Nghiên cứu tác động của nồng độ nacl tới sinh trưởng mầm và hoạt độ một số emzym chống oxy hóa ở hạt mầm đậu tương (glycine max (l) merr)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

PHẠM THANH DUNG

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG
CỦA NỒNG ĐỘ NACL TỚI SINH TRƢỞNG MẦM
VÀ HOẠT ĐỘ MỘT SỐ EMZYM
CHỐNG OXY HÓA Ở HẠT MẦM ĐẬU TƢƠNG
(GLYCINE MAX ( L).MERR)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2015


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
=======***=======

PHẠM THANH DUNG

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG
CỦA NỒNG ĐỘ NACL TỚI SINH TRƢỞNG MẦM
VÀ HOẠT ĐỘ MỘT SỐ EMZYM
CHỐNG OXY HÓA Ở HẠT MẦM ĐẬU TƢƠNG
(GLYCINE MAX ( L).MERR)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

PGS. TS. NGUYỄN VĂN MÃ

HÀ NỘI, 2015


LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn, sự kính trọng sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS.
Nguyễn Văn Mã đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực
hiện và hoàn thành bản khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Khoa Sinh – KTNN và Trung tâm
Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ - Trường ĐH Sư Phạm
Hà Nội 2 đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em thực hiện tốt đề tài này.
Lần đầu làm quen với việc nghiên cứu khoa học, đề tài của em không
tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận được sự chỉ bảo, góp ý kiến của các
thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài của em được hoàn thiện hơn.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Phạm Thanh Dung


LỜI CAM ĐOAN

Tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác động của nồng độ NaCl tới
sinh trưởng mầm và hoạt độ một số emzym chống oxy hóa ở hạt mầm đậu tương
(Glycine Max ( L).Merr) ”.
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả
nghiên cứu của đề tài này đảm bảo tính chính xác, khách quan, trung thực, không
trùng lặp với các tác giả khác.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Phạm Thanh Dung


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
1.1. Lý do chọn đề tài. ......................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu. ................................................................................... 3
1.3. Nội dung nghiên cứu. ................................................................................... 3
1.4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn. ......................................................................... 3
NỘI DUNG ........................................................................................................ 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 4
1.1. Sự nảy mầm và sinh trưởng của mầm đậu tương .......................................... 4
1.2. Tình hình nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của đậu tương ở Việt Nam
và thế giới . ......................................................................................................... 5
1.3. Vai trò của hai enzyme catalase và peroxidase trong giai đoạn nảy mầm và sinh
trưởng mầm của thực vật nói chung và ở cây đậu tương nói riêng. ........................... 8
1.4. Tình hình nghiên cứu về vai trò của enzym chống oxy hóa ở thực vật nói
chung và ở cây đậu tương nói riêng. .................................................................... 9
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 11
2.1. Đối tượng nghiên cứu. ................................................................................ 11
2.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 11
2.2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. ........................................................... 11
2.2.2. Cách bố trí thí nghiệm. ............................................................................ 12
2.2.3. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu. .................................... 13
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................... 17
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN. ....................... 18
3.1. Khả năng nảy mầm và sự sinh trƣởng của mầm đậu tƣơng trong môi
trƣờng mặn. ..................................................................................................... 18
3.1.1. Khả năng nảy mầm của hạt đậu tương................................................. 18

3.1.2. Sinh trưởng của mầm đậu tương trong môi trường mặn. ...................... 19
3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl đến hoạt độ một số enzym chống oxy hóa
của mầm đậu tƣơng. ........................................................................................ 25
3.2.1. Hoạt độ enzym catalase. ..................................................................... 25
3.2.2. Hoạt độ enzym peroxidase.................................................................. 30
KẾT LUẬN ...................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 36
PHỤ LỤC......................................................................................................... 17


MỞ ĐẦU
1.1. Lý do chọn đề tài.
Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành (tên khoa học là Glycine max) là loại
cây họ Đậu, có giá trị dinh dưỡng, giá trị kinh tế khá cao, có khả năng cải tạo đất
rất tốt và giữ một vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng hiện nay. Cây đậu
tương được trồng chủ yếu lấy hạt để chế biến thức ăn cho người và gia súc. Sản
phẩm từ cây đậu tương được sử dụng rất đa dạng như dùng trực tiếp hạt thô
trong chế biến món ăn thường ngày, làm snack, salad...Đối với hạt già phơi khô,
nấu chín hầm khoảng 15 phút, hạt sẽ mềm bở, không dai, bùi, ngon đậm hoặc
chế biến thành đậu phụ, ép thành đậu nành, nước tương, làm bánh kẹo, sữa đậu
nành, okara.
Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng rất phong phú gồm protein
(40%), lipit (12-25%), gluxit (10-15%), có các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P,Na,S;
các vitamin A,B1, B2, E, D, F, các enzym, sáp, nhựa, xenlulozo .....Đậu tương
còn được xem như là một thứ dược liệu có tác dụng ức chế phân hủy protein ,
điều hòa ngũ tạng, phòng bệnh và chữa bệnh cho con người.
Ngoài ý nghĩa về mặt dinh dưỡng, kinh tế đậu tương còn có tác dụng cao
trong cải tạo đất vì hệ rễ có nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm. Hiện nay đậu
tương được gieo trồng ngày càng rộng rãi ở nước ta và trên thế giới.

