khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của chủng vi khuẩn bacillus megaterium v1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN
SỰ PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY
LÔNG GIA CẦM CỦA CHỦNG VI KHUẨN
BACILLUS MEGATERIUM V1

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. BÙI THỊ MINH DIỆU

SINH VIÊN THỰC HIỆN
LÂM KIỀU DIỄM
MSSV: 3103948
LỚP: VI SINH VẬT HỌC K36

Cần Thơ, Tháng 12/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN

SỰ PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY
LÔNG GIA CẦM CỦA CHỦNG VI KHUẨN
BACILLUS MEGATERIUM V1

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. BÙI THỊ MINH DIỆU

SINH VIÊN THỰC HIỆN
LÂM KIỀU DIỄM
MSSV: 3103948
LỚP: VI SINH VẬT HỌC K36

Cần Thơ, Tháng 12/2013


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

Bùi Thị Minh Diệu

Lâm Kiều Diễm

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

LỜI CẢM TẠ
----------------------Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến:
Ban Giám Hiệu, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh
học, cùng tập thể quý Thầy, Cô - trường Đại học Cần Thơ đã dạy bảo, truyền đạt kiến
thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận
văn.
TS. Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và đóng
góp ý kiến quý báu trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận văn tốt
nghiệp.
Cô Nguyễn Thị Pha – Cố vấn học tập lớp Vi sinh vật học, khóa 36 – trường Đại
học Cần Thơ đã động viên, an ủi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện
và hoàn thành luận văn này.
Tập thể lớp Vi sinh vật học, khóa 36 cùng lớp bạn Công nghệ Sinh học, khóa 36
đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn công lao to lớn của cha mẹ đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi về mặt vật chất lẫn tinh thần cho tôi hoàn thành khóa học và thực hiện luận
văn tốt nghiệp.
Kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe, thành đạt trên nhiều lĩnh vực, luôn có
cống hiến quý báo cho sự nghiệp giáo dục.
Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày 16 tháng 11 năm 2013

Lâm Kiều Diễm

Chuyên ngành Vi sinh vật học

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

TÓM LƢỢC
Lông vũ chứa khoảng 90% keratin và được thải ra với một khối lượng lớn từ
ngành chăn nuôi và chế biến gia cầm làm ô nhiễm môi trường. Sử dụng vi sinh vật,
đặc biệt là vi khuẩn để xử lý nguồn chất thải chứa keratin này có ý nghĩa thiết thực
trong ngành công nghiệp, nông nghiệp như chế biến thức ăn gia súc, gia cầm và sản
xuất phân bón. Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự
phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1.
Kết quả khảo sát cho thấy thời gian nuôi cấy tối ưu cho dòng vi khuẩn này là 3 ngày.
Vi khuẩn phát triển thuận lợi trong môi trường pH 8 tại nhiệt độ thích hợp là 35oC.
Hoạt động của vi khuẩn bị ức chế khi môi trường nuôi cấy có bổ sung glucose (1%
w/v). Trong khi đó, môi trường có bổ sung rỉ đường (1% w/v), mật số vi khuẩn cho giá
trị cao nhất nhưng khả năng phân hủy bột lông lại giảm. Ngoài bã đậu nành giúp làm
tăng mật số vi khuẩn, các nguồn nitơ khác khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy đều
làm giảm sự phát triển cũng như khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn so với môi
trường chỉ chứa bột lông là nguồn dinh dưỡng duy nhất.
Từ khóa: Bacillus megaterium, môi trường nuôi cấy tối ưu, phân hủy bột lông.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

i

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT ......................................................................................................
LỜI CẢM TẠ...............................................................................................................
TÓM LƢỢC................................................................................................................ i
MỤC LỤC ..................................................................................................................ii
DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. iv
CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................................. vi
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU ....................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ......................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu đề tài................................................................................................... 1
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................... 2
2.1. Sơ lược về lông gia súc – gia cầm...................................................................... 2
2.2. Cấu trúc keratin ................................................................................................. 3
2.3. Enzyme keratinase ............................................................................................. 4
2.4 Sơ lược về vi sinh vật phân hủy keratin ............................................................. 5
2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme keratinase của lông
gia cầm..................................................................................................................... 6

2.5.1 Các yếu tố vật lý .......................................................................................... 6
2.5.2 Các yếu tố dinh dưỡng ................................................................................. 7
2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ....................................................... 10
2.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................... 10
2.6.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài ............................................................ 11
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 13
3.1. Phương tiện nghiên cứu ................................................................................... 13
3.1.1. Địa điểm - Thời gian ................................................................................. 13
3.1.2. Giống vi khuẩn ......................................................................................... 13
3.1.3. Vật liệu ..................................................................................................... 13
3.1.4. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn ................................................................... 13
Chuyên ngành Vi sinh vật học

ii

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

3.1.5. Hóa chất.................................................................................................... 14
3.1.6. Thiết bị - dụng cụ ...................................................................................... 14
3.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 15
3.2.1. Chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống.................................................................... 15
3.2.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian.............. 15
3.2.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và
khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn .................................................... 15
3.2.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến

sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn ........................... 16
3.2.5. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự
phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn ................................ 17
3.2.6. Phương pháp phân tích.............................................................................. 18
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 20
4.1. Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian ........................................... 20
4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia
cầm của vi khuẩn.................................................................................................... 21
4.3. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng
phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn ....................................................................... 24
4.4. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triể n và khả năng phân
hủy lông gia cầm của vi khuẩn ............................................................................... 28
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 31
5.1 Kết luận............................................................................................................ 31
5.2 Đề nghị............................................................................................................. 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 32
PHỤ LỤC .....................................................................................................................

