, lá mọc so le, dày. Các
cây thuộc chi này là nhóm hoa lan đa dạng có hoa đẹp với đầy đủ các màu sắc
và hương thơm Dù rằng Bulbophyllum (Lan Lọng) là một loài lớn nhất trong
họ hoa lan nhưng luận về hương sắc có lẽ Dendrobium vẫn vượt trội hơn
nhiều.
8
Hình 1.2 Cây lan Đai châu đỏ (Rhynchostylừ gỉgantea)
9
1
0
1.2. Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác của giống lan đai châu đỏ
1.2.1. Gui trị sử dụng của hoa lan
Xét về phương diện thẩm mỹ: Từ xưa hoa lan đã được coi là loại hoa
vương giả. Hoa sở dĩ được nhiều người ưa chuộng là bỏi màu sắc hoa thắm
tươi, đủ về cùng với trăm ngàn kiểu dáng hoa khác nhau. Không chỉ thế mà là
từ những bông hoa xinh đẹp đó còn tỏa ra những mùi hương thoang thoảng,
ngọt ngào đã làm ngây ngất lòng người. Khác vói các loài hoa sớm nở tối tàn,
hữu sắc vô hương, hoa lan được xếp vào hàng vương giả cũng bỏi những lí do
riêng của mình. Nếu giữ được đúng nhiệt độ và độ ẩm thì hoa có thể giữ
nguyên hương, nguyên sắc từ 2 tuần lễ cho đến 2 tháng, có những loại đến 4

tháng. Lan thường sống trên các thân cây, cành cây khác nhưng lại không phải
là loài kí sinh ăn hại vì nó không hút chất dinh dưỡng, không gây hại cho cây
mà chỉ mượn cây làm chỗ dựa, nhiều trường họp đem lại lợi ích cho cây mà
chúng bám lên.
Xét về mặt kinh tế, lợi từ vườn lan mang lại cao hơn nhiều lần các loại
cây trồng nông nghiệp khác. Theo thống kê của vụ kế hoạch thuộc Bộ NN &
PTNT nếu trồng lan cắt cành Dendrobium và Mokara thì lha có thể cho doanh
thu 500 triệu - 1 tỷ đồng/ha/năm. Hiện nay trên thế giới, một số nước xuất
khẩu hoa lớn như: Thái Lan, Đài Loan, Hà Lan .đang có xu hướng mở rộng
diện tích các trang trại trồng hoa lan, các quy mô lớn, dự án đầu tư cho ngành
thương mại hoa lan cũng không ngừng gia tăng.
1.2.2. Tĩnh hình nghiên cứu sản xuất hoa lan Đai Châu đỏ trên thế
giói và ở Viêt Nam
I.2.2.I. Tình hình nghiên cứu sản xuất hoa ỉan Đai Châu đỏ ở Việt Nam
1
1
Đất nước ta là một trong hai khu vực xuất phát các loài lan quý trên
thế giới. Do vị trí địa lý mà khí hậu, độ ẩm, nhiệt độ và cường độ ánh sáng của
nước ta thích họp cho sự tăng trưởng và phát triển của cây lan. Khánh
Hòa cũng là một trong những tỉnh có điều kiện tự nhiên để phát triển ngành
trồng lan. Trong quá trình điều tra và nuôi trồng thử nghiệm các loại lan tại
tỉnh Khánh Hòa, người ta nhận thấy lan Đai châu đỏ có khả năng phát triển
thuận lợi về điều kiện tự nhiên, nhưng việc phát triển lan tại tỉnh Khánh Hòa
còn nhiều khỏ khăn: chưa có đơn vị chuyên sâu nghiên cứu Phong lan, chưa
cung cấp được nguồn lan tại chỗ, kỹ thuật chăm sóc còn yếu kém, chưa quan
tâm nhiều đến phân bón và giá thể, chưa có phòng nuôi cấy mô hiện đại, đặc
biệt là rất khó khăn trong khâu nhân giống và chăm sóc, do đó tỷ lệ sống, sinh
trưởng phát triển còn thấp ở thời kỳ vườn ươm. Tại Khánh Hòa việc nhân
giống lan bằng nuôi cấy in vitro chưa được phát triển, giống cây con chủ yếu
nhập từ thành phố Hồ Chí Minh, Đà Lạt do đó giá thành cây con rất cao [28].

