Nghiên cứu tạo que thử để phát hiện nhanh một số độc tố ruột của tụ cầu khuẩn trong thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN THỊ SAO MAI

NGHIÊN CỨU TẠO QUE THỬ ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH
MỘT SỐ ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU KHUẨN
TRONG THỰC PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN THỊ SAO MAI

NGHIÊN CỨU TẠO QUE THỬ ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH
MỘT SỐ ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU KHUẨN
TRONG THỰC PHẨM

Chuyên ngành

: Vi sinh vật học

Mã số

: 62 42 01 07

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Cán bộ hƣớng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Thị Khánh Trâm
2. TS. Lê Quang Hòa

HÀ NỘI, 2015


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự hƣớng
dẫn của tập thể các nhà khoa học hƣớng dẫn luận án. Các số liệu và kết quả thí
nghiệm trình bày trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất
kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày

tháng 05 năm 2015
NGHIÊN CỨU SINH

Trần Thị Sao Mai


LỜI CẢM ƠN
Hoàn thành Luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những người
thầy hướng dẫn: Thầy thuốc nhân dân, PGS.TS. BS. Nguyễn Thị Khánh Trâm,
Cục An toàn Thực phẩm, Bộ Y tế, TS. Lê Quang Hòa, Viện Công nghệ Sinh học và
Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, đã tận tình định hướng,
chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện Luận án.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà và các thầy cô
giáo, các cán bộ của Bộ môn Vi sinh vật học, các thầy cô giáo của Khoa Sinh học,

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình trang bị
kiến thức cho tôi trong suốt những năm qua.
Tôi xin được cảm ơn tới các thầy cô lãnh đạo và cán bộ, nghiên cứu viên Viện Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo
điều kiện giúp tôi cơ sở vật chất để thực hiện các thí nghiệm cho Luận án này.
Trong thời gian học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự hỗ trợ và động viên
của các thầy cô giáo lãnh đạo và cán bộ viên chức của Trường Đại học Kỹ thuật Y tế
Hải Dương, tạo điều kiện cho tôi về thời gian và vật chất, tinh thần để tôi hoàn thành
khóa học, tôi xin được cảm ơn sự giúp đỡ quí báu này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Chủ nhiệm khoa Sinh học, Phòng Sau đại
học và Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giúp tôi hoàn
thành các hồ sơ trong suốt quá trình học tập và bảo vệ luận án.
Trong suốt những năm qua, tôi luôn nhận được sự động viên, giúp đỡ về vật
chất và tinh thần của gia đình, những người thân, sự đồng cảm của bạn bè, đồng
nghiệp, đây là nguồn động lực lớn giúp tôi hoàn thành khóa học và Luận án này.
Tôi xin được trân trọng biết ơn sự giúp đỡ quí báu đó.
Hà Nội, ngày

tháng 04 năm 2015

NGHIÊN CỨU SINH

Trần Thị Sao Mai


MỤC LỤC
MỤC LỤC.................................................................................................................................1
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .....................................................5
DANH MỤC HÌNH ẢNH......................................................................................................7
DANH MỤC BẢNG ..........................................................................................9

CHƢƠNG 1 . TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ...............................................14
1.1.TỤ CẦU KHUẨN ................................................................................................................14
1.1.1. Đặc điểm sinh học của tụ cầu vàng.......................................................... 14
1.1.2. Những yếu tố ảnh hƣởng tới sản sinh độc tố ruột của tụ cầu ................ 15
1.1.3. Tình hình ngộ độc thực phẩm do tụ cầu .................................................. 17
1.1.3.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột tụ cầu trên thế giới...................17
1.1.3.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam.........................................................18
1.2. ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU .......................................................................................20
1.2.1. Đặc điểm sinh hóa, hóa lý và di truyền của độc tố ruột của tụ cầu ......... 20
1.2.2. Cấu trúc phân tử của độc tố ruột tụ cầu ................................................... 23
1.2.3. Hoạt tính sinh học của các độc tố ruột tụ cầu .......................................... 24
1.2.3.1. Hoạt tính siêu kháng nguyên...............................................................................25
1.2.3.2. Hoạt tính gây nôn.................................................................................................26
1.2.3.3. Cơ chế gây viêm dạ dày - ruột do độc tố tụ cầu................................................27
1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU ...............................29
1.3.1. Phép thử sinh học .................................................................................... 29
1.3.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử ................................................................ 29
1.3.3. Phƣơng pháp miễn dịch ........................................................................... 30
1.3.3.1. Phương pháp khuếch tán trên gel (Microslide Double Diffusion ) ................30
1.3.3.2. Phương pháp miễn dịch phóng xạ - RIA (Radio Immunoassay) ....................30
1.3.3.3. Ngưng kết hạt latex (Reversed Passive Latex Aggulutination - RPLA) ........31
1.3.3.4. Các phương pháp dựa trên kỹ thuật ELISA ......................................................31
1.4. KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH VÀ ỨNG DỤNG .......................... 33
1.4.1. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch........................................................................ 33
1.4.1.1. Các hợp phần trong hệ thống sắc ký miễn dịch................................................34
1.4.1.2. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký miễn dịch................................................37
1.4.1.3. Phân loại que thử nhanh ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch........................37

