Nghiên cứu lựa chọn loại enzyme protease trong thủy phân sụn cá đuối (daisyatis zugei) tạo chondrotin sunfat

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG

ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
--- o0o ---

HOÀNG VĂN TIẾN

NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN LOẠI ENZYME PROTEASE
TRONG THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI ( Dasyatis zugei )
TẠO CHONDROTIN SUNFAT

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS. Vũ Ngọc Bội

Nha Trang, tháng 6 năm 2015


i

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đồ án này
Trước hết em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban
Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập
và nghiên cứu tại trường trong những năm qua.

Sự biết ơn sâu sắc nhất em xin được giành cho: TS. Vũ Ngọc Bội - Khoa
Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang và TS. Nguyễn Duy Nhứt Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và
động viên em trong suốt quá trình thực hiện đồ án.
Xin cảm ơn quý thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình
giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian qua.
Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của gia đình và bạn bè
luôn luôn chia sẻ cùng em trong quá trình nghiên cứu.


ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ iv
DANH MỤC HÌNH .............................................................................................. v
KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... vi
MỞ ĐẦU................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4
1.1. SỤN ĐỘNG VẬT ........................................................................................... 4
1.2. CHONDROITIN SUNFATE ........................................................................ 5
1.2.1. Đặc điểm và cấu trúc của Chondroitin sulfate ....................................... 5
1.2.2. Thu nhận và định lượng Chondroitin sulfate ....................................... 10
1.2.2.1. Các phương pháp thu nhận Chondroitin sulfate thô .................... 10
1.2.2.2. Các nghiên cứu chiết xuất và định lượng Chondroitin sulfate ..... 11
1.2.3. Ứng dụng của Chondroitin sulfate ...................................................... 12
1.2.3.1. Ứng dụng trong y học ................................................................ 12
1.2.3.2. Các ứng dụng khác ................................................................... 14
1.3. PROTEASE............................................................................................... 14
1.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme .................... 17
1.4. GIỚI THIỆU VỀ CÁ ĐUỐI ....................................................................... 21

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................ 25
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ................................................................................. 25
2.1.1. Sụn cá đuối bồng mõm nhọn ( Dasyatis zugei ) ................................ 25
2.1.2. Enzyme protease ................................................................................... 26
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................. 27
2.2.1. Phương pháp phân tích ........................................................................ 27
2.2.1.1. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson................... 27
2.2.1.2. Định lượng Chondroitin sulfate bằng so màu với Methylene blue
......................................................................................................................... 29
2.2.1.3. Phương pháp xác định hàm ẩm .................................................. 32
2.2.1.4. Phương pháp xác định tro toàn phần. ......................................... 32
2.2.1.5. Phương pháp xác định hàm lượng Nitơ tổng số. ........................ 33


iii

2.2.2. Phương pháp sinh học tách chiết Chondroitin sulfate ........................... 35
2.2.3. Bố trí thí nghiệm ................................................................................. 36
2.2.3.1. Quy trình dự kiến thu nhận CS thô ............................................ 36
2.2.3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xử lý sụn cá đuối làm nguyên liệu nghiên cứu . 39

2.2.3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian tối thích ......................... 41
2.2.3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn enzyme thích hợp .......................... 42
2.2.3.5.Thử nghiệm sơ bộ thủy phân sụn cá thu nhận và đánh giá CS thô 43
2.3. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ..................................................................... 44
2.3.1. Hóa chất ............................................................................................. 44
2.3.2. Thiết bị ............................................................................................... 45
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ SỐ LIỆU ............................................................ 45
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 46
3.1. NGHIÊN CỨU XỬ LÍ SỤN CÁ ĐUỐI ..................................................... 46

3.1.1. Phân tích thành phần hóa học cơ bản của sụn cá đuối ......................... 46
3.1.2. Xác định chế độ xử lí sụn cá đuối ....................................................... 42
3.2. NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN NGUỒN ENZYME THÍCH HỢP ........... 48
3.2.1. Xác định hoạt độ enzym papain, alcalase, neutrase ............................. 49
3.2.2. Xác định thời gian enzyme Neutrase thủy phân tối ưu sụn cá. ............ 50
3.2.3. So sánh khả năng thủy phân sụn cá của Papain, Alcalase và Neutrase.

......................................................................................................................... 51
3.3. THỬ NGHIỆM SƠ SỘ THỦY PHÂN SỤN CÁ THU NHẬN CS THÔ .......... 53

3.3.1. Đánh giá hàm lượng CS theo tỉ lệ enzyme thủy phân đã chọn. ............ 53
3.3.2. Đánh giá quá trình thủy phân và hiệu suất thu hồi của CS enzyme Neutrase 54
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ........................................ 56
I. KẾT LUẬN ..................................................................................................... 56
II. KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 57
PHỤ LỤC ............................................................................................................ 60


iv

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần chính của mô sụn ............................................................. 4
Bảng 1.2 Phân loại chondroitin sulfate .............................................................. 9
Bảng 2.1 Xác định đường cong chuẩn của tyrosine .................................... 28
Bảng 3.1 Tỷ lệ thành phần khối lượng sụn cá đuối ........................................... 46
Bảng 3.2 Thành phần hóa học cơ bản của sụn cá đuối ...................................... 46
Bảng 3.3 Bảng đánh giá mẫu sụn sau khi xử lý ................................................. 47
Bảng 3.4 Kết quả xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp Anson .............. 49
Bảng 3.5: Xác định thời gian enzyme Neutrase thủy phân tối ưu sụn cá ........... 50

Bảng 3.5. Hiệu quả thuỷ phân sụn cá trong 4 giờ của các protease.................... 52
Bảng 3.6. Hàm lượng CS thủy phân bằng enzyme Neutrase với các tỉ lệ khác nhau. .. 53

