Khoá luận tốt nghiệp nghiên cứu phân lập một số hợp chất flavonoit từ cây bần chua (sonnerratia caseolaris)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC s ư PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC

NGUYỄN THỊ TẤN

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP
• CHÁT
•

•

FLAVONOIT TỪ CÂY BÀN CHUA
(SONNERRATIA CASEOLARIS)

KHÓA LUẬN
• TỐT NGHIỆP
• ĐẠI
• HỌC
•
Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học
TS. Nguyễn Hoài Nam

HÀ NỘI - 2015


Trường Đ ại Học Su’ Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Khoá luận tốt nghiệp được hoàn thành tại Viện Hoá sinh biển. Với lòng
biết ơn chân thành, em xin cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của TS. Nguyễn Hoài
Nam, đã trực tiếp hướng dẫn em hoàn thành khoá luận này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tập thể các cán bộ phòng Dược
liệu biển, Viện Hoá sinh biển, đã tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khoá
luận tốt nghiệp.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới PG S.TS. Nguyễn Văn Bằng cùng các
thầy cô giáo trong khoa Hoá học trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã tận
tình dạy dỗ và chỉ bảo cho em trong suốt bốn năm học tại trường.

Hà Nội, tháng 05 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Thị Tấn

Sinh viên: Nguyễn Thị Tẩn

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

MỤC LỤC
MỞ Đ Ầ U ............................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG Q U A N ......................................................................................... 3
1.1 Tổng quan về cây Bần c h u a .................................................................................... 3
1.1.1. Giới thiệu về cây Bần c h u a .................................................................................3

1.1.2. Sinh học, sinh t h á i ................................................................................................ 3
1.1.3. Công d ụ n g .............................................................................................................. 3
1.1.4. Thành phần hóa h ọ c ............................................................................................. 4
1.2. Giới thiệu về lớp chat flavonoid [6 , 7].................................................................7
1.2.1. Giới thiệu c h u n g ....................................................................................................7
1.2.2 Các nhóm fla v o n o id ............................................................................................. 8
1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực v ậ t ................................................................ 12
1.3.1. Chọn dung môi c h i ế t ..........................................................................................12
1.3.2. Quá trình c h iết..................................................................................................... 14
1.4. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu c ơ ......................16
1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc k í ......................................................16
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc k í .........................................................................16
1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc k í ................................................................... 17
1.5. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu c ơ .....21
1.5.1. Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, I R ) ...............................................21
1.5.2. Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, M S )................................................... 22
1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy N M R )...................................................................................................... 23
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u .................26
2.1. Mầu thực v ậ t ...........................................................................................................26
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất.................................................................. 26
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (T L C ).....................................................................................26

Sinh viên: Nguyễn Thị Tẩn

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều c h ế ................................................................................27
2.2.3. Sắc ký cột ( C C ) ................................................................................................. 27
2.3.1. Điểm nóng chảy (M p).......................................................................................27
2.3.2. Phổ khối lượng (ESI - M S ) ............................................................................. 27
2.3.3. Phổ cộng hưởng từ nhân (N M R )....................................................................27
2.4. Dụng cụ và thiết b ị ............................................................................................... 27
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách c h i ế t .........................................................................27
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trú c ............................................................28
2.5. Hoá c h ấ t.................................................................................................................. 28
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KÉT Q U Ả ................................................... 29
3.1. Thu mẫu, xử lý mẫu và phân lập các hợp c h ấ t.............................................. 29
3.2. Các hằng số vật lý và số liệu p h ổ ...................................................................... 30
3.2.1. Hợp chất 1(BCW7): Chrysoeriol 7 - glucopyranoside.............................30
3.2.2. Hợp chất 2(BCW5): luteolin 7 - rutinoside................................................. 31
3.2.3. Hợp chất 3(BCW6): apigenin 7 - o - rutinoside....................................... 32
CHƯƠNG 4. THẢO L U Ậ N .......................................................................................33
4.1. Biện luận cấu trúc cho hợp chất 1 ....................................................................33
4.2. Biện luận cấu trúc cho hợp chất 2 ....................................................................38
4.3. Biện luận cấu trúc cho hợp chất 3 ....................................................................43
KẾT L U Ậ N .................................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM K H Ả O .......................................................................................... 49