Chuyên ngành Vi sinh vật học

iii

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

DANH SÁCH BẢNG

Trang
Bảng 1. Thành phần protein và acid amin có trong lông vũ .......................................... 2
Bảng 2. Thành phần dinh dưỡng của rỉ đường mía…………………………………….8
Bảng 3. Thành phần bã đậu nành ................................................................................. 9
Bảng 4. Thành phần hóa chất môi trường bột lông vũ lỏng ........................................ 13
Bảng 5. Thành phần hóa chất môi trường bột lông vũ rắn .......................................... 14
Bảng 6. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột
lông gia cầm…………………………………………………………………22
Bảng 7. Kết quả thí nghiệm 1..........................................................................................
Bảng 8. Kết quả thí nghiệm 2..........................................................................................
Bảng 9. Kết quả thí nghiệm 3..........................................................................................
Bảng 10. Kết quả thí nghiệm 4.......................................................................................

Chuyên ngành Vi sinh vật học

iv

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Cấu trúc keratin ............................................................................................... 4
Hình 2. Biểu đồ sự thay đổi mật số vi khuẩn theo thời gian......................................... 20
Hình 3. Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến mật số vi
khuẩn ............................................................................................................. 25

Hình 4. Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến khả năng phân
hủy bột lông của vi khuẩn .............................................................................. 26
Hình 5. Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến mật số vi khuẩn 28
Hình 6. Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến khả năng phân
hủy bột lông của vi khuẩn .............................................................................. 29
Hình 7. Biểu đồ ảnh hưởng sự tương tác pH và nhiệt độ đến mật số vi khuẩn.................
Hình 8. Biểu đồ ảnh hưởng sự tương tác pH và nhiệt độ đến khả năng phân hủy bột
lông của vi khuẩn………………………………………………………………..

Chuyên ngành Vi sinh vật học

v

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

CÁC TỪ VIẾT TẮT

B.

Bacillus

NXB

Nhà xuất bản

PTN

Phòng thí nghiệm

ĐVTN

Đơn vị thí nghiệm

SHPT

Sinh học Phân tử

CFU

Colony Forming Unit

rpm

Rotation per minute

w/v

Weight/volume

Chuyên ngành Vi sinh vật học

vi

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Việt Nam đang trong quá trình đẩy mạnh công nghiệp hóa – đô thị hóa và cùng
với đó là sự gia tăng các loại rác thải, do vậy công tác quản lý rác thải cần được thực
hiện một cách nghiêm ngặt để tránh ô nhiễm môi trường. Một trong những loại rác thải
khó phân hủy là rác thải được thải ra trong quá trình chăn nuôi và giết mổ gia súc – gia
cầm, phế phẩm lông là khó xử lý nhất do thành phần chính của chúng là keratin, một
loại protein có khả năng chống lại các tác nhân phân hủy cao, cần thời gian rất lâu để
phân hủy hoàn toàn trong tự nhiên.
Chất thải lông gia súc – gia cầm thường được xử lý bằng cách chôn lấp hoặc đốt
cháy và thậm chí là thải trực tiếp ra môi trường, gây ô nhiễm nghiêm trọng cho môi
trường đất, nước và không khí, cho nên đòi hỏi cần phải có biện pháp xử lý mới tốt
hơn cho các loại phế phẩm này; mục tiêu là vừa có khả năng phân hủy chúng và không
gây ảnh hưởng xấu đến môi trường. Công nghệ sinh học mà cụ thể là công nghệ vi
sinh vật chính là chìa khóa quan trọng để giải quyết vấn đề này. Do bản chất của lông
là protein nên vi khuẩn hoàn toàn có khả năng phân hủy được chúng thông qua hoạt
động của hệ enzyme keratinase. Chủng vi khuẩn Bacillus megaterium V1 được Phạm
Minh Triết (2013) phân lập và đánh giá là một trong những chủng vi khuẩn có khả
năng phân hủy lông gia súc – gia cầm đạt hiểu quả cao. Tuy nhiên, sự phát triển cũng
như khả năng phân hủy lông gia cầm của chủng vi khuẩn này phụ thuộc rất nhiều vào
điều kiện môi trường nuôi cấy. Do đó, việc xác định các điều kiện môi trường nuôi cấy
thích hợp là một nghiên cứu cần thiết trước khi đưa chủng vi khuẩn này vào ứng dụng
thực tế.
Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài: “Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng
đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của chủng vi khuẩn

Bacillus megaterium V1” được thực hiện.
1.2. Mục tiêu đề tài
Xác định được điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp cho dòng vi khuẩn
Bacillus megaterium V1 phân hủy lông gia cầm đạt hiệu quả cao nhất.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

