Phân lập và tuyển chọn các chủng loại nấm mốc có khả năng sinh cellulase cao ở vĩnh phúc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH- KTNN
_______***_______

PHÙNG DŨNG MẠNH

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC
CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG
SINH CELLULASE CAO Ở VĨNH PHÚC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT

Người hướng dẫn khoa học
TS. PHƯƠNG PHÚ CÔNG

HÀ NỘI - 2010


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo, TS. Phương Phú
Công người đã trực tiếp tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá
trình học tập và thực hiện đề tài này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong tổ vi sinh vật học
và toàn thể các thầy cô trong khoa Sinh - KTNN, trường ĐH Sư phạm Hà
Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên
cứu tại đây.
Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ

Em trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, tháng 05 năm 2010
Sinh viên
Phùng Dũng Mạnh


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng mình. Các
số liệu, các kết quả thu được trong khoá luận là trung thực, chưa từng
được công bố trong bất kì một công trình khoa học nào. Nếu sai tôi xin
hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Hà Nội, tháng 05 năm 2010
Sinh Viên
Phùng Dũng Mạnh


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU……………………………………………………………………..1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………..……………………......3

1.1.

Đại cương về nấm mốc……………….……..………………………....3

1.2.

Chi Aspergillus Micheli ex Fries……….………………………………6

1.2.1. Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus trên thế giới…………….6
1.2.2. Đặc điểm sinh học của Aspergillus…………………………………...9
1.3.

Sơ lược về chi Penicillium……………………………………………12

1.4.

Cellulose và cellulase…………………………………………………14

1.4.1. Cellulose………………………………………………………..……14
1.4.2. Cellulase……………………………………………………………..15
1.4.3. Cơ chế tác động của phức hệ cellulase……………………...............16
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……….18
2.1.

Vật liệu nghiên cứu…………………………………………………...18

2.1.1. Mẫu phân lập………………………………………………………...18
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất dung cho nghiên cứu…………………...18
2.2.

Môi trường………………………………………………………….…18

2.3.

Phương pháp nghiên cứu………………………………………….......19

2.3.1. Phương pháp phân lập……………………………………………..19
2.3.1.1. Thu thập mẫu…………………………………………………...19
2.3.1.2. Chuẩn bị môi trường phân lập và bảo quản…………………….19
2.3.1.3. Tiến hành phân lập……………………………………………...20


Khóa luận tốt nghiệp

Phùng Dũng Mạnh - K32D

2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính………………………………………...21
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu định loại (Maren A. Klich, 2002)………21
2.3.3.1. Phương pháp cấy chấm điểm các chủng nấm mốc lên môi trường
Crapek-Dox cơ sở để nghiên cứu các đặc điểm vĩ mô………….21
2.3.3.2. Phương pháp cấy trên khối thạch để quan sát các đặc điểm vi mô
(Robert A. Samson and Ellen S. Hoekstra, Jens C. Frisvad and
Filtenborg, 1996)………………………………………………..21
2.3.4. Phương pháp quan sát các đặc điểm phân loại…………………….22
2.3.4.1. Quan sát các đặc điểm vĩ mô sau đây bằng mắt thường hoặc dưới
kính hiển vi soi nổi……………………………………………...22
2.3.4.2. Quan sát và xác định các đặc điểm vi mô dưới kính hiển vi quang
học và chụp ảnh qua kính hiển vi (Axioskop)………………….23
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………..…………24
3.1.

Kết quả phân lập………………………………………………………24

3.2.

Kết quả thử hoạt tính………………………………………………….25

3.3.

Kết quả định loại sơ bộ……………………………………………….27

3.3.1. Bản mô tả chủng M3………………………………………………...27
3.3.2. Bản mô tả chủng M5-3………………………………………………29
3.3.3. Bản mô tả chủng M6-1………………………………………………31
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………...34


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG TRONG
LUẬN VĂN
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Các dạng bọng đỉnh giá ở chi Aspergillus………………………...10
Hình 1.2. Cấu tạo cơ quan sinh bào tử trần ở Aspergillus…………………...11
Hình 1.3. Cấu tạo khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử trần của Penicillium…...13
Hình 1.4. Cấu trúc không gian lập thể của cellulose………………………...15
Hình 1.5. Sơ đồ phân giải cellulose theo Erikson và CS (1974)…………….17
Hình 3.1. Hoạt tính cellulase của 3 chủng mạnh nhất……………………….26

Hình 3.2. Một số đặc điểm hình thái của chủng M3………………………...29
Hình 3.3. Một số đặc điểm hình thái của chủng M5-3………………………31
Hình 3.4. Một số đặc điểm hình thái của chủng M6-1………………………33
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Các chủng nấm mốc phân lập được………………………………23
Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của các chủng nấm mốc……………………...25