1

1.4.2. Một số nghiên cứu tạo que thử phát hiện độc tố ruột tụ cầu trong thực
phẩm ................................................................................................................. 40
1.5. CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA IGY..........42
1.5.1. Kháng thể lòng đỏ trứng IgY .................................................................. 42
1.5.2. Sản xuất kháng thể IgY ............................................................................ 45
1.5.3. Các phƣơng pháp tinh chế kháng thể IgY ............................................... 47
1.5.4. Ứng dụng của IgY trong chẩn đoán miễn dịch ........................................ 48
1.6. CÁC PHƢƠNG PHÁP SẢN XUẤT ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU ................................49
1.6.1. Sản xuất độc tố ruột tụ cầu trực tiếp từ S. aureus .................................... 49
1.6.2. Sản xuất độc tố ruột tụ cầu bằng phƣơng pháp tái tổ hợp ....................... 50
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 53
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ...........................................................................................53
2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU................................................................................................54
2.2.1. Vi sinh vật và plasmid ..............................Error! Bookmark not defined.
2.2.2. Hóa chất và sinh phẩm ............................................................................. 54
2.2.3. Máy, thiết bị ............................................................................................. 55
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................................................................56
2.3.1. Phƣơng pháp sản xuất độc tố ruột tụ cầu SEC1 tái tổ hợp ....................... 56
2.3.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn S. aureus .................................................56
2.3.1.2. Khuế ch đại gen sec
1 bằng kỹ thuật PCR ...........................................................57
2.3.1.3. Tinh sạch sản phẩm PCR ....................................................................................58
2.3.1.4. Xây dựng vector biểu hiện mang gen sec1 ........................................................58
2.3.1.5. Biến nạp plasmid pGS-21a-sec1 vào tế bào E. coli BL 21..............................59
2.3.1.6. Biểu hiện protein SEC1 tái tổ hợp.....................................................................60
2.3.1.7. Tinh sạch protein tái tổ hợp SEC1 .....................................................................60
2.3.1.8. Phương pháp điện di biến tính protein (SDS-PAGE) .....................................61
2.3.1.9. Phương pháp định lượng protein bằng đo mật độ quang ..............................61
2.3.1.10. Kiểm tra tính kháng nguyên của protein SEC1 tái tổ hợp bằng kỹ thuật

Western blot........................................................................................................................62
2.3.2. Phƣơng pháp sản xuất kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể IgY kháng
5 loại độc tố SE (A+B+C1+D+E) ...................................................................... 62
2.3.2.1. Gây miễn dịch.......................................................................................................63

2


2.3.2.2. Tinh sạch kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng .........................................................65
2.3.3. Chế tạo que thử phát hiện nhanh một số độc tố ruột tụ cầu ..................... 67
2.3.3.1. Thiết kế bộ que thử nhanh phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC1, SED
và SEE) của tụ cầu.............................................................................................................67
2.3.3.2. Xác định giới hạn phát hiện và tính ổn định của que thử ................................70
2.3.4. Sử dụng que thử nhanh phát hiện độc tố ruột tụ cầu trên một số nhóm mẫu
thực phẩm đã gây nhiễm độc tố SE ....................Error! Bookmark not defined.
2.3.5. PHƢƠNG PHÁP Xử LÝ Số LIệU............................................................................72
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN .......................................73
3.1. SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU SEC1 TÁI TỔ HỢP ..........73
3.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ S. aureus ...................................................... 73
3.1.2. Khuếch đại gen sec1 bằng kỹ thuật PCR ................................................. 74
3.1.3. Xây dựng vector biểu hiện pGS-21a mang gen sec1 ............................... 75
3.1.4. Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein SEC1 tái tổ hợp..................... 77
3.1.5. Xác định các điều kiện biểu hiện gen sec1 thích hợp trong E.coli ........... 80
3.1.6. Tinh sạch protein SEC1 tái tổ hợp............................................................ 83
3.1.7. Kiểm tra tính kháng nguyên của protein SEC1 tái tổ hợp bằng phản ứng
Western Blot ...................................................................................................... 85
3.2. CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG IgY .....................................................86
3.2.1. Lựa chọn loài gà và cách chăm sóc gà .................................................... 86
3.2.2. Cách gây miễn dịch và thu hoạch trứng .................................................. 87
3.2.3. Kết quả tách chiết và tinh sạch kháng thể IgY ........................................ 88

3.3. CHẾ TẠO QUE THỬ.........................................................................................................90
3.3.1. Thiết kế bộ que thử nhanh phát hiện một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA,
SEB, SEC1, SED và SEE) .................................................................................. 90
3.3.3.1. Tối ưu hóa lượng kháng thể cần cố định lên vạch kiểm chứng.......................90
3.3.3.2. Tối ưu hóa lượng kháng thể cần cố định lên vạch thử nghiệm .......................91
3.3.3.3. Tối ưu hóa lượng kháng nguyên cộng hợp cần sử dụng..................................92
3.3.2. Xác định giới hạn phát hiện và tính ổn định của que thử .................. 94
3.3.2.1. Xác định giới hạn phát hiện của que thử với các độc tố ruột SEA, SEB, SEC1,
SED và SEE........................................................................................................................94
3.3.2.2. Xác định tính ổn định của que thử......................................................................99

3


3.4. SỬ DỤNG QUE THỬ ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU TRÊN
THỰC PHẨM ĐƢỢC GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM .....................................................99
3.4.1. Sử dụng que thử để phát hiện một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB,
SEC1, SED và SEE) trên sữa đƣợc gây nhiễm thực nghiệm ............................ 99
3.4.1.1. Xác định độ pha loãng sữa để thử nghiệm .......................................................99
3.4.1.2. Sử dụng que thử để phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC1, SED và
SEE) trên sữa được gây nhiễm thực nghiệm ............................................................... 100
3.4.2. Sử dụng que thử để phát hiện một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB,
SEC1, SED và SEE) trên thịt đƣợc gây nhiễm thực nghiệm .......................... 104
3.4.2.1. Xác định độ pha loãng thịt để thử nghiệm...................................................... 104
3.4.2.2. Kết quả phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trên thịt
được gây nhiễm thực nghiệm ........................................................................................ 105
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ .................................................................................. 108
KẾT LUẬN.......................................................................................................................... 108
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU..................................................... 110
LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN......................................................................................... 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 112

4


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
{tc "DANH M?C CÁC KÝ HI?U, CÁC CH? VI?T T?T" \f C \l 1}
Ký hiệu