1

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lƣợc về lông gia súc – gia cầm
Lông là một phế phẩm sinh ra với số lượng lớn tại các cơ sở giết mổ gia súc – gia
cầm và nhà máy chế biến thực phẩm, khối lượng lên đến hàng tỷ tấn mỗi năm trên
toàn thế giới (Gousterova et al., 2005). Thành phần chủ yếu trong lông là keratin, các
chất thải giàu keratin này khó phân hủy và ngày càng tích lũy nhiều trong tự nhiên,
góp phần gây ra vấn đề ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, sự phân hủy các chất thải
chứa keratin vẫn mang lại những lợi ích thiết thực trong ngành công – nông nghiệp
như chế biến thức ăn thủy sản, gia súc, gia cầm và sản xuất phân bón,...
Bảng 1. Thành phần protein và acid amin có trong lông vũ
Hàm lƣợng (g/kg)

Protein và các acid amin
Protein

922,0

Alanine

28,8

Glycine

51,8

Isoleucine

39,4

Leucine

56,9

Valine

53,0

Phenylalanine

34,6

Arginine

67,6

Histidine

2,3

Lysine

15,4

Aspartic acid

41,8

Glutamic acid

82,2

Serine

87,3

Threonine

34,5

Proline

73,9

Cystine

65,8

Methionine

7,1

(*Nguồn: Latshaw et al., 1994)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

2

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Protein chiếm hơn 90% trong thành phần lông vũ, trong đó chủ yếu là  - keratin,
nên chất thải lông được xem là một dạng protein có tiềm năng thay thế cho những
nguồn protein đắt tiền khác để bổ sung vào thành phần thức ăn chăn nuôi. Nước ta là
nước công nghiệp hóa – hiện đại hóa nhưng việc sản xuất lông vũ làm thành phần bổ
sung trong thức ăn gia súc chưa được ứng dụng rộng rãi do quy trình sản xuất theo
phương pháp vật lý và hóa học còn nhiều hạn chế. Không những tiêu tốn năng lượng
và gây ô nhiễm môi trường, quy trình sản xuất này còn phá hủy một số acid amin, làm
cho sản phẩm khó tiêu hóa và nghèo nàn về giá trị dinh dưỡng (Wang và Parsons,
1997).
Ngày nay, công nghệ vi sinh vật đang trên đà phát triển mạnh mẽ và đã mở ra

một hướng đi mới, phân hủy chất thải lông bằng biện pháp sinh học nhờ hoạt động của
một số dòng vi khuẩn nhằm tạo ra một nguồn protein có tỉ lệ dinh dưỡng cân bằng
hơn, cải thiện giá trị dinh dưỡng của sản phẩm, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi thay thế
các nguồn protein đắt tiền khác, và đồng thời còn giúp hổ trợ xử lý các nguồn rác thải
có chứa nhiều cơ chất keratin để giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường.
2.2. Cấu trúc keratin
Keratin là một protein có cấu trúc dạng sợi, nó hình thành màng bảo vệ cho toàn
bộ động vật có xương sống: da, lông, tóc, vuốt, móng, sừng, vảy, mỏ,... Theo cấu trúc
cơ bản bậc hai, keratin đã được phân loại vào α (α - helix của tóc) và β (β - sheets của
lông) (Voet và Voet, 1995; Akhtar và Edwards, 1997). Các sợi keratin ở cả hai dạng α
- helix và β - sheets xoắn song song với nhau để đảm bảo độ bền ổn định của sợi
(Zerdani et al., 2004). Ngoài ra, keratin cũng được nhóm lại thành hai loại: keratin
cứng hiện diện nhiều ở tóc, móng guốc,… với hàm lượng cầu nối disulfide cao,
thường rất cứng và không thể co giãn được. Trong khi đó, keratin mền hiện diện ở da
và mô sẹo,... có hàm lượng cầu nối disulfide thấp và mền dẻo hơn. Sự liên kết chéo
chặt chẽ nhờ vào những cầu nối disulfide, liên kết hydro và tương tác kỵ nước làm cho
keratin có khả năng kháng lại tác động của các tác nhân phân hủy vật lý, hóa học và
sinh học. Keratin không tan trong nước, acid loãng, kiềm và dung môi hữu cơ, cũng
như không bị phân hủy bởi các enzyme phân hủy protein như pepsin, trypsin, papain
(Veslava et al., 2009). Mặc dù keratin là loại protein khó phân giải nhưng một số loại
vi khuẩn, actinomycetes và nấm phân lập từ đất chôn chất thải giàu keratin có thể phân

Chuyên ngành Vi sinh vật học

3

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

hủy keratin hiệu quả nhờ vào hoạt tính enzyme keratinase tạo ra (Onifade et al., 1998;
Riffel và Brandelli, 2006).

Hình 1. Cấu trúc của keratin
(*Nguồn: ngày 27/08/2013)

2.3. Enzyme keratinase
Keratinase thuộc họ protease có khả năng tấn công các mạch keratin và đóng vai
trò quan trọng trong ứng dụng phát triển các phụ phẩm lông vũ giá thành thấp thành
thức ăn chăn nuôi và phân bón. Keratinase là một loại enzyme ngoại bào, hoạt động
mạnh với khoảng pH và nhiệt độ rộng. Enzyme này có nhiều đặc trưng bề mặt, chúng
có thể phân giải protein có sợi như: fibrin, elastin, collagen và các protein không có sợi
như: casein, albumin trong huyết thanh bò, gelatin,...
Tuy keratin là một dạng protein khó bị phân hủy, nhưng thực tế ngoài tự nhiên
các dạng cơ chất chứa keratin như lông, móng, sừng,… vẫn bị phân hủy. Điều này có
được là do hoạt động của các vi sinh vật (vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc) có khả năng
sinh ra keratinase. Tuy nhiên, khả năng tạo ra keratinase của vi sinh vật phụ thuộc vào
nhiều yếu tố như chủng vi sinh vật, nguồn cơ chất và cả điều kiện của môi trường. Đây
được xem như một nguồn enzyme quan trọng có khả năng ứng dụng vào nhiều lĩnh
vực khác nhau như công nghiệp thuộc da, phân bón, thức ăn chăn nuôi, y dược,…