Trong quá trình sống, thực vật luôn chịu tác động của các nhân tố ngoại
cảnh. Trong số đó có những nhân tố không thuân lợi cho hoạt động sống của
thực vật như: khô hạn, giá rét, đất chua, đất mặn, sâu bệnh... Một trong những
nhân tố bất lợi của môi trường gây ảnh hưởng lớn đến năng suất là tác động của
muối. Hàm lượng muối cao trong đất là một trong những nguy cơ hạn chế năng
suất và phẩm chất cây trồng ở nhiều nơi trên thế giới. Hiện nay có khoảng 230

1


triệu ha đất (sản suất gần 50% sản lượng lương thực trên thế giới) bị nhiễm mặn.
Riêng ở Việt Nam và Đông Nam Á ước tính có khoảng 54 triệu ha đất bị nhiễm
mặn. Phần lớn diện tích mặn chưa được sử dụng, chỉ một phần nhỏ được sử dụng
nhưng cho năng suất chưa cao.
Những nghiên cứu về tác động của mặn và hạn nói chung lên sự sinh
trưởng và phát triển của cây trồng cho thấy, cây trồng có khả năng thích ứng
trong một giới hạn nhất định với tác động của các nồng độ muối. Khi gặp điều
kiện stress muối, thực vật sẽ có các phản ứng về mặt hình thái, sinh lý, sinh hóa
để thích nghi với điều kiện bất lợi đó của môi trường như thay đổi một số đặc
điểm hình thái giải phẫu phù hợp hoặc gia tăng một số chất có khả năng bảo vệ,
đặc biệt là sự hình thành và tích lũy một số enzym chống oxy hóa như: enzym
catalase và enzym peroxidase. .
Vấn đề nghiên cứu khả năng chống oxy hóa ở cây trồng đến nay còn ít,
nhất là ở giai đoạn sinh trưởng đầu tiên của mầm. Vì thế để nâng cao năng suất
và chất lương đậu tương cùng với công tác tạo giống thì việc lựa chọn những
giống thích hợp với từng vùng sinh thái khác nhau nhất là vùng đất mặn là việc
làm có ý nghĩa thực tiễn rất lớn.
Ở Việt Nam có khí hậu nhiệt đới, gió mùa nóng ẩm thích hợp cho việc
trồng đậu tương. Tuy nhiên, đậu tương lại khá nhạy cảm với các điều kiện bất lợi
của môi trường đặc biệt là giai đoạn nảy mầm, việc stress muối sẽ ảnh hưởng lớn

tới năng suất đậu tương.
Xuất phát từ những lý do trên nêu trên, trong điều kiện thời gian cho phép,
chúng tôi đã tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu tác động của nồng độ NaCl tới
sinh trƣởng mầm và hoạt độ một số emzym chống oxy hóa ở mầm đậu
tƣơng (Glycine Max ( L).Merr) ”.

2


1.2. Mục đích nghiên cứu.
Nghiên cứu ảnh hưởng của các mức nồng độ NaCl tới hoạt động của một
số enzym chống oxy hóa ở mầm của giống đậu tương ĐT22.
1.3. Nội dung nghiên cứu.
- Xác định về tỷ lệ nảy mầm, sinh trưởng mầm của hạt trong các mức
nồng độ dung dịch muối.
- Xác định về ảnh hưởng của NaCl tới hoạt động của các enzym oxy hóa:
catalase, peroxidase ở các nồng độ dung dich NaCl : 0.3%, 0.6%, 0.9%, 1.2%,
1.5%, 1.8%.
1.4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn.
- Nghiên cứu góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu về tính chống chịu của
đậu tương, đặc biệt là giống đậu tương ĐT 22 dưới tác động của điều kiện môi
trường mặn.
- Sử dụng chỉ thị về sự biến đổi enzym catalase và enzym peroxidase
trong điều kiện mặn để đánh giá khả năng chịu mặn của thực vật.