Tên đầy đủ tiếng Anh

Tên đầy đủ tiếng Việt

- APC

- Antigen Presenting Cell

- Tế bào trình diện kháng nguyên

- BSA

- Bovine Serum Albumin

- Albumin huyết thanh bò

- CFU

- Colony forming unit

- Đơn vị hình thành khuẩn lạc

- CNS

- Coagulase negative staphylococci

- Tụ cầu không sinh coagulase

- ELISA

- Enzyme Linked Immunosorbent Assay

- Phƣơng pháp miễn dịch hấp phụ
gắn enzym

- Fab

- Fragment of antigen binding

- Mảnh gắn kháng nguyên

- Fc

- Fragment crystalizable

- Mảnh kết tinh

- FCA

- Freud’s Complete Adjuvant

- Tá dƣợc Freud hoàn toàn

- FIA

- Freud’s Incomplete Adjuvant

- Tá dƣợc Freud không hoàn toàn

- GALT

- Gut Associated Lymphoid Tisue

- Mô limpho ở ruột

- GI

- Gastrointestinal

- Dạ dày-ruột

- GST

- Glutathione-S-Transferase

- HPLC

- High-Performance Liquid

- Sắc ký lỏng cao áp

Chromatography
- HLA-DR1

- Human Leukocyte
Antigen serotype DR1

- HTSKMD

- Hệ Thống Sắc Ký Miễn Dịch

- IPTG

-IsoPropyl-β-D-ThioGalactopyranoside

- kDa

- Kilo Dalton

- MCP-1

- Monocyte Chemoattractant Protein 1

5


- MHC-II

- Major histocompatibility complex

- NĐTP

- Phức hợp tƣơng thích mô chính
- Ngộ độc thực phẩm

- PBS

- Phosphate Buffered Saline-

- Muối đệm phosphate

- PCR

- Polymerase Chain Reaction

- PEG

- Polyetylen Glycol

- RNA

- Ribonucleic acid

- Axit ribonucleic

- RPLA

-Reversed Passive Latex Aggulutination

- Kỹ thuật ngƣng kết hạt latex

- SE

- Staphylococcal Enterotoxin

- Độc tố ruột tụ cầu

- SPA

- Staphylococcus aureus Protein A

- Protein A của tụ cầu

- TCR

- T-Cell antigen Receptor

- Thụ thể của tế bào T

- TNF

- Tumor Necrosis Factor

- Yếu tố hoại tử khối u

- TSST

- Toxic Shock Syndrome Toxin

- TSST-1

- Toxic Shock Syndrome Toxin-1

- VSATTP

- Độc tố gây hội chứng sốc do độc
- Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm

6


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. S. aureus dƣới kính hiển vi ..................................................................................15
Hình 1.2. S. aureus nuôi cấy trên môi trƣờng Baird Parker .............................................15
Hình 1.3. Tác nhân trong các vụ NĐTP từ năm 2007 đến năm 2012 ..............................20
Hình 1.4. Cấu trúc không gian của các độc tố ruột SEA, SEB, SEC2, SED ...................23
Hình 1.5. Mô hình tƣơng tác của SE với thụ thể tế bào T và với phân tử MHC II ....... 26
Hình 1.6 . Cơ chế gây viêm dạ dày - ruột do độc tố tụ cầu ..............................................28
Hình 1.7. Các hợp phần trong hệ thống sắc ký miễn dịch ..................................................34
Hình 1.8. Sắc ký miễn dịch kẹp đôi ......................................................................................39
Hình 1.9. Sắc ký miễn dịch cạnh tranh .................................................................................40
Hình 1.10. Sự hình thành kháng thể IgY..............................................................................44
Hình 1.11. Cấu trúc phân tử của IgG thỏ và IgY gà ...........................................................45
Hình 2.1. Sơ đồ vector biểu hiện pGS-21a...........................................................................53
Hình 2.2. Sơ đồ que thử phát hiện nhanh các độc tố ruột tụ cầu........................................68
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát quy trình chế tạo que thử .......................................72
Hình 3.1. Điện di đồ DNA tổng số tách từ S. aureus..........................................................73
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1, 2%..............................................74
Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm gen sec1 sau tinh sạch .......................................................75
Hình 3.4. Ảnh điện di plasmid pGS-21a sau khi cắt bằng enzyme cắt giới hạn ..............76
Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen sec1 ...................................................77

Hình 3.6. Điện di đồ so sánh protein tổng số của tế bào E.coli BL21 mang gen

sec1 tái

tổ hợp........................................................................................................................................77
Hình 3.7. Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E. coli
BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp ở các nhiệt độ khác nhau ..................................................81
Hình 3.8. Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E. coli
BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp ở các điều kiện IPTG khác nhau......................................81
Hình 3.9. Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E. coli
BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau ................82
Hình 3. 10. Điện di đồ khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 tan của tế bào

E. coli

BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp ở 30oC.................................................................................84
Hình 3.11. Điện di đồ protein SEC1 tinh sạch ở các nồng độ imidazol khác nhau ..........84
Hình 3.12. Kết quả chất lƣợng protein SEC1 tái tổ hợp bằng kỹ thuật Western blot ....86

7


Hình 3.13. Điện di đồ kháng thể IgY sau mỗi bƣớc tinh sạch ...........................................88
Hình 3.14. Lựa chọn lƣợng kháng thể cố định lên vạch kiểm chứng. ..............................91
Hình 3.15. Lựa chọn lƣợng kháng thể cố định lên vạch thử nghiệm ................................92
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của lƣ
ợng kháng nguyên cộng hợp đế n cƣờng đô ̣ tin
u vạch
thƣ̉
̣

́ hiê
nghiê ̣m......................................................................................................................................93
Hình 3.17. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEA ......................................................94
Hình 3.18. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEB ......................................................95
Hình 3.19. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEC1 .....................................................96
Hình 3.20. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SED ......................................................97
Hình 3.21. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEE ......................................................97
Hình 3.22. Lựa chọn nồng độ sữa pha loãng cần sử dụng .............................................. 100
Hình 3.23. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEA trên sữa .................................... 101
Hình 3.24. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEB trên sữa..................................... 101
Hình 3.25. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEC1 trên sữa ................................... 102
Hình 3.26. . Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SED trên sữa .................................. 103
Hình 3.27. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEE trên sữa ..................................... 103
Hình 3.28. Lựa chọn nồng độ pha loãng thịt cho que thử ............................................... 105
Hình 3.29. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEA trên thịt..................................... 105
Hình 3.30 Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEB trên thịt ..................................... 106
Hình 3.31. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEC1 trên thịt.................................... 106
Hình 3.32. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SED trên thịt..................................... 107
Hình 3.33. Độ nhạy của que thử phát hiện độc tố SEE trên thịt ...................... 104

8


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thống kê các vụ NĐTP từ năm 2009 đến năm 2013 ở Việt Nam ..................19
Bảng 1.2. Những đặc điểm và vị trí di truyền của các gen mã hóa của các SE ...............22
Bảng 1.3. Phân loại độc tố dựa vào việc so sánh trình tự axit amin .................................24
Bảng 1.4. Các bộ sinh phẩm thƣơng ma ̣i đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ngể đphát hiện các SE .................32
Bảng 1.5. So sánh kháng thể IgG ở thỏ và IgY ở gà ..........................................................43
Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợp kháng nguyên BSA ..........................................................64

