Nghiên cứu thu nhận hoạt chất kìm hãm α glucosidaza từ aspergillus oryzae và hướng ứng dụng

1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề: Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) và thừa cân béo phì đã
trở thành căn bệnh phổ biến không chỉ ở các nước phát triển mà còn
ở nước đang phát triển, do thay đổi trong lối sống của người dân và
thói quen ăn uống. Chất kìm hãm α-glucosidase (AGIs) thường được
sử dụng để ngừa bệnh ĐTĐ loại II. Với cơ chế tác dụng là AGIs kết
hợp với α- glucosidase ở ruột làm kìm hãm sự thủy phân tạo thành
glucose, ngăn hấp thụ glucose đường huyết sau ăn. AGIs có thể được
tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau như: Chiết xuất từ thực vật,
tổng hợp bằng con đường hóa học hoặc bằng con đường sinh học
nhờ các vi sinh vật. Các AGIs có nguồn gốc tự nhiên được đặc biệt
quan tâm vì không gây phản ứng phụ, do đó AGIs tự nhiên là một
trong những liệu pháp hấp dẫn để điều trị tăng đường huyết và thừa
cân béo phì. Gần đây có nhiều nghiên cứu về các AGIs từ nguồn vi
sinh vật như Bacillus subtilis, Actinoplanes spp, Aspergillus oryzae
(A.oryzae). AGIs được tìm thấy trong nhiều thực phẩm lên men,
được đánh giá cao về hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, ứng dụng hỗ
trợ trị bệnh ĐTĐ và thừa cân béo phì. Sử dụng A.oryzae bằng lên
men bề mặt trên môi trường rắn đậu đỗ đang là hướng mới cho chất
chiết có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, sản phẩm AGIs từ đỗ
tương lên men bằng A.oryzae hiện đang được phát triển ở nhiều quốc
gia, với mục đích hỗ trợ kiểm soát đường huyết, hỗ trợ kiểm soát
thừa cân béo phì. Trong các nghiên cứu đã công bố chủ yếu sử dụng
đỗ tương (Glycine max) lên men bằng A.oryzae để thu nhận AGIs.
Tuy nhiên các thông tin công bố về bản chất và cơ chế hình thành
của AGIs từ các loại đậu đỗ lên men bề mặt trên môi trường rắn bằng
A.oryzae còn hạn chế. Chính vì thế, việc nghiên cứu có hệ thống thu
nhận AGIs từ A.oryzae lên men trên các nguồn nguyên liệu trong
nước và hướng ứng dụng ở điều kiện hiện tại của Việt Nam là vấn đề
cấp thiết, mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao“Nghiên cứu thu

nhận hoạt chất kìm hãm α-glucosidaza từ Aspergillus oryzae và
hướng ứng dụng” là một việc làm cấp thiết hiện nay, được tiến hành
với những mục tiêu sau: (1) Phân lập, tuyển chọn A.oryzae phù hợp
cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao. (2) Xác định điều kiện lên
men mặt trên môi trường rắn phù hợp cho quá trình nhân giống, sinh
trưởng và hình thành AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu. (3) Xác định


2
điều kiện chiết xuất phù hợp cho tạo chế phẩm AGIs bằng A.oryzae
nghiên cứu. (4) Tinh chế, xác định thành phần hóa học AGIs bằng
A.oryzae nghiên cứu. (5) Hướng ứng dụng và đề xuất quy trình công
nghệ sản xuất AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu. Để đạt được mục tiêu
đề ra, luận án được tiến hành với nội dung sau:
2. Nội dung: Phần 1: Tuyển chọn A.oryzae cho hoạt tính kìm hãm αglucosidase cao: Phân lập A.oryzae từ các mẫu tương, mẫu đỗ đen
mốc; đỗ xanh mốc; đỗ tương mốc và gạo mốc lấy ở Bần, Yên Nhân,
Hưng Yên; Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội và Chợ Đồng Xuân – Hà
Nội; Tuyển chọn A.oryzae phân lập được, có hoạt tính kìm hãm αglucosidase cao; Định danh A.oryzae tuyển chọn được dựa trên so
sánh trình tự gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2; Phần 2: Xác định một số
yếu tố (độ ẩm, pH ban đầu, cơ chất môi trường lên men, nhiệt độ,
tỷ lệ trấu môi trường rắn, độ dày khối môi trường lên men và thời
gian nhân giống) ảnh hưởng tới quá trình nhân giống A.oryzae
nghiên cứu; Phần 3: Xác định một số yếu tố (độ ẩm, pH ban đầu, cơ
chất môi trường lên men, thành phần K2HPO4; KCL và MgSO4 bổ
sung vào môi trường, nhiệt độ, tỷ lệ tiếp giống ban đầu, tỷ lệ trấu
môi trường rắn, độ dày khối môi trường lên men và thời gian lên
men) ảnh hưởng tới khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae nghiên
cứu bằng lên men bề mặt trên môi trường rắn; Phần 4: Nghiên cứu
ảnh hưởng dung môi, nồng độ, tỷ lệ dung môi : nguyên liệu, nhiệt
độ, thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất

AGIs từ môi trường đỗ đen xanh lòng sau lên men bề mặt trên môi
trường rắn bằng A.oryzae nghiên cứu. (mục tiêu 3); Phần 5: Nghiên
cứu tinh sạch, xác định thành phần hóa học và định lượng AGIs được
hình thành bằng A.oryzae nghiên cứu: Xây dựng phương pháp, xác
định dung môi, nồng độ dung môi cho tinh sạch sơ bộ AGIs; Nhận
dạng AGIs bằng các enzyme thủy phân lần lượt với pepsin, trypsin,
pancreatin, α- amylase và maltase; Xây dựng phương pháp tinh sạch
và kiểm tra độ tinh sạch AGIs bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao pha
đảo (RP - HPLC); Xác định khối lượng phân tử và trình tự amino
acid của AGIs tinh sạch được phân tích bằng thiết bị MALDITOF/TOF mass spectrometer. Phổ AGIs được phân tích bằng phần
mềm Mascot và dữ liệu ngân hàng Ludwig NR hoặc SwissPro; Định
lượng AGIs bằng RP – HPLC; Phần 6: Xây dựng hướng ứng dụng


3
AGIs và đề xuất công nghệ sản xuất AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu:
Xây dựng phương pháp cô sấy dịch chiết AGIs cho tạo chế phẩm
AGIs; Đánh giá tính an toàn về độc tính cấp, hoạt tính kìm hãm αglucosidase và an toàn thực phẩm của AGIs tạo ra từ A.oryzae nghiên
cứu; Đề xuất công nghệ sản xuất AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: Nước ta có nguồn nguyên
liệu đậu đỗ đa dạng và A.oryzae phân lập từ tự nhiên là rất phong
phú. Trong sản xuất AGIs từ A.oryzae người ta thường dùng đỗ
tương làm môi trường lên men. AGIs từ môi trường rắn từ đỗ tương
sau lên men bằng A.oryzae cho hiệu quả giảm đường huyết đối với
người ĐTĐ cao, sử dụng an toàn và không có tác dụng phụ. Đó là lý
do thúc đẩy nghiên cứu chọn các đậu đỗ trong nước để lên men bằng
A.oryzae cho sản xuất AGIs. Các A.oryzae bản địa phân lập từ các
nguồn nguyên liệu mẫu tương, mẫu đỗ đen mốc; đỗ xanh mốc; đỗ
tương mốc và gạo mốc. Phương thức lên men bề mặt trên môi trường
rắn được chọn lựa dựa trên điều kiện thí nghiệm đơn giản. Tinh sạch

AGIs dùng cho nghiên cứu thành phần, hoạt tính và định lượng AGIs
từ A.oryzae nghiên cứu. Chế phẩm AGIs kỹ thuật, chỉ qua chiết xuất,
làm sạch sơ bộ có khả năng ứng dụng thực tiễn trong cải thiện AGIs
hỗ trợ điều trị ở người bệnh ĐTĐ.
4. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của
luận án: Luận án nghiên cứu hệ thống từ việc lựa chọn, định tên
A.oryzae, xác định bản chất của AGIs và đưa ra phương án thích hợp
nhất về điều kiện lên men, tách chiết hoạt chất và hoàn thiện để có
sản phẩm dạng bột chứa AGIs. Bằng quy trình công nghệ tạo ra chế
phẩm đã đề xuất và bản chất của AGIs từ đỗ đen lên men bằng
A.oryzae có thể ứng dụng để sản xuất sản phẩm cho người bệnh
ĐTĐ, góp phần nâng cao chất lượng sức khoẻ cộng đồng. Về mặt
khoa học, đề tài đã đưa ra một số điểm mới: Đây là một nghiên cứu
đầu tiên của Việt Nam tuyển chọn được A.oryzae cho hoạt tính αglucosidase cao trên môi trường đỗ đen xanh lòng (Vigna Cylindrica
Skeels), nghiên cứu được một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nhân
giống và lên men hình thành AGIs. Nghiên cứu đầu tiên sử dụng
sóng siêu âm để chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men, tinh sạch được
AGIs từ đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6, xác định được khối lượng
phân tử và bản chất của AGIs này là peptide. Nghiên cứu đầu tiên đề


