Phân lập và biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn e coli

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Văn Phòng

PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
YẾU TỐ ĐÔNG MÁU IX CỦA NGƢỜI Ở VI KHUẨN E. COLI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Văn Phòng

PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
YẾU TỐ ĐÔNG MÁU IX CỦA NGƢỜI Ở VI KHUẨN E. COLI
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. NÔNG VĂN HẢI

Hà Nội - 2012

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Amp

Ampicilin

Ampicilin

APS

Amonium Persulphate

Amonium Persulphate

bp

Base pair

Cặp base

cDNA

Compelementary DNA

ddNTP

Dideoxynucleoside triphosphate

Dideoxynucleoside triphosphate

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axít Deoxyribonucleic

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

Deoxynucleoside triphosphate

E. coli

Escherichia coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBr

Ethidium Bromide

Ethidium Bromide

EtOH

Ethanol

Ethanol

IPTG

Isopropyl-thio-β-D-galactoside

Isopropyl-thio-β-D-galactoside

Kb

Kilo base

1000 cặp base (1000 bp)

kD

Kilo Dalton

Kilo Dalton

LB

Luria Bertani

Môi trường

mRNA

Messenger RNA

RNA thông tin

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng nhân bản DNA

DNA được tạo ra trên khuôn mRNA
bằng enzyme phiên mã ngược


pJET

Vector pJET1.2/blunt

Vector pJET1.2/blunt

RNA

Ribonucleic acid

Axít Ribonucleic

RNase

Ribonuclease

Ezyme Ribonuclease

rRNA

Ribosomal Ribonucleic acid

ribosome RNA

Reverse Transcriptase- Polymerase

Kỹ thuật PCR bằng enzyme phiên mã

Chain Reaction

ngược

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

Sodium Dodecyl Sulphate

SDSPAGE

Sodium Dodecyl Sulphate
polyacrylamide gel sulfate

Điện di biến tính trên gel
polyacrylamide

TAE

Tris-Acetate-EDTA

Tris-Acetate-EDTA

TEMED

N, N, N’, N’-Tetramethyl
Ethylendiamine

N, N, N’, N’-Tetramethyl
Ethylendiamine

RT-PCR


MỤC LỤC
Nội dung

Trang

MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3
1.1. Tổng quan về bệnh Hemophilia ...........................................................................3
1.1.1. Giới thiệu chung về bệnh Hemophilia .......................................................3

1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh Hemophilia ..........................................................5
1.1.3. Phân loại Hemophilia ................................................................................7
1.1.4. Biểu hiện của bệnh Hemophilia .................................................................9
1.1.5. Phương pháp điều trị bệnh Hemophilia ...................................................10
1.2. Vai trò của yếu tố đông máu IX trong quá trình đông máu ...............................11
1.3. Cấu trúc gen mã hóa yếu tố đông máu IX ..........................................................13
1.4. Cấu trúc và những biến đổi sau dịch mã của yếu tố đông máu IX ....................16
1.4.1. Cấu trúc của phân tử protein FIX ............................................................16
1.4.2. Những biến đổi sau dịch mã của phân tử protein FIX .............................18
1.5. Sự hoạt hóa yếu tố đông máu IX ........................................................................22
1.6. Vector biểu hiện pET32a ...................................................................................24
1.7. Chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3) ..................................................................26
1.8. Các hệ thống biểu hiện dùng trong tạo protein tái tổ hợp ..................................29
1.9. Tình hình nghiên cứu trong nước .......................................................................30
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................32
2.1. Vật liệu ...............................................................................................................32
2.2. Phương pháp.......................................................................................................35
2.2.1. Tách chiết RNA tổng số ..........................................................................35
2.2.2. Tổng hợp cDNA ......................................................................................36
2.2.3. Nhân đoạn cDNA bằng phản ứng PCR ...................................................37


2.2.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ............................................39
2.2.5. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế ...........................................................40
2.2.6. Tinh chế các đoạn DNA trên gel agarose ................................................41
2.2.7. Ghép nối DNA .........................................................................................42
2.2.8. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt .....................43
2.2.9. Tách chiết DNA plasmid .........................................................................45
2.2.10. Xác định trình tự DNA ..........................................................................46
2.2.11. Biểu hiện gen mã hóa cho protein FIX ..................................................47

2.2.12. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE .............................48
2.3. Sơ đồ thí nghiệm ................................................................................................49
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................52
3.1. Phân lập gen mã hóa yêu tố đông máu IX ở người ............................................52
3.1.1. Thu thập mẫu mô gan sinh thiết người ....................................................52
3.1.2. Tách chiết RNA tổng số ..........................................................................52
3.1.3. Tạo dòng và xác định trình tự gen FIX ....................................................53
3.2. Thiết kế vector biểu hiện FIX (pET32a/FIXnoSP) ...............................................60
3.2.1. Khuếch đại cDNA mã hóa FIXnoSP ..........................................................62
3.2.2. Ghép nối cDNA mã hóa FIXnoSP vào vector biểu hiện pET32a ..............63
3.2.3. Kiểm tra sự có mặt của cDNA mã hóa FIXnoSP trong vector pET32a .....64
3.3. Biểu hiện cDNA mã hóa FIXnoSP ở vi khuẩn E. coli BL21(DE3) .....................68
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................71
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................72