Tuy nhiên, hiện nay việc sản xuất hoa lan ở Việt Nam mói chỉ phát triển
mạnh mẽ ở các tỉnh phía Nam. Bên cạnh đó những nghiên cứu về lan cũng
mới chỉ là những nghiên cứu về đặc tính nông sinh học mà chưa có những
nghiên cứu sâu sắc về đặc tính di truyền, biến dị ở mức độ khác nhau như hình
thái hay phân tử.
Kho tàng hoa lan Đai châu đỏ ở Việt Nam và Lâm Đồng, Đà Lạt là cả
một nguồn tài nguyên thiên nhiên gần như vô tận, vói khí hậu mát lạnh trong
sạch, giá thành nuôi trồng hoa lan chỉ bằng 1/5 - 1/10 ở các nước ôn đới. Gần
đây, việc nuôi cấy mô phát triển mạnh số giống mới mang nhiều tính ưu việt
như: đẹp, bền, có giá ttị xuất khẩu mang hiệu quả kinh tế xã hội rất đáng kể.
Nhưng bên cạnh thế mạnh này hoa lan Đai châu đỏ lại rất khó trồng vì thường
hay bị bệnh, năm 2006 có một số vườn nuôi trồng hoa bị thối và chết khoảng
1
2
50%. Đã phát triển kỹ thuật nuôi trồng hoa lan Đai châu đỏ, cần phải chuyển
hướng nuôi ttồng theo công nghiệp trong tương lai là rất cần thiết.
Có thể nói, lĩnh vực kinh doanh lan ở Việt Nam còn rất non trẻ, chỉ mới
thực sự bắt đàu được hơn 10 năm trở lại đây. Theo ông Đồng Văn Khiêm -
Giám đốc công ty phong lan xuất khẩu thành phố Hồ Chí Minh thì khỏ khăn
lớn nhất là nhà nước chưa có chính sách phát triển ngành lan, hơn nữa chính
sách thuế lại không rõ ràng Bên cạnh đó, việc xuất khẩu lan hiện nay còn
qua ủy thác, không tạo được sự chủ động cho nhà sản xuất. Trong thời gian
gần đây, đã có rất nhiều đề tài nhân giống cây Phong Lan, đặc biệt là các cây
lan có giá trị về dược liệu, hay các loài có giá trị kinh tế cao như của tác giả
Nguyễn Quỳnh Trang, 2013 [16]. Nhiều tác giả khác nhân nhanh in vitro với
nguồn nguyên liệu ban đầu là hạt gieo trên môi trường MS + 15% đường
saccarose + 2,0 mg/1 BA (Nguyễn Văn Song, 2011) [19]. Theo Lê Văn
Hoàng, 2008 [8], phương pháp nuôi cấy mô là phương pháp duy nhất có thể
nhân giống lan cho hệ số nhân cao, số lượng cây giống lớn, giá thành hợp lý.
Ở Việt Nam cũng đã có nhiều nhà khoa học quan tâm đến việc thu thập

lưu giữ nghiên cứu nguồn gen hoa lan bản địa và nhập nội. Khuất Hữu Trung
và công sự [17], đã nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn lan Kiếm (C
swarte) của Việt Nam bằng kĩ thuật RAPD, phân tích kết quả phản ứng PCR -
RAPD của 17 giống lan Kiếm ở Việt Nam có 12 mồi Operon khác nhau. Kết
quả đã nhận được tổng số 992 băng đa hình, từ đó đã thiết lập được bằng hệ số
tương đồng di truyền và sơ đồ cây phát sinh chủng loại về mối quan hệ di
truyền của 17 giống lan Kiếm Việt Nam. Dựa trên kết quả phân tích này, 17
giống lan Kiếm Việt Nam được chia làm 5 nhóm khác nhau và dựa vào mức
tương đồng di truyền của chúng.