3


NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Sự nảy mầm và sinh trƣởng của mầm đậu tƣơng
Sự sinh trưởng phát triển của đậu tương được chia làm các giai đoạn sau:
Nảy mầm, cây con, ra hoa, hình thành quả, quả chín.
Sau khi trồng hạt đậu tương ngấm nước rất nhanh trừ một vài giống đặc
biệt là loại hoang dại khả năng ngấm nước chậm hơn. Trong điều kiện thuận lợi,
rễ xuất hiện sau khi trồng 1-2 ngày. Rễ này gọi là rễ chính nó phát triển nhanh
xuống phía dưới, đến ngày thứ 3 - 4 rễ phụ bắt dầu xuất hiện. Sau 4 - 5 ngày lá
mầm xuất hiện và đẩy lên khỏi mặt đất sự sinh trưởng mạnh của phần trên trụ
mầm dưới lúc đầu lá mầm có màu vàng nhạt, sau có màu xanh sau cùng chuyển
sang màu vàng và rụng xuống.
Thực chất quá trình nảy mầm là quá trình biến đổi sinh lí, sinh hoá mạnh
mẽ diễn ra trong hạt,chuẩn bị cho sự hình thành cây non. Đậu tương thuộc cây
hai lá mầm nên sự nảy mầm cũng gồm các pha như sự nảy mầm ở các cây hai lá
mầm đó là:
+ Pha trương hạt: tính từ khi bắt đầu nảy mầm, hạt hút nước rất mạnh làm
trương hạt.
+ Pha hình thành và hoạt hoá enzym: hạt có một lượng enzym nhất định
nhưng chủ yếu ở dạng liên kết, khi hạt hút nước thì enzym mới được giải phóng
ở dạng tự do và bắt đầu hoạt động mạnh.
+ Pha tích luỹ chất dinh dưỡng: ngay trong những phút đầu ngâm trong
nước, độ hấp thụ oxy của hạt tăng lên đặc biệt là chu trình hexozomonophotphat
tăng lên nhiều lần, do vây lượng ATP tích luỹ nhiều hơn.

4


+ Pha động viên các chất dự trữ và xây dựng các chất hữu cơ đặc trưng cho
cơ thể ở giai đoạn nảy mầm: các chất dinh dưỡng trong hạt chủ yếu thuộc 3 nhóm
chất hữu cơ là: gluxit ,protein, lipit.trong quá trình nảy mầm enzym α-amilaza tác
động vào liên kết 1,4-glucozit phân giải tinh bột thành các đextrin tham gia vào quá

trình hô hấp ở các dạng saccarozo tích luỹ ở các tế bào trụ phôi. Protein được phân
giải bởi emzym proteaza thành các axit amin và các amit. Phần lớn các enzym
lipaza phân giải lipit thành axit béo và glixerol. Ngoài ra lipit còn được tái chuyển
hoá thành gluxit cung cấp năng lượng cho hạt nảy mầm.
1.2. Tình hình nghiên cứu sự sinh trƣởng và phát triển của đậu tƣơng ở Việt
Nam và thế giới .
Trên thế giới chia thành hai nhóm nghiên cứu chính:[28 ]
- Nghiên cứu về giống đậu tương:
Thí nghiệm quốc tế về đánh giá giống đậu tương thế giới (ISVEX) lần thứ
nhất vào năm 1973 đã được tiến hành với quy mô là 90 điểm thí nghiệm được bố
trí ở 33 nước đại diện cho các đới môi trường. Kết quả nghiên cứu cho thấy:
trong phạm vi các điểm thí nghiệm từ xích đạo đến vĩ tuyến 30o và độ cao dưới
500m, năng suất trung bình và trọng lượng hạt giảm khi vĩ tuyến tăng. Tuy vậy,
chiều cao cây không đạt mức tối ưu ở tất cả các đới. Mức đổ cây giảm khi vĩ
tuyến tăng. Mức tách quả rụng hạt đều không nặng ở tất cả các đới.
Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau màu châu Á (AVRDC) đã thiết lập hệ
thống đánh giá (Soybean – Evaluation – Aset) giai đoạn 1 đã phân phát được trên
20.000 giống đến 546 nhà khoa học của 164 nước Nhiệt đới và Á Nhiệt đới. Công
trình đã đưa vào trong mạng lưới sản xuất được 21 giống ở trên 10 quốc gia .

5


Mỹ là quốc gia đứng đầu về năng suất và chất lượng đậu tương do Mỹ đã
tạo ra được nhiều giống đậu tương tốt mới. Năm 1893 Mỹ đã có trên 10.00 mẫu
đậu tương thu thập từ các nước khác trên toàn thế giới. Mục tiêu của công tác
chọn tạo giống mới của Mỹ là chọn ra những giống có khả năng thâm canh, phản
ứng với quang chu kỳ, chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, hàm lượng
protein cao, dễ bảo quản và chế biến (Johnson H.W và Bernard R.L, 1976)
Trung Quốc đã tạo ra nhiều giống đậu tương mới bằng phương pháp gây

đột biến. Giống Tiefeng 18 được tạo ra do xử lý bằng tia gamma có khả năng
chịu được phèn cao, không đổ, năng suất cao, phẩm chất tốt. Giống Heinoum
N06, Heinoum N016 xử lý bằng tia gamma có hệ rễ tốt, lóng ngắn, nhiều cành,
chịu hạn, khả năng thích ứng rộng.
Thái Lan với sự phối hợp giữa hai trung tâm là MOAC và CGPRT nhằm
cải tiến tạo giống có năng suất cao, chống chịu với một số sâu bệnh hại chính
đồng thời có khả năng chịu được đất mặn, chịu được hạn hán và ngày ngắn
(Judy W.H và Jackobs J.A, 1979).
- Nghiên cứu về biện pháp kỹ thuật:
Theo Lawn các yếu tố khí hậu bao gồm nhiệt độ, ánh sáng và lượng mưa
là những yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến các thời kỳ sinh trưởng và phát triển, khả
năng cố định đạm và năng suất hạt đậu tương. Gieo trồng đậu tương ở thời vụ
không thích hợp thường làm giảm năng suất hạt đậu tương vì các nguyên nhân
sau: giảm mật độ cây trồng do độ ẩm đất thấp không đảm bảo cho sự nảy mầm
của hạt, rút ngắn thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng do điều kiện nhiệt độ cao…
Tại Queensland – Úc, Dickson và các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng
của phân lân được bón đã chỉ ra rằng năng suất đậu tương tăng lên rất đáng kể
khi đậu tương được bón phân lân.