Bảng 2.2. Thành phần hỗn hợp kháng nguyên các SE .......................................................64
Bảng 3.1. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEA.................................................94
Bảng 3.2. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEB .................................................95
Bảng 3.3. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEC1................................................96
Bảng 3.4. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED.................................................96
Bảng 3.5. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE .................................................97
Bảng 3.6. Tính ổn định của que thử phát hiện SE(A+B+C1+D+E) ..................................99
Bảng 3.7. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEA trên sữa ............................... 101
Bảng 3.8. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEB trên sữa................................ 101
Bảng 3.9. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEC1 trên sữa .............................. 102
Bảng 3.10. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED trên sữa ............................. 102
Bảng 3.11. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE trên sữa.............................. 103
Bảng 3.12. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEA trên thịt ............................. 105
Bảng 3.13. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEB trên thịt.............................. 106
Bảng 3.14. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEC1 trên thịt ............................ 106
Bảng 3.15. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SED trên thịt ............................. 107
Bảng 3.16. Giới hạn phát hiện của que thử với độc tố SEE trên thịt .............................. 107

9


MỞ ĐẦU
Việc đảm bảo chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm ảnh hƣởng trực tiếp tới sức
khỏe con ngƣời. Ngộ độc thực phẩm (NĐTP) là một trong những mối lo ngại lớn trên
toàn thế giới. Theo cơ quan Quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Mỹ ƣớc tính mỗi năm
tại Mỹ xảy ra khoảng 76 triệu ca NĐTP với 325 nghìn ngƣời phải nhập viện và khoảng
5 nghìn ngƣời chết. Các tác nhân chính gây NĐTP bao gồm hóa chất, vi sinh vật, độc
tố tự nhiên, ... Tuy nhiên, ghi nhận từ thực tế các vụ NĐTP đã xảy ra cho thấy tác nhân
vi sinh vật khá phổ biến, trong đó Staphylococcus aureus là một trong những nguyên
nhân hàng đầu, cho đến nay vẫn còn là một vấn đề nan giải. Nguyên nhân của NĐTP

do tụ cầu là ngƣời bị ngộ độc đã tiêu thụ các độc tố ruột tụ cầu (staphylococcal
enterotoxin - SE) tồn tại sẵn trong thực phẩm, do các chủng tụ cầu có coagulase dƣơng
tính, đặc biệt là S. aureus tổng hợp nên. Cho đến nay, 21 loại độc tố ruột tụ cầu (SE)
đã đƣợc thống kê, trong số đó, 5 loại SE bao gồm SEA, SEB, SEC, SED và SEE đƣợc
biết là nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm.
Các vụ NĐTP do độc tố tụ cầu là một trong những mối nguy cơ thƣờng trực đối
với ngƣời tiêu dùng. Các loại thực phẩm dễ bị nhiễm độc do S. aureus bao gồm các
thực phẩm giàu đạm nhƣ thịt, sữa, thủy sản, trứng, phô mai, rau, củ, quả, bánh kẹo ...
Theo các số liệu thống kê chƣa đầy đủ của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, Bộ Y tế,
trong những năm gần đây ở nƣớc ta mỗi năm có hàng trăm vụ NĐTP với hàng nghìn
ngƣời mắc, trong đó có nhiều ca nặng phải nhập viện và không ít các trƣờng hợp đã tử
vong. Bên cạnh đó, còn nhiều trƣờng hợp NĐTP không đƣợc thống kê vì những lý do
khác nhau. NĐTP có thể xảy ra ở tất cả các nƣớc trên thế giới, các vùng miền trong
mỗi nƣớc. Việt Nam là nƣớc có khí hậu nhiệt đới, nóng, ẩm, nguồn thực phẩm lại dồi
dào nên là môi trƣờng tốt cho vi khuẩn phát triển, trong đó có S. aureus.
Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay, để phát hiện độc tố ruột tụ cầu, ngƣời ta thƣ ờng sử dụng các sinh
phẩ m thƣơng m ại dựa trên kỹ thuâ ̣t ELISA nhƣ RIDASCREEN SET

(R-Biopharm,

Darmstadt, Đức) và VIDAS (BioMérieux, Marcy L´Etoile, Pháp). Quy trình phân tích

10


khi sử dụng các bộ sinh phẩm này cũng khá phức tạp, chỉ phù hợp với các phân tích tại
phòng thí nghiệm. Những sinh phẩ m này thƣờng s ử dụng kháng thể đa dòng và kháng
thể đơn dòng từ thỏ hoặc từ chuột. Tuy nhiên, vùng Fc của kháng thể IgG từ thỏ và
chuột phản ứng mạnh và không đặc hiệu với protein A của S. aureus nên có thể gây ra

hiê ̣n tƣơ ̣ng dƣơng tính gi ả khi sƣ̉ du ̣ng các bô ̣ sinh phẩ m này . Mă ̣t khác , giá thành b ộ
sinh phẩ m cao, thời gian xét nghiệm thƣờng kéo dài từ 2 đến 3 giờ và yêu cầu kỹ thuật
viên có trình đô ,̣ đó cũng là các yếu tố hạn chế sự ứng dụng của các b ộ sinh phẩ m này
ở Việt Nam.
Do vâ ̣y, cần phát triển một phƣơng pháp phân tić h sàng lọc m ới, có giá thành
thấ p, thời gian phân tích ngắn, thực hiện đơn giản và tránh đƣơ ̣c hiê ̣n tƣơ ̣ng dƣơng tính
giả. Sắc ký miễn dịch là một trong những kỹ thuật có triển vọng nhất để tạo ra những
bộ sinh phẩm đáp ứng đƣợc những yêu cầu trên. Theo sự hiểu biết của chúng tôi, cho
đến thời điểm này, trên thế giới vẫn chƣa có que thử thƣơng mại nào phát hiện nhanh
cả 5 loại độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE). Vì thế, việc phát triển
một hệ thống sắc ký miễn dịch có khả năng phát hiện nhanh các độc tố ruột tụ cầu
trong thực phẩm là rất cấp thiết, giúp đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho các sản
phẩm lƣu hành trong nƣớc và sản phẩm thực phẩm xuất khẩu. Từ thực tế trên, tôi thực
hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu tạo que thử để phát hiện nhanh một số độc tố ruột
của tụ cầu khuẩn trong thực phẩm”.
Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu của đề tài luận án là phát triển một bộ sinh phẩm dựa trên kỹ thuật sắc
ký miễn dịch để phát hiện nhanh một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED
và SEE) trong thực phẩm.
Nội dung nghiên cứu của đề tài
- Sản xuất và tinh sạch độc tố ruột tụ cầu tái tổ hợp SEC1 và ứng dụng để phát
triển que thử;
- Sản xuất và tinh sạch kháng thể lòng đỏ trứng IgY kháng BSA và kháng thể
lòng đỏ trứng IgY kháng một số độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) và
ứng dụng để tạo que thử;