1
3
Khi nghiên cứu thu thập đánh giá và tuyển chọn một số giống Phong lan
Hoàng thảo (Dendrobium) nhập nội tại miền bắc Việt Nam. Phạm Thị Liên và
công sự (2009) [12] đã thu thập được 6 giống lan Hoàng Thảo, ừong đó có 3
giống có nguồn gốc tại Băng kốc - Thái Lan, 2 giống tại Chiềng Mai và 1
giống tại Chiềng Rai. Các giống đều có năng suất cao, hoa đẹp, hiện nay thị
trường trong và ngoài nước rất ưa chuộng.
Khi nghiên cứu đa dạng di truyền loài lan Hài Đốm (paphiopedilum
concolor pfilzer) bản địa Việt Nam, Khuất Hữu Trung và cộng sự [18] đã nhận
xét: loài lan Hài đốm (paphiopediỉum concolor pfilzer) bản địa Việt Nam rất
đa dạng và phong phú.
Đặng Văn Đông và cộng sự [4] đã điều tra sự phân bố của hoa lan Việt
Nam và lưu giữ, đánh giá một số giống lan quý tại Gia Lâm - Hà Nội. Các tác
giả đã kết luận: “Việt Nam được chia thành 6 vùng lan chính, khác nhau về
tính đa dạng, độc đáo của lan rừng và sinh thái tự nhiên của các loài lan này:
phía Tây Bắc Bộ; phía Đông Bắc Bộ và Trung tâm Bắc Bộ; Bắc Trung Bộ; các
tỉnh Trung Bộ; Tây Nguyên; Nam Trung Bộ và Nam Bộ. Các tác giả đã thu
thập được 1.035 chậu (giò) gồm 50 loài thuộc 17 chi Phong lan, Địa lan Việt
Nam. Nhiều loại hoa lan có khả năng thích ứng tốt với điều kiện khí hậu tại
Tam Đảo - Vĩnh phúc (Đai châu, Phi Điệp ).

Phạm Thị Kim Hạnh và cộng sự (2008) đã nghiên cứu nhân nhanh in
vitro loài lan Đai Châu (Rhynchostylis gigantea) trong bioreactor và cho kết
quả về tỷ lệ nảy mầm cũng như tốc độ sinh trưởng của cây con in vitro tốt hơn
so với môi trường đặc. Môi trường nuôi cấy là wv bổ sung: vitamin, axit amin
MS bằng phương thức lỏng - bioreactor với các thông số kỹ thuật: nhiệt độ
25°c, lưu lượng không khí 0,5 líưphút, thời gian 45 ngày, chu kì 4 ngày ngập:
1 ngày khô là tốt nhất để tăng tỉ lệ cây con (91,1%), giảm thời gian phát triển
1
4
mầm (5 tuần) đồng thời kích thích sinh trưởng cây con in vitro. Cây con được
cấy chuyển sang môi trường đặc sau 3 tháng đạt được 5,8 lá; 5,2 rễ; dải lá 6,1
cm; rộng lá l,35cm, rễ mập 0,41 cm. Giá thể nuôi cấy ngoài vườn ươm bọt núi
+ than củi + tảo Đài Loan [10].
Năm 2009, Lê Minh Nguyệt và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của
môi trường và chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh và nhân giống
Hoàng lan thuộc chi lan Kiếm (cymbidium). Các tác giả đã khẳng định: môi
trường nhân nhanh bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và
cytokinin có tác dụng tốt tăng hệ số nhân và chất lượng chồi đối với hai giống
lan CD5 và CD9. Môi trường cho hệ số nhân và chất lượng chồi cao nhất với
giống CD5 là môi trường cơ bản MS bổ sung lmg/1 BAP và 0,3 mg/1 NAA.