DANH MỤC CÁC BẢNG
Số bảng

Tên bảng

Bảng 1

Kích thước các exon và intron của gen mã hóa cho yếu tố

Trang
14

đông máu IX
Bảng 2

Danh sách các đối tượng cho mẫu gan sinh thiết

32

Bảng 3

Trình tự các cặp mồi được sử dụng

33

Bảng 4

Các vector tách dòng và biểu hiện

34

Bảng 5

Môi trường nuôi cấy các chủng vi sinh vật

35

Bảng 6

Tương quan giữa nộng độ gel agarose và kích thước đoạn

39

DNA cần phân tách

Bảng 7

Thành phần các loại gel sử dụng trong điện di SDS-PAGE

48

Bảng 8

Danh sách người cho mẫu

52


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Số hình

Tên hình

Hình 1

Quá trình đông máu ở người bình thường và người mắc

Trang
3

bệnhHemophilia (theo Hiệp hội Hemophilia thế giới)
Hình 2

Tỷ lệ người mắc bệnh Hemophilia ở Việt Nam so với thế giới

4

theo đánh giá của Hiệp hội Hemophilia quốc tế vào tháng 3
năm 2012
Hình 3

Sự di truyền bệnh Hemophilia trong trường hợp cha mắc bệnh

6

và Mẹ không mang gen gây bệnh
Hình 4

Sự di truyền bệnh Hemophilia trong trường hợp mẹ mang bệnh

7

và cha không mắc bệnh
Hình 5

Biểu hiện bệnh Hemophilia thể nặng ở trẻ sơ sinh

Hình 6

Biểu đồ thể hiện sự đông máu

12

Hình 7

Vị trí của gen mã hóa yếu tố đông máu IX trên nhiễm sắc thể

14

9

X
Hình 8

Cấu trúc của gen FIX mã hóa cho yếu tố đông máu IX

15

Hình 9

Cấu trúc phân tử mRNA được phiên mã từ gen FIX

15

Hình 10

Trình tự amino acid và những biến đổi sau dịch mã của protein

17

FIX
Hình 11

Những biến đổi sau dịch mã của protein FIX trong con đường

18

chế tiết
Hình 12

Phản ứng carboxyl hóa

20

Hình 13

Các con đường hoạt hóa yếu FIX

23

Hình 14

Cấu trúc vector biểu hiện pET32a

26

Hình 15

Cơ chế cảm ứng promoter T7 bằng chất cảm ứng IPTG ở tế

28

bào E. coli BL21(DE3)
Hình 16

Sơ đồ quá trình phân lập và dòng hóa cDNA mã hóa yếu tố
đông máu IX (FIX)

50


Hình 17

Sơ đồ quy trình thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa

51

FIXnoSP và biểu hiệu trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21(DE3)
Hình 18

Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số trên gel agarose 1%

52

Hình 19

Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen cDNA mã hóa FIX trên

54

gel agarose 0,8%
Hình 20

Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 0,8%

56

Hình 21

Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang cDNA của gen

56

FIX bằng enzyme hạn chế XbaI và XhoI
Hình 22

So sánh trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của các

60

dòng plasmid mang cDNA mã hóa protein FIX ở người và
trình tự đã công bố
Hình 23

Sơ đồ vector biểu hiện pET32a/FIXnoSP

61

Hình 24

Ảnh điện di đồ sản phẩm PCR nhân cDNA mã hóa FIXnoSP

63

Hình 25

Ảnh điện đi đồ sản phẩm PCR và vector pET32a sau khi tinh

63

sạch trên gel agarose 0,8%
Hình 26

Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 0,8%

65

Hình 27

Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hạn

66

chế trên gel agarose 0,8%
Hình 28

Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của các plasmid

67

pET32a/FIXnoSP bắt đầu từ TVF mang cDNA mã hóa FIXnoSP
và trình tự đã công bố NM_000133
Hình 29

Điện di kết quả biểu hiện protein trên gel polyacrylamide

12,6%

69


MỞ ĐẦU
“Thu hẹp khoảng cách - Kết nối cộng đồng” là thông điệp được đưa ra tại Lễ
mít tinh hưởng ứng ngày Hemophilia thế giới (17/4/) diễn ra tại Hà Nội, với mong
muốn cải thiện tình hình chăm sóc bệnh nhân bị bệnh Hemophilia (hay còn gọi là
bệnh máu khó đông) trên phạm vi toàn cầu, hướng tới mục tiêu tất cả người bệnh
máu khó đông đều có cơ hội được điều trị và chăm sóc tốt. Ở Việt Nam, theo thống
kê của Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương ước tính hiện nay có khoảng
6.000 bệnh nhân bị bệnh Hemophilia, trong đó mới chỉ 20% bệnh nhân được phát
hiện và chăm sóc thường xuyên. Hemophilia là một rối loạn chảy máu di truyền do
bất thường gen gây nên, bệnh nhân bị chảy máu khó cầm ở khắp các bộ phận trên
cơ thể, đặc biệt là cơ và khớp. Bệnh xuất hiện do cơ thể thiếu hụt hoặc không có đủ
các yếu tố làm đông máu, thường gặp là yếu tố VIII (hemophilia A) và IX
(hemophilia B).
Trên thế giới, việc nghiên cứu và sử dụng các thuốc giúp làm máu đông
nhanh để điều trị bệnh Hemophilia bằng công nghệ sinh học đã được bắt đầu từ cuối
năm 1980. Cho tới nay, việc áp dụng những kỹ thuật hiện đại của công nghệ gen và
protein để phân lập và tách dòng cDNA nhằm sản xuất các chể phẩm protein tái tổ
hợp VIII và IX trong các tế bào vi khuẩn và tế bào động vật đã phát triển vượt bậc
[59]. Người ta đã sản xuất được các chế phẩm VIII và IX có giá trị trong điều trị với
giá thành hạ, sản lượng tăng, độ tinh sạch cao... đáp ứng những nhu cầu cấp bách
của thực tiễn [35].
Người bệnh Hemophilia có thể có cuộc sống gần như người bình thường nếu
được phát hiện sớm và điều trị đúng cách. Còn nếu người bệnh để bệnh phát triển
thì hậu quả sẽ là chảy máu nhiều lần, gây biến dạng cơ và khớp, dẫn đến khó khăn
trong việc đi lại, trở thành người tàn tật, thậm chí tử vong sớm. Ở nước ta, quá trình