Sinh viên: Nguyễn Thị Tẩn

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VẼ VÀ BIỂU ĐỒ

Bảng 4.1; D ữ liệu phô của B C W 7 ............................................................................. 36
Bảng 4.2: D ữ liệu phô của B C W 5 ..............................................................................41
Bảng 4.3: dữ liệu phổ NMR của hợp chất B C W 6 ....................................................46
Hình 1.1 : Flavan (2 - Phenyl chrom an).....................................................................7
Hình 1.2: Flavon và flavonol...................................................................................... 8
Hình 1.3: Flavanonol - 3

.......................................................................................... 9

Hình 1.4: C h a c o l............................................................................................................9
Hình 1.5: A u r o n ........................................................................................................... 10
Hình 1.6: Antoxianidin............................................................................................... 10
Hình 2.1: Bần chua - Sonneratia caseolaris (L.) Engl......................................26
Hình 3.1.a: Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu cây Bần chua Sonneratia caseolaris 29
Hình 3.1 .b: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn dịch chiết nước mẫu
cây Bần c h u a ..................................................................................................................30
Hình 4 .l.a: Phổ ' h - NMR của B C W 7 ..................................................................... 33
Hình 4.1.b: Cấu trúc của hợp chất B C W 7................................................................ 34
Hình 4.1.c: Phổ l3C - NMR của B C W 7 ....................................................................34
Hình 4.1 .d: Phổ HSQC của B C W 7 ............................................................................ 35
Hình 4.1.e: Phổ HMBC của B C W 7 ........................................................................... 37
Hình 4.1.f: Một số tương tác HMBC của B C W 7 ................................................... 38
Hình 4.2.a: c ấ u trúc của hợp chất B C W 5 ................................................................ 38
Hình 4.2.b: Phổ l3C - NMR của B C W 5 ....................................................................38
Hình 4.2.c: Phổ ' h - NMR của B C W 5 ..................................................................... 39

Hình 4.2.d: Phổ HSQC của B C W 5........................................................................... 10
Hình 4.2.e: Phổ HMBC của B C W 5 ...........................................................................42
Hình 4.2.f: Một số tương tác HMBC của B C W 5 ................................................... 42

Sinh viên: Nguyễn Thị Tẩn

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

Hình 4.3.a: c ấ u trúc của hợp chất B CW 6 ..............................................................43
Hình 4.3.b: Phổ ' h - NMR của B CW 6 .................................................................. 44
Hình 4.3.c: Phổ l3C - NMR của BCW 6 ................................................................. 44
Hình 4.3.d: Phổ HSQC của B CW 6 ......................................................................... 45
Hình 4.3.e: Phổ HSQC và HMBC của B CW 6 ..................................................... 47
Hình 4.3.f: Một số tương tác HMBC của B CW 6 .................................................47

Sinh viên: Nguyễn Thị Tẩn

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13c - NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13
Carbon - 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

' h - NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

' H-'H

' h - ' h Chemical Shift Correlation Spectroscopy

COSY
2D - NMR

Phố cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two - Dimensional
NMR

cc

Sắc ký cột Column Chromatography

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

El - MS

Phổ khối lượng va chạm electron
Electron Impact Mass Spectroscopy

FAB - MS

Phố khối lượng ban phá nguyên tử nhanh
Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC

Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

ESI - MS

Electron Sprayt Ionization Mass Spectroscopy

GC - MS

Sac kí khí - phổ khoi

LC - MS

Sac kí lỏng - phổ khoi

IR

Phổ hong ngoại Infrared Spectroscopy

Me

Nhóm metyl

MS

Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

NOESY

Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

TLC

Sac ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

Sinh viên: Nguyen Thị Tan

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đ ại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

M Ở ĐẦU

Các sản phẩm thiên nhiên ngày càng được con người quan tâm và ứng

dụng rộng rãi bởi đặc tính ít độc, dễ hấp thụ và không làm tốn hại đến môi
sinh. Theo các tài liệu công bố hiện nay, có khoảng 60%