4
xuất được quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen lên
men bằng A.oryzae T6. Dựa vào kết quả khoa học của đề tài cho thấy
tiềm năng sản xuất chế phẩm AGIs ở quy mô lớn, tạo chế phẩm
AGIs từ đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6 cho chế biến thực phẩm
cho người bênh ĐTĐ và béo phì. Kết quả luận án là công trình đầu
tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống về peptide có hoạt
tính kìm hãm α-glucosidase bằng phương pháp lên men rắn trên môi
trường đỗ đen xanh lòng nhờ A.oryzae (từ việc phân lập tuyển chọn

A.oryzae, các điều kiện lên men, tách tinh sạch AGIs, tạo chế phẩm,
kiểm tra chất lượng, an toàn thực phẩm). Bước đầu ứng dụng có hiệu
quả chế phẩm AGIs sản xuất bột ăn liền. Đây là kết quả bước đầu
góp phần làm phong phú thêm nguồn thu các chất có hoạt tính kìm
hãm α-glucosidase để ngăn ngừa bệnh ĐTĐ và béo phì.
5. Bố cục luận án: Luận án gồm 140 trang (không kể phụ lục), 16
bảng, 33 hình và 169 tài liệu tham khảo, được trình bày 5 chương
trong 7 phần lớn: Đặt vấn đề (5 trang); Tổng quan (35 trang);
Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu (22
trang); Kết quả và thảo luận (59 trang); Kết luận và kiến nghị (2
trang ); Danh mục các công trình đã công bố của luận án (1 trang);
Tài liệu tham khảo (16 trang); Phụ lục (14 trang).
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Phần tổng quan của luận án đã trình bày tóm tắt về: Bệnh đái tháo
đường (ĐTĐ) (Khái niệm ĐTĐ; Phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ);
Cơ sở khoa học của việc sử dụng AGIs đến quá trình trao đổi đường
trong cơ thể (Enzyme α-glucosidase; Cơ sở khoa học sử dụng AGIs
để điều trị bệnh ĐTĐ); Chất AGIs (Các AGIs từ tổng hợp; AGIs từ
động vật; AGIs từ thực vật; AGIs từ vi sinh vật; AGIs từ A.oryzae);
Đỗ đen và các sản phẩm lên men bề mặt từ đậu đỗ (Đỗ đen; Sản
phẩm lên men bề mặt từ đậu đỗ); A.oryzae và lên men bề mặt (Đặc
điểm hình thái A.oryzae; Ảnh hưởng thành phần môi trường đến sinh
trưởng và hình thành AGIs bằng A.oryzae (Ảnh hưởng của nguồn
carbon; Ảnh hưởng của nguồn nitơ; Ảnh hưởng của nguồn khoáng
dinh dưỡng); Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và
hình thành AGIs bằng A.oryzae (Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy;
Độ ẩm môi trường; Ảnh hưởng độ thoáng khí; Điều kiện pH ban đầu
của môi trường; Tỷ lệ giống; Thời gian lên men)); Thu nhận AGIs

5
(Chiết xuất AGIs từ sản phẩm môi trường sau lên men; Tinh sạch
AGIs); Ứng dụng sóng siêu âm trong chiết xuất; Nghiên cứu, thử
nghiệm và ứng dụng AGIs từ đậu đỗ lên men trên thế giới; Nghiên
cứu và ứng dụng AGIs ở Việt Nam. Trên cơ sở phân tích những vấn
đề tồn tại trong công nghệ thu nhận AGIs, cũng đã nêu rõ hướng
nghiên cứu và nội dung nghiên cứu của luận án.
Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2. 1. Nguyên vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Các nguồn vi sinh vật và vật liệu: Mẫu mốc tương và đỗ đen
mốc ở Bần, Yên Nhân, Hưng Yên; mẫu mốc tương, đỗ xanh mốc và
đỗ đen mốc ở Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội; đỗ tương mốc và gạo
mốc ở Chợ Đồng Xuân - Hà Nội; Đỗ đen xanh lòng, đỗ đen trắng
lòng, đỗ tương (VN93-4), đỗ xanh (ĐX11), gạo nếp cái hoa vàng,
cám gạo, trấu; Chuột nhắt trắng, chủng Swiss, có trọng lượng 20±2
g, cả đực cả cái, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm.
2.1.2. Hóa chất: Rat interstinal aceton power (từ ruột non chuột), pNitrophenyl α-D-glucopyranoside, NaCL, Tris Base, đệm phosphat
0,1 M (từ Sigma Chemical Co, Mỹ), đệm phosphate 0,5M pH 6,7...
2.1.3. Môi trường: Môi trường nuôi cấy phân lập và giữ giống
(Czapek-Dox); Môi trường nghiên cứu định loại Aspergillus: Czapek
concentrate (bổ sung kim loại vết); Czapek Yeast Agar với 20%
sucrose (CYA20S); Czapek Dox Agar (CZ); Czapek Yeast Agar
(CYA25, CYA37); Luận án đã trình bày về môi trường đậu đỗ giá
thể rắn và các môi trường rắn cho nhân giống.
2.1.4. Thiết bị và dụng cụ: Thiết bị siêu âm TJS-3000 V6.0, máy đo
quang (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech)...
2.1.5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: Trường Đại Học Bách
Khoa Hà Nội, Thời gian từ 2010 đến 2014
2.2. Phương pháp phân tích và đo đạc: Xác định % hoạt tính kìm
hãm α-glucosidase theo phương pháp của Toomoyuki và cộng sự,

(1999), hoạt lực kìm hãm α-glucosidase (IC50) theo phương pháp của
Jing và cộng sự, (2007); Xác định số lượng tế bào nấm mốc trong
mẫu bằng phương pháp đếm gián tiếp thông qua số khuẩn lạc mọc
trên môi trường thạch thạch; Hàm lượng protein (%) theo AOAC
991,20; Hàm lượng lipit (%) theo AOAC 991,36; Độ ẩm (%) theo
TCVN 4326: 2001 (ISO 6496:1999); Phân tích cảm quan: Theo


6
phương pháp của Hà Duyên Tư, (2006); Phương pháp tính toán, đánh
giá hiệu quả tinh sạch chế phẩm AGIs kỹ thuật (Hiệu suất thu hồi
Y(%) = (TA1 x100)/TA0, TA0: tổng AGIs có trong mẫu thô; TA1:
tổng AGIs có trong mẫu sau tinh chế; Độ sạch P (%) = (CAGIs x 100)/
A với A: Hàm lượng mẫu; CAGIs: Hàm lượng AGIs của mẫu); Tổng
số vi khuẩn yếu khí, nấm men, nấm men, nấm mốc theo TCVN
4886-89; E.coli, theo TCVN 6846:2007; Salmonella, theo TCVN
4829:2005; Staphylococcus aureus, theo TCVN 4830:2005;
Clostridium perfringens, theo TCVN 4991:2005; Bacillus cereus,
theo TCVN 4992:89; aflatoxin, theo TCVN 7596:2007; Tổng số vi
sinh vật hiếu khí, theo TCVN 4884:2005; Tổng bào tử nấm men –
mốc TCVN 6265:2007; Coliforms, theo TCVN 4882:2007; Hàm
lượng chì, theo AOAC 994.02; Asen, theo AOAC 952,13; Cadimi,
theo AOAC 2000; Thủy ngân, theo AOAC 971,21; Đồng, theo ISO
8294:1994; 3-MCPD, theo TCVN 7731: 2007; Các thí nghiệm được
bố trí ngẫu nhiên, lập lại ít nhất 3 lần. Số liệu được xử lý trên phần
mềm thống kê Irristat 4.0 và thống kê toán học.
2.3. Phương pháp nghiên cứu: Luận án đã trình bày về: Sơ đồ
nghiên cứu tổng quát; Tuyển chọn A.oryzae có hoạt tính kìm hãm αglucosidase cao (Phân lập A.oryzae: Định loại A.oryzae theo khóa
phân loại Aspergillus của Klich; Cấy chấm điểm để nghiên cứu đặc
điểm theo phương pháp của Pitt và Hocking, (1997); Tuyển chọn

nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao; Định danh chủng nấm
tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1-5,8SITS2); Xác định một số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng của
A.oryzae T6; Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành
AGIs bằng A.oryzae T6; Chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng
sóng siêu âm; Tinh sạch và định lượng AGIs từ đỗ đen lên men
(Khảo sát dung môi cho tinh sạch sơ bộ AGIs; Khảo sát nồng độ
ethanol cho tinh sạch sơ bộ AGIs; Nhận dạng AGIs theo phương
pháp của Min-Gu-Kang và cộng sự, (2013); Tinh sạch AGIs bằng
RP–HPLC theo Min-Gu-Kang và cộng sự, (2013); Xác định khối
lượng phân tử và trình tự amino acid của AGIs bằng khối phổ theo
Bringans và cộng sự, (2008). Phổ AGIs được phân tích bằng phần
mềm Mascot và dữ liệu ngân hàng Ludwig NR hoặc SwissPro; Định
lượng peptide AGIs bằng RP-HPLC).


7
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tuyển chọn A.oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao
3.1.1. Phân lập Aspergillus Bảng 3.1 Kết quả phân lập Aspergillus
oryzae: Từ 19 mẫu mốc tương, spp từ các nguồn khác nhau
Nguồn phân lập
Số
Aspergillus
gạo và đỗ tương thu thập ở các
mẫu
spp
tương Bần, Yên
3
3
địa điểm khác nhau, thực Mốc

Nhân, Hưng Yên
nghiệm đã phân lập được 12 Mốc tương Cựu Đà,
3
3
Oai, Hà Nội
chủng Aspergillus spp. Qua Thanh
Đỗ đen mốc ở Bần
3
1
quan sát đặc điểm phát triển, Yên Nhân, Hưng Yên
đen mốc ở Cựu Đà,
3
3
hình thái, đặc điểm vi thể và đối Đỗ
Thanh Oai, Hà Nội
chiếu với khóa phân loại Đỗ xanh mốc ở Cựu
3
1
Thanh Oai, Hà Nội
Aspergillus của Klich, cho thấy Đà,
Đỗ tương mốc ở Chợ
2
1
Đồng Xuân – Hà Nội
12 chủng phân lập được này đều
mốc ở Chợ Đồng
2
0
có đặc điểm giống loài A.oryzae Gạo
Xuân – Hà Nội

Tổng số
19
12
và ký hiệu từ T1-T12.
3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm
có hoạt tính kìm hãm αglucosidase cao Kết quả trình
bày (KQ) ở Hình 3.1 cho thấy
bước đầu tuyển chọn được chủng
T6 cho khả năng hình thành AGIs
cao nhất (37,52 ± 1,23% hoạt tính
kìm hãm α-glucosidase) được sử
dụng cho định danh, nghiên cứu
Hình 3.1 Hoạt tính kìm hãm αđiều kiện sinh trưởng và khả năng glucosidase của một số A.oryzae phân lập
hình thành AGIs.
được
3.1.3. Định danh chủng tuyển Kết quả điện di
chọn được dựa trên so sánh
trình tự gen vùng ITS1- 5,8S 800 bp
ITS2: Kết quả PCR khuếch đại
gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2:
Sản
400 bp
phẩm
Từ kết quả điện di (Hình 3.2) có
PCR
thể thấy, đã khuếch đại được
Hình 3.2 Sản phẩm PCR của chủng T6
đoạn gen trong vùng ITS1 Trong đó: M: Maker (Thang chuẩn 100 bp), 3
5,8S - ITS2 có kích thước giếng còn lại tương ứng với N: Đối chứng âm,
khoảng 500bp như mong muốn. P: Đối chứng dương, T6: mẫu nấm

8
Sản phẩm hiệu quả, nồng độ tốt. Bảng 3.2 Kết quả đánh giá mức độ
Có thể tinh sạch sản phẩm PCR tương đồng của trình tự đoạn vùng ITS1để giải trình tự gen. Đọc trình tự 5,8S-ITS2 của chủng T6 với GenBank
database sử dụng công cụ BLAST
gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2: Sản Tên Nấm mốc
Mã số truy cập
Độ tương
đồng (%)
phẩm PCR sau khi được tinh sạch
A.oryzae strain
gb|JX489381.1|
99,99%
tiến hành đọc trình tự bằng bộ kít Yz12
Bigdye 3.1 trên máy 3100 (ABI- A.oryzae
emb|FN823241.|
99.99%
Mỹ); Sau khi phân tích trình tự partial
A.oryzae strain
gb|HM064501.1|
99,99%
gen của chủng T6, có kết quả ở SEMCC-3.248
A. spp
gb|HM590656.1|
99,99%
Bảng 3.2 cho thấy trình tự
nucleotide này có độ tương đồng cao đạt tới 99% so với trình tự đoạn
gen của A.oryzae đã được công bố trên Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế
với mã số gbJX489381.1; embFN823241.1 và gbHM064501.1. Kết quả

định tên bằng phương pháp sinh học phân tử hoàn toàn phù hợp với kết
quả phân loại dựa trên các đặc điểm phát triển và hình thái học. Sau khi
kết hợp cả hai phương pháp: Phân loại Aspergillus theo khóa phân loại
của Klich và so sánh trình tự gen, có thể khẳng định chủng T6 là loài
A.oryzae, ký hiệu là A.oryzae T6.
3.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của A.oryzae T6
trong nhân giống trên môi trường rắn
3.2.1. Ảnh hưởng của thành
phần cơ chất môi trường rắn
đến sinh trưởng của A.oryzae
T6: KQ (Hình 3.3) cho thấy
A.oryzae T6 có thể phát triển
trên tất cả các môi trường khảo
sát, tuy nhiên do thành phần
dinh dưỡng của môi trường
khác nhau nên mật độ tế bào
của A.oryzae T6 thay đổi từ 31
Hình 3.3 Ảnh hưởng của thành phần
× 106 đến 68 × 106 CFU/g. Xác cơ chất môi trường rắn đến mật độ tế
định được môi trường M5 cho bào của A.oryzae T6
mật độ tế bào đạt cao nhất 68 × Ghi chú: M1 có tỷ lệ: Bột ngô : trấu là 4 : 1;
M2 là Đỗ tương : trấu là 4 : 1; M3 là Cám gạo
106 CFU/g.
: trấu là 4 : 1; M4 là Gạo : trấu là 4 : 1; M5 là
Cám gạo : gạo : trấu là 2 : 2 : 1. Các môi
trường này đều có độ ẩm 50% và pH 5,5.


9
3.2.2. Ảnh hưởng của thành

phần tỷ lệ trấu trong môi
trường rắn đến sinh trưởng
của A.oryzae T6: KQ ở Hình
3.4 cho thấy tỷ lệ trấu 20 %
trong môi trường rắn có thành
phần cám gạo và gạo (tỷ lệ 1:1),
cho mật độ tế bào cao nhất
trong nhân giống A.oryzae T6
đạt 66 x106 CFU/g sau 72 giờ
nuôi ở nhiệt độ 30 ± 20C.
3.2.3. Ảnh hưởng độ ẩm ban
đầu của môi trường nhân
giống đến sinh trưởng của
A.oryzae T6: KQ Hình 3.5 cho
thấy độ ẩm môi trường rắn ảnh
hưởng tới tốc độ phát triển của
A.oryzae T6, độ ẩm 55% ban
đầu ở môi trường rắn nhân
giống cho mật độ tế bào cao
nhất trong nhân giống A.oryzae
T6 đạt 65x107 CFU/g sau 120
giờ nuôi ở nhiệt độ 30 ± 20C.
3.2.4. Ảnh hưởng pH ban đầu
của môi trường nhân giống
đến sinh trưởng của A.oryzae
T6: KQ ở Hình 3.6 cho thấy pH
môi trường có ảnh hưởng đến
sinh trưởng của A.oryzae T6,
pH 5,5 ban đầu của môi trường
nhân giống cho A.oryzae T6

sinh trưởng đạt mật độ tế bào
lớn nhất, đạt 67 x 106 CFU/g
sau 72 giờ nuôi ở nhiệt độ 30 ±
20C.