Bảng 3.7 Bảng các chỉ tiêu đánh giá quá trình thủy phân ................................... 54
Bảng 3.8 Hiệu suất thu hồi CS thô của enzyme đã chọn ................................... 55


v

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của một đơn vị trong chuỗi CS. ............................ 7
Hình 1.2. Cấu trúc mạch của các CS................................................................. 7
Hình 1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng enzyme .................................. 19
Hình 1.4 Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme .......................................... 20
Hình 1.5 Cá đuối bồng mõm nhọn (Dasyatis zugei) ....................................... 22
Hình 2.1 Sụn cá đuối bồng mõm nhọn ( Dasyatis zugei ) ................................ 25
Hình 2.2 Sơ đồ quy trình dự kiến thu nhận CS thô từ sụn cá đuối .................... 36
Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xử lý sụn cá đuối làm nguyên liệu nghiên cứu
.............................................................................................................. 39
Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm chọn thời gian tối thích........................................... 41
Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn enzyme thích hợp ................................. 42
Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá hàm lượng CS theo tỉ lệ enzyme thủy
phân đã chọn .......................................................................................... 43
Hình 3.1 Hình ảnh về sụn cá đuối sau khi được xử lý ...................................... 48
Hình 3.2 Sự thay đổi hàm lượng CS tương đối theo thời gian thủy phân .......... 51
Hình 3.3 Sự thay đổi hàm lượng CS tương đối theo loại enzyme ..................... 52


vi

KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A664

Đo OD ở bước sóng 664 nm

CĐ

Cá đuối

CPC

Cetylpyridium chloride

CS

Chondroitin sunfate

CS4

Chondroitin-4-sulfate

CS6

Chondroitin-6-sulfate

CTAB

Cetyltrimethylamnonium bromide

GAG

Glycosaminoglycan

GalNAc

N-acety-D-lgalactosamine

OD

Optical Density

PG

Proteoglycan

TCA

Tricloacetic


1

MỞ ĐẦU
Hiện nay, nước ta có khoảng 300 cơ sở chế biến thủy sản và 200 nhà
máy chuyên sản xuất các sản phẩm đông lạnh phục vụ xuất khẩu. Theo báo cáo
“Đánh giá tác động môi trường trong lĩnh vực thủy sản năm 2002” thì tổng
lượng chất thải rắn như: đầu, xương, da, vây, vẩy… từ các nhà máy chế biến
thủy sản được ước tính khoảng hàng trăm tấn/năm [25]. Nhiều dược liệu quý
đã được chiết xuất từ nguyên liệu còn lại của các nhà máy chế biến thuỷ sản
như glucosamine được chiết xuất từ vỏ tôm, chondroitin từ sụn cá mập [14].

Chondrotinsunfat là một thành phần có trong sụn các loại động vật: cá, gà, heo(
lợn )… Do vậy từ các loại sụn này người ta có thể sản xuất ra chondroitin sunfat
để sử dụng trong điều trị các bệnh về khớp, mắt và các bệnh khác. Vì vậy, việc
điều tra và nghiên cứu nguồn dược liệu từ nguyên liệu còn lại sau chế biến là
rất cần thiết, không những tận dụng được nguồn phế liệu còn lại mà còn nâng
cao hiệu quả của chế biến.
Chondroitin sulfate (CS) là thành phần cơ bản cấu tạo nên sụn khớp, CS còn
có mặt trong các tổ chức sợi chun (gân, cơ, dây chằng…) tạo sự vận động linh
hoạt và tính đàn hồi trong hoạt động khớp, tạo độ bền khi bị nén ép. CS có tác
dụng hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương khớp. CS làm tăng sản xuất chất nhầy
và khả năng bôi trơn của dịch khớp, đảm bảo chức năng dinh dưỡng và sự
vận động linh hoạt của khớp. Vì vậy, CS giúp giảm và ngăn chặn quá trình
thoái hoá khớp [6]. CS còn có vai trò bảo vệ sụn khớp bằng ức chế các enzym
phá huỷ sụn khớp như collagenase, phospholipase A2, N–acetylglucosamindase
[4]. Ngoài ra CS cũng góp phần nuôi dưỡng các tế bào của giác mạc mắt, tái

tạo lớp giác mạc. Một trong những tác dụng quan trọng khác của CS là khả năng
ức chế hoạt chất angiogenesis - chất kích thích tạo tân mạch trong các khối u,
làm cho khối u hạn chế phát triển. CS có khả năng kháng viêm, ức chế sự tiết
các cytokine tiền viêm TNF-α, interleukin-1β, nitric oxid và các gốc oxy hóa tự
do [9]. Hiện nay các thuốc kết hợp CS và glucosamine đang được sử dụng


2

hiệu quả để điều trị bệnh viêm khớp.
Do phân tử CS rất đa dạng và phức tạp, cho nên CS chưa được tổng hợp
bằng con đường hóa học mới chỉ được tách chiết từ các nguồn nguyên liệu tự
nhiên. Những năm trước đây CS được tinh chế chủ yếu từ sụn cá mập, do đó giá
thành rất cao. Một số nghiên cứu trên thế giới đã tách chiết CS từ một số nguồn