Môi trường tốt nhất đối với giống CD9 là môi trường cơ bản MS bổ sung
lmg/1 BAP và 0,5 mg/1 NAA. Các chất điều hòa sinh trưởng IBA, kinetin bổ
sung riêng rẽ hay tổ hợp với các môi trường MS có bổ sung BAP và NAA.
Các chất có ttong các sản phẩm tự nhiên ở nước ta như chuối xanh, nước dừa
có thể bổ sung để tăng hiệu quả môi trường và tiết kiệm chi phí khi nhân giống
hoa lan. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh tốt nhất cho CD5 và CD9 là môi
trường MS bổ sung 1,0 g/1 than hoạt tính và 0,5 mg/1 NAA, tạo số rễ nhiều
nhất và chất lượng rễ tốt nhất. Giá thể tốt nhất để ra cây con sau giai đoạn in
vitro là dớn đối với cả 2 giống CD5 và CD9. Tuy nhiên có thể dùng hỗn hợp
rong biển và xơ dừa với tỷ lệ 1:1 YÌ tỷ lệ sống của giá thể hỗn hợp này cũng

khá cao, nhằm giảm chi phí giá thể trong nhân giống [15].
Võ Hà Giang, Ngô Xuân Bình, nghiên cứu nhân giống phong lan Đuôi
chồn (Rhynchotylỉs rotunda (L.) Blume) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế
bào. Các tác giả đã nghiên cứu môi trường gieo hạt và nhân chồi cho thấy, khi
bổ sung 0,3 mg/lit BAP và kinetin 0,1 mg/1 cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất đạt
1
5
86,67%, bổ sung phối hợp kinetin và BAP cho hiệu quả cao nhất ở nồng độ
0,5 mg kinetin/1 và 0,3 mg/1 BAP hệ số nhân chồi đạt 5 - 6 chồi và 5,7
chồi/cụm [5].
Theo Vũ Ngọc Lan và cộng sự (2010) đã nghiên cứu ảnh hưởng của giá
thể ttồng đến quá trình sinh trưởng của lan Hoàng thảo trúc đen (D.
Hancockỉỉ) trên 3 loại giá thể: gỗ nhãn, than củi, xơ dừa. Kết quả cho thấy, giá
thể gỗ nhãn có hiệu quả nhất đến giai đoạn sinh trưởng của cây lan này
[13].
Nhận xét chung:
Ở Việt Nam đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu về điều tra, thu
thập, lưu giữ và phát triển hoa lan. Tuy nhiên việc nghiên cứu chỉ tập trung
chủ yếu vào một số giống lan công nghiệp như Hồ Điệp, Vũ Nữ, Mokara,
Cattleya Còn về lan rừng, đặc biệt với các loài lan đặc hữu thì các nghiên cứu
về giống chưa nhiều.
7.2.2.2. Ngoài nước
Trên thế giới, có rất nhiều công trình nghiên cứu về nhân nhanh các
giống lan nhằm bảo tồn và tăng số lượng phục vụ sản xuất. Điển hình như
Kusumoto and Furukawa (1977) [25], Shu Fung Lo et a/.,(2004) [27], Kauth
P.(2005),Tawaro Supavadee et «/.,(2008) [28]. Ở Thái Lan có cây Ngọc điểm
với nhiều nhánh đã ra tới 30 chùm hoa. Ngoài ra cây lan ra hoa có nhiều màu
đỏ khác đã tạo ra một giống đỏ tuyền. Những cây lan hoa màu đỏ này, nếu
mùa thu quá nóng, sẽ thành sắc đỏ có pha lẫn trắng. Ngày nay lan đã trở thành
loại hàng hóa rất được ưa chuộng ở nhiều quốc gia trên thế giới. Do đó một số

nước phát triển như: Pháp, Mỹ, Hà Lan,Thái Lan, Trung Quốc đã và đang
ứng dụng những công nghệ tiên tiến vào việc nghiên cứu lai tạo ra các giống
1
6
hoa lan mới có hương thơm và màu sắc đa dạng nhằm đáp ứng nhu cầu ngày
càng cao của thị trường đồng thời cũng nhằm đem lại một nguồn lọi kinh tế
đáng kể cho các nước này.