điều trị cho những người mắc bệnh Hemophilia gặp phải rất nhiều khó khăn. Điều
trị bằng phương pháp tiếp máu có những khó khăn như rất tốn kém và để có được
nguồn máu phù hợp cho người bệnh là rất khó. Ngoài ra, cách điều trị này còn tiềm

1


ẩn lây truyền các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm như virus viêm gan, HIV... cho
bệnh nhân Hemophilia. Bên cạnh đó, nếu điều trị bằng cách sử dụng các dược phẩm
dưới dạng các yếu tố đông máu VIII/IX thì phải nhập ngoại các dược phẩm này do
không có sẵn trên thị trường. Do vậy, giá thành của chúng rất cao. Theo thông tin từ
Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương, chi phí cho một bệnh nhân Hemophilia
trung bình khoảng 50 – 100 triệu đồng/năm.
Cho đến nay, ở nước ta vẫn chưa có một công bố hay đề tài nào về nghiên cứu
sản xuất yế u tố đông máu IX tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn hay tế bào động vật
được thực hiện. Do những nhu cầ u cấ p thiế t trong điề u tri ̣bê ̣nh Hemophilia , chúng
tôi đã tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Phân lập và biểu hiện gen mã hóa
yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn E. coli”, nhằm tạo ra một bước tiền đề
hướng tới việc nghiên cứu và phát triển chế phẩm yếu tố đông máu IX tái tổ hợp,
góp phần vào việc chăm sóc sức khỏe bệnh nhân Hemophilia trong tương lai.
Đề tài thực hiện với mục tiêu cụ thể sau:
1. Tách chiết được RNA tổng số từ mô gan sinh thiết của người.
2. Phân lập được đoạn cDNA mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô người.
3. Thiết kế được vector biểu hiện mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông
máu IX của người.
4. Chuyển và biểu hiện vector mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông
máu IX của người ở vi khuẩn E. coli.

2

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về bệnh Hemophilia
1.1.1. Giới thiệu chung về bệnh Hemophilia
Hemophilia là một bệnh rối loạn đông máu di truyền mà trong dân gian
thường hay gọi là “bệnh máu loãng”, “bệnh máu không đông” hoặc “bệnh máu khó
cầm”. Bệnh này đặc trưng bởi sự thiếu hụt hoặc không có một trong các protein cần
thiết cho quá trình đông máu. Một số người mắc bệnh Hemophilia do thiếu hụt yếu
tố đông máu VIII, được gọi là Hemophilia A. Một số khác do thiếu yếu tố đông
máu IX, được gọi là Hemophilia B. Ngoài ra, có tỷ lệ rất hiếm người mắc bệnh
Hemophilia C, bệnh do thiếu hụt yếu tố đông máu XI [70], [71].

Hình 1. Quá trình đông máu ở người bình thường và người mắc bệnh Hemophilia
(theo Hiệp hội Hemophilia thế giới).

Người mắc bệnh Hemophilia không chảy máu nhanh hơn người bình thường.
Tuy nhiên, người bệnh lại chảy máu khó cầm hơn những người khác (Hình 1). Biểu
hiện của bệnh là xuất hiện các vết thâm tím lớn dưới da, chảy máu khó cầm ở khắp
các vị trí trên cơ thể. Chảy máu xuất hiện một cách tự nhiên và kéo dài sau những
tổn thương hoặc phẫu thuật. Vị trí hay gặp nhất là ở cơ và khớp. Chảy máu cơ và

3


khớp nhiều lần sẽ làm teo cơ, cứng khớp, biến dạng khớp, khiến người bệnh gặp
nhiều khó khăn trong việc đi lại, trở thành người tàn tật, sống cô lập với cộng đồng
và thậm chí dẫn tới tử vong sớm.
Theo Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương, hiện nay ở Việt Nam ước
tính có khoảng gần 6.000 người mắc Hemophilia, trong đó số được chẩn đoán và
quản lý mới chỉ chiếm chưa tới 20% [66]. Do hiểu biết của cộng đồng, của bệnh

nhân và gia đình về bệnh còn hạn chế, đa số bệnh nhân còn được chẩn đoán muộn
và chưa biết cách tự chăm sóc. Bên cạnh đó, chế phẩm máu điều trị cho bệnh nhân
còn chưa được cung cấp đầy đủ vì vậy tỷ lệ bệnh nhân tàn tật còn cao, chiếm 60%.
Theo số liệu thống kế của Hiệp hội Hemophilia quốc tế, hiện nay trên thế
giới có hơn 400.000 người mắc bệnh Hemophilia. Trong đó, Hoa Kỳ có khoảng
20.000 người mắc bệnh và ước tính mỗi năm có khoảng 400 bé trai mới sinh mắc
bệnh. Hình 2 minh họa mối tương quan tỷ lệ mắc bệnh Hemophilia của Việt Nam
so với thế giới [72].