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

CBH

Cellobiohydrolase

CMC

Cacboxyl methyl cellulose

CMC-ase

Cacboxymethylcellulase

CS

Cộng sự

E1

Exoglucanase

E2

Endoglucanase

UV

Tia cực tím


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Nấm mốc là vi sinh vật hiếu khí, nhân chuẩn, dị dưỡng, chúng thường
có mặt trong đất, xác động thực vật và không khí, một số ký sinh trên động
thực vật và người. Một số nấm mốc là tác nhân gây bệnh, làm hư hỏng các
sản phẩm công, nông nghiệp nhưng cũng có nhiều loài có ích như tổng hợp ra
các enzyme, axit hữu cơ, thuốc kháng sinh, vitamin, các kích thích tố tăng
trưởng động thực vật và đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như công
nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dược phẩm, công nghệ môi trường,
nông nghiệp.
Cellulase là một phức hệ enzyme thủy phân cellulose, được tổng hợp
chủ yếu bởi các vi sinh vật, trong đó có nấm mốc. Cellulase được ứng dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, trong hiện tại và tương lai người ta sử dụng

cellulase nhằm hai mục đích chính: thứ nhất là dùng cellulase trực tiếp để
phân hủy phế thải của công, nông nghiệp có thành phần chủ yếu là cellulose
trong công nghệ môi trường, thứ hai là thuỷ phân cellulose tạo cơ chất lên
men để thu các sản phẩm cuối cùng khác nhau. Đặc biệt trong chăn nuôi, một
trong những biện pháp nâng cao năng suất vật nuôi là nâng cao hiệu suất sử
dụng các chất dinh dưỡng có trong thức ăn ở mức cao nhất. Để giải quyết vấn
đề này, người ta có thể dùng chế phẩm enzyme (gồm nhiều loại enzyme gọi là
multi-enzyme, trong đó có cellulase) để bổ sung vào khẩu phần thức ăn của
vật nuôi. Các enzyme này cùng với các enzyme có sẵn trong đường tiêu hóa
sẽ phân giải các chất dinh dưỡng của thức ăn giúp cho con vật tiêu hóa được
tốt hơn. Việc bổ sung chế phẩm gồm nhiều loại enzyme sẽ giúp vật nuôi hấp
thụ tốt hơn các nguồn thức ăn khác nhau.

1


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

Hàng năm, hoạt động trong ngành nông nghiệp đã thải ra môi trường
hàng trăm ngàn tấn phế phẩm có thành phần chủ yếu là cellulose, hiện đã và
đang là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường. Nếu lượng
phế phẩm này được xử lý làm thức ăn gia súc hoặc phân bón thì đó sẽ là một
nguồn lợi lớn về mặt kinh tế, đồng thời lại giải quyết được vấn đề về ô nhiễm
môi trường. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về
cellulose ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi như: Chu Thị Thanh Bình và CS
(2002) đã ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải hoa quả giàu
cellulose làm thức ăn gia súc. Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng (1991) đã lên
men xốp sắn bằng cách sử dụng Aspergillus hennebergii, Aspergillus niger

sản phẩm dùng làm thức ăn cho gà, lợn, bò... và kết quả cho nhiều triển vọng.
Tuy nhiên cũng chưa có nhiều nghiên cứu tập trung vào các chủng nấm mốc
phân giải cellulose, nguyên nhân có thể do trong tự nhiên có nhiều nhóm vi
sinh vật tỏ ra ưu thế hơn so với nấm mốc về khả năng sinh cellulase. Nhưng
nếu xét về khả năng chống chịu pH, khả năng sử dụng nguồn cacbon, nguồn
nitơ... thì nấm mốc tỏ ra ưu thế hơn so với các nhóm vi sinh vật khác.
Từ những lý do, trên với mục đích tìm hiểu, làm quen với phương pháp
nghiên cứu khoa học, tôi chọn đề tài “Phân lập và tuyển chọn các chủng
nấm mốc có khả năng sinh cellulase cao ở Vĩnh Phúc” để nghiên cứu.
2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp
cellulase.
Bước đầu phân loại sơ bộ một số chủng có hoạt tính cellulase cao nhất.
3. Ý nghĩa của đề tài
Bước đầu tuyển chọn những chủng nấm mốc có hoạt tính enzyme
cellulase cao, cung cấp nguồn giống vi sinh vật phục vụ cho các nghiên cứu
khác đi sâu hơn vào ứng dụng, hứa hẹn cho nhiều ứng dụng trong thực tiễn.