Chuyên ngành Vi sinh vật học

4

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Các keratinase từ vi khuẩn thường được sản xuất dưới điều kiện chìm và lắc,
ngoại trừ các dòng vi khuẩn chịu nhiệt (Nam et al., 2002; Riessen và Anttranikian
2001) và nấm (Kaul và Sambali 1999; Singh 1999) thì lên men chìm tĩnh. Tuy nhiên,
chưa có bài báo nào nói về lên men rắn cho sự sản xuất keratinase. Một điều thú vị
được phát hiện là lượng ezyme keratinase được sản xuất và sự phân hủy keratin không
tỷ lệ thuận với nhau. Do đó, sự phân giải keratin không thể xem là dấu hiệu cho sự
sinh keratinase và ngược lại với nhiều tài liệu cho thấy thời gian keratinase được sản
sinh và sự phân hủy keratin khác nhau (Williams et al., 1990; Cheng et al., 1995;
Sangali và Brandelli 2000; Kim et al., 2001; Ramnani và Gupta 2004; Thys et al.,
2004). Điều này được cho là do các cơ chế phức tạp của sự phân giải keratin của các vi
sinh vật.
Phần lớn keratin bị phân hủy do tác động của keratinase tiết ra từ tế bào vi khuẩn,
tuy nhiên theo nhiều báo cáo nghiên cứu, các tế bào vi khuẩn cũng giữ một vai trò
quan trọng trong quá trình phân hủy cơ chất chứa keratin. Những thành phần disulfide
reductases, sulfite, thiosulfate và keratinase có trong tế bào giúp bẻ gãy các cầu nối
disulfide hỗ trợ cho quá trình phân hủy của enzyme ngoại bào được tốt hơn. Như vậy,
có thể nói rằng, quá trình phân hủy keratin bao gồm hai bước là phá hủy các cầu nối
disulfide và phân hủy protein (Gupta và Rammani, 2006).
2.4 Sơ lƣợc về vi sinh vật phân hủy keratin
Những dòng vi khuẩn sản sinh ra karatinase phân giải β – keratin được tìm thấy
trong lông gia cầm. Các dòng này chủ yếu thuộc chi Streptomyces và Bacillus. Vi
khuẩn Bacillus phân bố rộng trong tự nhiên, nhất là trong đất, chúng tham gia tích cực
vào sự phân hủy vật chất hữu cơ nhờ vào khả năng sinh nhiều loại enzyme ngoại bào.
Đây là những vi khuẩn hình que, Gram dương, sinh trưởng hiếu khí hoặc kỵ khí không
bắt buộc và hình thành nội bào tử. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn thuộc chi Bacillus

rất đa dạng. Khuẩn lạc thường to và có màu trắng đến xám.
Trong số các chủng Bacillus sp., Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis được
mô tả có khả năng phân hủy keratin tốt (Manczinger et al., 2003). Bacillus
licheniformis là vi khuẩn Gram dương, được tìm thấy nhiều trong đất, nhiệt độ tăng
trưởng tối ưu khoảng 30°C, sinh enzyme tối đa ở 37°C và có khả năng sinh bào tử ở
môi trường khắc nghiệt.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

5

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Bacillus megaterium là vi khuẩn Gram dương, hình que, hình thành bào tử, hô
hấp hiếu khí và nó được tìm thấy trong đất. Bacillus megaterium phát triển ở nhiệt độ
từ 3 – 45oC, tối ưu khoảng 30oC. Một số phân lập từ một hồ địa nhiệt ở Nam Cực đã
được tìm thấy phát triển ở nhiệt độ lên đến 63oC. Bacillus megaterium đã được sử
dụng trong công nghiệp hơn 50 năm, vì nó sở hữu một số enzyme rất hữu ích và là
nguồn sản xuất exoenzymes dồi dào, vi khuẩn này được chọn lọc về khả năng của
chúng để phân giải các chất hữu cơ và khả năng chuyển hóa các protein, carbohydrate,
các chất béo, các chất dầu và các acid hữu cơ. Nó được ứng dụng rộng rãi trong xử lý
môi trường.
Các dòng vi khuẩn mới được phân lập có khả năng phân giải keratin được tìm
thấy là các vi khuẩn Gram dương như: Arthrobacter sp. (Lucas et al., 2003),
Microbacterium sp. (Thys et al., 2004) và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006). Một số