- 70% các loại

thuốc chữa bệnh đang được lưu hành hoặc trong giai đoạn thử nghiệm lâm
sàng có nguồn gốc tự nhiên.
Bằng các phương pháp thử hoạt tính sinh học hiện đại, có kết quả cao,
người ta đã tiến hành nghiên cứu các mẫu dịch chiết thực vật, nghiên cứu các
chất đã tách được từ các dịch chiết. Nhờ vậy mà phát hiện ra nhiều hợp chất
có hoạt tính sinh học quý báu, tạo điều kiện vô cùng thuận lợi cho việc phát
triển ngành y dược trong công cuộc chữa bệnh cứu người.
Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, lượng mưa lớn, độ ẩm cao
(khoảng trên 80%), Việt Nam hiện có một hệ thực vật rất phong phú với
khoảng 12000 loài, trong đó có tới 4000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo
dược cùng các mục đích khác phục vụ cuộc sống con người.
Cùng với bề dày phát triển 4000 năm lịch sử của dân tộc, ngành đông y
đã dành được những thành tựu rực rỡ, nhiều phương thuốc cây cỏ động vật đã
được ứng dụng hiệu quả lưu truyền cho đến ngày nay. Đó là cơ sở rất quan
trọng cho việc phát triển ngành hoá học các hợp chất thiên nhiên.
Tuy nhiên đối với một đất nước còn hạn chế về nguồn vốn và cơ sở vật
chất như Việt Nam thì vấn đề đặt ra là làm thế nào để khai thác và sử dụng
nguồn tài nguyên một cách hiệu quả nhất cho xã hội.
Vì vậy tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu thành phần
flavonoit từ cây Bần chua - Sonneratia caseolaris
Cây Bần chua - Sonneratia caseolaris thuộc họ Lythraceae là loại cây
phổ biến ở các quần thể cây ngập mặn. Tuy nhiên, hiện chưa có nhiều tài liệu
công bố về thành phần hoá học cũng như ứng dụng dược lý của loài này.

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

1

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

Khoá luận này tập trung nghiên cứu thành phần ílavonoit của lá cây
Bần chua tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm
thuốc mới, các giải pháp điều trị bệnh.
Nhiệm vụ của đề tài:
1. Phân lập hợp các hợp chất flavonoit từ lá cây Bần chua bằng các
phương pháp sắc ký.
2. Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất đã phân lập được bằng
các phương pháp phổ.

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

2

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1

Tổng quan về cây Bần chua

1.1.1. Giới thiệu về cây Bần chua
• Tên khoa học : Sonneratia caseolaris (Tên đông nghĩa - Sonneratia acida
L.f., Rhizophora caseolaris L.)
• Tên Việt Nam : Bần chua
Ngoài ra cây còn có tên : Hải Đồng, Thủy Liễu, Bằng Lăng Tía.
• Mô tả cây :
Cây gỗ rừng ngập mặn, cao khoảng 6 - 8 m, đường kính thân đến 30 cm;
xung quanh gốc thường mọc lên các rễ thở cao đến 50 cm. Lá đơn, mọc đối;
phiến lá dày, ròn, hình trứng ngược đến bầu dục, chóp lá tròn, mép lá nguyên,
gân bên 8 - 1 2 đôi, cuống lá 3 - 5 mm. Hoa đơn độc ở đỉnh ngọn. Đài hình
ống cao 7 - 1 2 cm, thùy đài 6 , hình tam giác; cánh hoa 6 , hình đường, dài đến
2,5 cm; nhị nhiều, chỉ nhị dài đến 4 cm; bầu hình cầu dẹt, vòi nhụy rất dài.
Quả có đài tồn tại; hình cầu dẹt, đường kính 3 - 5 cm.
1.1.2. Sinh học, sinh thái
Ở Vườn Quốc gia Xuân Thủy, cây ra hoa tháng 3 - 5, có quả tháng 5 - 8 .
Chúng phân bố tại các khu vực rừng ngập mặn thuộc c ồ n Lu và c ồ n Ngạn.
Nhưng tập trung chủ yếu gần cửa Ba Lạt khu vực c ồ n Lu (Bồng Trắng).
1.1.3. Công dụng
Người ta lấy quả ăn sống hay nấu canh cá. Cũng được sử dụng làm
thuốc đắp vào chỗ viêm tay vì bong gân. Ở Ấn Độ dùng dịch quả lên men làm
thuốc ngăn chặn các chứng xuất huyết. Còn dịch ép từ hoa là một thành phần
trong bài thuốc chữa đái ra máu. Ớ ta dùng lá giã ra, thêm tí muối, làm thuốc