11


- Tối ƣu hóa lƣợng kháng thể cần cố định lên vạch kiểm chứng, vạch thử

nghiệm của que thử và lƣợng kháng nguyên cộng hợp cần sử dụng trên que thử;
- Xác định giới hạn phát hiện một số độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED
và SEE) của que thử;
- Xây dựng quá trình chuẩn bị mẫu của một số nhóm thực phẩm (sữa, thịt);
- Xác định giới hạn phát hiện một số độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED
và SEE) của que thử trên một số nhóm thực phẩm (sữa, thịt) đƣợc gây nhiễm thực
nghiệm.
Điểm mới của luận án
Đã có nhiều nghiên cứu về S.aureus và các độc tố của chúng nhƣng việc nghiên
cứu, chế tạo thành công que thử để phát hiện nhanh các độc tố của S.aureus trong thực
phẩm ở nƣớc ta thì đây là một kết quả mới, cụ thể nhƣ sau:
- Sản xuất đƣợc kháng nguyên tái tổ hợp SEC1; sản xuất đƣợc kháng thể lòng đỏ
trứng gà (IgY) kháng BSA và kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB,
SEC1, SED và SEE) làm nguyên liệu tạo que thử phát hiện các SE.
- Đã xây dựng và hoàn thiện đƣợc quy trình tạo que thử dựa trên kỹ thuật sắc ký
miễn dịch cạnh tranh để phát hiện nhanh 5 loại độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1,
SED và SEE) trên một số nhóm thực phẩm (sữa và thịt) ở trong phòng thí nghiệm.
Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài
Việc xác định S. aureus trong thực phẩm ở nƣớc ta hiện nay chủ yếu dựa vào
việc phát hiện và định lƣợng vi khuẩn S. aureus có phản ứng coagulase dƣơng tính.
Phƣơng pháp này cần nuôi cấy vi khuẩn trong phòng thí nghiệm với thời gian để trả
lời kết quả khoảng 3- 4 ngày nhƣng chỉ cho thấy trong mẫu thực phẩm có vi khuẩn S.
aureus hay không mà không phát hiện đƣợc độc tố ruột tụ cầu do vi khuẩn này tiết ra,
là nguyên nhân gây NĐTP.
Kết quả nghiên cứu của đề tài luận án giúp giải quyết hạn chế nói trên. Sử dụng các que
thử đã phát hiện đƣợc các độc tố ruột tụ cầu với thời gian phân tích ngắn, đơn giản, dễ
sử dụng, không cần các thiết bị phức tạp, đắt tiền. Mặt khác, các nguyên liệu chính để
sản suất que thử (kháng nguyên cộng hợp và các kháng thể) đều đƣợc nhóm nghiên cứu

12

chủ động tạo ra, do đó làm hạ giá thành sản phẩm nhiều lần so với giá thành các bộ kít
nhập ngoại hiện nay. Kết quả của đề tài luận án tạo sản phẩm mới, ứng dụng xác định
nhanh ô nhiễm độc tố staphylococcus trong thực phẩm, phục vụ trong kiểm soát an
toàn thực phẩm.
Cấu trúc của luận án
Luận án ngoài phần mở đầu, kết luận, kiến nghị và phần phụ lục, phần chính
gồm 3 chƣơng với 23 bảng; 47 hình:
-

Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu nghiên cứu

-

Chƣơng 2: Đối tƣợng, vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu

-

Chƣơng 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận

13


CHƢƠNG 1 . TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1.TỤ CẦU KHUẨN
Tụ cầu khuẩn (Staphylococci) là một trong những vi khuẩn gây bệnh đƣợc ghi
nhận sớm nhất, từ đầu những năm 1880. Tụ cầu phân bố rộng rãi trong tự nhiên và
thƣờng ký sinh trên da và các hốc tự nhiên của ngƣời, động vật (ở bò, cừu, gà, thỏ, chó,
lợn,..) [2]. Cho tới nay, đã có 50 loài tụ cầu đƣợc phát hiện [44]. Trong đó nhiều loài là

những tụ cầu khuẩn cộng sinh và một vài loài là những vi khuẩn gây bệnh giới hạn.
Trên phƣơng diện gây bệnh, tụ cầu đƣợc chia thành hai nhóm chính: tụ cầu có
coagulase và tụ cầu không có coagulase [113]. Các đại diện quan trọng của tụ cầu có
coagulase là: tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và Staphylococcus intermedius.
Trong các vi khuẩn Gram dƣơng, S. aureus là loài vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp nhất
và kháng lại kháng sinh mạnh nhất, đặc biệt là gây nhiễm khuẩn huyết, gây ngộ độc
thức ăn, gây nhiễm trùng bệnh viện, … Ngƣợc lại, tụ cầu không có coagulase là thành
phần của hệ vi khuẩn bình thƣờng của da và niêm mạc. Hai đại diện có vai trò quan
trọng trong y học của nhóm này là S. epidermidis (tụ cầu da) gây nhiễm khuẩn cơ hội
và S. saprophyticus gây nhiễm khuẩn tiết niệu [7].
1.1.1. Đặc điểm sinh học{tc "I.2.1.1. Đ?c đi?m sinh h?c" \f C \l 4} của tụ cầu vàng
* Hình dạng và kích thước: Tụ cầu vàng là những cầu khuẩn có đƣờng kính từ
0,8 - 1,0 μm, xếp lại với nhau thành hình chùm nho, bắt màu Gram dƣơng (Hình 1.1),
không có lông, thƣờng không có vỏ, không sinh bào tử [1].
* Nuôi cấy: Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, chúng phát triển đƣợc ở nhiệt
độ từ 7 - 48,5°C, (khoảng tối ƣu từ 30-37°C), pH từ 4,2- 9,3, (khoảng tối ƣu từ 7 7,5), thích hợp đƣợc ở cả điều kiện hiếu và kỵ khí, phát triển tốt ở nồng độ muối cao
tới 10%, thậm chí ở nơi nồng độ muối tới 20% vi khuẩn vẫn có thể sinh trƣởng chậm
[44]. Trên môi trƣờng BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trƣng của tụ cầu vàng có
màu đen nhánh, bóng, lồi, đƣờng kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng
từ 2- 5 mm (Hình 1.2).