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thành phần
tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến
mật độ tế bào của A.oryzae T6

Hình 3.5 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu
của môi trường nhân giống đến mật
độ tế bào của A.oryzae T6

Hình 3.6 Ảnh hưởng pH ban đầu
của môi trường nhân giống đến mật
độ tế bào của A.oryzae T6


10
3.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ
nhân giống đến sinh trưởng
của A.oryzae T6: KQ ở Hình
3.7 cho thấy, nhiệt độ 200C và
400C A.oryzae T6 phát triển với
mật độ tế bào thấp tương ứng là
41x106 CFU/g và 51x106
CFU/g. Ở nhiệt độ 300C mật độ
tế bào của A.oryzae T6 cao
nhất, đạt 69×106 CFU/g sau 72
giờ nhân giống.

3.2.7. Ảnh hưởng của độ dày
khối môi trường nhân giống
đến sinh trưởng của A.oryzae
T6: KQ ở Hình 3.8 cho thấy độ
dày khối môi trường khác nhau
cho khả năng sinh trưởng của
nấm mốc khác nhau, ở độ dày
khối môi trường 6 cm cho sinh
trưởng của A.oryzae T6 có mật
độ tế bào lớn nhất, đạt 67x107
CFU/g sau 120 giờ nhân giống
ở nhiệt độ 30 ± 20C
3.2.8. Ảnh hưởng của thời gian
nhân giống đến sinh trưởng
của A.oryzae T6: KQ ở Hình
3.9 cho thấy thời gian 5 ngày
nhân giống A.oryzae T6 là phù
hợp cho mật độ tế bào cao, đạt
67x107 CFU/g ở nhiệt độ 30 ±
20C, môi trường có tỷ lệ khối
lượng cám gạo : gạo : trấu là 2 :
2 : 1; độ ẩm ban đầu là 55%, pH
5,5; độ dày khối môi trường là 6
cm, tỷ lệ tiếp giống ban đầu là
105 CFU/g,

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ
nhân giống đến mật độ tế bào của
A.oryzae T6

Hình 3.8 Ảnh hưởng của độ dày
khối môi trường nhân giống đến mật
độ tế bào của A.oryzae T6

Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian
nhân giống đến mật độ tế bào của
A.oryzae T6


11
3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến
bằng A.oryzae T6
3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất
môi trường lên men đến khả năng
hình thành AGIs bằng A.oryzae T6:
KQ ở Hình 3.10 cho thấy, các cơ chất
được khảo sát đều cho mật độ tế bào
khoảng 106 CFU/g, trong đó đỗ đen
xanh lòng là thích hợp nhất để lên men
hình thành AGIs bằng A.oryzae T6
với hoạt tính kìm hãm α-glucosidase
cao nhất (là 68,63±0,25% sau 48 giờ
lên men ở nhiệt độ 30±20C)
3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ
lệ cám gạo bổ sung vào môi trường
lên men đến khả năng hình thành
AGIs bằng A.oryzae T6: KQ Hình
3.11 cho thấy môi trường đỗ đen xanh
lòng có 10% cám gạo được chọn để
lên men hình thành AGIs bằng

A.oryzae T6 cho hoạt tính kìm hãm αglucosidase cao nhất (là 68,40 ± 1,24
% sau 48 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ±
20C).
3.3.3. Ảnh hưởng của thành phần
K2HPO4, KCL và MgSO4 bổ sung vào
môi trường lên men bằng A.oryzae
T6 đến khả năng hình thành AGIs:
KQ Hình 3.12 cho thấy nên sử dụng
lượng S, P, K thích hợp với tỷ lệ ở
công thức MT3 có thành phần khối
lượng đỗ đen xanh lòng : cám gạo :
K2HPO4 : KCL : MgSO4 là 900 : 100
: 0,4 : 0,08 : 0,4 cho lên men hình
thành AGIs bằng A.oryzae T6 với
hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao
nhất (là 72,60 ± 0,78 % sau 60 giờ lên
men ở nhiệt độ 30 ± 20C).

khả năng hình thành AGIs

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nguồn
cơ chất môi trường đến hoạt tính
kìm hãm α – glucosidase và mật độ
tế bào của A.oryzae T6

Hình 3.11 Ảnh hưởng của thành
phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi
trường lên men bằng A.oryzae T6
đến hoạt tính kìm hãm αglucosidase

Hình 3.12 Ảnh hưởng của thành
phần K2HPO4, KCL và MgSO4 bổ
sung vào môi trường lên men bằng
A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm
α-glucosidase
Ghi chú:


12

3.3.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của
môi trường lên men bằng
A.oryzae T6 đến khả năng hình
thành AGIs: KQ Hình 3.13 cho
thấy pH 5,5 ban đầu của môi
trường lên men rắn là thích hợp
nhất để lên men hình thành AGIs
bằng A.oryzae T6 với hoạt tính kìm
hãm α-glucosidase cao nhất (là
68,27 ± 0,71% sau 60 giờ lên men
ở nhiệt độ 30 ± 20C)
3.3.5. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu
của môi trường lên men bằng
A.oryzae T6 đến khả năng hình
thành AGIs: KQ ở Hình 3.14 cho
thấy độ ẩm 55% ban đầu của môi
trường lên men rắn là thích hợp
nhất để lên men hình thành AGIs
bằng A.oryzae T6 với hoạt tính kìm
hãm α-glucosidase cao nhất (là

74,60 ± 1,03% sau 60 giờ lên men
ở nhiệt độ 30 ± 20C).
3.3.6. Ảnh hưởng độ đầy khối
môi trường lên men bằng
A.oryzae T6 đến khả năng hình
thành AGIs: KQ Hình 3.15 cho
thấy độ dày khối môi trường lên
men 6 cm cho lên men rắn là thích
hợp nhất để lên men hình thành
AGIs bằng A.oryzae T6 với hoạt
tính kìm hãm α-glucosidase cao (là
82,15 ± 1,02 % sau 60 giờ lên men
ở nhiệt độ 30 ± 20C) vì ở độ dày
này vẫn đảm bảo độ thoáng khí và
tiết kiệm diện tích lên men.

Hình 3.13 Ảnh hưởng pH ban đầu
của môi trường lên men bằng A.oryzae
T6 đến hoạt tính kìm hãm α glucosidase

Hình 3.14 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu
của môi trường lên men bằng A.oryzae
T6 đến hoạt tính kìm hãm α glucosidase

Hình 3.15 Ảnh hưởng độ đầy của khối
khối môi trường lên men bằng A.oryzae
T6 đến hoạt tính kìm hãm α glucosidase


13

3.3.7. Ảnh hưởng của lượng giống
ban đầu lên men bằng A.oryzae
T6 đến khả năng hình thành
AGIs: KQ ở Hình 3.16 cho thấy
lượng giống ban đầu 106 CFU/g là
phù hợp cho lên men hình thành
AGIs bằng A.oryzae T6 với hoạt
tính kìm hãm α-glucosidase cao (là
75,31 ± 1,17% sau 60 giờ lên men ở
nhiệt độ 30 ± 20C) Điều này cũng
phù hợp với các nghiên cứu của
Shie-Jea Lin và cộng sự (2010).
3.3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên
men bằng A.oryzae T6 đến khả
năng hình thành AGIs: KQ Hình
3.17 cho thấy nhiệt độ 30 ± 20C là
phù hợp cho lên men hình thành
AGIs bằng A.oryzae T6 với hoạt
tính kìm hãm α-glucosidase cao (là
81,23 ± 1,54 % sau 60 giờ lên men)
và cũng là nhiệt độ thích hợp cho
sinh trưởng của chủng đã được
khảo sát (mục 3.2.5). Kết quả này
cũng phù hợp với nghiên cứu của
Hiroyuki Fujita đã công bố.
3.3.9. Sự biến động AGIs trong
quá trình lên men bề mặt trên môi
trường rắn bằng A.oryzae T6: KQ
ở Hình 3.18 cho thấy 58 giờ lên
men là phù hợp cho lên men hình

thành AGIs bằng A.oryzae T6 với
hoạt tính kìm hãm α-glucosidase
cao nhất là 86,90 ± 0,47 % trên môi
trường có thành phần tỷ lệ khối
lượng đỗ đen xanh lòng : cám gạo :
K2HPO4 : KCL : MgSO4 tương ứng