Trung Quắc: Là nước có truyền thống chơi lan lâu đời, đặc biệt là lan
Kiếm, loài lan này được coi là quốc hoa của Trung Quốc, vì thế họ đã tập
trung đầu tư nghiên cứu nhất là khoảng 20 năm trở lại đây và đã thu đươc
những kết quả rực rỡ. Họ đã sử dụng phương pháp lai hữu tính thụ quả, sau đó
gieo và tuyển chọn cho các loài hoa đáp ứng được màu sắc, kiểu dáng sau đó
họ sử dụng kỹ thuật nhân giống vô tính ỉn vitro và để tạo ra sản phẩm hàng
hóa có giá trị kinh tế cao, giá bán 1 cành hoa khoảng từ 5 - 10 USD.
Singapore: Năm 1987 bắt đầu nghề trồng hoa lan xuất khẩu ttên quy
mô lớn. Nhận thấy được tiềm năng xuất khẩu của loài hoa này trên thế giới. Vì
vậy các trang trại trồng lan đã không ngừng được mở rộng. Năm 1993 quốc
gia này đã xuất khẩu 3,8 triệu cành đến Châu Âu và một số lượng khá lớn đến
thị trường Nhật Bản.
Thái Lan: là nước dẫn đầu thế giới về xuất khẩu lan với tổng thu nhập
chỉ riêng 6 tháng đầu năm 2007, Thái Lan đã được hơn 70,0 triệu USD từ việc
xuất khẩu, diện tích ttồng loại hoa này chiếm hơn 1/3 tổng diện tích các loại
hoa khác. Hoa lan Thái Lan xuất khẩu phần lớn thuộc nhóm lan Dendrobỉum,
hơn 80% lượng hoa thuộc nhóm này trên thị trường thế giới có xuất xứ từ Thái
Lan.
Đài Loan: Diện tích trồng hoa cây cảnh là 12.481 ha, trong đó diện
tích trồng hoa lan là 484 ha. Giá ttị xuất khẩu lan Hồ Điệp của Đài Loan đạt
23,9 triệu USD năm (2004); 27,05 triệu USD năm (2005) và tăng thêm 35,38
triệu USD trong năm 2006 [27].
1

7
Chuơng 2 VÂT LIÊU, PHƯƠNG PHÁP VÀ NÔI DUNG
NGHIÊN CỨU
2.1. Đổi tượng nghiên cứu
* Vật liệu nghiên cứu:Sử dụng quả (có độ tuổi từ 8 - 10 tháng) của cây Đai
châu đỏ khỏe mạnh, thu ở rừng đặc dụng Tam đảo, Vĩnh Phúc.
* Các thiết bị nghiên cứu: panh, kéo, dao cắt, box cấy vô trùng, đèn uv,
cân kĩ thuật, cân phân tích, tủ sấy, hệ thống giàn đèn, nồi hấp tiệt trùng,
máy đo pH
* Hóa chất: Môi trường sử dụng trong nghiên cứu là môi trường MS cơ
bản gồm các muối đa, vi lượng, các hợp chất hữu cơ theo Murashige và
Skoog (1962). Đường saccarose, agar, các chất kích thích sinh trưởng:
BAP, NAA được bổ sung vào môi trường cơ bản theo từng giai đoạn
nuôi cấy.