dòng vi khuẩn Gram âm cũng có khả năng phân giải keratin như: Xanthomonas,
Vibrio, Stenotrophomonas, Chryseobacterium (Sangali và Brandelli, 2000; De Toni et
al., 2002). Bên cạnh đó, nhóm xạ khuẩn và nấm cũng có khả năng phân giải keratin
như: Streptomyces fradiae (Novel và Nickerson, 1959), Streptomyces sp. A11
(Mukhopadhyay, Chandra, 1990), Streptomyces pactum (Bockle et al., 1995),
Streptomyces albidoflavus (Letourneau et al., 1998), Streptomyces thermoviolaceus
SD8 (Chitte et al., 1999). Chrysosporium, Aspergillus, Scopulariopsis, Sepedonium,
Alternaria, Penicillium, Curvularia, Cladosporium, Fusarium, Geomyces, Gleomastis,
Monodictys, Myrothecium, Paecilomyces, Stachybotrys, Urocladium, Doratomyces,
Trichurus (Gradisar et al., 2000). Hoạt tính keratinase giúp phân giải keratin trong
nước còn được biểu hiện ở một số loài vi khuẩn chịu nhiệt như: Fervidobacterium
pennavorans (Friedrich và Antranikian, 1996), Thermoanaerobacter keratinophilus
(Riessen and Antranikian, 2001), Fervidobacterium islandcum (Nam et al., 2002) và
các dòng vi khuẩn ưa kiềm như: Nesternkonia sp. AL-20 (Gessesse et al., 2003) và
Nocardiopsis sp. TOA-1 (Shinju et al., 2004).
2.5 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme keratinase của
lông gia cầm
2.5.1 Các yếu tố vật lý
Nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng phân giải keratin của vi sinh vật bị ảnh
hưởng bởi nhiều yếu tố. Các thông số vật lý cho sự sản xuất của vi sinh vật chuyên
Chuyên ngành Vi sinh vật học

6

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

biệt theo loài và vì thế thay đổi tùy theo từng dòng vi sinh vật. Các giá trị pH kiềm
nằm trong khoảng từ 6 – 9 hỗ trợ sự sinh tổng hợp keratinase và sự phân hủy lông gia
cầm ở hầu hết các vi khuẩn. Giá trị pH kiềm được cho là kích thích sự phân hủy
keratin do làm biến đổi các cystine thành lathionine khiến cho keratinase dễ dàng tiếp
cận cơ chất. Nhiệt độ cho sự sinh tổng hợp keratinase nằm trong khoảng từ 28 – 50oC
ở hầu hết các vi khuẩn. Dòng vi khuẩn Chryseobacterium sp. kr6 phát triển tối ưu ở
nhiệt độ 30oC và pH 8,0 và hoạt động phân hủy lông vũ cũng biểu hiện tối đa ở nhiệt
độ này (Riffel et al., 2003). Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của các dòng vi khuẩn
thuộc họ Vibrionaceae từ một cơ sở sản xuất gia cầm ở Brazil được ghi nhận là 30oC,
và cũng tại nhiệt độ này lượng enzyme và các protein hòa tan được tạo ra cực đại
(Sangali et al., 1999). Theo Sinoy et al. (2011), các chủng vi khuẩn thuộc dòng
Bacillus sp. phát triển thuận lợi trong khoảng nhiệt độ 30oC – 40oC và pH tối ưu là 6 –
8, hoạt độ keratinase cũng thu được cao nhất trong khoảng nhiệt độ, pH này.
2.5.2 Các yếu tố dinh dƣỡng

 Nguồn carbon
Tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn carbon được cung cấp có thể là chất vô cơ (CO2,
NaHCO3, CaCO3,...) hoặc chất hữu cơ. Fructose, glucose, sucrose, lactose, galactose,
starch, glycerol, maltose và dextrose là những nguồn carbon tốt nhất đối với quá trình
sản sinh ra enzyme keratinase bằng vi sinh vật. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ
các nguồn thức ăn carbon khác nhau phụ thuộc vào 2 yếu tố: một là thành phần hóa
học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn này, hai là đặc điểm sinh lý của từng loại vi
sinh vật. Trên thế giới hầu như không có hợp chất carbon hữu cơ nào mà không bị
hoặc nhóm vi sinh vật này hoặc nhóm vi sinh vật khác phân giải. Không ít vi sinh vật
có thể đồng hóa được cả các hợp chất carbon rất bền vững như cao su, chất dẻo, dầu
mỏ, parafin, khí thiên nhiên.
Nhiều chất hữu cơ vì không tan được trong nước hoặc vì có khối lượng phân tử
quá lớn cho nên trước khi được hấp thụ, vi sinh vật phải tiết ra các enzyme thủy phân
để chuyển hóa chúng thành các hợp chất dễ hấu thụ. Người ta thường sử dụng đường

để làm thức ăn carbon khi nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng. Để nuôi cấy các
loại vi sinh vật khác nhau người ta dùng các nồng độ đường không giống nhau. Với vi
khuẩn người ta thường dùng 0,5 – 0,2% đường, còn đối với nấm men, nấm sợi lại
thường dùng 3 – 10% đường.
Chuyên ngành Vi sinh vật học

7

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Rỉ đường là một phụ phẩm của ngành sản xuất đường, là sản phẩm cuối cùng của
quá trình sản xuất đường mà từ đó đường không còn có thể kết tinh một cách kinh tế
nữa bởi các công nghệ thông thường. Khoảng 75% tổng rỉ đường của thế giới được sản
xuất từ mía và đa phần còn lại có từ củ cải đường. Thành phần chính của rỉ đường là
đường, chủ yếu là saccharose một ít glucose và fructose. Thành phần chính xác của rỉ
đường rất khó dự đoán vì nó phụ thuộc vào điều kiện thổ nhưỡng và thời tiết, khí hậu,
giống mía và giai đoạn thu hoạch cũng như quy trình sản xuất đường trong từng nhà
máy. Do vậy, đường thay đổi đáng kể về thành phần dinh dưỡng, mùi vị, màu sắc và
độ nhớt. Bảng 2 cho thấy biến động của các thành phần của rỉ đường.
Bảng 2. Thành phần dinh dƣỡng của rỉ đƣờng mía (%)
Thành phần