14


Hình 1.1. S. aureus dưới kính hiển vi

Hình 1.2. S. aureus nuôi cấy trên
môi trường Baird Parker
(Nguồn:glogster.com)

(Nguồn:microbiologyinpictures.com)

* Đặc tính sinh hóa: Tụ cầu vàng có hệ thống enzym phong phú, những enzym
đƣợc

dùng

trong

chẩn

đoán

là

coagulase,

catalase,

deoxyribonuclease,

phosphatase...[1, 7, 56]. Trong đó coagulase có khả năng làm đông huyết tƣơng ngƣời
và động vật khi đã đƣợc chống đông. Đây là đặc tính quan trọng nhất để phân biệt tụ
cầu vàng với các tụ cầu khác.
1.1.2. Những yếu tố ảnh hƣởng tới sản sinh độc tố ruột của tụ cầu
Sự sản sinh độc tố ruột của tụ cầu đã đƣợc nghiên cứu trong điều kiện thí nghiệm và
trong nhiều loại thực phẩm khác nhau. Những yếu tố ảnh hƣởng tới sản sinh SE gồm: nhiệt
độ, hoạt độ nƣớc (aw), nồng độ muối, độ pH, glucose, sự cạnh tranh của vi sinh vật, tùy
từng loại thực phẩm và sự biểu hiện của gen agr.
Nhiệt độ tối thiểu cho sản sinh SE là 10oC và nhiệt độ tối đa là 48oC. Khoảng

nhiệt độ thích hợp cho sự sản xuất độc tố của tụ cầu là 35-40oC, nhiệt độ 37oC thƣờng
đƣợc sử dụng trong nuôi cấy [73].
Đối với hoạt độ nƣớc, aw thích hợp cho tụ cầu sản sinh ra độc tố là từ 0,87 đến
0,99; tối ƣu là 0,98 [73].

15


Nồng độ muối cũng là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sự
sinh trƣởng và khả năng sản xuất độc tố của tụ cầu. Độ thẩm thấu thấp là một trong
những nguyên nhân làm tăng sự sản xuất độc tố. Nồng độ muối tối đa cho sự sản xuất
độc tố là dƣới 12%, nhƣ vậy nếu nồng độ muối từ 12% trở lên thì sự sản xuất độc tố tụ
cầu sẽ bị ức chế [73].
Nếu pH trung tính là điều kiện thích hợp nhất cho quá trình hình thành các SE
thì ở điều kiện pH axit, sự hình thành SE sẽ bị giảm hay bị ức chế. Khoảng pH để sản
xuất độc tố từ 5,1 đến 9,0 và thông thƣờng sự sản xuất SE bị ức chế ở pH nhỏ hơn 5
[70]. Tại một pH nhất định, các chất đƣợc sử dụng để axit hóa môi trƣờng có thể có tác
dụng nhiều hơn hoặc ít hơn đến việc sản xuất độc tố của tụ cầu. Ví dụ, axit axetic có
tác dụng ức chế hơn so với axit lactic trong việc sản xuất SE [77]. Ngoài ra, glucose
cũng là một trong những thành phần ức chế sự tạo ra độc tố, đặc biệt là sự tạo độc tố
SEB và SEC, do sự chuyển hóa glucose làm giảm độ pH [107 ].
S. aureus rất nhạy với vi sinh vật cạnh tranh. Khi trong thực phẩm có mặt các
sinh vật cạnh tranh khác, vi khuẩn này chỉ sinh trƣởng mà không sinh độc tố.
Genigeorgis (1989) đã chứng minh rằng khi trong sữa có các vi sinh vật cạnh tranh với
mật độ cao thì sẽ ức chế sự sinh trƣởng cũng nhƣ tạo độc tố của tụ cầu [Trích theo
107]. Sự cạnh tranh với các vi khuẩn sinh axit lactic cũng đƣợc nghiên cứu ở phomat,
sữa và xúc xích lên men [81, 95]. Điều này có thể liên quan tới sự hình thành axit
lactic làm giảm độ pH, sự hình thành peroxide và đôi khi do sự tổng hợp một số kháng
sinh đã ức chế quá trình sinh trƣởng của S. aureus.
Các độc tố thƣờng đƣợc tụ cầu tạo ra nhiều hơn trong các thực phẩm giàu

protein nhƣ thịt, sữa và các sản phẩm từ sữa [Trích theo 68]. Những thực phẩm này
đều có nhiều yếu tố tƣơng đối phù hợp với sự sinh trƣởng và phát triển của tụ cầu nhƣ
độ pH, các chất dinh dƣỡng, muối, nồng độ ôxy và nhiệt độ môi trƣờng. Tụ cầu cần có
những axit amin khác nhau cho quá trình sinh trƣởng và sản sinh độc tố [107]. Ví dụ:
Valine cần thiết cho quá trình sinh trƣởng và phát triển của S. aureus, Arginine và
Cystine cần cho cả quá trình sinh trƣởng phát triển lẫn việc sản sinh độc tố [77, 107].