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Di truyền học,
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
Thời gian: Khóa luận tiến hành từ tháng 10/2013 đến 04/2015.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn để tạo nguồn vật liệu in vitro.
phương pháp khử trùng và cơ quan nuôi cấy
* Phương pháp khử trùng nuôi cấy
- Vật liệu từ quả
1
8
Tất cả các mẫu sau khi thu về làm sạch bằng nước xà phòng và tráng cồn
70°c trong 1 phút trước khi tiến hành khử trùng bằng hóa chất Ca(OCỈ2)2.
Trong quá trình khử trùng tiến hành lắc đều để đảm bảo mẫu cấy được tiếp xúc
với dung dịch khử trùng. Thời gian khử trùng là 10 phút. Với nồng độ 20%,

50%, 100%, thí nghiệm được bố trí theo công thức sau:
CT1: Nồng độ Ca(OCỈ2)2 20% ttong thời gian 10 phút CT2: Nồng độ
Ca(C)Cl2)2 50% ttong thời gian 10 phút CT3: Nồng độ Ca(OCỈ2)2100% trong
thời gian 10 phút Mau cấy sau khi khử trùng được cấy vào các môi trường
dinh dưỡng nuôi cấy MS + 20 g/1 saccarose + 7 g/1 agar.
2.3.1.2. Giai đoạn nhân nhanh
Sau một thời gian nuôi cấy, từ đỉnh sinh trưởng sẽ hình thành nên các
cụm chồi. Khi các cụm chồi đủ lớn, chúng được tách thành từng cụm nhỏ hơn
vói 3 -5chồi/cụm và được cấy vào môi trường nhân nhanh. Môi trường nhân
nhanh được bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và
auxin ở các nồng độ khác nhau để đạt được hệ số nhân nhanh cũng như chất
lượng chồi là tốt nhất. Thành phàn môi trường như sau:
NN1: 0,5 mg/1 BAP + 1 mg/1
NAA NN2: 1,0 mg/1 BAP + 1
mg/1 NAA NN3: 1,5 mg/1 BAP +
1 mg/1 NAA NN4: 2,0 mg/1 BAP
+ 1 mg/1 NAA NN5: 2,5 mg/1
BAP + 1 mg/1 NAA (các công thức
có bổ sung: MS + 30 g/1 saccarose
+ 30 g/1 khoai tây + 10% nước dừa
+ 1 g/ỉ agar).
1
9
2.3.1.3. Giai đoạn tạo rễ
Đây là giai đoạn cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ để chuẩn bị
đem ra vườn ươm. Sau khi xây dựng hệ thống nhân nhanh thànhcông chúng
ta tiến hành khảo sát ảnh hưởng cường độ chiếu sánglên khả năng sinh
trưởng của chồi. Nuôi cấy trong môi trường tạo rễ với các môi trường có bổ
sung than hoạt tính. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA (thuộc nhóm
auxin nhân tạo) lên khả năng tạo rễ của cây lan Đai châu đỏ, được bố trí vói

các thí nghiệm như sau:
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng cường độ chiểu sáng lên khả năng
sinh trưởng chồi.
Ánh sáng trong nuôi cấy mô thực vật là ánh sáng nhân tạo, cường độ ánh
sáng là 1000 - 5000 lux, chu kì chiếu sáng thông thường là 16h chiếu sáng. Để
chồi lan Đai châu đỏ được phát triển hoàn chỉnh thì cần được điều chỉnh
cường độ ánh sáng thích họp. Để tìm hiểu điều này chúng tôi nghiên cứu trên
những dải cường độ ánh sáng khác nhau ttên cùng chu kìchiếu sáng 5 công
thức với 150 mẫu chồi lan được bố trí như sau:
CT1: NN4 ở điều kiện 800 lux
CT2: NN4 ở điều kiện 1300 lux
CT3: NN4 ở điều kiện 1800 lux
CT4: NN4 ở điều kiện 2300 lux
CT5: NN4 ở điều kiện 2800 lux
NN4 là công thức nhân nhanh
tốt nhất, các công thức đều bổ
sung 30 g/1 saccarose + 30 gỉl
2
0
khoai tây + 10% nước dừa + 7
g/l agar).