nguyên liệu như từ da của cá Labeo rohita [21], cá mập [22], sụn gà [23], sụn
bò [24]...Việc nghiên cứu để tách chiết CS từ các nguồn nguyên liệu khác nhau
vẫn được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm đặc biệt nhằm hạ giá thành
sản phẩm.
Để sản xuất CS từ sụn động vật có nhiều phương pháp khác nhau như sử dụng
acid, sử dụng nhiệt, sử dụng enzyme protease. Trong số các phương pháp sử dụng
thủy phân sụn động vật thì phương pháp sử dụng enzyme có nhiều ưu điểm như
không độc hại, sản phẩm sau thủy phân không bị biến đổi gốc sunfat…do vậy hiện
nay các nhà nghiên cứu đang quan tâm đến việc sử dụng enzyme protease để thủy
phân sụn động vật.
Trong các loại động vật có sụn, cá là loại động vật hiện đang được nghiên cứu
nhiều bởi sụn cá thường được tách khi chế biến. Mặt khác, một số loại cá sụn như
cá đuối, cá mập lại có giá thành thấp. Vì thế việc nghiên cứu tận dụng các loại cá
sụn trong sản xuất CS là một trong những nghiên cứu mới đáng quan tâm. Mà trong
các loại cá sụn thì cá đuối (Dasyatis zuge) là loại động vật dễ kiếm và giá thành
thấp ở Việt Nam.
Do vậy, đề tài: " Nghiên cứu lựa chọn loại enzyme protease trong thủy
phân sụn cá đuối ( Dasyatis zugei ) tạo Chondrotin sunfat” có ý nghĩa thực
tiễn cao và nhiều triển vọng để ứng dụng vào thực tế sản xuất dược phẩm
nước nhà trong giai đoạn tới.
Mục tiêu của đề tài:
Thử nghiệm sử dụng enzyme protease thay thế hóa chất trong thủy phân sụn
cá đuối để sản xuất CS.


3

Đề tài cần thực hiện nhiệm vụ chính sau:
 Xác định chế độ xử lí sụn cá đuối tiền thủy phân;
 Nghiên cứu lựa chọn loại protease thích hợp thể thủy phân sụn cá đuối tạo

chondroitin sulphate trong số 3 loại protease ( Neutrase, alcalase, papain)
 Sơ bộ thử nghiệm thủy phân sụn cá đuối bằng protease đã chọn
Ý nghĩa khoa học của đề tài.
Lần đầu tiên nghiên cứu một cách có hệ thống việc tìm chọn các enzym và
các thông số cho quy trình tách chiết chondroitin sulfate từ sụn cá đuối, vì vậy là
nguồn bổ sung các tư liệu có tính khoa học về các tính chất dược lý của CS.
Các kết quả thu được của đề tài sẽ bổ sung hữu ích nguồn tài liệu phong phú cho
các nhà nghiên cứu các sản phẩm có giá trị gia tăng từ phế thải thuỷ sản.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở cho các nhà thực nghiệm thử nghiệm
sử dụng các chất có tính dược học vào đời sống con người, góp phần nâng cao
giá trị sử dụng của sụn cá.


4

CHƯƠNG 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

SỤN ĐỘNG VẬT

Sụn động vật là loại mô liên kết đặc tồn tại trong cơ thể động vật có
xương sống, cũng như ở động vật không xương sống (sam, sên biển và động
vật chân đầu (cephalopod)... [25]
Trong cơ thể người và các loài động vật có xương sống khác, sụn có ở nhiều
bộ phận như các khớp, xương sườn, tai, mũi, ống hô hấp, đĩa đệm cột sống… Sụn
là phần chính trong bộ xương của bào thai, nhưng nó sẽ biến đổi thành xương
khi cơ thể trưởng thành. Các loài cá sụn (chondrichthyes) như cá mập, cá đuối là
những loài động vật có xương sống nhưng bộ xương chứa hoàn toàn sụn cả khi

ở tuổi trưởng thành. Sụn khác biệt ở chỗ chỉ chứa một loại tế bào, không có mạch
máu, không chứa các tế bào thần kinh (aneurol) và không chứa hệ bạch huyết
(alymphatic) [25]
Có hai loại sụn là sụn khớp và sụn chêm. Thành phần hoá học của cả hai
loại sụn nêu trên đều bao gồm hai pha chủ yếu là pha lỏng bao gồm nước và các
chất điện phân, pha rắn do các đại phân tử tạo thành gồm sợi collagen (collagen
loại II trong sụn chêm và loại I trong sụn khớp), proteoglycan và tế bào sụn
(chondrocytes). Tế bào sụn tạo nên chất cơ bản (matrix) của sụn [25]
Bảng 1.1. Thành phần chính của mô sụn
Mô

Nước (%)

Sụn khớp

68,0 – 85,0

Sụn chêm

60,0 – 70,0

Collagen (%)

Proteoglycan

10,0 - 20,0 ( loại I)

(%) 5,0-10,0
15,0 - 25,0 ( loại II)
1,0- 2,0

Thành phần chính của hai loại sụn được thể hiện trong bảng 1.1. Ba thành
phần chính này tác động đồng bộ, tạo nên đặc tính cơ học của sụn. Sự thay
đổi của các thành phần này (do bị bệnh lão hoá...) sẽ làm thay đổi đặc tính cơ
học phụ thuộc vào thời gian của sụn. Có tới 30% nước nằm trong khoảng không


5

giữa các sợi collagen. Kích thước sợi collagen và hàm lượng nước được xác định
nhờ áp suất trương sinh ra do mật độ điện tích của các đại phân tử proteoglycan
mang điện tích âm phân bố trong khối collagen. Sự gắn kết của proteoglycan ảnh
hưởng đến trương lực và sự chuyển động của pha lỏng khi bị nén ép. Chondroitin
là thành phần cơ bản của proteoglycan chứa trong sụn [25].
1.2.

CHONDROITIN SUNFATE

1.2.1.