Trung bình

Biến động

Nước

20

17 – 25

Saccharose

35

30 – 40

Glucose

7

4–9

Fructose

9

5 – 12

Các chất khử khác

3

1–5

Glucid khác

4

2–5

Khoáng

12

7 – 15

Các chất chứa N

4,5

2–6

5

2–8

0,4

0,1 – 1

Các chất không chứa N
Sáp, Sterol, photpholipid
(*Nguồn: Wolfrom vaf Binkley, 1953)

Thành phần tiêu chuẩn của rỉ đường được chia thành 3 phần: đường, chất hữu cơ
không đường và chất khoáng. Các loại glucide hòa tan (đường đôi và đường đơn) là
thành phần dinh dưỡng chính của rỉ đường, trong đó saccharose là chủ yếu. Bên cạnh
đó, rỉ đường là một nguồn giàu chất khoáng, vitamin – kích thích sự sinh trưởng và
phát triển của vi khuẩn.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

8

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Theo kết quả nghiên cứu của Mohammad et al. (2007), bổ sung nồng độ rỉ đường
với 1% thúc đẩy sự hoạt động của enzyme phân hủy lông gia cầm ở dòng vi khuẩn
Bacillus licheniformis MZK-3.

 Nguồn nitơ
Các nguồn nitơ hữu cơ như: bột ngô, bột đậu nành, cám mì, casein, peptone,
tryptone, yeast extract, sữa không béo,... và các nguồn nitơ vô cơ như: urea, NH4NO3,
NH4Cl, NO2-, NO3-,... thích hợp cho các vi khuẩn sinh trưởng và phát triển, sản sinh
nhanh enzyme thúc đẩy quá trình phân hủy lông gia cầm. Brandelli (2000) sử dụng
nguồn nitơ bổ sung là yeast extract và NH4Cl cho hiệu quả phân hủy keratin đáng kể.
Các dạng nitơ hữu cơ không những là nguồn dinh dưỡng nitơ mà còn là nguồn dinh
dưỡng carbon cho vi sinh vật. Theo nghiên cứu của Mohammad et al. (2007), NH4Cl

được bổ sung với nồng độ 0,1% (w/v) cho kết quả là hoạt động enzyme tăng thêm
12%. Trong trường hợp bổ sung cả rỉ đường và NH4Cl với nồng độ lần lượt là 1%
(w/v) và 0,1% (w/v), sự phân hủy lông gia cầm của dòng vi khuẩn Bacillus
licheniformis MZK-3 đạt hiệu quả cao.
Bột đậu nành cũng được biết đến như là chất cảm ứng cho sự sinh enzyme
(Cheng et al., 1995; Gradisar et al., 2000)
Bã đậu nành là phế phẩm thu được trong quá trình sản xuất sữa đậu nành hoặc
đậu phụ (bánh đậu hủ). Bã đậu được loại bỏ trong quá trình sản xuất, có các thành
phần như sau:
Bảng 3. Thành phần bã đậu nành
Thành phần

Tỷ lệ

Nước

Không quá 88%

Protein

Không dưới 2,5%

Lipid

Không quá 1,4%

Glucide

Không dưới 6%

Tro tan trong acid clohidric

Không quá 1,8%

(*Nguồn: />ngày 26/11/2013)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

9

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Trong bã đậu nành vẫn giữ được khá đầy đủ các acid amin của đậu nành; 1kg bã
đậu nành có 0,8g canxi, 0,6g phosphate. Bã đậu nành thường dùng trong chế biến thức
ăn gia súc, gia cầm và thức ăn thủy sản, vì vậy đây là nguồn nguyên liệu giá rẻ thích
hợp dùng làm chất cảm ứng sinh enzyme keratinase.
2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
2.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng phân hủy keratin còn rất
hạn chế, chỉ có một số nghiên cứu về phân lập vi sinh vật phân hủy lông vũ và vẫn
chưa có nghiên cứu ứng dụng vào thực tế. Nguyễn Đình Quyến và Trần Thị Lan
Hương (2001) đã tiến hành phân lập được từ đất cơ sở giết mổ gia cầm 7 chủng xạ
khuẩn và 15 chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính phân giải casein; trong đó 5 chủng
xạ khuẩn và 2 chủng Bacillus có khả năng phân giải lông gà mạnh.
Nguyễn Huy Hoàng et al. (2010) đã phân lập một số dòng vi khuẩn (Bacillus sp.