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAẢ đến khả năng tạo rễ được bổ
trí theo các công thức sau:
TRI: MS + 1 mg/1 NAA TR2: MS + 2
mg/1 NAA TR3: MS + 3 mg/1 NAA TR4:
MS + 4 mg/1 NAA (Các công thức thí
nghiệm đều bổ sung 30g/l khoai tây +10%
nước dừa + 30 g/1 saccarose)
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính (THT)lên khả năng tạo
rễ của giống lan Đai châu đỏ

CT1: TR2 + 0 g/1 THT
CT2: TR2 + 0,5 g/1
THT CT3: TR2 + 1
g/1 THT CT4: TR2 +
1,5 g/1 THT CT5: TR2
+ 2 g/1 THT Nền môi
trường: MS + 30 g/1
saccarose + 30 g/1
khoai tây + 10% nước
dừa + 7 g/1 agar. TR2
là công thức ra rễ bổ
sung chất kích thích tốt
nhất.
2.3.1.4. Giai đoạn ra cây
2
1
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và chất lượng
cây con ngoài vườn ươm của giống lan Đai châu đỏ. Thí nghiệm được tiến
hành trên 3 công thức sau:
CT1: Bột xơ dừa
CT2: Than củi
CT3: Xơ dừa
2.3.2. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007.
2.4. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phương pháp khử trùng tạo vật liệu sạch bệnh bằng nuôi
cấy quả lan.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng nhân
nhanh, ra rễ của lan Đai châu đỏ
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng của cây:

ánh sáng, than hoạt tính,
- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống của cây con lan Đai
châu đỏ.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khử trùng cơ quan nuôi cấy tạo nguồn vật liệu in vitro
Trong tự nhiên các loài lan nhân giống nhờ sinh sản hữu tính qua hạt,
do hạt lan không có nội nhũ nên khả năng nảy mầm rất thấp. Nhiều tác giả
trên thế giới đã sử dụng phương pháp gieo hạt in vitro và đạt tỷ lệ nảy mầm
cao.
2
2
Theo Noel Bernard năm 1909, nhà thực vật người Pháp đã phát hiện
nấm ở rễ cây lan con và sử dụng hạt lan trong nuôi cấy mô, bằng cách này
100% hạt lan nảy mầm. Chính YÌ thế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu cách
khử trùng quả lan làm nguồn yật liệu trong nhân giống in vitro vói giống lan
Đai châu đỏ, các kết quả được thể hiện tại bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Ca(OCh)2 đến tỷ lệ sống
của hạt lan Đai châu đỏ (sau 10 ngày nuôi cấy).
Công
thức
số mẫu ban đàu
Tỷ lệ sống (%)
Tỷ lệ nhiễm và chết(%)
CT1 150 86/150 (57,33%) 65/150 (43,33%)
CT2 150 144/150 (96,00%) 6/150 (4,00%)
CT3 150 131/150 (87,33%) 19/150 (12,67%)
Dựa vào kết quả bảng 3.1, khử trùng ở các nồng độ khác nhau cho hiệu
quả khử trùng khác nhau. Xử lí ở nồng độ dung dịch Ca(OCỈ2)2 thấp (20%)
thì tỷ lệ mẫu nhiễm và chết cao nhất (43,33%); khi tăng nồng độ Ca(OCỈ2)2
lên (50%) tỷ lệ mẫu sống cao đạt cao nhất (96,00%), tỷ lệ mẫu nhiễm và chết

thấp (4,00%). Tuy nhiên khi tiếp tục tăng nồng độ hóa chất lên (100%), thì tỷ
lệ mẫu nhiễm và chết lại tăng lên (12,67%), nguyên nhân của hiện tượng này
do
hóa chất nồng độ cao gây ảnh hưởng đến khả năng sống của mẫu. Qua phân
tích kết quả trên, chúng tôi thấy nồng độ thích hợp để khử trùng mẫu là 50%,
với tỷ lệ mẫu sống là 96,00% (Hình 3.1 A), tỉ lệ nhiễm và chết là 4,00%
2
3
(Hình 3.1 B) . Theo Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Thị Lý Anh sử dụng cồn kết hợp
với HgCl
2
khử trùng quả lan cũng cho kết quả rất tốt, tỷ lệ cây sống đạt 97%
[14]. Tuy nhiên xét về độ an toàn, chúng tôi thấy Ca(OCỈ2)2 an toàn, ít độc hại
hơn.