Hình 3.16 Ảnh hưởng của lượng
giống ban đầu lên men bằng A.oryzae
T6 đến hoạt tính kìm hãm α glucosidase

Hình 3.17 Ảnh hưởng của nhiệt độ
lên men A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm
hãm α-glucosidase

Hình 3.18 Hoạt tính kìm hãm αglucosidase trong quá trình lên men bề
mặt trên môi trường rắn bằng A.oryzae
T6


14
là 900 : 100 : 0,4 : 0,08 : 0,4; độ ẩm là 55%; pH ban đầu là 5,5; độ dày
khối môi trường là 6 cm, tỷ lệ tiếp giống ban đầu là 106 CFU/g và nhiệt
độ 30 ± 20C).
3.4. Chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6 bằng
sử dụng sóng siêu âm
3.4.1. Ảnh hưởng của dung môi
đến khả năng chiết xuất AGIs từ
đỗ đen lên men: KQ Hình 3.19 cho
thấy, khả năng chiết xuất AGIs của

methanol và ethanol là lớn nhất.
Khả năng chiết xuất AGIs của
methanol lớn hơn so với ethanol
không nhiều, trong khi đó IC50 của
chất hòa tan trong ethanol mạnh
nhất (IC50 là 427,32 ± 12,36 Hình 3.19 Ảnh hưởng của dung môi
µg/ml), mạnh hơn cả dung môi chiết xuất đến hoạt tính kìm hãm αchiết xuất là methanol (IC50 là glucosidase (%) và IC50 của dịch chiết
480,43 ± 14,57 µg/ml),thấp nhất là đỗ đen lên men
dung môi chiết xuất là nước (IC50 là 563,21 ± 11,61µg/ml). Do đó
ethanol được lựa chọn làm dung môi chiết xuất AGIs, cho hoạt tính kìm
hãm α-glucosidase là 61,87 ± 1,31%, IC50 là 427,32 ± 12,36 µg/ml sau 6
phút chiết xuất ở tỷ lệ dung môi ethanol 96% : bột đỗ đen lên men là 6 :
1 (lít / kg), ở nhiệt độ 600C, siêu âm cường độ 8W/cm2 ở tần số 20 kHz.
3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ
ethanol đến khả năng chiết xuất
AGIs từ đỗ đen lên men: KQ ở
Hình 3.20 cho thấy nồng độ
ethanol 50% phù hợp cho chiết
xuất AGIs cao từ đỗ đen lên men,
với hoạt tính kìm hãm αglucosidase cao nhất là 84,63 ±
2,17% và IC50 mạnh nhất là 235,41
± 13,26 µg/ml sau 6 phút chiết xuất
ở tỷ lệ dung môi : bột đỗ đen lên Hình 3.20 Ảnh hưởng của nồng độ
men là 6 : 1 (lít / kg), ở nhiệt độ dung môi ethanol đến hoạt tính kìm
600C, siêu âm cường độ 8W/cm2 ở hãm α-glucosidase (%) và IC50 của
dịch chiết đỗ đen lên men
tần số 20 kHz).


15

3.4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung
môi ethanol và đỗ đen lên men đến
khả năng chiết xuất AGIs: Kết quả
(Hình 3.21) cho thấy ở tỷ lệ ethanol
50% : đỗ đen lên men là 6 lít / kg
được lựa chọn sử dụng cho quá trình
chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men
bằng sóng siêu âm là phù hợp, cho
hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt
Hình 3.21 Ảnh hưởng của tỷ lệ
84,63 ± 1,41 % sau 6 phút chiết xuất dung môi ethanol và đỗ đen lên men
ở nhiệt độ 600C, siêu âm cường độ đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase
8W/cm2 ở tần số 20 kHz.
(%) của dịch chiết đỗ đen lên men
3.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến
khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen
lên men: Kết quả nghiên cứu (Hình
3.22) cho thấy chiết xuất AGIs từ đỗ
đen lên men bằng sóng siêu âm ở 600
C là phù hợp (cho hoạt tính kìm hãm
α-glucosidase cao (84,65 ± 2,41%)
và có IC50 mạnh nhất là 260,92 ± 11,
37µg/ml sau 6 phút chiết xuất tỷ lệ Hình 3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ
dung môi ethanol 50% : bột đỗ đen đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase
là 6/1, siêu âm cường độ 8W/cm2 ở (%) và IC50 của dịch chiết đỗ đen lên
men
tần số 20 kHz).
3.4.5. Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả
năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6: KQ Hình
3.23 cho thấy cho thấy năng lượng sóng siêu âm đem lại hiệu quả khả

năng chiết xuất chất AGIs, tăng cường độ sóng siêu âm phần lớn tăng
khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men. Xác định được mức thời
gian 10 phút siêu âm chiết xuất ở cường độ siêu âm 8 W/cm2 cho hoạt
tính kìm hãm α-glucosidase cao (89,85 ± 0,97%) và IC50 mạnh (230,00
± 4,47µg/ml) được lựa chọn phù hợp nhất cho chiết xuất chất AGIs từ
đỗ đen lên men. Kết quả (Bảng 3.3) cho thấy chiết xuất bằng sóng siêu
âm cường độ 8W/cm2 với tần số 20 kHz ở nhiệt độ 60 ± 1,00C trong 10
phút cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase là 89,85 ± 0,97%, IC50 là
230,00 ± 4,47 µg/ml và lượng chất khô thu được 2,28 ± 0,042%,
phương pháp chiết xuất không sử dụng sóng siêu âm, chiết ở nhiệt độ 60
± 1,00C trong 10 phút cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt 58,54 ±


16
0,84%, IC50 là 608,18 ± 5,03 µg/ml và lượng chất khô thu được 1,49 ±
0,031%, chiết xuất không sử dụng sóng siêu âm ở nhiệt độ 800C trong
120 phút (2 giờ) cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt 78,20 ± 1,06
%, IC50 là 516,15 ± 6,21 µg/ml và lượng chất khô thu được 5,12 ±
0,43%. Cho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase chiết xuất đều thấp
hơn và hoạt lực kìm hãm α-glucosidase có IC50 đều yếu hơn so với chiết
xuất ở cường độ siêu âm 8w/ cm2 ở thời gian 10 phút hoạt tính kìm hãm
α-glucosidase bằng sóng siêu âm cường độ 8W/cm2 cao hơn 11,65 % so
với chiết xuất không có siêu âm trong 2 giờ ở nhiệt độ 800C và giảm
đáng kể nhiệt độ chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bởi A.oryzae T6 từ
nhiệt độ 800C ở quá trình chiết xuất thông thường để giảm nhiệt độ chiết
xuất ở nhiệt độ 600C trong quá trình sử dụng sóng siêu âm, giảm khoảng
25% nhiệt độ chiết xuất.

Hình 3.23 Ảnh hưởng của thời gian, cường độ sóng siêu âm đến hoạt tính kìm hãm
α-glucosidase (%) và IC50 của dịch chiết đỗ đen lên men

Kết quả cho thấy điều kiện thích hợp chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên
men bằng A.oryzae T6 cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao là


17
89,85 ± 0,97%, hoạt lực kìm hãm α-glucosidase cho IC50 mạnh là
230 ± 4,47 µg/ml ở cường độ siêu âm 8 W/cm2 sau 10 phút siêu âm ở
điều kiện: Tỷ lệ dung môi ethanol 50% : bột đỗ đen lên men là 6 lít /
kg, siêu âm cường độ 8W/cm2 với tần số 20 kHz / dung tích 20 lít ở
nhiệt độ chiết xuất ở nhiệt độ 600C
Bảng 3.3 So phương pháp chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng sử dụng sóng
siêu âm và không sử dụng sóng siêu âm
Chỉ tiêu