6


Oliver S. and S.A Barler cho biết: Hoạt động cố định Nito của vi khuẩn nốt
sần được đo bằng hàm lượng Legemoglobin vào cuối thời kì ra hoa đã tăng 2,5 lần ở
600 ppmP và 800 ppmP. Nhưng Canxi lại làm giảm hoạt động của vi sinh vật. Khi
bón nhiều lân, tốc độ cố định Nitơ cao hơn và lượng axit glutamic tăng.
Ở nước ta, do vị trí quan trọng của đậu tương trong hệ thống cây trồng nên
các nhà khoa học đã đầu tư chọn, tạo các giống đậu tương mới với mục tiêu: nâng
cao năng suất, phẩm chất và khả năng thích ứng, tính chống chịu. Bên cạnh đó,
công tác nhập nội nguồn gene đậu tương cũng làm xuất hiện nhiều giống đậu

tương có năng suất cao song việc đưa các giống này gieo trồng đại trà ở nhiều
vùng sinh thái đã gặp nhiều khó khăn do điều kiện đất đai, khí hậu, tập quán. Để
khắc phục dần những khó khăn đó, đã có rất nhiều nhà khoa học đi sâu nghiên cứu
các vấn đề: sinh trưởng, năng suất, bản chất sinh lý, sinh hóa của đậu tương.
Trong số các công trình nghiên cứu về khả năng sinh trưởng của cây đậu tương:
Nguyễn Danh Đông, Trần Đình Long,…đã tiến hành nghiên cứu về quá trình sinh
trưởng của rễ, thân, hoa, quả là chủ yếu, một số công trình lại tìm hiểu biện pháp
kỹ thuật canh tác ảnh hưởng đến sinh trưởng của đậu tương [3], [9], [10].
Một số công trình nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh
trưởng, Nguyễn Văn Đính đã nghiên cứu về ảnh hưởng của

- NAA tới khả

năng nảy mầm, năng suất của đậu tương trên giống DT84,…[2].Một số nghiên
cứu tìm hiểu ảnh hưởng của các nguyên tố khoáng và phân vi lượng: Nguyễn
Văn Mã, Điêu Thị Mai Hoa tìm hiểu ảnh hưởng của phân vi lượng tới khả năng
chịu hạn của đậu tương [7], [20], Phạm Gia Ngân nghiên cứu ảnh hưởng của
Co, Mo, B, Zn,… đến khả năng sinh trưởng, năng suất của đậu tương. [12], [23]
Bên cạnh đó, cũng có những nghiên cứu đề cập tới sự sinh trưởng, khả năng
quang hợp của đậu tương trên đất bạc màu [18], [19]. Một số nghiên cứu lại tập

7


trung vào việc tìm hiểu khả năng chịu hạn của các giống đậu tương năng suất cao
thông qua việc tìm hiểu mối quan hệ giữa tính chịu hạn và một số đặc điểm giải
phẫu hình thái lá, thời gian sinh trưởng, diện tích lá, chiều cao cây,... [4], [5],
[16], [17]. Một số khác lại đi sâu tìm hiểu các khía cạnh khác: Trần Thị Phương
Liên và cộng sự nghiên cứu mối quan hệ của tính chịu hạn, chịu nóng với hàm
lượng protein, lipit và thành phần axit amin trong hạt đậu tương.[11]

Hiện nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật đã giúp
các nhà khoa học chọn tạo được các giống đậu tương mới năng suất cao góp
phần nâng cao hiệu quả kinh tế của cây đậu tương. Các kết quả nghiên cứu của
Mai Quang Vinh, Ngô Phương Thịnh tại Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo ra
nhiều giống đậu tương mới: DT84, DT90, DT95,… có năng suất cao và tính
chống chịu điều kiện bất lợi cũng tăng hơn các giống cũ. [24], [25]
1.3. Vai trò của hai enzyme catalase và peroxidase trong giai đoạn nảy mầm và
sinh trƣởng mầm của giới thực vật nói chung và ở cây đậu tƣơng nói riêng.
Trong các yếu tố ngoại cảnh thì nước là yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng lớn
nhất đến sinh trưởng phát triển và năng suất của đậu tương. Dưới điều kiện tác
động của NaCl, lượng nước cung cấp cho các quá trình sinh lí, sinh hóa giảm ,
gây khó khăn cho sự phát triển của hạt mầm. Nồng độ muối cao dẫn tới hạn sinh
lí và sự nhiễm độc các ion Na+ và Cl-, ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển
của đậu tương.[15]
Nồng độ muối cao tác động tiêu cực đến tăng trưởng, đặc điểm nông học,
chất lượng giống và số lượng, và do đó làm giảm năng suất của đậu tương. Để
đối phó với stress muối, đậu tương đã phát triển một số cơ chế, bao gồm: (i) duy
trì cân bằng nội môi ion; (ii) điều chỉnh để đáp ứng với stress thẩm thấu; (iii)