Hình 2. Tỷ lệ người mắc bệnh Hemophilia ở Việt Nam so với thế giới theo đánh giá
của Hiệp hội Hemophilia quốc tế vào tháng 3 năm 2012.

4


1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh Hemophilia
Hemophilia là bệnh rối loạn chảy máu di truyền, được gây ra bởi đột biến
trong các gen mã hóa cho các yếu tố đông máu VIII, IX và XI. Trong hầu hết các
trường hợp, gen đáp ứng cho bệnh Hemophilia được truyền từ cha hoặc/và mẹ sang
con cái. Tuy nhiên, có khoảng 30% trường hợp mắc bệnh Hemophilia được sinh ra
từ một gia đình không có tiền sử về bệnh Hemophilia trước đó. Trong những trường
hợp như vậy, nguyên nhân gây bệnh Hemophilia là do đột biến gen tự phát tại thời
điểm thụ tinh [70].
 Nguyên nhân do di truyền
Gen mã hóa cho hai yếu tố đông máu VIII và IX đều nằm trên nhiễm sắc thể
giới tính "X" [Nữ (XX), nam (XY)]. Do đó, Hemophilia được gọi là rối loạn chảy
máu di truyền liên kết với nhiễm sắc thể giới tính "X". Điều này có nghĩa là bệnh
Hemophilia chủ yếu xảy ra ở nam giới, còn nữ giới là người mang gen gây bệnh.
Nam giới mắc bệnh có mức độ biểu hiện thấp hoặc không có yếu tố đông máu VIII
và IX trong tuần hoàn máu. Trong khi nữ giới mang gen bệnh sẽ có ít nhất một

nhiễm sắc thể giới tính “X” mang gen mã hóa cho yếu tố đông máu VIII và IX ở
trạng thái bình thường, đáp ứng khoảng 50% mức độ yếu tố đông máu. Các mô hình
di truyền chung cho cả hai bệnh Hemophilia A và B có thể được tóm tắt sau:
 Bệnh Hemophilia được di truyền trong trường hợp cha mắc bệnh, mẹ
không mắc bệnh:
Người cha mắc bệnh sẽ di truyền gen gây bệnh nằm trên nhiễm sắc thể “X”
cho toàn bộ con gái. Do đó, tất cả con gái được sinh ra từ người cha này trở thành
người mang gen bệnh. Mỗi người con trai được sinh ra trong trường hợp này sẽ
nhận một nhiễm sắc thể “Y” từ người cha và một nhiễm sắc thể “X” không mang
gen bệnh từ người mẹ. Bởi vậy, tất cả các con trai sẽ không mắc bệnh (Hình 3) [69].

5


Hình 3. Sự di truyền bệnh Hemophilia trong trường hợp
cha mắc bệnh và Mẹ không mang gen gây bệnh [69].

 Bệnh Hemophilia được di truyền trong trường hợp người cha không mắc
bệnh, mẹ mang bệnh:
Trường hợp này, người mẹ mang gen bệnh có thể di truyền chính chiếc
nhiễm sắc thể “X” mang gen bệnh cho cả con gái và con trai của mình. Do đó, cả
hai con trai và con gái có 50% nguy cơ nhận được một chiếc nhiễm sắc thể X này từ
người mẹ. Nếu một người con trai nhận được nhiễm sắc thể “X” mang gen bệnh,
người con này sẽ mắc bệnh. Còn nếu, người con trai nhận được một chiếc nhiễm
sắc thể X không mang gen bệnh, người con này sẽ không mắc bệnh. Đối với con
gái, nếu như một người con gái nhận từ nhiễm sắc thể “X” mang bệnh từ người mẹ,
người còn gái này sẽ mang gen bệnh. Vì vậy, các con gái được sinh ra từ trường
hợp này có 50% nguy cơ cũng trở thành người mang gen bệnh. Các con trai cũng có
50% nguy cơ mắc bệnh (Hình 4) [69].
Ngoài ra, sự thiếu hụt yếu tố đông máu XI thường là một bệnh di truyền,

được gây ra bởi đột biến gen (alteration) của gen mã hóa cho yếu tố đông máu XI.
Đây là một rối loạn di truyền gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường, có nghĩa là cả

6


bố và mẹ đều phải mang gen bệnh thì mới có khả năng sinh ra một người con mắc
bệnh. Sự ảnh hưởng của gen gây bệnh này đối với cả nam và nữ là như nhau [74].

Hình 4. Sự di truyền bệnh Hemophilia trong trường hợp
mẹ mang bệnh và cha không mắc bệnh [69].