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

3

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

đắp chữa các vết thương dụng dập. Ở Malaixia, lá giã lẫn với cơm dùng làm
thuốc đắp chữa bí tiểu tiện. Quả già làm thuốc diệt giun, còn nước ép từ quả
xanh làm thuốc giảm ho. [ 1 ],[ 2 ]
1.1.4. Thành phần hóa học
Năm 2006, Samir Kumar Sadhu và cộng sự (Bangladesh và Nhật Bản)
công bố 2 hợp chat flavonoid từ phần lá loài Sonneratia caseolarỉs thu thập
tại Bangladesh, cả 2 hợp chất này đều thế hiện hoạt tính chống oxi hóa [3].

Luteolin

Luteolin 7 - rutinoside

Năm 2009 nhóm nghiên cứu của Shi Biao Wu (Trung Quốc) tách được
9 hợp chất từ quả cây Bần chua, trong đó 2 hợp chat nor - lignans (1, 2) và 2
dẫn xuất 6 H - benzo[b,d]pyran - 6 - one (3, 4) được phần lập lần đầu tiên từ
chi Sonneratia có thế coi là các các chất “chỉ dấu” (taxonomic markers) cho
việc phân loại chi này. Ket quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế
bào u thần kinh đệm chuột c - 6 cho thấy các chất 1 , 2 , và 6 thể hiện khả năng
gây độc tế bào ở mức độ trung bình với IC50 tương ứng là 19.02, 20.21 và
31.77 ỊJg/ml (đối chứng dương 5 - fluorouracil có IC50 = 5.84 |ig/ml). [4].

o.
-o
HO ----- { '

N)------OH

3. 3,8 - Dihydroxy - 6 H benzo[b,d]pyran - 6 - one

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

4.3 - hydroxy - 6H - benzo[b,d]pyran - 6 - one

4

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

COOH

'COOH
HO,

HO

5. oleanolic acid
6 . maslinic acid

8 . luteolin 7 - o - ß - glucoside

9. benzyl - o - ß - D - glucopyranoside

Năm 2009, hai mươi bốn hợp chất trong đó có tám Steroid (1 - 8 ), chín
triterpenoids (9 - 16, 24), ba flavonoids (20 - 22), và bốn dẫn xuất
benzenecarboxylic (17 - 19, 23) được phân lập và xác định từ thân và cành
của cây ngập mặn Sonneratia caseolarỉs. Trong số này các hợp chất 1, 4 - 20
và 22 - 24 đã được phân lập lần đầu tiên từ loài này. Các thử nghiệm in vitro
gây độc tế bào trên dòng tế bào gan người SMMC - 7721 cho thấy hợp chất
2 1 (3’,4',5,7 - tetrahydroxyflavone) thể hiện hoạt tính tốt với IC 50 = 2,8 |ig/ml,

còn các hợp chất axit oleanolic (14), 3,3' - di - o - methyl ether axit ellagic
(18), và 3,3',4 - o - tri - o - methyl ether axit ellagic (19) có hoạt tính yếu.
Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất trên cũng được thử nghiệm trên các
chủng Candida albicans và Staphylococcus aureus, tuy nhiên không có hợp
chất nào thế hiện hoạt tính đáng kế. [5]

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

5

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà Nội 2

Khỏa Luận Tốt Nghiệp

1 R = 6-O-acetyl-ß-D-glc
2 R = OH
3 A 22(23)

9 Rị =
10 Ri =
11 Rj =
12 R ị =
R3 =

4 R = palmitate
5 R = 6-O-hexadecanoyl-ß-D-glc
6 R = ß-D-glc

R4 = H, R2 = C H 3, R 3 = CH 2OH
R 4 = h ’ R 2 = R 3 = CH 3
R 4 = h ’ r í = CH 2OH, R3 = CH3
(E)-coum aroyl, R t = CH 3,
COOH, R 4 = OH “

24 Rị = R4 = H, R2 = COOH, R3 = CH3

8 Rị = H, R2 = OH

13R = OAc
14 R = OH

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

6

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đ ại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

o,

o
'ơ

HO-

OH

Ò
18 R = H
19 R = CH3

17
.OH

OH
HO.