8


khôi phục sự cân bằng thẩm thấu; và (iv) trao đổi chất khác và sự thích ứng của
cấu trúc tế bào.[29]
Đậu tương có khả năng chống lại hoặc hạn chế sự mất nước bằng những
biến đổi hình thái và những phản ứng hóa sinh phù hợp. Hệ thống chống oxy hóa
hoạt động rất phức tạp để trung hòa các gốc tự do. Các enzym chống oxy hóa đã
có những biến đổi để bảo vệ hạt mầm trong điều kiện mặn: khi cây bị stress
nước, ở mức độ nội bào sẽ tạo ra các tác nhân gây hại như gốc superoxit, H2O2
và gốc hydroxy tự do, đây là nguyên nhân gây hư hại cho màng sinh chất, các

bào quan gây ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng. Và khi đó hệ thống enzym
chống oxy hóa sẽ hoạt động: superoxit dismutase chuyển gốc supeoxit thành O2
và H2O2 , sau đó H2O2 được giải độc nhờ catalase và peroxidase.[14 ]
1.4. Tình hình nghiên cứu về vai trò của enzym chống oxy hóa ở thực vật
nói chung và ở cây đậu tƣơng nói riêng.
Trong cơ thể thực vật, ở điều kiện bình thường, dưới sự kiểm soát chặt chẽ
của các enzym chống oxy hóa superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT),
peroxidase (POD)…, các gốc tự do chứa oxy như: superoxit (O2-), hydrogen
peroxit (H2O2), và hydroxy ( ·OH), các dạng oxy hoạt hóa (ROS-reactive oxygen
species) là sản phẩm chuyển hóa của oxy, tham gia điều khiển sự sinh trưởng,
phát triển của các cơ quan lá, hoa, quả… thông qua điều tiết các quá trình chuyển
hóa nội bào. Khi cơ thể gặp điều kiện sống bất lợi như hạn hán, mặn, lạnh, nóng,
nấm bệnh…, hàm lượng các gốc này tăng đột biến, gây nên hiện tượng “stress
oxy hóa”.[30]
Theo Journal of Integrative Plant Biology 2008, trong “stress oxy hóa”,
các gốc tự do biểu hiện cả hai vai trò tích cực và tiêu cực. Với hàm lượng cao
trong tế bào, chúng tác động tiêu cực làm thay đổi tính thấm, độ dẫn điện, phân

9


giải thành phần photpholipid, dẫn đến phá hủy màng nội chất, gây chết các tế
bào, tổn thương các cơ quan, bộ phận. Vai trò tích cực được đánh giá trên
phương diện sự bùng nổ đó lại là một dạng phản ứng phòng vệ của cơ thể thực
vật đối với các yếu tố gây stress, đặc biệt là đối với bệnh nấm, bệnh vi khuẩn và
có nhiều nghiên cứu đã đánh giá vai trò này trên các loại cây trồng (Maffei và
cộng sự, 2007; Ahmad và cộng sự, 2008). Trong trường hợp sâu bệnh tấn công,
vai trò bảo vệ của các gốc tự do bước đầu đã được ghi nhận ở một số loài ngũ
cốc (Ni và cộng sự, 2000; Ni và Quisenberry, 2003). Tuy nhiên, những nghiên
cứu theo hướng này còn chưa nhiều và chưa trải rộng đến các giống cây trồng

nói chung và cây đậu tương nói riêng.[ 29]
Một số thí nghiệm nghiên cứu đã cho thấy, ở đậu tương, khi bị stress mặn
nhẹ, bên trong mầm có một mức độ cao của các enzym chống oxy hóa và giảm
hàm lượng glutathione có thể bảo vệ chống lại các gốc tự do hay oxy hoạt tính
(ROS), và do đó tránh được các sự cố của leghemoglobin, peroxy lipid và
protein.[ 30]
Tuy nhiên, nếu stress mặn nghiêm trọng thì tế bào hạt mầm bị suy thoái
không thể đảo ngược trong leghemoglobin và giảm hoạt động nitrogenase bất
chấp sự gia tăng GR hoạt động mức độ cao của glutathione ở trạng thái khử
(GSH) (Comba et al. 1998).