Đặc điểm và cấu trúc của Chondroitin sulfate

CS được phát hiện và lần đầu tiên được tách chiết từ những năm 60
do Davidson và Meyer. CS thuộc nhóm chất heteropolysaccharide gọi là
glycosaminoglycan (GAG) ngoại bào được tìm thấy trong tự nhiên như một
polime mạch thẳng gồm các đơn vị cơ bản cấu tạo bởi 2 đường (disaccharide)
N-acetyl-D- galactosamine (GalNAc) và D-glucuronic acid (GlcA) xen kẽ nhau
(polymeric D- galactosamine and D-glucuronic acid), các gốc đường này
được sulfate hoá hay không bị sulfate hoá [8], một số gốc GlcA bị epime
hoá thành L-iduronic acid (IdoA). CS là một polime có phân tử lớn gồm 15-150

đơn vị cấu trúc 2 đường đơn của GlcA và GalNAc. Khối lượng phân tử của
CS thường biến động trong khoảng 10.000 - 100.000 Dalton [12].
Kato (1994) và Bernfield (1999) đã nhận thấy CS thường gắn với các
protein bằng liên kết o-glycosid tạo thành một proteoglycan (PG)
(glucoprotein), là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharide [5].
Sự kết hợp giữa nhóm sulfate (SO42-) của gốc đường với các nhóm
carboxyl(-COO-) của gốc đường acid làm cho phân tử chondroitin có mật độ
điện tích âm rất cao (anionic polysaccharide) dễ dàng liên kết đồng hoá trị với
các protein trong cấu tạo của PG. Chuỗi CS được gắn với nhóm -OH của gốc
serine ở một số protein. Các protein gắn chọn lọc chính xác như thế nào với
GAG vẫn chưa được làm sáng tỏ. GAG được tổng hợp trong mạng lưới nội
bào và trong thể Golgi. Sự gắn kết của chuỗi GAG bắt đầu với 4 gốc đường
đơn theo phương thức cố định là Xyl- Gal-Gal-GlcA; xylose được gắn với


6

protein trong mạng lưới nội bào, còn các phân tử đường khác được gắn trong
hệ Golgi [18].
CS ưa nước vì thế hàm lượng nước trong mô sụn cao. Các điều kiện
thủy phân cũng có thể làm giảm trọng lượng phân tử trung bình của sản phẩm
thu được. Mỗi phân tử đường có thể không bị sulfate hoá, bị sulfate hoá 1 lần
hay 2 lần. Đa phần nhóm OH ở vị trí carbon 4 và 6 của GalNAc được sulfate
hoá, đối với một số chuỗi GAG khác thì ở vị trí 2 của GlcA. Quá trình sulfate
hoá là nhờ các enzym sulfotransferase đặc hiệu. Việc sulfate hoá ở các vị trí
khác nhau tạo nên hoạt tính sinh học đặc thù của CS.
Trong cơ thể sống, các PG và GAG giữ vai trò quan trọng trong nhiều
quá trình khác nhau như: điều hòa hoạt động của enzym và sự bám dính, phát
triển và di thực của tế bào. GAG còn có chức năng cấu trúc và điều khiển trong
cơ thể sống. Về cấu trúc, nó là thành phần chính của mô sụn. Về điều khiển,

CS rất dễ gắn kết với protein trong mô tế bào nhờ có điện tích âm, mối quan
hệ này rất quan trọng cho việc điều hoà các hoạt động của tế bào. Phân tử
(monomer) PG của mô sụn (chứa khoảng 80-100 mạch CS) cùng với protein
gắn kết và acid hyaluronic tạo thành một phức hệ thuỷ động học có khả năng
nén thuận nghịch rất cần thiết cho sụn để chống lại sự ép nén với sự biến dạng
nhỏ nhất [8]
Công thức hoá học của chondroitin sulfate (C14H21NO14S)n :


7

Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của một đơn vị trong chuỗi CS.
Chondroitin-4-sulfate: R1 = H; R2 = SO3H; R3 = H. Chondroitin-6-sulfate:
R1 = SO3H; R2, R3 = H.

n
Hình 1.2. Cấu trúc mạch của các CS
Chondroitin có 3 loại chính là A, B và C chúng đặc trưng bởi số lượng và
vị trí của nhóm sulfate trong nhóm disaccharide lặp lại của chuỗi
polysaccharide. Chondroitin sulfate A: gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 (chondroitin4-sulfate, CS4), có nhiều ở mô sụn, CS có thể kết hợp với protein tạo nên
chondromucoit. Chondroitin sulfate C: gốc sulfate gắn ở vị trí C-6
(chondroitin-6-sulfate, CS6). Chondroitin sulfate B: acid iduronic thay thế
acid glucuronic. Loại A và B (CS4) thường được tìm thấy ở sụn động vật có
vú (bò và lợn), ngược lại loại C (CS6) được tìm thấy chủ yếu ở các loài cá


8

sụn (cá mập, cá đuối (rays, skates)...). Tuy nhiên, CS từ các nguồn nguyên
liệu khác nhau rất đa dạng về cấu trúc và kích thước, chúng chứa ở mức độ

nhiều hay ít một số lượng các isome của CS, có tới 16n isome của CS, phụ
thuộc vào sự thay đổi vị trí sulfate hoá của các cặp đường đôi tạo nên 16 isome/
mỗi cặp . Trong đó CS A và CS C là những thành phần chủ yếu hình thành PG [18].
+ Chondroitin Sulfate A (GlcA-GalNAc-4S)-CS4

+ Chondroitin sulfate B (IdoA-GalNAc-4S) -CS4
Tên cũ là dermatan sulfate (iduronic acid thay cho glucuronic acid),
thường có nhiều ở da, còn thấy có ở van tim, gân, thành mạch. Vị trí bị sulfate
hoá ở C-4 của GlcNAc và C-5 của glucuronic acid bị epime hoá thành iduronic
acid.