 Nguyên nhân do đột biến
Đột biến xảy ra ở các gen mã hóa cho các yếu tố đông máu (VIII, IX và XI)
chủ yếu là các đột biến điểm, đảo đoạn, mất nucleotide và đột biến vô nghĩa. Các
dạng đột biến này chiếm tỷ lệ tương ứng 46%, 42%, 8%, 4%. Người bệnh nhận
được những đột biến này theo phương thức tự phát hơn là được di truyền từ cha mẹ.
Bởi vì, một đột biến mới có thể được tạo ra ở một trong các giao tử do cha mẹ sinh
ra. Các đột biến tự phát chiếm khoảng 30% trong tổng số các trường hợp mắc bệnh
Hemophilia [54].
1.1.3. Phân loại Hemophilia
Quá trình đông máu được thực hiện nhờ sự tham gia tương tác của nhiều
thành phần trong máu, trong đó có 13 yếu tố đông máu (Clotting Factor I-XIII) [32].
Nếu một trong những yếu tố đông máu này không có, hoặc bị thiếu hụt thì có thể

7


xảy ra chảy máu kéo dài (bệnh Hemophilia). Bệnh Hemophilia có thể được chia làm
3 loại chính: Hemophilia A, Hemophilia B và Hemophilia C [74].

a. Hemophilia A: Là loại bệnh phổ biến nhất, do sự thiếu hụt chức năng của
yếu tố đông máu VIII trong tuần hoàn máu và gen gây bệnh liên kết với nhiễm sắc
thể X, do đó bệnh chủ yếu xảy ra ở nam giới. Tỷ lệ mắc bệnh là 1:10000 bé trai sơ
sinh mỗi năm và chiếm khoảng 80% số trường hợp mắc bệnh Hemophilia. Ví dụ
như Canada, hiện nay số người mắc bệnh này là 2.500 người.
b. Hemophilia B: Đây là bệnh phổ biến thứ hai sau bệnh Hemophilia A, so
với bệnh Hemophilia A thì nó thấp hơn khoảng 4 lần. Bệnh được gây ra do sự thiếu
hụt chức năng của yếu tố đông máu IX và gen gây bệnh liên kết với nhiễm sắc thể
X, do đó bệnh chủ yếu xảy ra ở nam giới. Tỷ lệ mắc bệnh là 1:50000 bé trai sơ sinh
mỗi năm và nó chiếm khoảng 20% số trường hợp mắc bệnh Hemophilia. Ví dụ như
Canada, hiện nay số người mắc bệnh này là 600 người.
c. Hemophilia C: Bệnh này hiếm gặp nhất. Bệnh được gây ra do sự thiếu hụt
chức năng của yếu tố đông máu XI. Tỷ lệ mắc bệnh này là 1:100000 bé trai sơ sinh
mỗi năm.
Mức độ nặng của bệnh Hemophilia phụ thuộc vào lượng yếu tố đông máu có
mặt trong máu. Người bình thường, trong huyết tương nồng độ của các yếu tố đông
máu VIII và IX dao động từ 50 – 150% [68]. Tùy theo mức độ thiếu hụt yếu tố đông
máu nhiều hay ít mà người ta phân chia Hemophilia thành 3 thể bệnh sau:
a. Thể nặng (< 1%): Nồng độ yếu tố VIII hoặc IX nhỏ hơn 1%. Chảy máu
trong cơ, khớp hoặc các bộ phận khác xảy ra tự nhiên hay sau chấn thương nhỏ. Thể
bệnh nặng chiếm khoảng 60% số trường hợp mắc bệnh Hemophilia.
b. Thể trung bình (1 – 5%): Nồng độ yếu tố VIII hoặc IX từ 1% đến 5%.
Chảy máu sau chấn thương trung bình hoặc phẫu thuật, nhổ răng. Thể bệnh trung
bình chiếm khoảng 15% số trường hợp mắc bệnh Hemophilia.
c. Thể nhẹ (5 – 30%): Nồng độ yếu tố VIII hoặc IX từ hơn 5% đến 30%.
Chảy máu thường liên quan đến chấn thương lớn, phẫu thuật hoặc nhổ răng. Bệnh

8

nhân thường được chẩn đoán muộn, có liên quan đến chấn thương hoặc mổ xẻ. Thể
bệnh nhẹ chiếm khoảng 25% số trường hợp mắc bệnh Hemophilia.
1.1.4. Biểu hiện của bệnh Hemophilia
Hầu hết bệnh nhân Hemophilia là nam giới. Bệnh gặp ở khắp nơi trên thế
giới với tỷ lệ khoảng 1:5000 bé trai mới sinh. Nhìn chung, bệnh nhân Hemophilia
càng nặng biểu hiện bệnh càng sớm. Triệu chứng thường xuất hiện khi trẻ bắt đầu
tập đứng và lẫm chẫm tập đi. Sau những lần ngã thường có xuất huyết dưới da hoặc
chảy máu môi, lưỡi.
Biểu hiện của bệnh rất đa dạng: chảy máu bất thường, tự nhiên hoặc sau
phẫu thuật, có thể xảy ra ở bất cứ vị trí nào trên cơ thể tuy nhiên cơ và khớp thường
hay bị chảy máu hơn đến nỗi nhiều người bệnh nhầm tưởng là bệnh của cơ, khớp
[65]. Hình 5 minh họa một trong những biểu hiện của bệnh Hemophilia.