Hình 3.1: Ảnh hưởng của chất khử trùng lên khả năng nảy mầm của hạt
3.2. Ảnh hưởng của tồ họp BAP và NAA lên khả năng nhân
nhanh của giống lan Đai châu đỏ
Mục tiêu của giai đoạn này là tìm ra môi trường tốt nhất để có được nhiều
chồi nhất trong thòi gian ngắn nhất. Môi trường nuôi cấy được bổ sung vào
các hợp chất cytokinin kết hợp với auxin với nồng độ khác nhau để kích thích
sự nhân nhanh chồi. Chúng tôi tiến hành các thí nghiệm có sự phối họp các
chất điều tiết sinh trưởng, nhằm tìm ra công thức tối ưu nhất đối với khả năng
nhân nhanh và chất lượng chồi của loài lan.Trong nghiên cứu này chúng tôi
dùng tổ họp BAP và NAA để cho ra kết quả tốt nhất, kết quả cho thấy sau 40
2
4
A. Hạt nảy mầm B. Hạt bị nhiễm
ngày cấy, các chồi đều có khả năng nhân nhanh, môi trường có bổ sung 2 chất
kích thích sinh trưởng (bảng 3.2).
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của tổ họp BAP, NAA đến khả năng nhân nhanh

của giống lan Đai châu đỏ bằng in vỉtro.
Công thức Số chồi ban đầu Số chồi sau 40 ngày cấy
Sô chôi Hê sô nhân ■
NN1 150 359 2,39
NN2 150 372 2,48
NN3 150 413 2,75
NN4 150 504 3,36
NN5 150 302 2,01
Qua bảng 3.2 chúng tôi nhận thấy, khi tăng dần nồng độ BAP kết hợp
với nồng độ NAA thì ta thấy hệ số nhân chồi tăng dần từ (2,39 - 3,36 chồi),
mẫu có số chồi mói tạo thành/số chồi ban đầu khá cao (số chồi mới tạo
thành/chồi ban đầu cao nhất ở CT4 có bổ sung 2 mg/1 BAP và 1 mg/1 NAA
đạt 504 chồi, hệ số nhân lớn nhất đạt 3,36 chồi các chồi mập, khỏe, sinh
trưởng mạnh và dễ tách rời nhau. Nhưng khi bổ sung 2,5 mg/1 BAP và 1 mg/1
NAA thì hệ số nhân lại giảm (hệ số nhân giảm chỉ còn 2,01 chồi). Điều này
chứng tỏ rằng, do nồng độ chất kích thích cao sẽ ức chế sinh trưởng của chồi.
Ket quả của chúng tôi thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của Kalimuthu và cs
(2006) trên Oncỉdỉum sp. Và kết quả của Anjum và cs (2006) khi nghiên cứu
trên D.Malones môi trường có bổ sung 1,5 mg/1 BAP và lmg/1 NAA sau
25 ngày hệ số đạt được 3,66 lần, nhưng chồi nhỏ và yếu.
2
5