9

+ Chondroitin Sulfate - C (GlcA-GalNAc-6S ) - CS6

CS được tách chiết trước khi cấu trúc của nó được xác định. Vì vậy tên
gọi của CS cũng có sự thay đổi. Ngoài ra còn có chondroitin sulfate D và E.
Phân loại các CS được tóm tắt trong bảng 1.2.
Bảng 1.2 Phân loại chondroitin sulfate
Tên

Vị trí bị sulfate hoá

Tên phân loại

Carbon 4 của đường - N- Chondroitin-4-sulfate (CS4); ở người có
Chondroitin sulfate A

acety-D-galactosamine

trong: sụn khớp, giác mạc, da, thành mạch...

(GalNAc)
Chondroitin sulfate B

Carbon 4 của GalNAc – L-

( Dermatant sulfate)

iduronic acid

Chondroitin-4-sulfate (CS4)

Chondroitin sulfate C

Carbon 6 của GalNAc

Chondroitin-6-sulfate (CS6)

Carbon 2 của
Chondroitin sulfate D

glucuronic

acid and 6 của GalNAc

Chondroitin-2,6-sulfate (C2,S6)

Carbons 4 và 6 của GalNAc

Chondroitin sulfate E

Chondroitin-4,6-sulfate (C4,S6)

CS tinh chế là chất bột màu trắng hoặc trắng ngà, hoà tan tốt trong nước
vì thế rất dễ hút ẩm; nhưng không hoà tan trong ethanol, methanol, cetone...
Khối lượng phân tử của CS nguyên liệu thường được sử dụng trong chế phẩm


10

thuốc là thấp hơn, khoảng 15000 - 20000 Dalton.
1.2.2.

Thu nhận và định lượng Chondroitin sulfate

Cấu trúc phân tử CS rất đa dạng và phức tạp nên chưa thu nhận CS được
bằng con đường tổng hợp hoá học, cho đến nay mới chỉ tổng hợp được
các mạch oligosaccharide ngắn có trình tự giống một đoạn mạch CS như một
số CS tetrasaccharide (4 gốc đường đơn) có khả năng kích thích sự phát triển
và phân hoá của neron thần kinh, còn phân tử disaccharide thì không có tác dụng
trên.
Vì thế, hiện nay nguyên liệu CS thô mới chỉ được thu nhận duy nhất từ
các nguồn tự nhiên nhờ chiết xuất CS từ các loại mô động vật. Sụn cá mập
(xương sọ, xương sống, vây...) là nguồn nguyên liệu CS phổ biến nhất trong các
chế phẩm thuốc và chế phẩm bổ sung dinh dưỡng.
CS trong mô động vật liên kết chặt với protein trong dạng phức
proteoglycan. Cho nên việc đầu tiên là phải tách CS ra khỏi protein nhờ việc
làm yếu mối liên kết giữa CS-protein và phân huỷ protein để giải phóng các phân
tử CS.

1.2.2.1. Các phương pháp thu nhận Chondroitin sulfate thô
Quá trình thu nhận chế phẩm CS thô từ sụn có thể được thực hiện
bằng phương pháp hoá học hoặc phương pháp sinh học (dùng enzym) để thuỷ
phân sụn.
Trong phương pháp hoá học mô sụn được xử lý bằng nước nóng, dung
dịch muối, kiềm (NaOH) hoặc acid (HCl, CH3COOH...) để tách GAG khỏi
các phân tử khác (protein, hyaluronic acid…). Phương pháp này đã áp dụng để
thu CS từ sụn gà, sụn bò tuy nhiên, đã xuất hiện việc phá vỡ các liên kết
glycoside của CS khi thu nhận CS.
Phương pháp sinh học dùng enzym để thuỷ phân mô sụn là phương pháp
có hiệu quả để thu nhận CS không bị biến đổi về cấu trúc, giữ được hoạt tính
sinh học của chúng và làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường do các hoá chất


11

(muối, kiềm, acid...) gây nên. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng các protease
(papain, actinase, pronase…) để thuỷ phân sụn giải phóng GAG khỏi các
protein liên kết. Sau khi loại bỏ protein thì CS được tách ra và tinh sạch. Phương
pháp này đã được dùng để thu nhận GAG từ da cá Labeo rohita , cá mập, cá sấu, cá
đuối...
Các chuỗi dài hydrophilic polymers GAG không tan trong ethanol, cetone
và methanol, vì vậy có thể sử dụng các dung môi này để thu CS thô. Một số
nghiên cứu cho thấy ethanol 60-70% tủa được hàm lượng CS cao nhất và tách
CS với một số polysaccharide khác [17].
1.2.2.2. Các nghiên cứu chiết xuất và định lượng Chondroitin sulfate
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã tách chiết CS từ một số nguồn nguyên
liệu như từ da của cá Labeo rohita , sụn của cá mực , cá mập, sụn gà, sụn bò...
Các loài cá sụn (chondrichthyes) như cá mập, cá đuối là những loài động vật
có xương sống nhưng bộ xương chứa hoàn toàn sụn cả khi ở tuổi trưởng thành.