2


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Đại cƣơng về nấm mốc
Phần lớn nấm mốc thuộc nhóm phân loại Deuteromycetes, một số là

dạng sinh sản vô tính của các nhóm nấm túi (Ascomycetes) hoặc nhóm nấm
đảm (Basidiomycetes). Deuteromycota bao gồm khoảng 2400 chi trong đó có
1700 chi thuộc nhóm nấm Hyphomycetes và 700 chi thuộc nhóm
Coelomycetes. Theo E. Kiffer, M. Morelet, 2000, trong số các chi nấm thuộc
tổ chi Phialoconidiae (lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành
phụ Deuteromycotina) thì chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223
loài, tiếp theo là chi Aspergillus có khoảng 185 loài.
Deutermycota

cùng

với

nấm

túi

(Ascomycetes),

nấm

đảm

(Basidiomycetes) được xếp vào nhóm nấm bậc cao (Michael J. Carlile et al.
2001). Chúng là những sinh vật nhân chuẩn, dị dưỡng, phần lớn sống hoại
sinh (saprophytism), một số kí sinh (parasitism) trên người và động thực vật,
còn một số khác cộng sinh (symbiosis). Thành tế bào có kitin, hệ sợi
(mycelium) là một tản phát triển mạnh dạng sợi có vách ngăn, nhân ở thể đơn
bội, hoặc lưỡng bội, hoặc thể song nhân, sinh sản bằng bào tử (bào tử không

có roi).
Theo quan điểm của các nhà nấm học hiện nay thì nhóm nấm bất toàn
(Deuteromycetes) là nhóm nấm bao gồm các nấm túi và nấm đảm mất khả
năng sinh sản hữu tính (telemorph), chỉ còn hình thức sinh sản vô tính
(anamorph) được gọi chung là nhóm Mitosporic fungi (Michael J. Carlie,
Sarah C. Watkinson, Graham, 1994; Noyd R.K, 2000).
Ở nấm túi (Ascomycetes) và nấm đảm (Basidiomycetes), quá trình sinh
sản hữu tính xảy ra trong một giai đoạn của vòng đời gọi là giai đoạn hoàn
thiện (perfect stage) hay dạng sinh sản hữu tính (telemorph). Ngược lại đặc
trưng của nấm bất toàn Deuteromycetes là hình thức sinh sản vô tính. Các bào
tử trần vô tính (conidia hay mitotic spores) được sinh ra bằng quá trình
3


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

nguyên phân từ một tế bào biệt hóa của sợi nấm có tên là cuống sinh bào tử
trần hay giá bào tử trần (conidiophores, stipe). Các giá bào tử trần có thể được
hình thành trực tiếp từ sợi dinh dưỡng (hyphal form) ở dạng đơn độc
(mononematous) hoặc nhóm thành cụm giá xuất phát từ một điểm gốc
(facide) hoặc thành bó kết chặt (synematous). Nếu giá bào tử trần to hơn, dày
hơn hệ sợi cơ chất thì gọi là macronematous, nếu bằng hoặc nhỏ hơn sợi cơ
chất thì gọi là micronematous.
Các giá bào tử trần cũng có thể được tạo thành bên trong một cấu trúc
đặc biệt gọi là thể quả (conidiomata). Kiểu hình thành bào tử trần này gọi là
conidioma forms. Hình dạng của các quả thể này có thể có nhiều hình dạng
khác nhau. Thường có hai dạng là dạng hình chai (pycnidia) và dạng hình
vòm (acervuli).

Một số ít nấm bất toàn không có khả năng sinh bào tử trần gọi là nhóm
nấm bất thụ (mycelia steritia). Sự sinh sản của chúng nhờ các dạng hệ sợi sinh
dưỡng hoặc các dạng chống chịu với môi trường như hạch nấm (sclerotia),
bào tử áo (chlamydospores), tế bào Hulle …
Deuteromycetes có khoảng 15000-20000 loài thuộc 2400 chi
Mitosporic đã được biết đến. Nó là lớp lớn thứ hai sau lớp nấm túi
Ascomycetes.
Sự phân loại nấm bất toàn cho đến nay vẫn mang tính chất nhân tạo
không phản ánh mối quan hệ họ hàng của các loài nấm. Khóa phân loại nấm
bất toàn đầu tiên được đưa ra là khóa phân loại của Saccardo (1880-1884).
Đây là khóa phân loại hoàn toàn mang tính hình thái, dựa vào kiểu tập hợp
của các giá bào tử trần để phân chia tạm thời nhóm nấm này vào 3 lớp chính
là Hyphomycetes, Coelomycetes và Agonomycetes. Đặc điểm của từng lớp
được miêu tả như sau:

4


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

Hyphomycetes (moniliaales - nấm bông):
Đặc điểm của nhóm này là các giá bào tử trần được sinh ra tự do trên
sợi nấm, có thể phân nhánh hoặc không phân nhánh, có thể đơn độc hoặc
xoắn thành bó kiểu coremia hoặc stilbace.
Coelomycetes (nấm xoang):
Coelomycetes khác với Hyphomycetes là giá bào tử trần được tạo thành
trong các quả thể nhỏ (small fruit-bodies or conidiomata) dạng hình chai hoặc
dạng hình vòm. Các quả thể nhỏ này được hình thành từ các sợi nấm kết lại

hoặc từ các mô thực vật kết hợp với sợi nấm ở những loài kí sinh trên thực
vật. Phân loại lớp Coelomycetes dựa vào hình thái bào tử và thể quả đồng thời
dựa vào phương pháp hình thành bào tử và giá bào tử trần.
Agonomycetes (mycelia sterilia – nấm bất thụ):
Agonomycetes không có khả năng sinh sản bằng bào tử. Một số tạo
thành cấu trúc gọi là sclerotina, các bào tử áo (chlamydospore) hoặc các tế
bào dày (tế bào Hulle). Nói chung đây là nhóm không có các đặc điểm đặc
trưng để phân loại (Erick H.C.Mckenzie, 2004; Michael J.Carlie, Sarah C
Watkinson, Graham, 1994).
Năm 1955, Hughes đã đưa ra khóa phân loại có tính liên kết và tổng
quát hơn về nhóm Hyphomycetes. Ông chia nhóm này thành 8 tổ chi dựa vào
đặc điểm của giá bào tử trần (conidiophores) và bào tử trần (conidia). Năm
1968, Baron lại đưa ra một khóa phân loại khác hoàn chỉnh hơn mà ngày này
nhiều nhà nấm học vẫn sử dụng (H.L.Barnett & Barry B. Hunter, 1973), trong
đó các đặc điểm của conidia, các kiểu tạo thành conidia từ các tế bào sinh ra
nó, sự tiến hóa của các tế bào conidia và các tế bào sinh ra nó … là những đặc
điểm quan trọng để phân loại (Erick H.C.Mckenzie, 2004;E. Kifer & N.
Morelet, Robert K.Noyd, 2000).

5


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

Gần đây, trong các khóa phân loại của mình E. Kifer & N. Morelet,
Robert K. Noyd (2000) đã kết hợp khóa phân loại của Saccardo (1880-1884)
và Grove (1919) để phân chia Deuteromycota thành 2 lớp lớn là
Hyphomycetes và Coelomycetes dựa vào cách sắp xếp của các giá bào tử trần.

- Lớp Hyphomycetes: đặc trưng bởi các giá bào tử trần (conidiophores)
tạo ra trên sợi nấm, không tạo thể quả vô tính.
- Lớp Coelomycetes: các giá bào tử trần (conidiophores) được sinh ra
trong các thể quả vô tính (axesual ascomata).
1.2.

Chi Aspergillus Micheli ex Fries

1.2.1. Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus trên thế giới
Chi Aspergillus do Micheli mô tả lần đầu tiên năm 1729, sau đó năm
1809, Link đã mô tả loài Aspergillus glaucus và loài nấm túi Eurotium
herbariorum được phát hiện trên cùng một tiêu bản mẫu cây khô. Fries (1832)
đã công nhận chi nấm này của Micheli. De Bary (1850) phát hiện ra rằng, giai
đoạn bào tử trần của Eurotium herbariorum chính là Aspergillus glaucus.
Như vậy, theo Luật pháp Quốc tế và danh pháp thực vật, chi Aspergillus
chính thức mang tên Aspergillus Micheli ex Fries.
Chuyên luận về chi Aspergillus xuất bản gần đây nhất và vẫn đang
được sử dụng rộng rãi để định loại các loài của chi nấm này là chuyên luận
của Raper và Fennell (1965). Hệ thống phân loại chi Aspergillus của Raper và
Fennell (1965) gồm 132 loài (đã được chấp nhận) và được xếp vào 18 nhóm
loài (Robert A. Samsom,1999), đến nay vẫn ổn định và được sử dụng rộng
rãi, về cơ bản không sửa đổi, mặc dù cho đến nay một số loài mới thuộc chi
nấm này đã được công bố với số loài hiện biết là 185 loài Aspergillus (E.
Kifer & N. Morelet; Robert K. Noyd, 2000).
Để có thể xử lý phân loại một số lượng lớn các loài thuộc chi này, các
nhà nghiên cứu trước đây đã chia nó ra thành các nhóm loài (group) hoặc các
thứ (series) dựa trên màu sắc bào tử, hình dạng và kích thước của bọng đỉnh
6

Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

giá, sự có mặt của trạng thái hữu tính… (Raper & Fennell, 1965). Năm 1985,
Gams và cộng sự đề nghị đổi các nhóm loài (group) thành các chi phụ
(subgenera) và các tổ chi (sections) để cho nó phù hợp với danh pháp thực vật
hơn. Dưới đây là phần tóm tắt hệ thống phân loại chi Aspergillus hiện đang
được sử dụng rộng rãi (Maren A. Klich, 2002). Ở đây chúng tôi bổ sung tên
các nhóm loài (group) tương đương trong chuyên luận của Raper & Fennell,
1965.
Chi Aspergillus Micheli ex Fries:
Chi phụ Aspergillus: thể bình dạng đơn tầng (uniseriate), ưa khô, bào tử
màu lục xám.
- Tổ chi (Section) Aspergillus (tƣơng đƣơng với A. glaucus Group):
dạng hữu tính eurotium, thể quả (cleistothecia) màu vàng với thành là
một lớp tế bào nhu mô giả hình đa giác, bào tử túi (ascospore) trong
suốt.
- Tổ chi (Section) Restricti (tƣơng đƣơng với A. restrictus Group): chỉ
có dạng vô tính, sinh trưởng chậm trên tất cả các môi trường.
Chi phụ Fumigati: dạng thể bình đơn tầng, bọng đỉnh giá thường có hình
quả lê, bào tử màu lục xám, lục xanh đến màu cam.
- Tổ chi (Section) Fumigati (tƣơng đƣơng với A. fumigatus Group):
bào tử màu lạc xám đến lục xanh.
- Tổ chi (Section) Cervini (tƣơng đƣơng với A. cervinus Group): bào
tử cam nhạt đến cam xám.
Chi phụ Ornati: thể bình dạng đơn tầng, bào tử màu lục xám, lục vàng
hoặc nâu olive.
- Tổ chi (Section) Ornati (tƣơng đƣơng với A. ornatus Group): giống
với chi phụ.

7


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

Chi phụ Clavati: thể bình dạng đơn tầng, bọng đỉnh giá chủ yếu hình
chùy, bào tử có màu lục xám.
- Tổ chi (Section) Clavati (tƣơng đƣơng với A. Clavatus Group): giống
với chi phụ.
Chi phụ Nidulantes: thể bình có dạng đơn tầng, màu sắc bào tử thay đổi.
- Tổ chi (Section) Nidulantes (tƣơng đƣơng với A. nidulans Group):
giá bào tử trần ngắn, thường nâu, bào tử lục, thường có tế bào Hulle, đa
số các loài có trạng thái hữu tính Emericella. Thể quả có thành mềm,
bao quanh bởi tế bào Hulle, bào tử túi màu đỏ đến tía.
- Tổ chi (Section) Versicolores (tƣơng đƣơng với A. versicolor Group):
giá bào tử trần trong suốt đến nâu, bào tử lục, lục xám hoặc lục xanh.
- Tổ chi (Section) Usti (tƣơng đƣơng với A. ustus Group): giá bào tử
trần màu nâu, bào tử màu đỏ đục, nâu, hoặc olive.
- Tổ chi (Section) Terrei (tƣơng đƣơng với A. terreus Group): giá bào
tử trần trong suốt, bào tử màu da bò, đến cam nâu.
- Tổ chi (Section) Flavipedes (tƣơng đƣơng với A. flavipes Group): giá
bào tử trần trong suốt đến nâu nhợt, bào tử màu trắng đến da bò.
Chi phụ Circumdati: thể bình dạng lưỡng tầng hoặc đơn tầng, bọng đỉnh
giá hình cầu cho đến hình quả lê.
- Tổ chi (Section) Wentii (tƣơng đƣơng với A. wentii Group): bào tử
màu da bò, nâu vàng cho đến nâu olive.
- Tổ chi (Section) Flavi (tƣơng đƣơng với A. flavus Group): bào tử

màu lục vàng đến nâu olive.
- Tổ chi (Section) Nigri (tƣơng đƣơng với A. niger Group): giá bào tử
trần có thành nhẵn, bào tử đen hoặc gần đen.
- Tổ chi (Section) Circumdati (tƣơng đƣơng với A. ocharaceus
Group): thể bình thường là dạng lưỡng tầng, bào tử vàng, màu lông bò
đến màu vàng nâu nhạt.
8


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

- Tổ chi (Section) Candidi (tƣơng đƣơng với A. candidus Group): bào
tử trắng hoặc gần trắng.
- Tổ chi (Section) Cremei (tƣơng đƣơng với A. cremeus Group): bào tử
nâu, vàng hoặc xanh lục.
- Tổ chi (Section) Sparsi (tƣơng đƣơng với A. sparsus Group): bào tử
xám nhợt đến màu olive.
Chi phụ Stilbothamnium : đặc điểm nổi bật là các giá bào tử trần tập hợp
thành bó, dạng cụm lớn, thẳng. Chi phụ này được thiết lập bởi Samson và
Seifert năm 1985 (J.E.Smith, 1994). Tuy nhiên, sự sắp đặt của một số loài
và sự tồn tại của một số nhóm loài này vẫn đang còn nhiều tranh cãi
(Kozakiewiez, 1989; Samson & Frisvad, 1991; Peterson, 2000).
1.2.2. Đặc điểm sinh học của Aspergillus
Các đặc điểm đặc trƣng của chi Aspergillus Micheli ex. Fries :
- Hệ sợi nấm gồm các sợi có vách ngăn phân cách, không màu, màu
nhạt, hoặc một số trường hợp trở nên nâu hay màu sẫm khác ở vùng
nhất định của khuẩn lạc.
- Sinh sản vô tính bằng bào tử trần (conidia). Cũng như các loại nấm bất