16


Gen agr điều hòa hầu hết các yếu tố độc lực của tụ cầu. Khi nồng độ glucose và
độ pH thấp thì có tác dụng ức chế sự biểu hiện của gen agr. Ngoài ra, ở điều kiện độ
pH kiềm cũng làm giảm biểu hiện của gen agr dẫn đến việc giảm sự sản sinh ra các
độc tố SEB, SEC và SED [74, 77, 89].
Khi các chủng vi khuẩn tụ cầu vốn mang gen mã hóa các độc tố ruột SE phát
triển đến một số lƣợng nhất định trong thực phẩm (khoảng 106 CFU/g, ml), chúng có
thể tiết ra một lƣợng độc tố đủ để gây ra hiện tƣợng ngộ độc cho ngƣời tiêu dùng
[Theo 51, 107].
1.1.3. Tình hình ngộ độc thực phẩm do tụ cầu
1.1.3.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột tụ cầu trên thế giới
Tính đến năm 2003, có khoảng 250 loại bệnh truyền qua thực phẩm đã đƣợc
xác định và vi khuẩn là tác nhân gây ra 2/3 các vụ NĐTP [107]. Trong số đó, tụ cầu là
một trong những tác nhân gây ngộ độc phổ biến nhất. Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu
đƣợc định nghĩa là sự tiêu thụ các SE, vốn đã tồn tại sẵn trong thực phẩm, do các
chủng tụ cầu có coagulase dƣơng tính, đặc biệt là S. aureus tổng hợp nên [78].
Một số vụ ngộ độc trên thế giới: vụ NĐTP lớn đầu tiên đƣợc ghi nhận do sử
dụng phomai bị nhiễm độc tố ruột tụ cầu, đã xảy ra vào năm 1884 ở Michigan, Mỹ.
[45]. Sau đó là vụ NĐTP ở Pháp vào năm 1894 do dùng thức ăn là thịt bò bị nhiễm
độc tố này. Các thống kê về dịch tễ học tại Pháp trong hai năm 1999-2000 chỉ ra rằng
S. aureus là tác nhân gây NĐTP đứng hàng thứ hai, chỉ sau Salmonella [42]. Năm

2000, mô ̣t vụ ngộ độc thực phẩm do sử dụng thịt lợn và thịt hun khói nhiễm độc tố tụ cầu
đã xảy ra ở Đức làm 297 ngƣời phải nhâ ̣p viê ̣n [16]. Tại Nhật Bản, một vụ ngộ độc với
quy mô lớn làm ảnh hƣởng đến 13.420 ngƣời đã xảy ra do tiêu thụ sữa nƣớc tách béo và
sữa chua đƣợc chế biến từ sữa bột có nhiễm SEA vào tháng 6 năm 2000 [14]. Theo
thống kê năm 2011 của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa dịch bệnh Mỹ ƣớc tính
hàng năm tại nƣớc này có khoảng 240.000 trƣờng hợp mắc bệnh với 1000 ca nhập
viện và 6 trƣờng hợp tử vong có liên quan đến NĐTP do tụ cầu [54]. Ƣớc tính mỗi ca
NĐTP do tụ cầu tiêu tốn 695 USA, nâng tổng số thiệt hại ở Mỹ lên tới 167.597.860
USA mỗi năm do các vụ NĐTP [54].

17


Ngưỡng gây ngộ độc: Ngƣỡng gây ngộ độc của các SE ở ngƣời hiện nay vẫn
chƣa đƣợc xác định một cách chính xác. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng liều gây ngộ
độc ở ngƣời của SEA là khoảng 1 µg, ở một số trƣờng hợp chỉ cần 20 – 100ng cũng
đủ để gây ra hiện tƣợng ngộ độc [49]. Đặc biệt, trong một vụ ngộ độc do uống sữa
sôcôla có chứa SEA, lƣợng độc tố đƣợc xác định chỉ có 0,5 ng/ml [38].
Loại độc tố, 5 loại SE bao gồm SEA, SEB, SEC, SED và SEE đƣợc biết là
nguyên nhân chủ yếu gây NĐTP. Theo thống kê ở Anh từ năm 1969 đến 1990, 79%
các ca ngộ độc có nguyên nhân gây ngộ độc do SE: chỉ riêng độc tố SEA (56,9%), cả
hai độc tố SEA và SED (15,4%), SEB (3,4%), SEC (2,5%), cả SEB và SED (1,1%)
[111]. Thống kê từ các nghiên cứu khác cũng cho thấy độc tố ruột SEA cũng là loại
độc tố phổ biến nhất: Pháp (69,7%) [57], Mỹ (77,8%) [22] và Hàn Quốc (90%) [23].
Các loại thực phẩm liên quan đến ngộ độc: các loại thực phẩm liên quan tới các
vụ ngộ độc do S. aureus bao gồm các sản phẩm thịt, cá, trứng và sữa vốn đều là các
thực phẩm giàu đạm. Tại Anh, 75% các vụ NĐTP do S. aureus gây ra gắn liền với các
sản phẩm từ thịt; 8% do các sản phẩm từ sữa; 7% từ các sản phẩm cá và 3,5% từ trứng
[107]. Tại Pháp, các sản phẩm sữa lại là nguyên nhân chính gây ra ngộ độc, chiếm tới
32%; các loại thịt 31%; xúc xích và các loại bánh 15%; các sản phẩm cá và hải sản

khác 11%; trứng 11% [107]. Một nghiên cứu năm 2001 cho thấy 15% các trƣờng hợp
NĐTP tụ cầu tại 8 nƣớc phát triển do đã sử dụng các sản phẩm từ sữa, đặc biệt, ở Pháp
tỷ lệ này là 85% [31]. Tại Mỹ, 47% các vụ ngộ độc gắn liền với các sản phẩm thịt;
12% do các loại rau; 5% do mỳ ống và chỉ có 1,4% do các sản phẩm sữa và hải sản
[69].
1.1.3.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam
Theo các số liệu thống kê, các vụ NĐTP trong vòng 5 năm gần đây ở Việt Nam
của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, Bộ Y tế (Bảng 1.1), số vụ NĐTP trên cả nƣớc
dao động từ 148-175 vụ, với 4700-5676 ngƣời mắc, từ 3663- 4700 ngƣời nhập viện,
số ca tử vong từ 27- 51 ca [112]. Trong báo cáo sơ kết 6 tháng đầu năm 2014 vừa đƣợc
Bộ Y tế công bố, điều đáng chú ý là số ngƣời chết do NĐTP tăng cao. Tính đến ngày
30/6/2014, toàn quốc ghi nhận có 90 vụ NĐTP với 2636 ngƣời mắc, 2035 ngƣời nhập