Đây là nguồn nguyên liệu dễ kiếm và có chứa thành phần CS. Cho đến nay, nghiên
cứu ứng dụng enzym thay thế các chất hóa học trong quá trình thu nhận CS từ sụn
động vật (đặc biệt các nguồn sụn nguyên liệu thuỷ sản) là rất cần thiết để giảm
độ độc hại trong khi sản xuất cũng như tăng chất lượng của chế phẩm CS. Ở Việt
Nam, vấn đề nghiên cứu thu nhận CS còn rất mới mẻ, có rất ít công trình đề cập
đến vấn đề này. Mới có đề tài “Nghiên cứu tách chiết chondroitin sulfate từ
xương sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii) và cá nhám (Carcharhinus sorrah) bằng
công nghệ sinh học” của Võ Hoài Bắc, Đỗ Ngọc Tú, Trần Cảnh Đình, Lê Thị
Lan Oanh, (2010), được đăng trên Tạp chí Viện nghiên cứu Hải sản số 16: 26-30.
Vì phân tử CS rất đa dạng và phức tạp, cho nên mới chỉ tổng hợp được
các mạch oligosaccharid ngắn có trình tự giống một đoạn mạch CS: tổng hợp
được một số CS tetrasaccharid [11], có khả năng kích thích sự phát triển và
phân hoá của neron trong khi đó disaccharid không có tác dụng trên. Vì
vậy, các CS chủ yếu được tách chiết từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên.


12

Xác định hàm lượng CS theo sự thay đổi quang phổ hấp thụ của chất
màu Methylene blue khi nó gắn với CS. Hoà tan bột CS khô vào nước đã loại
ion để nhận dung dịch 8-12% (w/v) và xác định hàm lượng CS của dung dịch
theo Beer- Lambert và cộng sự dùng CS4 và CS6 tinh khiết làm chất chuẩn, và
đo độ hấp thụ của dung dịch màu ở bước sóng 664nm trên máy quang phổ [19]
Hàm lượng CS được thu nhận từ các nguồn nguyên liệu sụn khác nhau
qua các phương pháp đã mô tả được tóm tắt trong bảng 1.3.
Bảng 1.3 Hàm lượng CS được tách từ các nguồn sụn khác nhau [7].
STT

Nguyên liệu

1

Vây cá mập

CS4 (%)

CS6 (%)

Loại CS

9,60 ± 1,05

8,76 ± 0,96

CS6,CS4

Sụn lưỡi

14,84 ± 0,38

13,54 ± 0,35

CS6,CS4

Xương sườn

5,56 ± 0,96

5,08 ± 0,87

CS6,CS4

Xương ức

11,55 ± 0,88

10,54 ± 0,80

CS6,CS4

Cổ họng

9,51 ± 1,99

8,68 ± 1,81

CS6,CS4

Cá đuối

5,27 ± 0,91

4,81 ± 0,84

CS6,CS4

Cá sấu

2

3
4

Xương lưỡi hái của gà
Sụn mũi bò

5

14,08 ± 2,51 13,38 ± 4,74

CS4,CS6

11,50

CS4, CS6

Như vậy hàm lượng CS trong các nguyên liệu sụn biến động từ khoảng 10,0
- 28,3%, phần lớn chứa cả 2 loại CS4 và CS6.
1.2.3.

Ứng dụng của Chondroitin sulfate

CS đã được sử dụng rộng rãi trong các loại chế phẩm bổ sung dinh
dưỡng (dietary supplements) khác nhau trong thời gian dài và đang ngày càng
được mở rộng ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau. Thị trường chế phẩm
bổ sung CS và glucosamine rất lớn. Trong một năm (1998-1999) doanh thu
bán lẻ ở Mỹ đạt tới 500 triệu USD. CS có nhiều tác dụng trong điều trị bệnh
lý cũng như trong các lĩnh vực khác.
1.2.3.1. Ứng dụng trong y học

13

 Bệnh khớp (osteoarthritis):
Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy CS đã được ứng dụng rộng rãi
trong điều trị các bệnh lý về xương khớp, đặc biệt là bệnh viêm khớp theo các cơ
chế :
- Giảm đau, kháng viêm, giảm sưng khớp do làm giảm tạo ra tân dịch.
- CS còn được tìm thấy trong hoạt dịch, chất lỏng bao quanh khớp, giúp
bôi trơn khớp, tăng sự mềm mại của khớp.
- Tham gia vào cấu trúc tái tạo sụn khớp.
- Bảo vệ khớp bằng cách ức chế các enzym phá hủy sụn khớp như
collagenase,

elastase,

proteoglycanase,

phospholipase

A2

và

Nacetylglucosamindase; kích thích hoạt động các enzym xúc tác phản ứng tổng hợp
hyaluronic acid giúp khớp hoạt động tốt [3].
Điều trị CS với liều 800 mg/ngày trong 3 tháng với liệu trình 2 đợt một
năm có tác dụng giảm đau và cải thiện chức năng rõ rệt ở bệnh nhân bị viêm khớp.
Các nghiên cứu dược lý tại châu Âu trong khoảng 10 năm gần đây cho
thấy CS được sử dụng điều trị cho bệnh nhân đã không có một phản ứng

phụ nào nghiêm trọng xảy ra [13].
 Bệnh mắt:
CS là chất sinh lý của giác mạc duy trì độ trong suốt cho mắt, tạo độ nhớt
thích hợp và bồi bổ nội mô giác mạc, nuôi dưỡng các tế bào giác mạc mắt, tái
tạo lớp phím nước mắt trước giác mạc, tăng cường độ đàn hồi của thấu kính,
chống tình trạng khô mắt. Mac Rae và cộng sự đã chỉ ra CS có tác dụng
giảm sự tổn thương thấu kính mắt. CS được dùng trong thuốc nhỏ mắt để phòng
ngừa và điều trị các tình trạng khô mắt, mỏi mắt, thoái hoá võng mạc [10]. Ngoài
ra CS còn được sử dụng để điều chế chất nhầy thường được dùng trong phẫu thuật
lấy thủy tinh thể và đặt thủy tinh thể nhân tạo nhằm bảo vệ biểu mô và nội mô
của giác mạc [2]. Công ty TNHH ROHTO-MENTHOLATUM (Việt Nam) sản
xuất thuốc nhỏ mắt New V.Rohto có chứa CS chữa các bệnh: mỏi mắt, xung huyết