Đơn
vị

Dung môi ethanol 50%:
Đỗ đen nguyên liệu
Nhiệt độ chiết xuất
Thời gian
IC50
Lượng chất khô so với
đỗ đen lên men
Hoạt tính kìm hãm αglucosidase ở dịch chiết

l / kg
0

C
phút
µg/ml
(%)
%

Chiết xuất - siêu âm
cường độ 8W/cm2 ở
tần số 20 kHz
6

Chiết xuất không sử dụng sóng
siêu âm
6

6

60 ± 1,0
10
230 ± 4,47
2,28 ± 0,042

60 ± 1,0
10
608,18 ± 5,03
1,49 ± 0,031

80 ± 1,0
120
516,15 ± 6,21

5,12 ± 0,43

89,85 ± 0,97

58,54 ± 0,84

78,20 ± 1,06

3.5. Tinh sạch và định lượng AGIs từ đỗ đen lên men bằng
A.oryzae T6
3.5.1. Khảo sát dung môi để tinh
sạch sơ bộ AGIs: Chế phẩm
AGIs chiết xuất từ đỗ đen lên
men sau khi kết tủa bằng các
dung môi methanol, ethanol và
isopropyl alcohol (Hình 3.24) cho
thấy, hoạt tính kìm hãm αglucosidase tập trung chủ yếu ở
phần tan trong dung môi, còn
phần kết tủa rất thấp. Phần tan có
Hình 3.24 So sánh giá trị IC50 của
giá trị IC50 theo thứ tự: methanol, AGIs thu được ở phần kết tủa và phần tan
isopropyl alcohol và ethanol lần khi sử dụng methanol, ethanol và
lượt là 0,072; 0,064 và 0,058
isopropyl alcohol
mg/ml, mạnh hơn nhiều so với đối chứng (chế phẩm AGIs chiết xuất có
IC50 là 0,23 mg/ml). Như vậy, cả ba loại dung môi khảo sát đều có thể
sử dụng để tinh sạch AGIs sơ bộ, trong đó ethanol cho khả năng tinh
sạch sơ bộ với hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao nhất.

18
3.5.2. Khảo sát nồng độ ethanol
để tinh sạch sơ bộ AGIs: KQ
Hình 3.25 cho thấy khả năng tủa
tạp chất để tinh sạch AGIs phụ
thuộc vào nồng độ ethanol. Lượng
chất khô hòa tan ở trường hợp sử
dụng ethanol 90% (14,04 % chất
khô) lớn hơn ở trường hợp sử dụng
ethanol 95% (13,95 % chất khô).
Nồng độ chất tan ở hai nồng độ
Hình 3.25 So sánh giá trị IC50 của chất
90% và 95% ethanol chênh lệc
khô ở phần tủa và phần tan khi sử dụng
không đáng kể. Do đó có thể lựa các nồng độ ethanol khác nhau để làm
chọn nồng độ ethanol 90% để tinh sạch chế phẩm AGIs chiết xuất từ đỗ đen
sạch sơ bộ AGIs.
lên men
3.5.3. Tinh sạch AGIs: Để chứng minh bản
chất của chất có hoạt tính kìm hãm αglucosidase từ đỗ đen lên men, từ chế phẩm
AGIs tinh sạch sơ bộ, xử lý bằng các enzyme
thủy phân khác nhau theo phương pháp của a)
Min-Gu-Kang và cộng sự, năm 2013. Các
dịch có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase từ
đỗ đen lên men được xử lý thủy phân lần
lượt bằng pepsin, trypsin, pancreatin, αamylase và maltase ở điều kiện phản ứng tối b)
Hình 3.26 Sắc ký đồ có píc
ưu cho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase
của AGIs (a). Hình dạng píc
tăng sau khi xử lý (IC50 trước khi xử lý là của AGIs (b)

57,84 µg/ml và sau xử lý là 41,5 µg/ml).
Điều này cho thấy AGIs chiết từ đỗ đen lên men không bị thủy phân bởi
các enzyme này. Kết quả này phù hợp so với công bố của Min–Gu Kang
và cộng sự (2013) về AGIs từ đỗ tương lên men bằng A.oryzae N159-1 có
bản chất là peptide.Chế phẩm AGIs chiết xuất sau khi tinh sạch sơ bộ bằng
ethanol 90% và xử lý bằng pepsin đã được phân tích hoạt tính kìm hãm αglucosidase cho IC50 là 41,52 µg/ ml. Dịch chiết này được tách phân đoạn
bằng RP - HPLC. Các phân đoạn thu được bằng chương trình gradient. Sau
đó, từng phân đoạn được kiểm tra lại độ tinh sạch bằng RP - HPLC và phân
tích hoạt tính kìm hãm α-glucosidase. Kết quả thu được cho thấy chỉ có một
phân đoạn có pic như trên sắc ký đồ tại khoảng thời gian 23,5 đến 24 phút
(Hình 3.26a), có bước sóng ở chân đỉnh là 232 nm, đỉnh là 266 nm (Hình
3.26b) cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao nhất (IC50 là 8,21 µg/ml) và
có một píc duy nhất so với các phân đoạn còn lại (Hình 3.27c). Kết quả
1750

mAU
23.58/ 1.00

1500
1250

256

1000

232

750
500

200

300

400

500

600

700

775

719
727

0

678

603
622
640
644

250

nm

mAU
280nm,4nm (1.00)

100

75

50

25

0

23.5

24.0

24.5

min


19
(Bảng 3.4) cho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase tăng lên ở các bước
tinh sạch lần lượt là chiết đỗ đen lên men (IC50 là 230 µg/ml), tinh sạch sơ
bộ bằng ethanol 90% (IC50 là 57,84 µg/ml), xử lý pepsin (IC50 là 41,52
µg/ml) và cao nhất ở bước tinh sạch bằng RP - HPLC (IC50 là 8,12 µg/ml).
Ở nghiên cứu này, cho thấy AGIs tinh sạch từ đỗ đen lên men bằng
A.oryzae T6 có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao hơn so với AGIs từ
A.oryzae N159-1 (IC50 là 3,1 mg /mL), thấp hơn so với AGIs của nấm linh

chi (có IC50 của SKG-3 là 4,6 µg/ml), chiết từ vỏ cây thông (IC50 là 5 μg/ml)
đã được công bố.
a)
4000

b)

c)

mAU
280nm,4nm (1.00)

mAU
280nm,4nm (1.00)

mAU
125 280nm,4nm (1.00)

1500

3500
3000

1250

100

1000

75

750

50

2500
2000
1500
1000

500

25

500

250

0

0.0

0
0.0

-500
5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

min

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

min

0
0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

min

Hình 3.27 Sắc ký đồ môi trường đỗ đen xanh lòng trước khi lên men (a). Sắc ký đồ
dịch sau khi lên men, trước tinh sạch (b). Sắc ký đồ AGIs sau khi tinh sạch (c)

Kết quả ở Hình 3.27 cho thấy: Sắc ký của mẫu đỗ đen sau lên men, trước
tinh sạch (Hình 3.27 b) thu được một số pic mới so với sắc ký đồ của mẫu
đỗ đen trước khi lêm men (Hình 3.27 a) không có và kết quả sắc ký đồ ở
mẫu sau khi tinh sạch có một píc ở thời gian khoảng 24 phút (Hình 3.27c)
có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, píc này trùng với píc mới ở sắc ký đồ
dịch sau khi lên men, trước tinh sạch (Hình 3.27 b). Kết quả này cho thấy
nguồn gốc của peptide AGIs là được hình thành bằng lên men A.oryzae T6
trên môi trường đỗ đen xanh lòng.

3.5.4. Xác định khối lượng phân tử và trình tự axit amin của
peptide AGIs tinh sạch từ đỗ đen bằng khối phổ: Mẫu chế phẩm
AGIs tinh sạch được phân tích bằng thiết bị MALDI-TOF/TOF mass
spectrometer theo phương pháp của Bringans và cộng sự 2008, thực hiện
bằng khối phổ cho thấy chất tinh sạch này có khối lượng phân tử 926,4861
Da tương ứng là một đoạn peptide có trình tự axit amin là YIYEIAR. Khi so
sánh với ngân hàng giữ liệu của LudwigNR thì không thấy có sự trùng lặp

nào của đoạn peptide này trong các protein đã được công bố. Ngược lại,
bằng sử dụng dữ liệu của SwissPro cho thấy chất tinh sạch AGIs này là một

Hình 3.28 Khối lượng phân tử và trình tự axit amin của peptide AGIs tinh sạch
được thực hiện bằng khối phổ. R.YLYEIAR.R


20
đoạn peptide, có trình tự axit amin YIYEIAR trùng với trình tự axit amin
trong đoạn peptide của FETA_BOVIN (Alpha-fetoprotein từ huyết thanh
bào thai bò) là R.YIYEIAR.R (Hình 3.28 và Phụ lục KQ KP) Nghiên cứu
này cho thấy peptide AGIs tinh sạch từ đỗ đen lên men cho khối lượng phân
tử lớn hơn so với peptide AGIs thu được từ dịch lên men lỏng bằng
A.oryzae N159-1 (360,1 Da) đã được công bố.