toàn khác, hình thái cơ quan sinh bào tử trần là một đặc điểm chủ yếu,
đặc trưng dùng trong phân loại chi nấm này.
Các đặc điểm của cơ quan sinh bào tử trần:
Cơ quan sinh bào tử trần phát triển từ một tế bào đặc biệt gọi là tế bào
chân (foot-cell) có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các tế bào lân cận của
sợi nấm. Từ tế bào chân phát triển thành giá bào tử trần (conidiophore hay
stipe) Giá bào tử trần có thể có vách ngăn, bề mặt nhẵn hoặc không nhẵn,
trong suốt hoặc có màu, dài hay ngắn tùy thuộc vào loài. Phần ngọn của giá
bào tử trần phình rộng tạo thành bọng đỉnh giá (versicle). Bọng đỉnh giá có
thể có nhiều hình thái khác nhau, đây là một đặc điểm đặc trưng để phân loại

9


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

Aspergillus với các loại nấm Hyphomycetes khác, đặc biệt với chi
Penicillium.
Bọng đỉnh giá có thể có hình cầu (hình 1.1: q), hình bán cầu (hình 1.1:
k, m, l), hình chùy (hình 1.1: k), hình quả bầu (hình 1.1: b, d), hình bàn trang
(phần bọng đỉnh giá thẳng) (hình 1.1: a, c, e).
Từ bọng đỉnh giá sinh ra các tế bào sinh bào tử trần gọi là thể bình
(phialide). Nếu các thể bình sinh ra trực tiếp từ bọng đỉnh giá thì gọi là dạng
đơn tầng (uniseriate). Nếu các thể bình được sinh ra qua một lớp tế bào gốc
xuất phát từ bọng đỉnh giá (lớp cuống thể bình, metulae) thì gọi là dạng lưỡng
tầng (biseriate). Phialide hoặc metulae mọc trên bọng đỉnh giá cũng là đặc
điểm đặc trưng để phân biệt Aspergillus với các chi có quan hệ gần gũi với
nó. Từ thể bình sinh ra các bào tử trần (conidia). Bào tử trần không có vách

ngăn khác nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc… ở các loài khác nhau.

Hình 1.1. Các dạng bọng đỉnh giá ở chi Aspergillus

10


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

Chuỗi bào tử trần trên phialide có thể dài ngắn khác nhau ở từng loài.
Mức độ bao phủ bọng đỉnh giá bởi thể bình cũng là đặc điểm quan trọng để
phân loại đến loài các loại Aspergillus. Thể bình có thể bao phủ gần toàn bộ
(75%) hoặc toàn bộ (100%) bọng đỉnh giá, hoặc bao phủ một nửa bọng đỉnh
giá, hoặc chỉ một phần ở bọng đỉnh giá, chúng có thể mọc sát chặt vào nhau
hoặc mọc rời rạc lẻ tẻ (Bùi Xuân Đồng, 2001; Maren A. Klich, 2002).
Toàn bộ phần bọng đỉnh giá, thể bình và bào tử trần gộp lại tạo lên
bông nấm (conidial head). Hình dạng của toàn bộ bông nấm cũng là những
đặc điểm phân loại đáng chú ý. Hình dạng bông nấm có thể là hình cầu chặt
hoặc lỏng, hoặc hình phóng xạ, có thể là hình cột thẳng đứng, chặt, có thể là
phân thành các thùy khác nhau (Botton B, Breton A, 1990; Raper & Fennell,
1965).
Một số loài Aspergillus có khả năng tạo ra nhiều tế bào có thành dày
gọi là tế bào Hulle (hình 1.2: c) và các hạch nấm (sclerotium)

Hình1.2. Cấu tạo cơ quan sinh bào tử trần ở Aspergillus
Ghi chú: a: Thể bình dạng đơn tầng (uniseriate);b: Thể bình dạng lưỡng tầng
(biseriate); c: Tế bào Hulle; d: Tế bào gốc (foot-cell); e: Bào tử trần (conidia).
11

Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

Ở một số loài Aspergillus người ta đã tìm thấy hình thức sinh sản hữu
tính (telrmorph) của chúng, các loài này được xếp vào các chi của lớp nấm túi
như Emercella, Eurotium, Neosartorya và một số chi khác (Raper & Fennell,
1965; Samson, 1979).
Đặc điểm đặc trƣng của nhóm loài Aspergillus niger:
Theo khóa phân loại đến loài của chi Aspergillus (Raper & Fennell,
1965; Al-Musallam, 1980; Domsch et al., 1980; Klich &Pitt, 1988;
Kozakiewiez, 1989; Tzean et al., 1990; Parenicova, 2000 và Maren A Krick,
2002) thì nhóm loài Aspergillus niger có những đặc điểm nổi bật sau :
- Bông nấm (conidial head): dạng màu đen tối, đen hơi lục, đen hơi nâu,
đen tía hoặc đen cacbon; có hình cầu hoặc phóng xạ hoặc chia ra thành
các cột không đều đặc.
- Giá bào tử trần (conidiophore, stipe): thường nhẵn hoặc hơi ráp ở một
số loài, thành thường dày.
- Bọng đỉnh giá (vesicle): hình cầu hoặc gần cầu.
- Các lớp thể bình (seriation): đơn tầng hoặc lưỡng tầng ở tùy loài.
- Bào tử trần (conidia): hình cầu, gần cầu, elip, nhẵn hoặc gần nhẵn, hơi
ráp hoặc ráp.
- Hạch nấm: hình gần cầu đến cầu, màu kem khi non, khi già màu lông
bò hoặc hồng hoặc nâu.
1.3.

Sơ lƣợc về chi Penicillium
Theo E. Kiffer, M. Morelet, 2000, trong số các chi nấm thuộc tổ chi

Phialoconidiae (lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ
Deuteromycotina) thì chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223 loài,
chúng phân bố ở khắp nơi trên trái đất, cư trú ở trên rất nhiều các ổ sinh thái.

12


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

Hinh 1.3. Cấu tạo khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử trần của Penicillium
Chúng có những đặc điểm chung với Aspergillus nhưng cũng có các
đặc điểm đặc thù như :
Màu khuẩn lạc : Thường có màu xanh xám.
Khuẩn ty: khuẩn ty của Penicillium phân nhánh, nhiều khuẩn ty có
vách ngăn ngang và chính khuẩn ty này có khả năng hấp thu chất dinh
dưỡng để tạo ra cọng bào tử và đính bào tử; Mỗi tế bào thường có một
nhân nhưng nhiều khi có những tế bào có nhiều nhân, mỗi đoạn khuẩn
ty có thể phát triển thành sợi khuẩn ty mới.

13


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

Bông nấm (conidial head): bông nấm có hình dạng chổi (hình 1.3).

Giá bào tử trần (conidiophore, stipe): phân nhánh, đối xứng hoặc
không đối xứng, có vách ngăn ngang (hình 1.3).
Bọng đỉnh giá (vesicle): có hình đế hay hình bàn chang.
Các lớp thể bình (seriation): thể bình dạng lưỡng tầng (biseriate).
Bào tử trần (conidia): Đính bào tử có dạng tròn có vách láng hay ráp
nhưng chỉ có đơn nhân nhưng cũng có khi chúng có đa nhân.
1.4.

Cellulose và cellulase

1.4.1. Cellulose
Cellulose là một polysaccarit mạch thẳng gồm từ 1400-12000 gốc β-Dglucose có cấu trúc không gian dạng ghế bành (hình 1.4). Hai phân tử khác
nhau quay góc với nhau 180o. Cellulose là loại hợp chất hữu cơ dồi dào trong
tự nhiên chiếm tới 40%-50% hydratcabon, là thành phần chất khô chủ yếu của
thực vật. Cellulose có cấu trúc dạng sợi song song, dài khoảng 5 µm với
đường kính 3 nm. Các sợi này liên kết với nhau bởi các liên kết hydro và các
liên kết Vandervan tạo thành các bó sợi nhỏ có đường kính 10-40 nm gọi là vi
sợi (microfibrin). Các vi sợi có cấu trúc không đồng nhất tạo nên cấu trúc
mixen của cellulose, cellulose dạng mixen gồm hai vùng:
Vùng kết tinh (crystalline): có các sợi chặt chẽ, đậm đặc ngăn cản sự hấp
thụ nước và ít chịu tác động phân giải. Vùng này chiếm 3/4 cấu trúc
cellulose.
Vùng vô định hình (amorphous regions): có cấu trúc kém chặt chẽ, dễ bị
trương lên và dễ bị phân giải.
Trong tự nhiên cellulose khá bền vững, không tan và bị trương lên khi
hấp thụ nước. Cellulose bị thủy phân khi đun nóng với axit hay kiềm ở nồng

14

Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

độ khá cao, hoặc bị phân giải dưới tác dụng của cellulase được tổng hợp bởi
các vi sinh vật.