14

kết mạc, bệnh mắt do tia cực tím hay các tia sáng khác, nhìn mờ do tiết dịch, mắt
ngứa, viêm mi ...
 Các bệnh khác
CS của sụn cá mập được một số công trình nghiên cứu chứng minh là có
khả năng ức chế một số loại ung thư. Vì từ sụn cá mập tinh chế chứa các chất có
khả năng ức chế sự hình thành các vi mao mạch tân sinh mà các mô ung thư
rất cần để phát triển, nên có thể hạn chế các khối u. CS cùng với mitomycin C
có thể ức chế các tế bào ung thư cổ trướng sarcoma 180.
Sụn cá mập cũng có khả năng tăng cường hệ miễn dịch nên giúp giảm nhẹ
các chứng miễn dịch như thấp khớp, đau nhức xương (phong thấp), vẩy nến,
chàm (eczema), luput đỏ [2].
Nhiều nghiên cứu cho thấy CS có khả năng tăng cường kháng viêm, ức chế
sự tiết các cytokine tiền viêm TNF-α, interleukin-1β, nitric oxid và các gốc oxy
hóa tự do.

1.2.3.2. Các ứng dụng khác
CS có trong thành phần các mỹ phẩm (tác nhân dưỡng tóc, kem dưỡng
và chất giữ ẩm…). CS còn có trong thành phần các chế phẩm chứa gelatin
(thực phẩm, mỹ phẩm, thuốc, nguyên liệu công nghiệp và làm ảnh).
CS còn có thể bổ sung để điều trị và ngăn tắc nghẽn động mạch, có tác
động chống đông máu.
CS có tác động điều khiển tế bào. CS làm tăng sinh một số loại tế bào bạch
cầu, tăng tổng hợp RNA trong tế bào sụn nuôi cấy do đó làm tăng tổng hợp
proteoglycogens và collagens, thúc đẩy sự tích luỹ hyalin trong gan, tuỵ và hạt lympho.
1.3.

PROTEASE

Protease là những enzym xúc tác quá trình thuỷ phân mối liên kết peptit
của các peptit hoặc protein. Trong các protease, protease tiêu hóa được nghiên
cứu sớm hơn cả. Từ thế kỉ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp Reomur đã phát
hiện ra trong dich dạ dày của chim ăn thịt có tác dụng tiêu hoá thịt. Corvisart


15

(1857) đã tách được tripxin từ dịch tụy. Đó là protease đầu tiên nhận được ở
dạng chế phẩm. Sau đó, Bruke đã tách pepxin từ dạ dày chó (1861)… Ngoài ra,
thời bấy giờ người ta cũng đã có những quan sát đầu tiên về protease trong máu.
Các protease ở thực vật được phát hiện muộn hơn và Warts được coi là người đầu
tiên tách được protease ở thực vật vào năm 1879. Đó là papain từ đu đủ (Carica
papaya). Đến nửa đầu thế kỉ 20, người ta phát hiện thêm các peptithydrolase khác
là bromelain ở dứa, catepxin ở mô cơ động vật. Tuy nhiên nguồn protease chủ yếu
là từ các vi sinh vật, đặc biệt từ các vi sinh vật Bacillus, Aspergilus,
Streptomyces…Các vi sinh vật này thường tổng hợp nhiều protease khác nhau.

Cùng với những hiểu biết về protease, việc phân loại và gọi tên các
protease cũng thay đổi qua các thời kỳ. Năm 1960, Harley phân chia protease
thành 4 nhóm theo cơ chế xúc tác, nhưng do có những hiểu biết mới về mặt hoá
học của trung tâm xúc tác ở các nhóm này nên Barrett (1980) đã sửa đổi cho
phù hợp và được uỷ ban danh pháp hoá sinh quốc tế công nhận (1984). Theo
Barrett, tên gọi của 4 nhóm protease này bao gồm tên của acid amin quan
trọng nhất đối với vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động và theo đó chúng
được chia thành 4 nhóm nhỏ Chúng là các enzym thuộc nhóm 3-hydrolases
(thuỷ phân), và phân nhóm 3.4 - peptide hydrolases (thuỷ phân peptide) hay
peptidases, có ký hiệu chung là nhóm EC 3.4. Theo tên của acid amin quan
trọng nhất hay nhóm hoạt chất đóng vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động
mà protease được chia thành 4 nhóm nhỏ: Protease- serine [E.C 3.4.21];
Protease-cysteine (thiol) [E.C 3.4.22]; Protease-aspartic hay endopeptidase
[E.C

3.4.23]

và

Protease

kim

loại

(metallo-protease

hay

metalloendopeptidase) [E.C 3.4.24].

Nhiều protease, đặc biệt protease của động vật được tổng hợp ở dạng
không hoạt động gọi là tiền enzym (zimogen hay proenzym). Các zimogen có
thể chuyển thành dạng hoạt động nhờ quá trình thuỷ phân giới hạn hoặc quá
trình chuyển vị cầu disulfit.
Các protease tham gia vào hầu hết các quá trình quan trọng của hệ