Hình 5. Biểu hiện bệnh Hemophilia thể nặng ở trẻ sơ sinh [23].
Các vết thâm tím dưới da tạo thành do chảy máu tĩnh mạch ở bệnh nhân Hemophilia

Chảy máu khớp: Chảy máu khớp thường gặp nhất ở bệnh nhân Hemophilia.
Đây là loại chảy máu nguy hiểm vì khi tái phát nhiều lần gây ra viêm khớp, biến
dạng khớp. Chảy máu khớp có thể xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thương. Nếu
điều trị muộn sau 4 giờ thì cảm giác đau có thể tăng lên, khớp sẽ sưng và việc điều
trị bị kéo dài tới vài ngày. Trẻ lớn có thể nhận biết được chảy máu khớp trước khi

9


đau và sưng xảy ra với cảm giác gai châm hoặc kiến bò trong khớp. Điều trị sớm sẽ
dự phòng được tình trạng đau mãn tính và biến dạng khớp.
Chảy máu trong cơ: Chảy máu trong cơ cũng thường gặp và xuất hiện tự
nhiên hoặc sau chấn thương. Những cơ hay bị chảy máu là: cẳng chân, đùi, cánh
tay. Chảy máu cơ gây ra sưng đau trong vài ngày. Một dấu hiệu quan trọng và kín

đáo trong chảy máu cơ là cảm giác đau, nóng, ngứa ran hoặc tê bì. Nếu không được
điều trị sớm cơ sẽ bị phá huỷ và có thể gây liệt.
Chảy máu não: Có thể xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thương, ví dụ như
ngã hoặc đập đầu vào vật cứng. Triệu chứng chảy máu não có thể xảy ra ngay hoặc
vài ngày sau chấn thương bao gồm: dễ kích ứng, ngủ gà, đau đầu, lú lẫn, nôn, buồn
nôn…
Chảy máu trong cổ và ngực: Chảy máu ở cổ và ngực có thể được coi là
nghiêm trọng vì sưng nề có thể gây chèn ép đường thở. Nhiễm trùng cũng có thể
làm sưng cổ và đôi khi khó có thể phân biệt hiện tượng sưng là do nhiễm trùng hay
do chảy máu.
1.1.5. Phƣơng pháp điều trị bệnh Hemophilia
Đến nay, bệnh này vẫn chưa thể điều trị tận gốc. Người bệnh phải phụ thuộc
vào các loại thuốc đặc trị và bổ sung suốt đời các yếu tố đông máu lấy từ nguồn
máu hiến và họ có thể chung sống với bệnh. Hemophilia được điều trị khác nhau
tùy thuộc vào mức độ nghiêm trọng của tình trạng bệnh.
Hemophilia A nhẹ: Điều trị có thể bao gồm tiêm chậm hormon hesmopressin
(DDAVP) vào tĩnh mạch để kích thích trợ giúp cho sự vận chuyển yếu tố đông máu
VIII đến nơi thành mạch máu bị tổn thương [46]. Desmopressin cũng có thể được
dùng theo đường xịt mũi.
Hemophilia A hoặc hemophilia B từ thể vừa tới nặng: Điều trị bằng cách
truyền yếu tố đông máu được chiết xuất từ máu người hoặc yếu tố đông máu tái tổ
hợp để cầm máu. Có thể phải truyền nhiều lần nếu bệnh nặng.
Hemophilia C: Cần truyền huyết tương để ngăn chặn các đợt chảy máu.

10


Thông thường, việc truyền yếu tố đông máu dự phòng 2 hoặc 3 lần/tuần có
thể giúp ngăn ngừa chảy máu. Cách này giúp giảm thời gian nằm viện và hạn chế
tác dụng phụ. Bệnh nhân có thể được hướng dẫn cách tự tiêm truyền desmopressin

tại nhà.
1.2. Vai trò của yếu tố đông máu IX trong quá trình đông máu
Sự đông máu là một quá trình phức tạp qua đó tạo ra các cục máu đông.
Đông máu là một cơ chế quan trọng trong quá trình cầm máu. Khi thành mạch máu
bị tổn thương, máu được cầm nhờ vị trí tổn thương được che phủ bởi cục máu đông
chứa tiểu cầu và sợi huyết. Rối loạn đông máu có thể làm tăng nguy cơ chảy máu
và/hoặc tạo cục máu đông và huyết tắc. Cơ chế đông máu được bảo tồn khá chắc
trong tiến hóa; ở lớp thú, hệ thống đông máu bao gồm hai thành phần: tế bào (tiểu
cầu) và protein (13 các yếu tố đông máu) [32].
Trong quá trình đông máu, yếu tố đông máu IX đóng vai trò như một
protease của quá trình cầm máu nên nó có vai trò hết sức quan trọng (Hình 6). Sự
đông máu được điều khiển bởi một mức độ nồng độ các protein thông qua sự tương
tác qua lại giữa hai con đường, nội sinh và ngoại sinh. Con đường ngoại sinh bao
gồm một số yếu tố, các yếu tố này thường không có mặt trong máu trong điều kiện
bình thường và được gọi là yếu tố mô (tissue factor-TF). Yếu tố mô xuất hiện trên
bề mặt của các tế bào và nó liên kết với chất nền ngoại bào. Ngược lại, con đường
nội sinh chỉ bao gồm các yếu tố có thể phân lập được từ huyết thanh [31]. Trong
mạch máu, sự đông máu được khởi đầu bằng việc thành mạch máu bị tổn thương và
tiếp theo yếu tố mô được bộc lộ trên bề mặt của các tế bào ngoài mạch máu để hoạt
hóa yếu tố đông máu VII thành dạng hoạt hóa/FVIIa [47]. Sự kiện này khởi đầu cho
một chuỗi phức tạp các phản ứng thủy phân protein có liên quan đến nhiều yếu tố,
nhiều loại tế bào và nhiều chất ức chế mà kết quả cuối cùng dẫn đến sự hình thành
cục máu fibrin.
Được tổng hợp chủ yếu ở gan sau đó được tiết vào máu, yếu tố đông máu IX
đóng vai trò rất quan trọng trong việc hoạt hóa yếu tố đông máu X thành dạng hoạt