18


viện và 28 trƣờng hợp tử vong. Tuy nhiên, các số liệu này chỉ thống kê tới những vụ
NĐTP với quy mô lớn hoặc những trƣờng hợp ngộ độc nặng phải nhập viện. Số ca
NĐTP trong thực tế có thể lớn hơn nhiều lần số lƣợng trên.
Bảng 1.1. Thống kê các vụ NĐTP từ năm 2009 đến năm 2013 ở Việt Nam
Năm

Số vụ NĐTP

Số ngƣời mắc

Số ngƣời
nhập viện
4137

Số ca tử vong

2009

152

5212

35

2010

175

5676

3978

51

2011

148

4700

3663

27

2012

168

5541

4335

34

2013

160

5238

4700

28

Nguồn [112]
Về các tác nhân gây NĐTP: theo thống kê của Cục An toàn Thực phẩm từ năm
2007 đến 2012, các tác nhân chính của các vụ NĐTP bao gồm: vi sinh vật (chiếm từ
7,8% đến 45,8%), hóa chất (chiếm từ 0,5% đến 10,8%), độc tố tự nhiên (19,1% đến
27,1%) và không rõ tác nhân (21,4% đến 71,1%) (Hình 1.3). Số liệu này cho thấy
trong các vụ NĐTP ở nƣớc ta thì tác nhân do vi sinh vật chiếm gần một nửa. Những
loại vi khuẩn thƣờng gây ra các vụ ngộ độc ở nƣớc ta bao gồm Salmonella,
Streptococcus, E. coli và S. aureus [112].
Các vụ NĐTP xảy ra ở tất cả các vùng, chiếm tỷ lệ cao nhất là miền núi phía
Bắc, với trung bình 19,8 -36,3% số vụ/năm, số vụ xảy ra tại bếp ăn gia đình là cao nhất

với 48,6 - 60,6% số vụ/năm. Những thức ăn là nguyên nhân gây NĐTP đƣợc xác định
là: thực phẩm hỗn hợp, thịt và các sản phẩm từ thịt, thủy sản, rau, củ quả, bánh kẹo, …
[112].

19


Hình 1.3. Tác nhân trong các vụ NĐTP từ năm 2007 đến năm 2012 [112]
Tuy chƣa có một nghiên cứu có hệ thống nào về tình hình nhiễm các độc tố SE
trong các thực phẩm ở nƣớc ta nhƣng với điều kiện khí hậu nóng ẩm và ý thức về vệ
sinh an toàn thực phẩm của ngƣời dân chƣa cao thì có thể một phần không nhỏ các
trƣờng hợp NĐTP là do nhiễm các SE. Trƣớc tình hình đó, bên cạnh các biện pháp
tuyên truyền nhằm nâng cao ý thức của ngƣời dân về vệ sinh an toàn thực phẩm, việc
kiểm tra phát hiện nhanh các mẫu thực phẩm nhiễm SE trên thị trƣờng đóng vai trò rất
quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe của ngƣời tiêu dùng.
1.2. ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU
1.2.1. Đặc điểm sinh hóa, hóa lý và di truyền của độc tố ruột của tụ cầu
Cho đến nay, ngƣời ta đã thống kê đƣợc có ít nhất 21 loại SE, bao gồm: các SE
từ SEA đến SEE, SEG đến SEI, SER đến SET có hoạt tính gây nôn, các protein giống
độc tố ruột của tụ cầu (Staphylococcus Enterotoxin like - SEl) không có hoạt tính gây
nôn khi thử trên linh trƣởng (SElL và SElQ) hoặc chƣa đƣợc kiểm tra (SElJ, SElK,
SElM đến SElP, SElU, SElU2 và SElV). Các SE và SEl đƣợc chia thành nhóm cổ điển
(SEA đến SEE) và nhóm mới (SEG đến SElU2) [65].

20


Các SE có bản chất là những chuỗi protein đơn có khối lƣợng phân tử thấp
(khoảng từ 22 đến 29 kDa). Mỗi loại SE đều có những yếu tố quyết định kháng
nguyên chuyên biệt. Các độc tố này dễ tan trong nƣớc và trong các dung dịch muối.

Đặc biệt, các SE đƣợc mô tả hầu hết là có tính ổn định cao, chúng có tính chịu nhiệt và
không bị protease thông thƣờng nhƣ pepsin, trypsin, chymotrypsin, papain,… thủy
phân, vì thế chúng giữ nguyên đƣợc cấu trúc trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời [107]. Ví
dụ: SEA có thể không bị bất hoạt ở 121°C trong 10 phút với nồng độ lớn (> 100 ng/g
nấm ăn) [39]. Khả năng chịu nhiệt cao này của các SE là một trong những tính chất
đáng lƣu ý nhất góp phần làm tăng nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm. Trong quá trình
chế biến thực phẩm, nếu nguyên liệu bị nhiễm một chủng S. aureus có khả năng sinh
độc tố và các điều kiện chế biến có lợi cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn cũng nhƣ sự
sản sinh độc tố của vi khuẩn này thì một lƣợng lớn SE sẽ đƣợc tích tụ trong thực phẩm
đó, ngay cả khi sản phẩm đƣợc xử lý với nhiệt độ để tiệt trùng trƣớc khi sử dụng thì
thực phẩm đó vẫn có nguy cơ gây ngộ độc.
Các gen mã hóa SE có vị trí rất khác biệt trên thể gen của S. aureus. Bảng 1.2
dƣới đây thể hiện điều này một cách chi tiết. Tất cả các gen se và sel mã hóa lần lƣợt
các SE và SEl đều có đặc điểm quan trọng là nằm trên các yếu tố di truyền phụ, bao
gồm các plasmid, prophage và các vùng gây bệnh nhỏ của S. aureus (SaPIs), vùng gen
vSa hoặc bên cạnh các vùng nhiễm sắc của tụ cầu (Bảng 1.2). Hầu hết trong số chúng là
các yếu tố di truyền di động, do đó chúng có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự
phát triển của tác nhân gây bệnh này. Đối với S. aureus, hai loại plasmid đặc trƣng mang
se và sel đã đƣợc liệt kê (Bảng 1.2) là plasmid pIB485 và pF5. Các SaPI là những vùng
gây bệnh có kích thƣớc từ 15-17 kb, ngoại trừ SaPIbov2 (27 kb) và một SaPI bị thoái
hóa (3.14 kb) [65].

21