10


CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣ ng nghiên cứu.
Giống ĐT22:
- Nguồn gốc: Được Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ chọn tạo từ
dòng đột biến của hạt lai DT95 và ĐT12. Đã được Hội đồng Khoa học và Công nghệ
( Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) công nhận là giống mới.[33]
- Đặc điểm: ĐT22 có hoa màu trắng, hạt vàng, rốn nâu đậm, quả chín có
màu nâu, phân cành trung bình, số quả chắc trung bình đạt 25 – 45 quả trên cây,
có khoảng 16% – 20% số quả ba hạt, chiều cao cây khoảng 45cm – 75cm, khối
lượng 1000 hạt 155g – 160g.[32]
Năng suất đạt 18 – 27 tạ/ha, tùy thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm
canh, có thể trồng được cả ba vụ trong năm.
ĐT22 là giống chịu được đất ướt và những bệnh mức nhẹ đến trung bình
đối với một số loại bệnh hại chính, kháng được bệnh phấn trắng.
Được Trung tâm Khuyến nông – Khuyến lâm tỉnh Bắc Cạn đưa vào dự án
trồng khảo nghiệm bảy giống đậu tương mới và hai giống đối chứng, ĐT22 được

công nhận nổi trội hơn so với các giống khác.
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.
Đề tài được tiến hành từ tháng 7/2014 đến 5/2015.
Địa điểm nghiên cứu: Được tiến hành tại Trung tâm hỗ trợ Nghiên cứu
khoa học và chuyển giao công nghệ và phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật trường
ĐHSP Hà Nội 2.

11


2.2.2. Cách bố trí thí nghiệm.
- Chọn hạt giống đều, khỏe, có phôi sáng, không sâu mọt, không nấm mốc.
- Khử trùng khay đựng (kích thước phù hợp 20 x 35cm, có nắp, đảm bảo
đủ oxy), bình, tay… bằng cồn.
- Giấy thấm phải được sấy ở 1300C trong vòng 1 giờ.
- Hạt được khử trùng bằng dung dịch KMnO4 1% trong 5 phút ( để hạt vào
túi màn, nhúng vào trong dung dịch). Sau đó rửa bằng nước cất rồi ngâm hạt
vào nước từ 5 - 10 phút để hạt trương nước.
- Gieo hạt trên khay với tỉ lệ 50 hạt/khay, trên các rãnh gấp nếp của giấy thấm.
- Xếp hạt vào các khay với 6 nồng độ NaCl tăng dần. Mỗi nồng độ có 3
khay hạt và gieo 3 khay hạt dùng làm đối chứng
Tiến trình
- Hạt được gieo trong khay với nồng độ đã được đánh dấu NaCl : 0%
(đối chứng), 0.3%, 0.6%, 0.9%, 1.2%, 1.5% và 1.8%, đánh dấu khay theo thứ tự
lần lượt là ĐC, M 0,3; M0,6; M0,9; M1,2; M1,5; M1,8 và hạt được tiếp xúc với
nước bằng ba mặt.
- Tiến hành đo hoạt độ của các enzym chống oxy hóa sau 2 giờ, 4 giờ và 6
giờ sau khi hạt được gieo (ngày 1).
- Ngày thứ 2, 3, 4, 5, 6, tiến hành đo hoạt độ của các enzym chống oxy

hóa 1 lần và vào một khung giờ giống nhau. Ghi lại kết quả thu được của một
ngày vào bảng để theo dõi và tổng hợp.
- Hàng ngày, bổ sung lượng dung dịch muối NaCl khoảng 50 ml/khay,
gia giảm số lượng để đạt mức độ đủ ẩm, không úng ngập.

12


2.2.3. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu.
Xác định tỷ lệ nảy mầm.
Tỷ lệ nảy mầm được xác định theo phương pháp của Volcova (1984).
Đếm số hạt nảy mầm trong các khay mẫu từ khi hạt đầu tiên nảy mầm đến khi
không còn có thêm hạt mới nảy mầm. Những hạt nảy mầm là những hạt có chiều
dài rễ mầm đạt từ 3mm trở lên, tỷ lệ nảy mầm được tính theo công thức sau:
P=

a
 100
b

Trong đó:
P: Khả năng nảy mầm của hạt (%).
a: Số hạt nảy mầm
b: Tổng số hạt đem gieo
Xác định khả năng sinh trƣởng của mầm.
Đo chiều dài thân mầm, thân rễ vào các ngày 2, 4 và 6 và khối lượng tươi,
khô vào ngày 1 và ngày 6 sau khi gieo hạt.
- Sinh trưởng của thân, rễ mầm (mm): Dùng thước chia đến milimet đo
chiều dài của thân, rễ mầm.
- Khối lượng tươi của mầm (g): Dùng giấy thấm thấm sạch nước, sau đó

cân khối lượng tươi của mầm bằng cân phân tích.
- Khối lượng khô của mầm (g): Rửa sạch mầm bằng nước cất, sau đó sấy
trong 4 giờ ở nhiệt độ 105oC, sau đó cân khối lượng khô bằng cân phân tích.
Xác định hoạt độ enzym catalase.
Xác định hoạt độ enzym catalase bằng phương pháp chuẩn độ (theo
Nguyễn Quang Vinh và cộng sự)[ 14].