11


hóa FXa thông qua sự kết hợp với cofactor của nó là FVIIIa (dạng hoạt hóa của yếu

tố đông máu VIII) và cơ chất là yếu tố đông máu X để hình thành phức hợp tenase
[31]. Phản ứng này cần có sự tham gia của ion Ca2+ và phospholipid, xảy ra trên bề
mặt của cả tế bào tiểu cầu hoạt hóa và các tế bào nội bì [36]. Sự hoạt hóa của yếu tố
đông máu X trong phức hợp tenase thể hiện sự liên kết giữa cả hai con đường nội
sinh và ngoại sinh. Sự hoạt hóa yếu tố đông máu X phụ thuộc vào FIXa (dạng hoạt
hóa của yếu tố đông máu IX) là điều kiện tiên quyết cho quá trình cầm máu, nếu
như sự thiếu hụt một trong hai yếu tố đông máu VIII hoặc IX dẫn đến kết quả là
mắc bệnh Hemophilia A hoặc Hemophilia B mà khó có thể phân biệt được kiểu
hình giữa hai bệnh này.

Hình 6. Biểu đồ thể hiện sự đông máu [67].
Các phản ứng liên quan tới yếu tố đông máu IX được thể hiện bằng màu chữ đỏ.

Theo Hình 6, yếu tố đông máu X không chỉ được hoạt hóa bằng FIXa mà
còn được hoạt hóa bởi chính phức hệ TF-FVIIa. Tuy nhiên, TF-FVIIa không thể

12


hoạt hóa đủ yếu tố đông máu X để ngăn cản sự xuất hiện bệnh Hemophilia ở mỗi cá
thể khi có sự thiếu hụt yếu tố đông máu VIII hoặc IX [36].
Yếu tố đông máu IX lưu thông trong mạch máu như là một zymogen bất hoạt
và phải được chuyển hóa thành dạng enzyme hoạt động (FIXa). Trước khi nó thực
hiện chức năng là một chất hoạt hóa yếu tố đông máu X thì yếu tố đông máu IX
được hoạt hóa bằng phức hợp TF-FVIIa hoặc bằng FXIa (dạng hoạt hóa của yếu tố
đông máu XI) [27]. Sự hoạt hóa yếu tố đông máu IX bằng phức hợp TF-FVIIa được
kết hợp với sự khởi đầu của quá trình đông máu hoặc xảy ra trên bề mặt tế bào
mang TF [37]. Cơ chế hoạt hóa yếu tố đông máu IX bằng TF-FVIIa chỉ tạo ra một
lượng rất nhỏ FIXa.
Con đường hoạt hóa yếu tố đông máu IX bằng FXIa tạo ra lượng FIXa nhiều

hơn và xảy ra trên bền mặt của các tế bào tiểu cầu hoạt hóa [36]. Sự hoạt hóa đông
máu IX thông qua cơ chế này rất quan trọng cho việc duy trì sự hình thành và đảm
bảo tính nguyên vẹn cục máu đông, đặc biệt trong một số trường hợp kích thích
đông máu nghiêm khắc hoặc khi quá trình đông máu xảy ra trong môi trường thủy
phân fibrin cao [22]. Nhờ đó, yếu tố đông máu IX đóng một vài trò quan trọng trong
cả sự khởi đầu hình thành cục máu và duy trì tính nguyên vẹn của cục máu thông
qua sự hoạt hóa yếu tố đông máu X.
1.3. Cấu trúc gen mã hóa yếu tố đông máu IX
Gen FIX là gen mã hóa cho yếu tố đông máu IX (human factor IX, protein
FIX), nằm trên cánh tay dài của nhiễm sắc thể giới tính X tại vị trí Xq27.1 (Hình 7).
Gen FIX có kích thước khoảng 34 kb gồm 8 exon và 7 intron [17], [63]. Trong đó,
trình tự nucleotide mã hóa cho protein FIX chỉ chiếm có 4% tổng số nucleotide của
gen và kích thước của exon lớn nhất khoảng 1935 bp (Bảng 1) [63].

13


Hình 7. Vị trí của gen mã hóa yếu tố đông máu IX trên nhiễm sắc thể X [64].