Hình 1.4. Cấu trúc không gian lập thể của cellulose
1.4.2. Cellulase
Cellulase xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành các sản
phẩm hòa tan, dễ sử dụng (hấp thụ). Hệ thống cellulase bao gồm ba loại chính
sau:
Endo-β-glucanase

hay

1,4-β-D-glucan-glucanolhydrolase,

cellobiohydrolase (CBH), carboxymethylcellulase (CMC-ase): enzyme
này tấn công vào các điểm khác nhau trên chuỗi cellulose của CMC một
cách ngẫu nhiên, sản phẩm tạo ra là glucose và các oligosaccarit (có thể
từ 3-6 cacbon hoặc nhiều hơn). Sự phân cắt này hình thành các đầu khử
tự do, tạo điều kiện cho exo glucanase hoạt động. Bởi vậy cellulose
vùng kết tinh được phân giải triệt để, hiệu quả.
Exo-β-glucanase hay 1,4-β-D-glucan-cellobiohydrolase, Avicelase:
enzyme này tấn công vào đầu không khử (non-reducing end) của
cellulose tạo ra các cellobiose.

15

Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

1,4-β-glucosidase hay cellobiose: thủy phân cellobiose và một vài cellooligosaccarit thành glucose. Hoạt tính của 1,4-β-glucosidase mạnh nhất
trên cellobiose và giảm dần theo chiều dài của chuỗi.
1.4.3. Cơ chế tác động của phức hệ cellulase
Hiện nay cơ chế phân giải cellulose của phức hệ cellulase có nhiều
quan điểm khác nhau. Năm 1950, Resse và cộng sự đã đề xuất cơ chế phân
giải cellulose như sau:

Cellulose tự
nhiên

E1

Cellulose
hoạt động

E2

Đường
hoà tan Cellobiase

Glucose

Theo cơ chế này exoglucanase (E1) là nhân tố đầu tiên của quá trình
thủy phân, không có tính đặc hiệu, có tác dụng cắt đứt các liên kết hidrohidrobond chuyển hóa cellulose tự nhiên thành các chuỗi cellulose mạch
ngắn. Các chuỗi này tiếp tục bị phân giải bởi endoglucanase (E2) tạo thành

các đường hòa tan (cellobiose và glucose), các cellobiose này sẽ bị cellobiase
chuyển hóa thành glucose.
Năm 1974, Erickson và CS đã đưa ra cơ chế phân giải cellulose như
sau: đầu tiên các endo-β-glucanase phân cắt các liên kết 1,4-β-glucosit ở các
vùng vô định hình trong chuỗi cellulose tạo ra các đầu mạch tự do. Tiếp đó,
dưới tác động của exo-β-glucanase, các đầu mạch tự do này tiếp tục bị phân
cắt thành các cellobiose. Kết quả tác động của hai loại enzyme trên làm xuất
hiện các cello-oligosaccarit, oligosaccarit và glucose. Các sản phẩm này dưới
tác động của β-glucosidase sẽ bị phân cắt thành sản phẩm cuối cùng là
glucose.

16


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

Hình 1.5. Sơ đồ phân giải cellulose theo Erikson và CS (1974)
Cơ chế này đã nêu rõ được vai trò của từng enzyme riêng biệt và giải
thích được tác động hỗ trợ của các enzyme trong quá trình phân giải cellulose
nên được nhiều người chấp nhận.

17


Phùng Dũng Mạnh - K32D

Khóa luận tốt nghiệp

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Mẫu phân lập
Rác thải, lá cây mục, đất mùn, gỗ cây mục, rơm dạ mục lấy được lấy ở
huyện Yên Lạc, Xuân Hòa (Phúc Yên) và thành phố Vĩnh Yên của tỉnh Vĩnh
Phúc.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất dùng cho nghiên cứu
- Thiết bị: Buồng cấy, tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp, máy lắc, máy lắc li tâm, cân
điện tử, kính hiển vi quang học, máy ảnh kỹ thuật số và các thiết bị khác
trong phòng thí nghiệm vi sinh vật khoa Sinh - KTNN trường ĐH Sư
phạm Hà Nội 2.
- Hóa chất: H2O, NaNO3, MgSO4.7H2O, KCl, KH2PO4, FeSO4, Saccarose,
CMC (cacboxyl methyl cellulose), thuốc thử liugon 1%, cồn, dầu soi
kính… và các hoá chất thông dụng khác.
2.2.

Môi trƣờng

- Môi trường phân lập, nuôi cấy và giữ giống: môi trường Crapek-Dox cơ
sở, thành phần môi trường như sau:
Saccarose

: 30 g/l

FeSO4 (dạng vết)

: 1 - 2 hạt

NaNO3

: 10 g/l

Thạch Agar

: 20 g/l

MgSO4.7H2O

: 0,5 g/l

H2O

: 1 lít

KCl

: 0,5 g/l

KH2PO4

: 2 g/l

NaCl

: 1%

pH

:5-6

- Môi trường lỏng: để nuôi cấy thu enzyme, tôi sử dụng môi trường có
thành phần giống với môi trường Crapek-Dox cơ sở nhưng không có

18