HO

'OH

ÒH
ÓH

Ö

Ö

21 R = H
22 R = O-ß-L-arabinopyranosyl

20

1.2. Giới thiệu về lớp chất ĩlavonoid [6, 7].
1.2.1. Giới thiệu chung
Các ílavonoid là lớp chất phố biến trong thực vật. Chúng là hợp chất
được cấu tạo gồm hai vòng benzen A, B được kết nối bởi 1 dị vòng c với
khung các bon C 6 - C 3 - CóCác ílavonoid là dẫn xuất của 2 - phenyl chroman (íìavan).
2'

5

3'

4

Flavan (2- phenyl chroman )
Hình 1.1 : Flavan ( 2 - Phenyl chroman)
Các flavonoid có ở trong tất cả các bộ phận của cây, bao gồm quả,
phấn, hoa, rễ... Một so flavonoid có hoạt tính sinh học thể hiện ở khả năng

chống oxi hóa.
Sinh viên: Nguyễn Thị Tẩn

1

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

1.2.2 Các nhóm flavonoid
1.2.2.1. Flavon và flavonol
Nhóm flavon và flavonol chỉ khác nhau ở vị trí cacbon số 3. Công thức
cấu tạo của hợp chất như sau:

2-phenyl cromon hay 2-phenyl benzopyron

3 hydroxi flavon

Hình 1.2: Flavon và flavonol

Flavon và Aavonol rất phổ biến trong tự nhiên, vị trí và số lượng các
nhóm hydroxi liên kết với các nguyên tử cacbon của khung tạo nên các chất
khác nhau.
Trong thực vật, các flavon và flavonol thường không tồn tại dưới dạng
tự do mà thường dưới dạng glycozit.
1.2.2.2. ĩỉa va no n (dihydroýlavon)

Các flavanon nằm trong cân bằng hỗ biến với các chalcol do vòng
dihydropyron của ílavanon kém bền nên dễ xảy ra mở vòng chuyển thành
chalcol.

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

8

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

[0H1

rHI

1.2.2.3. Flavanonol - 3
Các flavanonol - 3 còn gọi là flavanon - 3 ol hay dihydroflavonol, flavanonol có cấu trúc
giống như flavanon chỉ khác nhóm thế hydroxi ở
vị trí cacbon số 3 (C - 3).
Flavaol-3 (dihydroíìavonol)

Người ta đã biết đến khoảng 30 hợp chất thuộc

Hình 1.3: Flavanonol - 3

nhóm này, phần lớn chúng ở dạng aglycon chỉ có

vài chất ở dạng glycozit. Flavanonol có hai

HO

nguyên tử cacbon bất đối là c - 2 và c - 3 nên
chúng

có

tính

quang

hoạt.

Các

hợp

chất

flavanonol - 3 thường gặp là aromadendrin, fustin
và taxifolin.
1.2.2.4. Chacol
Chacol khác với các loại ílavonoid khác là
nhóm chacol có phân tử gồm hai vòng benzen A và
B được nối với nhau bởi một mạch hở có 3 nguyên
tử cacbon, số thứ tự các nguyên tố được bắt đầu
đánh từ vòng B.
Hình 1.4: Chacol

Hiện nay người ta biết đến khoảng 20 hợp chất Chalcol, ngoài ra còn
thấy hợp chất dihydrochalcol. Tuy vậy, giữa chalcol và dihydrochalcol hầu
Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

9

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đ ại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

như không có mối quan hệ khăng khít nào. Chalcol có thể bị đồng phân hoá
thành flavanon khi đun nóng với axit clohydric (HC1).
1.2.2.5. Auron
Auron là hợp chất có vòng c là một dị vòng 5 cạnh. Công thức cấu tạo
chung của nhóm auron như sau:

Ö

Auron
Hình 1.5: Auron
Auron có màu vàng đậm và không tạo màu khi thực hiện phản ứng
Shinoda (phản ứng định tính íìavonoit). Trong tự nhiên, các chalcol - glycozit
dễ bị oxy hóa thành auron - glycozit nên hai nhóm chất này tồn tại cạnh nhau.
Các auron - glycozit hay xuất hiện trong họ Cúc. Ví dụ như hai hợp chất
auron có trong cây Cúc chuồn chuồn là coreopsin và sunphurein, công thức
như sau:

Ö

S u n p h u r e in

C o r e o p s in

1.2.2.6. Antoxianidin
Antoxianidin thường gặp trong tự nhiên ở dạng glycozit dễ tan trong
nước. Công thức chung như sau:

OH

Antoxianidin
Hình 1.6: Antoxianỉdin

Sinh viên: Nguyễn Thị Tẩn

10

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

1.2.2.7. Leucoantoxianidin
Leucoantoxianidin còn gọi là ílavan - 3,4 diol. Các hợp chất này mới chỉ tìm thấy ở dạng
aglycon, chưa tìm thấy ở dạng glycozit.
Leucoantoxiandin

1.2.2.8. Catechin
Catechin là các dẫn xuất ílavan - 3 - ol. Do đó hai trung tâm cacbon bất đối
nên chúng tồn tại dưới dạng hai cặp đồng phân đối quang. Ví dụ như các cặp
catechin và epicatechin.Trong đó chỉ có (+) - catechin và ( - ) -

epicatechin

xuất hiện trong thiên nhiên.

(+)- catechin

(-) epicatechin

(-) catechin

(+) epicatechin

I.2.2.9. Isoflavonoid
Isoflavonoid bao gồm các dẫn xuất của 3 - phenyl chroman, được chia
thành các nhóm như sau:
.0 .

3- phenyl chroman

Sinh viên: Nguyễn Thị Tẩn

11

Lớp: K37A - Hóa học

Trường Đại Học S ư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

ì . 2.2.10. Rotenoid và neoflavonoid
Các rotenoid có quan hệ chặt chẽ với các isoflavon về mặt cấu trúc
cũng như sinh tống hợp. Khung cacbon được mở rộng thêm một nguyên tử
cacbon nên có thế tạo thêm một vòng pyran thứ hai. Công thức như sau:

1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất
có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân
cực trung bình...) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.
1.3.1. Chọn dung m ôi chiết
Thường thì các chất chuyến hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác
nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung
môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyến hoá
thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng
với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc.
Neu dung môi có lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất
lượng của quá trình chiết. Vì vậy những dung môi này nên được chưng cất để thu
được dạng sạch trước khi sử dụng. Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi
như các diankyl phtalat, tri - n - butyl - axetylcitrar và tributylphosphat. Những
chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo
quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa.

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

12

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đ ại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

Methanol và chloroírom thường chứa dioctylphtalat [di - (2 - etylhexyl)
- phtalat hoặc bis - 2 - etylhexyl - phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả
phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thế hiện hoạt tính trong
thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlroữom, metylen
clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình
chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa...
Những tạp chất của chloroữom như C H 2CI 2, CH 2ClBr có thể phản ứng
với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm
khác. Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HC1) cũng
có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp
chất khác. Chloroírom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm
việc với chất này cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và
phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn
chloroữom.
Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ
thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của
chloroữom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol
hoà tan phần lớn các chất chuyến hoá phân cực cùng với các hợp chất phân
cực trung bình và thấp. Vì vậy, khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị

hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính
tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
methanol trong suốt quá trình chiết. Thí dụ trechlonolide A thu được từ
trechlonaetes aciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình phân
huỷ 1 - hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense
được chiết trong methanol nóng.
Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

13

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà Nội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.
Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất
dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit
dễ nổ. Peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với các hợp chất không
có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có
thế tạo thành axetonit nếu 1,2 - cis - diol có mặt trong môi trường axit. Quá
trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân
tách đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit - bazơ có thể tạo
thành những sản phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong cây
được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá

trình chiết, tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo thành
chất mong muốn.
Sau khi chiết, dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ
không quá 30 - 40°c, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt
độ cao hơn.
1.3.2. Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
- Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.
- Chiết sắc với dung môi nước.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi
nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và
thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy
để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung

Sinh viên: Nguyễn Thị Tấn

14

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước
đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể
dùng bình thuỷ tinh.