3.5.5. Định lượng peptide AGIs của đỗ đen lên men: AGIs sau khi
tinh sạch, dùng peptide AGIs này làm chất chuẩn để định lượng peptide
AGIs trong mẫu đỗ đen lên men bằng RP - HPLC thông qua diện tích píc
thu được. Định lượng được peptide AGIs trong đỗ đen sau lên men bằng
A.oryzae T6 là 1,83 mg/g (0,183%). Kết quả xác định hiệu suất tinh sạch
AGIs của sản phẩm sau các bước tinh sạch được trình bày ở Bảng 3.4.
Sau khi tinh sạch sơ bộ bằng ethanol 90%, hiệu suất đạt 87,81 %, sau
khi xử lý bằng pepsin – đạt 86,46 % và tinh sạch bằng RP - HPLC - hiệu
suất 57,92 %. Các sản phẩm sau các bước tinh sạch có độ tinh sạch tăng
dần, hàm lượng lần lượt là: 50,216; 56,501 và 99,99 % peptide AGIs.
Bảng 3.4 Đánh giá sản phẩm sau các bước tinh sạch AGIs từ đỗ đen lên men
Bước tinh sạch

Hoạt lực AGIs
(IC50 µg/ml)

-

Lượng chất
khô(%)
100

Hiệu suất
(%)
-

Độ tinh sạch

Chiết xuất đỗ đen lên men

230,00

2,28

100

8,026

Tinh sạch sơ bộ bằng
ethnol 90%
Xử lý pepsin
Tinh sạch bằng RP-HPLC

57,84

0,32

87,81

41,52
8,12

0,28
0,106

86,45
57,92

Đỗ đen lên men

(% peptide AGIs)

0,183

50,216
56,501
99,99

3.6. Ứng dụng AGIs.
3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô sấy tạo chế phẩm đến chất lượng
chế phẩm AGIs: Bảng 3.5 cho thấy nhiệt độ 60 ± 20C là tối ưu để cô
sấy tạo chế phẩm AGIs cho hiệu quả cao về chất lượng cảm quan sản
phẩm và thời gian sấy (điểm cảm quan cao nhất đạt 29,5 điểm).
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ cô sấy chân không đến chất lượng cảm quan,
hoạt tính kìm hãm α-glucosidase và thời gian cô đến chất lượng chế phẩm AGIs
Nhiệt độ

cô sấy (0C)

(IC50
(µg/ml))

Thời gian
(phút)

50 ± 2
60 ± 2
70 ± 2
80 ± 2
90 ± 2
100 ± 2

231,72 ± 0,12
231,57 ± 0,21
231,31 ± 0,35
231,22 ± 0,28
231,12± 0,31
229,07± 0,38

270
155
125
110
95
65

Màu

sắc
7,5
7,5
7,0
7,0
6,5
5,5

Mùi
8
7,5
7,0
6,5
6,5
6

Cảm quan
Vị
Trạng
thái
7
7
7,5
7
7
7
6,5
7
7
6,5

6,5
6,5

Tổng
điểm
29,5
29,5
28
27
26,5
24,5


21
3.6.2. Đánh giá chỉ tiêu chất lượng, cảm quan và an toàn thực
phẩm của chế phẩm AGIs: KQ (Bảng 3.6) cho thấy chế phẩm AGIs
từ đỗ đen lên men có hoạt lực kìm hãm α-glucosidase với giá trị
IC50 = 0,23 mg/ml, cho thấy IC50 của chế phẩm AGIs từ đỗ đen lên
men cao hơn gấp đôi so với chất chiết touchi (từ đỗ tương lên men bề
mặt, công bố với giá trị IC50 là Bảng 3.6 Kết quả phân tích hoạt tính
0,54 mg/ml), cao hơn so với kìm hãm α-glucosidase, dinh dưỡng và
các chỉ tiêu lý hóa của chế phẩm AGIs
một số loại thực phẩm như dịch
Đơn vị
Kết quả
Tên chỉ
chiết trà xanh và trà ô long có
tính
tiêu
IC50

( mg/ml)
0,23
IC50 lần lượt là 73,5 và 134
Hàm lượng
(%)
0,15
mg/ml. Bảng 3.7) cho thấy sản
lipit
phẩm tạo ra được đạt một số các
Hàm lượng
(%)
65
protein
chỉ tiêu hàm ẩm và lượng tro
Độ ẩm
(%)
2,5
tổng số, phân tích kim loại nặng
Hàm lượng
(%)
0,45
và vi sinh vật cho thấy sản
tro tổng số
Cảm quan
Màu sắc
Màu be sáng
phẩm chế phẩm AGIs có hoạt
Cảm quan
Vị
Nhạt

lực kìm hãm α-glucosidase từ
Cảm quan
Mùi
Thơm nhẹ
đỗ đen xanh lòng lên men bằng
Cảm quan
Khả năng
Tan, có mầu
hòa tan
be
A.oryzae T6 đã đáp ứng được
các yêu cầu về giới hạn kim loại nặng và vi sinh vật cho phép trong
thực phẩm.
Bảng 3.7 Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật, kim loại nặng và các chất
không mong muốn trong sản phẩm chế phẩm AGIs
Chỉ tiêu
Tổng số vi khuẩn hiếu khí
Tổng số bào tử nấm men – mốc
Coliforms (370C/ 48 giờ)
E. Coli (370C/ 96 giờ )
S. aureus (370C/ 48 giờ)
Cl.Perfringens
Salmonella (370C/ 48 giờ)
B.cereus
Hàm lượng chì (Pb)
Hàm lượng Asen (As)
Hàm lượng Cadimi (Cd)
Hàm lượng thủy ngân (Hg)
Hàm lượng đồng (Cu)
Aflatoxin

3-MCPD

Đơn vị
tính
cfu/g
cfu/g
cfu/g
cfu/g
cfu/g
cfu/g
cfu/25g
cfu/g
mg/kg
mg/kg
(mg/kg)
(mg/kg)
(mg/kg)
µg/kg
µg/kg

Kết
quả
KPH
KPH
KPH
KPH
KPH
KPH
KPH
KPH

KPH
KPH
KPH
KPH
KPH
KPH
KPH

Giới hạn
nhiễm*
104
102
10
0
3
10
0
10
≤ 10,0
≤ 5,0
≤ 0,3
≤ 0,5
≤ 5,0
≤ 5,0
50

Phương pháp thiết bị
TCVN 4884:2005
TCVN 6265:2007
TCVN 4882:2007

TCVN 6846:2001
TCVN 4830:2005
TCVN 4991:2005
TCVN 4829:2005
TCVN 4992:89
AOAC 994,02
AOAC 952,13
AOAC 2000(F-AA)
AOAC -1997
ISO 8.294:1994
HPLC
GCMS

Ghi chú: KPH: Không phát hiện (nghĩa là dưới ngưỡng phát hiện của phương pháp (0,002 mg/kg)).


22

Kết quả (Bảng 3.8) cho thấy chế phẩm Bảng 3.8 Số liệu thử độc tính
AGIs đạt chỉ tiêu độc tính cấp của chế cấp của chế phẩm AGIs
Liều uống
Số chuột
Số
phẩm AGIs trên chuột với liều tương
(g bột/ kg trong 1 lô
chuột
đương gấp 996 lần liều uống trên người 60
thể trọng)
chết
mg/ ngày, cho thấy chuột vẫn khỏe mạnh,

8
10
0
hoạt động ăn uống và bài tiết bình thường.
10
10
0
12
10
0
Bột chế phẩm chế phẩm AGIs có độ an
toàn cao.

3.6.7. Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm AGIs cho sản xuất thử
nghiệm bột uống liền AGIs cho người bệnh ĐTĐ: KQ Bảng 3.9
cho thấy đánh giá cảm quan bằng phép thử thị hiếu, nhìn chung là
các công thức phối trộn tạo ra sản phẩm đã đưa ra được người thử
đánh giá khá cao. Tuy nhiên cần lựa chọn ra công thức mà người thử
nghiệm ưa thích nhất. Công thức T2 cho kết quả đánh giá cao nhất
với tổng điểm là 29,5 điểm. Tiếp đến là T3 cho kết quả thứ 2 với
29,0 điểm. Các công thức không có sự khác nhau nhiều ở mức ý
nghĩa 5%. Bước đầu đã Bảng 3.9 Kết quả điểm đánh giá cảm quan cho
chọn được nguyên liệu các chỉ tiêu của sản phẩm bột uống liền
Công
Chỉ tiêu
phối chế phù hợp cho
thức
Màu
Mùi
Vị

Trạng
Tổng
công thức tạo sản phẩm
sắc
thái
điểm
b
b
ab
a
T1
6,5
6,5
7,5
6,5
27,0
AGIs dạng bột uống liền
T2
7,5a
7,0ab
8,0a
7,0a
29,5
là công thức T2 với tỷ lệ
T3
7,5a
7,5a
7,0b
7,0a
29,0

(%): chế phẩm AGIs :
T4
7,5a
7,0ab
7,0b
6,5a
28,0
T5
7,0ab
7,0ab
7,0b
7,0a
28,0
Stevioside : lactose là 50
LSD
0,732 0,624 0,653 0,604
: 1 : 49.
0,05
Chú thích: a, b là sai khác giữa các công thức trong
cùng một thời điểm có ý nghĩa ở mức ý nghĩa = 5%.