13


Nguyên tắc thí nghiệm:
Catalase xúc tác cho phản ứng:
2 H2O2

catalase

O2 + 2 H2O

Để định lượng catalase có thể dùng dung dịch KMnO4 0,1N để xác định lượng
H2O2 trước và sau khi enzym tác dụng, từ đó tính lượng H2O2 đã bị chuyển hóa.
5 H2O2 + 2 KMnO4 3 H2SO4, 8 H2O

2 KMnO4 + K2SO4 + 5 O2 .

Từ phản ứng trên có 1ml dung dịch KMnO4 0,1N tương ứng với 1,7mg H2O2.
Thiết bị và vật liệu:
- Đệm photphat 50mM (pH 7,0): (a) hòa tan 6,81g KH2PO4 trong 1000ml
nước cất; (b) hòa tan 11,41g K2HPO4.3H2O trong 1000ml nước cất; trộn dung
dịch a và b cho đến khi đạt pH 7,0.
- KMnO4 o,1N , H2SO4 10%, H2O2 0,1% trong đệm photphat 50mM (pH 7,0)

- Chiết enzym:
 Lấy mẫu từ các khay nồng độ, cân mẫu, nghiền mẫu trong 10ml đệm
photphat (pH 7,0) 50mM.
 Ly tâm lạnh ở 6000g/ 40 phút/ 2oC.
 Dịch trong phía trên là dịch chiết enzym thu được.
Cách tiến hành:
- Lấy 2 bình nón dung tích 100ml:

 Bình thí nghiệm: Dung dịch H2O2 0,1% (ml): 10
Dịch chiết enzym (ml)

: 10

Giữ ở 30oC trong 30 phút
Axit H2SO4 10% (ml)

:5

Chuẩn độ H2O2 dư thừa bằng KMnO4 0,1N cho đến khi xuất hiện màu
hồng bền ( bền màu trong khoảng 30 giây).

14


 Bình đối chứng: Dịch chiết enzym (ml) : 10
Đun sôi cách thủy trong 5 phút để biến tính enzym, lấy ra để nguội.
Dung dịch H2O2 0,1% (ml): 10
Giữ ở 30oC trong 30 phút
Axit H2SO4 10% (ml)

:5

Chuẩn độ H2O2 dư thừa bằng KMnO4 0,1N cho đến khi xuất hiện màu
hồng bền ( bền màu trong khoảng 30 giây).
Tính hoạt độ enzym:
- Tính số mg H2O2 bị phân giải dưới tác dụng của enzym có trong a (g) mẫu:
x=

( A  B).1,7.V 1
V 2.a

Trong đó: A- Số ml KMnO4 đã dùng để chuẩn độ H2O2 dư thừa trong bình
đối chứng.
B- Số ml KMnO4 đã dùng để chuẩn độ H2O2 dư thừa trong bình thí nghiệm.
V1- Số ml dịch chiết enzym từ mẫu (= 10ml).
V2- Số ml dịch chiết enzym dùng cho phản ứng (= 10ml).
a - Khối lượng mẫu (g).
- Số đơn vị catalase trong 1g mẫu (số µmol H2O2 bị phân giải trong 1 phút):
C( U/g) =

X
0,034.30

Trong đó: 30- thời gian enzym tác dụng.
0,034- 1µmol đương lượng H2O2.
Xác định hoạt độ enzym peroxidase.
Xác định bằng phương pháp đo máy quang phổ sử dụng Pyrogallol làm cơ chất(
theo BBI Solutions, Blaenavon AP 132 Analytical procedures 1/5/2013)[28]
Peroxidase phân giải H2O2 thành H2O và O2, khi có mặt của chất cho hidro
là pyrogallol. Sự oxi hóa pyrogallol thành sản phẩm có màu vàng là

15


purpurogallin có thể được đo quang phổ ở bước sóng 420nm với khoảng thời
gian đặc hiệu ( sử dụng phần mềm Kinetis, đo trong 3 phút, 20 giây đọc kết quả
một lần).
Thiết bị và vật liệu:
- A: 2M NaOH : Hòa tan 8g NaOH trong 90ml nước cất, sau đó dâng lên
100ml nước.
- B: 0,1M đệm photphat pH 6,0: Hòa tan 6,8g KH2PO4 vào 450ml nước
cất,sử dụng máy đo độ pH, thêm dung dịch NaOH 2M để đạt đệm pH 6,0. Sau
đó dâng nước lên 500ml.
- C: 5,33% Pyrogallol: Hòa tan 1,333g Pyrogallol trong 20ml nước cất,
sau đó dâng lên vạch 25ml. ( Bảo quản lạnh, để trong lọ tối, pha mới mỗi ngày).
- D: Dung dịch H2O2: Pha 0.66ml H2O2 30% vào 50ml nước cất. ( Để
trong lọ tối, pha mới mỗi ngày).
- E: Dịch chiết enzym: Nghiền mẫu với 5ml đệm pH 6,0 ( tỷ lệ 1 phần
mẫu : 5 phần đệm). Tiến hành ly tâm dịch nghiền 6000g/30 phút/ 0 oC. Dịch
trong phía trên là dịch chiết enzym thu được.
Cách tiến hành:
Đo ở bước sóng 420nm.
Hóa chất
0,1M đệm photphat pH 6,0.
5,33% Pyrogallol
H2O2
Dịch chiết enzym
Tổng