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương
pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng
24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ
thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những
chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách
khác nhau.
Ví dụ:
- Khi chiết các alcaloid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất
này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân
Đragendroff và tác nhân Maye.
- Các flavonoid thường là những hợp chất màu. Vì vậy, khi dịch chiết
chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn
chiết.
- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra
và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình
chiết.
- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde
có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với
aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể
biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung
môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp
chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.

Sinh viên: Nguyễn Thị Tẩn

15

Lớp: K37A - Hóa học

Trường Đ ại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

1.4. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các họp chất hữu cơ
Phương pháp sắc kí (Chromatography) là một phương pháp phổ biến và
hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp
chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí
Sắc kí là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác
nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha:
pha động và pha tĩnh.
Sắc kí gồm có pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu
tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất
của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan...).
Phương pháp sắc kí dựa trên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của các
chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với một pha tĩnh. Nguyên nhân của
sự khác nhau đó là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau hoặc do
khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh.
Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh.
Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này
đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Ket
quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyến động chậm hơn qua hệ
thống sắc kí so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điếm này
mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí.
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc kỉ
Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa
pha động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ

thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nộng độ của dung dịch (hoặc
với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng
nhiệt Langmuir:

Sinh viên: Nguyễn Thị Tẩn

16

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đ ại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

rioo.b.c
n " 1+b.c
n

: Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.

n oo : Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó.
b

: Hằng số.

c

: Nồng độ của chất bị hấp phụ.

1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc kí
Trong phương pháp sắc kí: Pha động là các chất ở trạng thái khí hay
lỏng, còn pha tĩnh có thế là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.
* Theo bản chất của hai pha sử dụng
- Pha tĩnh: Có thế là chất rắn hoặc chất lỏng
+ Pha tĩnh là chất rắn: Thường là alumin hoặc silica gel đã được xử lý,
nó có thể nạp nén vào trong một cột
+ Pha tĩnh là chất lỏng: Có thế là một chất lỏng được tấm lên bề mặt
một chất mang
- Pha động: Có thể là chất lỏng hoặc chất khí
+ Pha động là chất khí: Thí dụ trong kỹ thuật sắc kỷ khí. Trong truờng
hợp này chất khí được gọi là khí mang hay khí vectơ.
+ Pha động là chất lỏng: Thí dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp
mỏng, sắc ký cột.
* Phân loại sắc ký theo bản chất của hiện tựợng xảy ra trong quá trình phân
tách chất.
- Sắc ký phân chia (partition chromatography)
+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)
+ Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất lỏng
này đuợc nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn.
- Sắc ký hấp thụ (Adsorption chromatography)

Sinh viên: Nguyễn Thị Tẩn

17

Lớp: K37A - Hóa học


Trường Đ ại Học S ư Phạm Hà N ội 2

Khóa Luận Tốt Nghiệp

+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí.
+ Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ,
được nhồi trong một cái ống. Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử
dụng là những hạt silica gel hoặc alumin.
- Sắc ký trao đối ion (Ion exchange chromatography)
+Pha động chỉ có thể là chất lỏng
+ Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học
là polymer nên gọi là hạt nhựa. Be mặt của hạt mang các nhóm chức hóa học
ở dạng ion. Có hai loại hạt nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation.
- Sắc ký lọc gel (size exclusion chromatography,

gel filtration

chromatography)
+ Pha động chỉ có the là chat lỏng.
+ Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bang polymer, trên bề
mặt có nhiều lỗ rỗng.
- Sắc ký ái lực (arrinicy chromatography)
+ Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong
cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị. Một protein có ái lực
với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyến sẽ bị cản trở.
+ Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi
trong việc tinh sạch protein.
- Sắc ký lỏng cao áp
+ Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký
cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kế. Bản thân vật liệu
tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tuơng tác

dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật
liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ
chảy thích hợp.

Sinh viên: Nguyễn Thị Tẩn

18

Lớp: K37A - Hóa học