Về mặt cấu trúc, exon thứ nhất của gen FIX có chứa trình tự dẫn dầu và tín
hiệu cho sự khởi đầu quá trình phiên mã và dịch mã. Quá trình dịch mã được bắt
đầu với bộ ba mã hóa cho Met, nằm ở vị trí -46 trước khi bộ ba được dịch mã sang
đầu amino của phân tử protein hoàn chỉnh [63]. Nằm giữa exon thứ nhất và exon
thứ hai là một đoạn intron có kích thước khá lớn, khoảng 6 kb (Bảng 1).
Bảng 1. Kích thước các exon và intron của gen mã hóa cho yếu tố đông máu IX [63].
Exon

Kích thƣớc (bp)

Intron

Kích thƣớc (bp)

1

117

1

6206

2

164

2

188

3

25

3

3689

4

114

4

7163

5

129

5

2565

6

203

6

9473

7

115

7

668

8

1935

Ngược lại, xen vào giữa exon thứ hai và exon thứ ba chỉ là đoạn intron có
kích thước rất bé, khoảng 188 bp. Exon thứ hai và exon thứ ba mã hóa cho vùng
Gla của phân tử protein FIX, vùng này có chứa các acid γ-carboxylglutamic (Gla),
tham gia vào sự liên kết với ion Ca2+. Exon thứ tư và exon thứ năm có một intron
kích thước lớn (khoảng 7 kb) xen kẽ, mỗi exon này mã hóa cho một vùng tương

14


đồng với yếu tố sinh trưởng biểu mô tương ứng EGF1 và EGF2 [28]. Exon thứ sáu
nằm cách đầu 5’ khoảng 21 kb, mã hóa cho vùng hoạt hóa với hai đầu biên chính là
hai vị trí tham gia vào hoạt hóa protein FIX thành dạng hoạt hóa FIXa. Hai exon
còn lại nằm ở đầu kết thúc của trình tự đầu 3’ và được phân tách bằng một đoạn
intro ngắn. Hai exon này cùng mã hóa cho vùng serine protease (Hình 8).

Hình 8. Cấu trúc của gen FIX mã hóa cho yếu tố đông máu IX [63].

Phân tử mRNA trưởng thành được phiên mã từ gen FIX có chiều dài 2803
base, bao gồm vùng 5’-UTR (29 base), một khung đọc mở có mang mã kết thúc
(1383 base) và một vùng 3’-UTR (1390 base) (Hình 9).
mRNA tổng hợp từ gen FIX (2803 nt)
5’-UTR
(29 nt)

Trình tự mã hóa + Mã kết thúc
(1383 nt)

3’-UTR
(1390 nt)

Hình 9. Cấu trúc phân tử mRNA được phiên mã từ gen FIX [63].

15


1.4. Cấu trúc và những biến đổi sau dịch mã của yếu tố đông máu IX
1.4.1. Cấu trúc của phân tử protein FIX
Ở người, phân tử protein FIX là một protein phụ thuộc vào vitamin K, tham
gia vào quá trình đông máu. Phân tử protein FIX được tổng hợp ở các tế bào của mô
gan dưới dạng một protein tiền chất của một serine protease-FIXa. Sau khi được
tổng hợp, protein tiền chất này là một chuỗi polypeptide đơn gồm 461 amino acid,
khối lượng khoảng 56 kDa. Phân tử protein FIX được chia thành các vùng chính:
vùng tín hiệu (signal peptide-SP); vùng propeptide (PP); vùng Gla; hai vùng giống
vùng nhân tố sinh trưởng biểu mô (epidermal growth factor – EGF); vùng hoạt hóa
(activation peptide – AP) và vùng serine protease (Hình 10).
Để trở thành một protein FIX hoàn chỉnh gồm 415 amino acid với khối
lượng phân tử khoảng 57 kDa, lưu thông trong máu với nồng độ trung bình 4-5
μg/ml [20], có chứa khoảng 17% về khối lượng phân tử là carbonhydrate thì phân tử
protein FIX tiền chất ban đầu phải trải qua những biến đổi sau dịch mã. Những biến
đổi này bao gồm: carboxyl hóa 12 amino acid glutamic đầu tiên của chuỗi
polypeptide tạo thành γ-carboxyglutamate [58]; đường hóa các amino acid tại các vị
trí Asn-157, Asn-159, Ser-53, Ser-61, Thr-159, Thr-169 và Thr-172 [24]; hydroxyl
hóa gốc Asp-64 [29]; loại bỏ đoạn tín hiệu (28 amino acid) và đoạn propeptide (18
amino acid) (Hình 11).
Về mặt cấu trúc, phân tử protein FIX hoàn chỉnh được chia thành một số
vùng như sau: vùng gắn acid carboxylic vào các amino acid glutamic đầu N (Nterminal gamma-carboxyglutamic acid domain, Gla: từ gốc 1-40); vùng kỵ nước
(hydrophobic stack: 41-46); 2 vùng giống vùng nhân tố sinh trưởng biểu mô

(epidermal growth factor-like domains, EGF1: 47-83, EGF2: 88-127) liên kết với
nhau nhờ cầu nối linker (84-87); vùng hoạt hóa (activation peptide: 146-180) và
vùng serine protease tận cùng đầu C (C-terminal serine protease domain: 181-415)
[20]. Vùng Gla chứa các vị trí có liên kết yếu và vừa phải với ion Ca2+ [16], trong
khi đó cả vùng EGF1 và serine protease đều chứa một vị trí liên kết mạnh với ion

16