Chương 4. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT
CHẾ PHẨM AGIs TỪ ĐỖ ĐEN XANH LÒNG LÊN MEN BẰNG
A.ORYZAE T6
Lên men đỗ đen xanh lòng bằng A.oryzae T6
Bước 1. Chuẩn bị nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị: Chuẩn bị nguyên
liệu: Đỗ đen xanh lòng, cám gạo, K2HPO4, KCL và MgSO; Chuẩn bị
dụng cụ và thiết bị: Khay lên men bề mặt (có kích thước 55 x 40 x 15
cm) vô trùng; nồi hấp vô trùng; máy sấy; đũa vô trùng dùng để trộn

23
giống với môi trường; phòng vô trùng cho lên men bề mặt giá thể rắn;
Vô trùng dụng cụ và phòng lên men bề mặt giá thể rắn: Khay, đũa để
trộn… được vô trùng bằng nồi hấp ở 1210C / 60 phút. Phòng lên men bề
mặt được làm sạch, tiệt trùng bằng đèn cực tím UV / 60 phút; Bước 2.
Chuẩn bị môi trường lên men: Phối trộn môi trường: Đỗ đen được ngâm
nước ở nhiệt độ 300C/10 giờ, để ráo nước rồi phối trộn với cám gạo theo
tỷ lệ đỗ đen/cám gạo là 90/10, bổ sung bổ sung K2HPO4 0,4 g/kg; KCL
0,4 g/kg và MgSO4 0,08 g/kg; điều chỉnh hàm ẩm của môi trường đạt
55%; pH 5,5; Khử trùng môi trường: Hấp vô trùng môi trường ở nhiệt
độ 1100C/ 30 phút; Bước 3. Cấy giống: Các khay vô trùng được đặt
trong phòng vô trùng (vô trùng phòng bằng tia UV trong 30 phút trước
khi cấy giống cho lên men bề mặt). Trộn giống mốc A.oryzae T6 với
môi trường lên men ở tỷ lệ tiếp giống là 106 CFU/g. Phân phối môi
trường đã cấy giống ra các khay, bề dày môi trường lên men giá thể rắn
ở các khay (55 x 40 x 15 cm) là 6 cm; Bước 4. Lên men bề mặt: Các
khay lên men bề mặt được đặt lên kệ trong phòng lên men bề mặt giá
thể rắn đã được vô trùng. Nhiệt độ lên men bề mặt là 30 ± 20C, thời gian
lên men bề mặt là 58 giờ; Bước 5. Thu môi trường sau lên men: Môi
trường sau khi lên men bề mặt được đem sấy ở nhiệt độ 600C đến hàm
ẩm đạt khoảng 5%, đem đóng gói, thu được sản phẩm đỗ đen lên men bề
mặt A.oryzae T6.
Chiết xuất và thu nhận chế phẩm AGIs từ đỗ đen lên men bằng
A.oryzae T6
Bước 1. Chuẩn bị nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị: Chuẩn bị nguyên
liệu: Đỗ đen xanh lòng đã lên men bề mặt, sấy khô có hàm ẩm 5%,
ethanol 50% (thực phẩm); Chuẩn bị dụng cụ và thiết bị: Máy nghiền bột
mịn (d = 0,8 mm), hệ thống chiết xuất sóng siêu âm cường độ 8W/cm2 ở
tần số 20 kHz / 20 lít, thiết bị cô đặc chân không 70 lít/mẻ; Bước 2. Xử

lý đỗ đen lên men: Đỗ đen lên men bề mặt hàm ẩm 5%, nghiền thành
bột có d = 0,8 mm; Bước 3. Chiết xuất: Bột đỗ đen lên men được
ngâm trong ethanol theo tỷ lệ: Dung môi ethanol 50% : bột đỗ đen
lên men là 6 lít / kg được chiết xuất bằng siêu âm cường độ 8W/cm2
với tần số 20 kHz / 20 lít ở thời gian chiết xuất là 10 phút ở nhiệt độ
600C; Bước 4. Thu dịch chiết: Dịch chiết được lọc bằng giấy lọc, cô thu
hồi dung môi ethanol ở nhiệt độ 600C, - 0,8 atm được dịch chiết; Bước
5. Cô dịch tạo chế phẩm AGIs: Dịch chiết thu được tiếp tục cô ở 600C, 0,8 atm được cao đặc, sau đó sấy chân không ở nhiệt độ 600C, - 0,8 atm,
nghiền sản phẩm sấy khô thu được và tạo bột chế phẩm AGIs.


24
Chương 5. KẾT LUẬN
1. Từ 19 mẫu mốc được lấy ở một số cơ sở sản xuất tương đã phân lập,
tuyển chọn và định danh bằng phương pháp giải trình tự gen vùng ITS1
- 5,8S - ITS2 được A.oryzae T6 cho khả năng hình thành hoạt tính kìm
hãm α-glucosidase cao.
2. Xác định được điều kiện thích hợp đối với sinh trưởng của A.oryzae
T6 là môi trường rắn có thành phần tỷ lệ khối lượng cám gạo : gạo : trấu
tương ứng là 2 : 2 : 1; độ ẩm là 55%; pH là 5,5; ở độ dày khối môi
trường là 6 cm; tỷ lệ tiếp giống ban đầu là 105 CFU/g và nhân giống ở
nhiệt độ 30 ± 20C / 5 ngày (120 giờ).
3. Xác định được điều kiện thích hợp hình thành AGIs bằng A.oryzae T6
ở điều kiện tối ưu là môi trường rắn có tỷ lệ khối lượng đỗ đen xanh
lòng : cám gạo : K2HPO4 : KCL : MgSO4 tương ứng là 900 : 100 : 0,4 :
0,08 : 0,4; độ ẩm là 55%; pH ban đầu của môi trường là 5,5; độ dày khối
môi trường là 6 cm, tỷ lệ tiếp giống ban đầu là 106 CFU/g; ở nhiệt độ 30
± 20C, thời gian lên men là 58 giờ
4. Xác định được điều kiện thích hợp chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men
bằng A.oryzae T6: Tỷ lệ dung môi ethanol 50% : bột đỗ đen lên men là

6 lít / kg; ở nhiệt độ 600C, thời gian 10 phút siêu âm cường độ 8W/cm2 ở
tần số 20 kHz, dung tích 20 lít).
5. Xác định được điều kiện tinh sạch, định lượng AGIs và bản chất của
AGIs từ đỗ đen lên men: Tinh sạch sơ bộ AGIs từ chế phẩm AGIs thô
bằng ethanol 90% cho hiệu suất thu hồi đạt 87,81% và độ tinh sạch
50,216 %. Tinh sạch qua sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP HPLC) cho hiệu suất thu hồi đạt 57,92% và AGIs có hoạt tính kìm hãm
α-glucosidase đạt IC50 là 8,12 µg/ml với độ tinh sạch 99,99 %. Xác định
được bản chất của AGIs tinh sạch là peptide có khối lượng phân tử
926,4861 Da và xác định được lượng peptide AGIs trong đỗ đen lên
men chiếm 0,183 %.
6. Bước đầu ứng dụng có hiệu quả chế phẩm AGIs sản xuất bột ăn liền
cho người bệnh đái tháo đường và béo phì. Đây là kết quả bước đầu góp
phần làm phong phú thêm nguồn thu các chất có hoạt tính kìm hãm αglucosidase để ngăn ngừa bệnh đái tháo đường và béo phì.
KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
Tiến hành nghiên cứu về hiệu quả chức năng của peptide AGIs tinh sạch
được trên động vật thực nghiệm và thử nghiệm lâm sàng.