Ống đối chứng

2,5ml
0,3ml
0,2ml
0ml
3ml

Ống thí nghiệm
2,4ml
0,3ml
0,2ml
0,1ml
3ml

Đo Kinetis ở bước sóng 420nm trong 3 phút, 20 giây ghi lại kết quả một lần.
Tính hoạt độ enzym:
Công thức tính hoạt độ peroxidase:

16


U/ml = X =  E420nm/20s . 2,5 . 50
X
= a

U/g

Trong đó:  E420nm/20s – giá trị đo được trong 20 giây.
a - Khối lượng gam mẫu.
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
- Mỗi lần 21 phép đo (3 lần lặp lại x 7 nồng độ). Các đồ thị được biểu

diễn bởi giá trị trung bình và sai số trung bình của các phép đo. Kết quả thí
nghiệm được tổng hợp và xử lý bằng phần mềm thống kê Microsoft Excel
theo các tham số: giá trị trung bình ( X ), độ lệch chuẩn (  ), sai số trung bình
(m), hệ số biến động (Cv), sai số của hiệu các trung bình số học (m d), độ
chính xác của thí nghiệm( m%), độ tin cậy của hai số trung bình (t d) được tính
theo các công thức:
N

X

Cv = 

=


i 1

Xi



n

 .100

m%=

X

td =



m= 


X

n

md = (m1  m2)
2

d=

Trong.đó:
Xi – giá trị đo được qua mỗi lần đo.
n – số lần nhắc lại.
- trung bình đối chứng.

17

- trung bình thí nghiệm.
m1 - sai số mẫu đối chứng.
m2 – sai số mẫu thí nghiệm.

2


CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.

3.1. Khả năng nảy mầm và sự sinh trƣởng của mầm đậu tƣơng trong môi
trƣờng mặn.
3.1.1. Khả năng nảy mầm của hạt đậu tương.
Tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu tương trong 6 ngày thí nghiệm được thể hiện
qua bảng 1 và hình 1.
Bảng 1. Ảnh hƣởng của các nồng độ NaCl đến tỷ lệ nảy mầm của đậu tƣơng
ĐV: %
Mẫu TN

Ngày 2

Ngày 4

Ngày 6

ĐC

79,33

100,00

100,00

M0,3

72,00

100,00

100,00

M0,6

46,66

100,00

100,00

M0,9

15,33

66,33

70,78

M1,2

-

48,11

56,00

M1,5

-

36,00

44,80

M1,8

-

4,66

14,60

Tỷ lệ nảy mầm của hạt tăng nhanh từ ngày 2 đến ngày thứ 4. Qua ngày thứ
4, tỷ lệ hạt nảy mầm tăng thêm nhưng không còn cao, những hạt chưa nảy mầm
trương nước to nhưng mầm vẫn không làm nứt được vỏ hạt để chồi ra. Sang
ngày thứ 6, những hạt chưa nảy mầm có lớp keo bao quanh và bắt đầu có dấu
hiệu bị hỏng.
Tỷ lệ hạt nảy mầm ở nồng độ NaCl 0,3 và 0,6 khá cao, đạt giá trị ngang
bằng với tỷ lệ nảy mầm ở khay đối chứng từ ngày 4. Tỷ lệ hạt nảy mầm tỷ lệ
nghịch với sự gia tăng của nồng độ NaCl. Ngày 2 ( sau 1 ngày hạt được gieo),
đậu tương chỉ nảy mầm ở các nồng độ 0,3% ; 0,6% và 0,9% với tỷ lệ nảy mầm

18


giảm dần theo thang nồng độ tăng. Ngày 4 (sau 3 ngày hạt được gieo), đậu tương
nảy mầm được ở những nồng độ NaCl cao hơn và nồng độ NaCl càng cao thì tỷ
lệ hạt nảy mầm càng thấp.

Hình 1. Ảnh hƣởng của các nồng độ NaCl đến tỷ lệ nảy mầm của đậu tƣơng
Tỷ lệ nảy mầm của hạt như đã nói ở phần trên đã chứng tỏ nồng độ muối có

ảnh hưởng lớn tới sự nảy mầm của hạt. Khi nồng độ muối trong môi trường cao,
chúng ảnh hưởng đến áp suất thẩm thấu và gây độc cho hạt. Nồng độ càng cao thì
áp suất thẩm thấu càng cao, làm giảm khả năng hút nước của tế bào để đảm bảo
cho sự nảy mầm, tế bào phải tăng cường tích lũy một số chất phản ứng chống lại
điều kiện stress muối, do đó ảnh hưởng tới các quá trình sinh hóa và cân bằng
năng lượng dẫn tới làm giảm khả năng nảy mầm của hạt.
3.1.2. Sinh trưởng của mầm đậu tương trong môi trường xử lý mặn.

19