16

thống sống, chúng không chỉ đóng vai trò là chìa khoá trong việc điều hoà quá
trình đổi mới protein trong tế bào mà còn tham gia điều hoà nhiều quá trình
sinh lý khác. Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau
như: công nghiệp, nông nghiệp, y dược và trong nghiên cứu khoa học… Ở nước
ta việc nghiên cứu và sử dụng protease đã được bắt đầu từ những năm 60 và
cũng thu được một số thành tựu đáng kể và tạo nhiều chế phẩm có ý nghĩa
thực tiễn lớn như: sản xuất nước mắm ngắn ngày, bột làm mềm thịt, bột dinh
dưỡng cao cấp.
Các protease chiếm vị trí then chốt về chức năng sinh lý trong cơ thể
sống đồng thời có tiềm năng ứng dụng thương mại rất lớn, chiếm khoảng 60%
thị phần enzym công nghiệp toàn cầu [20]. Nguồn nguyên liệu để thu protease
rất đa dạng và phong phú bao gồm các cơ thể thực vật, động vật và vi sinh vật.
Nhiều protease thực vật như Papain từ nhựa của thân, lá, quả đu đủ
(Carica papaya); Bromelain từ quả, đọt và chồi dứa (Ananas sativa); Phycin từ
nhựa cây cọ (Ficus carica); Keratinase thuỷ phân tóc và len... đã được nghiên
cứu và thu nhận. Papain và Bromelin là những enzym thực vật đã được ứng
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực (dược phẩm, mỹ phẩm, chế biến thực
phẩm...). Việc sản xuất protease thực vật bị hạn chế vì phụ thuộc vào các yếu
tố như diện tích và điều kiện khí hậu để trồng nguyên liệu, hơn nữa quy trình
thu nhận enzym tốn nhiều thời gian.Vì thế cho đến nay chỉ có Papain và
Bromelain còn đang được sản xuất để ứng dụng [20].

Các protease có nguồn gốc động vật cũng đã được nghiên cứu nhiều
như trypsin, chymotrypsin, pepsin và rennin từ tuyến tuỵ, dạ dày..... Tuy nhiên,
nguồn nguyên liệu để thu các enzym này cũng bị hạn chế vì phụ thuộc nhiều
vào sự phát triển của ngành chăn nuôi.
Khối lượng protease thực vật và động vật thu được không có khả năng
đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thực tiễn cho nên các protease từ vi sinh
vật (vi khuẩn, nấm, virut...) đang được quan tâm đặc biệt. Riêng protease vi
khuẩn chiếm trên 40% thị phần enzym toàn cầu. Đặc điểm ưu việt là chúng có


17

tất cả các đặc tính cần thiết cho các ứng dụng về công nghệ sinh học, nguồn
nguyên liệu lại vô cùng lớn, đa dạng và phong phú, hơn nữa quy trình thu
nhận lại ít tốn kém về thời gian và chi phí, hạ được giá thành.... Trong phạm
vi đề tài này chỉ đề cập tới nhóm protease của vi khuẩn là những vi sinh vật
sản sinh nhiều loại protease ngoại bào đang được ứng dụng rộng rãi trong
công nghệ dược phẩm, dệt may, tẩy rửa, thực phẩm và xử lý phế thải.
Đa số các protease thương mại từ vi khuẩn chủ yếu thuộc loại enzym
trung tính và kiềm được sản suất từ chi (giống) Bacillus. Các protease vi khuẩn
trung tính hoạt động trong dải pH hẹp (pH 5-8) và nhiệt độ tương đối thấp,
chúng làm giảm vị đắng (so với protease động vật) cho các sản phẩm thuỷ phân
protein, có ái lực cao với các amino acid kỵ nước nên nó được ưa chuộng cho
công nghệ chế biến thực phẩm và sữa. Một số protease trung tính thuộc
protease chứa kim loại nên đòi hỏi các ion kim loại hoá trị 2 cho hoạt động
của chúng. Các protease vi khuẩn mang tính kiềm có hoạt độ cao ở pH cao
(pH 10) và có đặc thù về phổ cơ chất rộng, nhiệt độ tối ưu khoảng 60oC cho nên
rất thích hợp cho công nghệ giặt tẩy [8].
Ở nước ta việc nghiên cứu và sử dụng protease đã được bắt đầu từ
những năm 60 và cũng thu được một số thành tựu đáng kể tạo nhiều chế phẩm

có ý nghĩa thực tiễn lớn như: thuốc, thực phẩm (sản xuất nước mắm ngắn ngày,
bột làm mềm thịt, bột dinh dưỡng cao cấp), chế biến sữa, dệt may, thức ăn cho
chăn nuôi và thuỷ sản, xử lý môi trường [1] .
1.3.1.

Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme

Quá trình thủy phân protein:
Protein  polypeptide  peptite  acid amine
Quá trình thủy phân bắt đầu thực hiện khi ở điều kiện hoạt động ( nhiệt độ,
pH,…) thích hợp. Enzyme chuyển từ trạng thái không hoạt động sang hoạt động,
tiến hành cắt đứt các liên kết peptide trong cơ chất. Ban đầu sản phẩm tạo thành là
polypeptide sau một thành gian thủy phân sẽ hình thành các peptide ngắn hơn và


18

một số acid amine.
1.3.1.1. Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme. Tốc độ phản ứng
enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản
ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ
phản ứng enzyme sẽ giảm đến mức triệt tiêu.
Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt Q10 để biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ
đến tốc độ phản ứng. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất
được gọi là nhiệt độ tối ưu. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40
– 50oC. Nhiệt độ tối ưu của những enzyme khác nhau là hoàn toàn khác nhau.
Một số enzyme khác có nhiệt độ tối ưu ở 60oC, một số khác lại có nhiệt độ tối ưu
ở 70oC, thậm chí có một số enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis lại hoạt động
mạnh ở 90oC.

Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm.
Khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính.
Ngược lại, ở nhiệt độ 0oC enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng
khi đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu.
Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ
chất, kim loại, pH, các chất bảo vệ. Người ta thường sử dụng nhiệt độ để điều
khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng trong chế biến và bảo quản thực
phẩm.