Đ.NĐ 1.2, Bacillus sp. Đ.HY 1.1, chủng L.HY 2.6 và L.TO 2.1) có khả năng phân hủy
lông vũ tạo nguồn thức ăn cho nuôi trồng thủy sản. Điều kiện thích hợp cho các chủng
vi khuẩn này là ở 30°C đến 40°C và có khả năng phân hủy lông vũ đạt từ 75% đến
90% sau một tuần nuôi cấy. Tuy nhiên, vẫn chưa thấy báo cáo nào về ứng dụng các
dòng vi sinh vật đã phân lập.
Đinh Thị Bé Hiền (2011) đã tiến hành phân lập được từ đất và nước 19 dòng vi
khuẩn có khả năng phân giải lông gia súc. Trong đó, dòng vi khuẩn K13, dòng O3 và
dòng K8 cho kết quả cao và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại với tỷ lệ phân
giải lông gia súc lần lượt là 63,38%, 60,9% và 58,33%.
Bùi Thị Minh Diệu et al. (2012) đã phân lập được 21 dòng vi khuẩn, kết quả
đánh giá khả năng phân giải lông gà cho thấy 21 dòng vi khuẩn đã làm giảm khối
lượng bộtlông gà từ 24,43% đến 58,13% sau một tuần lắc ủ ở 37 oC. Ngoài ra các dòng
vi khuẩncó khả năng làm gãy rụng các sợi lông con trên sợi lông gà lớn sau 10 ngày
lắc ủ. Trong đó, hai dòng vi khuẩn K14 và K15 cho thấy khả năng phân giải lông gà
hiệu quả nhất. Kết quả định danh cho thấy dòng vi khuẩn K14 tương đồng với dòng
Chryseobacterium indologenes McR-1 với độ tương đồng 98% và dòng K15 tương
đồng với dòng Bacillus subtilis BE-91 với độ tương đồng 99%.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

10

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Nguyễn Thu Hiền et al.(2010), viện khoa học và công nghệ Việt Nam, cũng đã

phân lập được dòng vi khuẩn Chryseobacterium có khả năng phân giải lông vũ.
Nguyễn Đình Quyến và Lê Thị Thu Huyền (2012) cũng thực hiên một nghiên
cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis dòng Kr2 có khả năng phân giải lông gà, pH tối
ưu cho sự phát triển và sinh enzyme keratinase tối ưu của dòng này là 7 – 8, nhiệt độ
35C, nồng độ lông là 20g/l.
2.6.1 Tình hình nghiên cứu ở nƣớc ngoài
Gupta và Ramnani (2006) đã thực hiện nghiên cứu về keratinase từ vi khuẩn và
ứng dụng của enzyme này. Trong đó, keratinase chỉ được sinh ra trong điều kiện môi
trường có sự hiện diện cơ chất có chứa keratin như lông, tóc, móng,… cơ chế phản
ứng phân hủy keratin bao gồm phản ứng cắt đứt cầu nối disulfide và thủy phân protein.
Keratinase được ứng dụng trong chế biến thức ăn cho gia súc, phân bón, làm sạch và
làm giảm ô nhiễm ở các khu công nghiệp.
Mohammad et al. (2007) nghiên cứu sự phát triển và hoạt tính keratinase của
dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis MZK-3 phân lập từ chất thải gia cầm. Dòng vi
khuẩn này phát triển và sinh enzyme tốt nhất ở điều kiện pH 8,0 và nhiệt độ 40°C. Khả
năng phân hủy keratin tăng 12% trong môi trường có bổ sung NH 4Cl với tỉ lệ 0,1%
(w/v) và tăng 30% khi bổ sung rỉ đường với tỉ lệ 1% (w/v).
Bo Xu et al. (2009) đã phân lập được một dòng vi khuẩn mới được định danh là
Bacillus licheniformis K-19 chịu được nhiệt độ cao (30 – 90oC) và pH rộng (6 – 10).
Nhiệt độ tối ưu là 60oC và pH tối ưu từ 7,5 – 8.
Onuoha et al. (2011) đã chọn ra dòng vi khuẩn Bacillus sp. D4 có khả năng phân
hủy lông vũ cao, pH tối ưu của dòng vi khuẩn này là 10 và phát triển tốt nhất ở nồng
độ bột lông từ 6 – 7% (w/v).
Hai dòng vi khuẩn Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis có khả năng phân
hủy tóc, móng và lông gia súc đã được phân lập bởi Savitha et al. (2010). Enzyme của
chúng có thể cải thiện giá trị dinh dưỡng của thịt, đồng thời enzyme được sản xuất từ
các dòng vi khuẩn này cũng được sử dụng để xử lý các loại rác thải chứa keratin.
Kết quả nghiên cứu của Riffel et al. (2003) cho thấy vi khuẩn Chryseobacterium
sp. dòng kr6 có khả năng phân hủy hoàn toàn lông vũ trong quá trình nuôi cấy. Dòng
vi khuẩn này có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 30ºC và pH tối ưu 8,0. Dưới điều

Chuyên ngành Vi sinh vật học

11

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

kiện này, hoạt động phân giải lông vũ cũng biểu hiện tối đa. Nghiên cứu cũng cho thấy
hoạt tính của keratinase bị ức chế bởi EDTA, Hg2+, Cu2+ và được kích hoạt bởi Ca2+.
Joshi et al. (2007) đã phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus sp. PW-1 có khả
năng phân hủy lông vũ từ chất thải gia cầm. Vi khuẩn này được nuôi cấy trên môi
trường cơ bản với lông vũ đóng vai trò là nguồn carbon, niteogen và lưu huỳnh. Theo
kết quả nghiên cứu của Agrahari et al. (2010), ba dòng vi khuẩn B. megaterium SN1,
B. thuringenesis SN2, B. pumilis SN3 phân lập từ bãi đất chôn lông gia cầm có khả
năng phân hủy lông gà và lông bồ câu sau 120 giờ nuôi cấy.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

12

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm - Thời gian
- Thời gian thực hiện: từ tháng 08/2013 đến 11/2013.
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật, Viện Nghiên cứu và
Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Giống vi khuẩn
Chủng vi khuẩn Bacillus megaterium V1 được Phạm Minh Triết (2013) phân lập
từ nguồn chất thải lông gia súc, gia cầm do phòng thí nghiệm SHPT Thực Vật tại Viện
Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ cung cấp.
3.1.3. Vật liệu
- Lông gia cầm được thu mua tại các chợ và cơ sở giết mổ gia cầm tại thành phố
Vĩnh Long.
- Lông gia cầm (tỉ lệ lông gà – vịt 1:1) đã được chọn lọc và rửa sạch. Sau đó, cắt
các mẫu lông thành mảnh nhỏ và sấy khô ở 80 oC trong 48 giờ trong tủ sấy. Tiến
hành nghiền mẫu thành bột lông thông qua máy nghiền lông.
- Dịch rỉ đường được lọc qua vải lọc, loại bỏ các phần xác bã mía, bảo quản trong
bình thủy tinh ở nơi khô mát.
- Bột đậu nành, bã đậu nành và bột bắp được nghiền mịn, sấy khô ở 80°C trong 48
giờ, bảo quản trong ống nghiệm.
3.1.4. Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn
Bảng 4. Thành phần hóa chất môi trƣờng bột lông vũ lỏng
Hóa chất

Nồng độ (g/l)

MgSO4.7H2O

0,1

KH2PO4

0,4

K2HPO4

0,3

NaCl

0,5

Bột lông gia cầm

10

(*Nguồn: Bo Xu et al., 2009)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

13

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Bảng 5. Thành phần hóa chất môi trƣờng bột lông vũ rắn
Hóa chất

Nồng độ (g/l)

MgSO4.7H2O

0,1

KH2PO4

0,4

K2HPO4

0,3

NaCl

0,5

Bột lông gia cầm

10

Agar

20

(*Nguồn: Bo Xu et al., 2009)

3.1.5. Hóa chất
 Hoá chất dùng để nuôi cấy các dòng vi khuẩn:
K2HPO4, KH2PO4, NaCl, MgSO4.7H2O, Glucose, Sucrose, NH4Cl, Yeast
extract.
 Hóa chất điều chỉnh pH:
NaOH 0,1N, HCl 0,1N.
3.1.6. Thiết bị - dụng cụ
- Tủ ủ (Herich, Đức).
- Tủ sấy (Ehret - Đức).
- pH kế (Eutech – Malaysia).
- Cân điện tử (Sartorius Teg101 – Đức).
- Tủ cấy (Telstar Bio-II-A, Tây Ban Nha).
- Bộ micropipette (NichipetEX – Nhật Bản).
- Nồi khử trùng nhiệt ướt (Pbinternational – Ý).
- Kính hiển vi (Olympus U-CMAD3, Nhật Bản).
- Máy lắc mẫu (New Brunswich Scientific – Hoa Kỳ).
- Đĩa petri, bình tam giác và các dụng cụ thủy tinh.
- Một số dụng cụ khác như: ống nghiệm, cốc thuỷ tinh, đầu cone (vàng, xanh, trắng),
găng tay, khẩu trang y tế, đèn cồn, bình hút ẩm,...

Chuyên ngành Vi sinh vật học

14

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống
Giống vi khuẩn ròng trữ lạnh trong ống nghiệm được cấy chuyển sang đĩa petri
chứa môi trường bột lông vũ rắn, ủ ở 37oC trong hai ngày. Sau đó cấy vào bình chứa
100ml môi trường bột lông vũ lỏng đã được khử trùng ở 121ºC trong 15 phút, nuôi
tăng sinh khối trên máy lắc (120 rpm) ở 37oC trong 48 giờ. Rút 1ml dịch nuôi cấy tiến
hành đếm mật số vi khuẩn. Mật số cần đạt khoảng 108 CFU/ml. Trữ lạnh bình nuôi
tăng sinh khối trong tủ lạnh ở 4oC.
3.2.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian
 Mục đích: Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian, từ đó chọn ra thời
gian nuôi cấy thích hợp của dòng vi khuẩn B. megaterium V1.
 Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố là thời gian: ngày
1, ngày 2, ngày 3, ngày 4, ngày 5, ngày 6, ngày 7.
- Số lần lặp lại: 3 lần.
- Số nghiệm thức: 7 nghiệm thức.
- Số đơn vị thí nghiệm: 21
 Các bước thực hiện:
 Chuẩn bị 3 bình thủy tinh 80mL chứa 40mL môi trường bột lông vũ lỏng.
 Đậy kín miệng bình và khử trùng ở 121ºC trong 15 phút.
 Chủng vào mỗi bình 2mL dịch nuôi tăng sinh khối vi khuẩn, ủ trên máy lắc (120
rpm) với nhiệt độ 37ºC.
 Mỗi ngày rút 100µL trong mỗi bình tiến hành pha loãng đếm mật số vi khuẩn.
Thực hiện liên tục đến ngày thứ bảy.
 Chỉ tiêu theo dõi: Mật số của vi khuẩn.
3.2.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và
khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn

 Mục đích: Xác định mức nhiê ̣t đô ̣ và pH thích hợp cho sự sinh trưởng , phát triển và
phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

15

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học