Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ chủng Micromonospora N°9

BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Nguyễn Tín Trung

-V"

GÓP PHẨN NGHIÊN cứu KHÁNG SINH TỪ
CHỦNG MICROMONOSPORA N°9
(hhoá ỉuận tốt nghiệp dư
ợcs ĩ hhoá 1997 - 2002)

Người hướng dẫn : TS. Cao Văn Thu
Nơi thực hiện

: Bộ môn Công Nghiệp dược
trường Đại học dược Hà Nội

Thời gian thực hiện: 26/ 06/ 2001 - 20/ 05/ 2002

Hà Nội-5 . 2002
#

\Ả


J2Sf

ỷit

ầJựl ớtỏij Ln, mỡnh, tờ tntớụ tt gi ti th y

giỏ ầ7&. @n bỳ eh tụi trtỡti Ut thũi ỡatt ike hiờn ktr
iớiớtt itớt - iti hỡờớ tt v k ớ nớt trỳtr ớới ớớe.
^ti thi ti ettg dein. iTtiỗ'e gut Li eỏm tt
ehón thnh ti ee ilti iỳ ýeờ giỳ htLễe h
ằnụtớ eụti stht de c/itt tỳn thờ cỏc. h tnụtt
phng, ớut eớie nn ó nhiet tinh iỳi ũto
tiu bin
tlrun
Li
chỳ ti hit th ith kho ti


*
Lun fifty .



ằli ,nỡuj 20 thnq 5 nm 2002
linfa aiit
Q lut Q ù/t ầ7r/Iff(/


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỂ.............................................................................. 1
PHẦNI' -TỔNG QUAN........................................................................... 2
1.1.Đạicươngvề Micromonospora................................................................ 2
1.1.1.Đặc

điểm sinh thái của Micromonospora..................................... 2

1.1.2.Đặc điểm hình thái của Micromonospora............................................. 2
1.1.3.Đăc điểm sinh lý của Mỉcromonospora.................................................2
1.1.4.Sựtạo thành sắc tố của Micromonospora.............................................. 3
1.1.5.Kháng sinh được tạo thành từ Mỉcromonospora...................................3
1.2.Cải tạo ,chọn giống vi sinh vật..............................................................4
1.2.1.Đại cương về cải tạo chọn giống vi sinh vật sinh kháng sinh................. 4
1.2.2.Đột biến bằng ánh sáng uv......................................................................6
1.2.3.Phương pháp sàng lọc........................................................................... 7
1.2.4.Chọn giống bậc thang..........................................................................7
1.3.1ên men sinh tổng hợp kháng sinh.......................................................... 7
1.3.1.Lên men bề mặt.......................................................................................8
1.3.2.Lên men chìm......................................................................................... 8
1.4.Chiết tách và tinh chế.................... ..........................................................9
1.4.1.Chiết xuất kháng sinh bằng dung môi hữucơ.......................................10
1.4.2.sắc ký lớp mỏng..................................................................................10
1.4.3.sắc ký cột................................. ............................................................. 10
ỉ.5.Các nghiên cứu về kháng sinh...................................................................11
1.5.1.Vi khuẩn kháng thuốc và ý tưởng mớivề thuốc kháng sinh....................11
1.5.2.Hướng nghiên cứu mới trong tinh chế kháng sinh
nhóm vancomycin.................................................................................12
1.5.3.Actinohivin kháng sinh chống HỈVbằng cách
ngăn cản sự xâm nhập virus vào tế bào.......................................................... 13
1.5.4.Phát

hiện mới về boromycin.......................................................15


1.5.5.Adriamycin một kháng sinh chống ung thư mới.................................. 15
1.5.6.Micromonospora echinospora(jữcc 15831)sản xuất kháng sinh.......16

1.5.7.Kháng

sinh nhóm polyen chống nấm từ cơ chất việt nam.... 16

PHẦN II THựC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ....................................................17
2.1.Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu...........................................17
2.1.1.Nguyên liệu .................................................................................... ....17
2.1.2.Phương pháp nghiên cứu.......................................................................18
2.2.Kết

quả và nhận xét........................................................................24

2.2.1.Lựa chọn biến chủng trongnghiên cứu.................................................. 24
2.2.2.Kết quả sàng lọc chọn giống................................................................ 25
2.2.3.Kết quả cải tạo giống............................................................................29
2.2.4.Kết quả chiết xuất và tinh chế.............................................................. 34

PHẦN m KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT................................................... 38
3.1.Kết luận...................................................................................................38
3.2.Ý kiến đề xuất.......................................................................................38


ĐẶT VẤN ĐỂ
Ngày nay một số thuốc kháng sinh thông dụng hầu như đã trở nên vô
hiệu, vi khuẩn kháng thuốc phát triển phổ biến trên toàn thế giới với tốc độ
nhanh chóng. Chính vì vậy, bên cạnh việc sử dụng kháng sinh hợp lý hơn cho
người lẫn súc vật thì việc tìm tòi những thuốc kháng sinh mới là công việc
nghiên cứu cần thiết.
Những năm qua tại Bộ môn Công nghiệp Đại học dược Hà Nội công
trình nghiên cưú khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ một số chủng

Mỉcromonospora đã đạt kết quả nhất định, cho thấy khả nâng tìm được một số
chất kháng sinh mới có giá trị trong y học là điều có thể và với hy vọng ngày
càng hiện thực hơn.
Để góp phần thực hiện công trình này, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu đề
tài “Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ chủng Micromonospora N°9” với
những mục tiêu cụ thể sau:
- Tiếp tục nghiên cứu cải tạo giống bằng đột biến kết hợp với sàng lọc
nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh của chủng
Micromonospora N°9.
- Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh trên qui mô phòng thí
nghiệm với các biến chủng đã được tuyển chọn.
- Tìm hiểu sơ bộ về thành phần chất kháng sinh của Micromonospora
N°9 và tiếp tục hoàn thiện qui trình chiết suất, tinh chế trên qui mô phòng thí
nghiệm.

1


PHẦN THỨ I. TỔNG QUAN
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỂ MICROMONOSPORA [ 3, 7,11]
1.1.1. Đặc điểm sinh thái của Micromonospora
Micromonospora là một chi thuộc lớp xạ khuẩn Actinomycetes phân bố
khá phổ biến trong tự nhiên như đất, nước, bùn, cát... Một số nhà vi sinh vật
học đã đưa ra những nhận định sau: Zususa cho rằng trong đất miền núi tỷ lệ
Micromonospora là 2,6%, trong đất trồng lúa là 14%, trong đất than bùn là
26% - 27% so với các Actinomycetes khác. Theo Tibelar và Vruggih từ mẫu
đất ruộng sâu khi phân lập chỉ có khuẩn lạc Micromonospora.
1.1.2. Đặc điểm hình thái của Micromonospora
Micromonospora hầu như chỉ có khuẩn ty cơ chất phân nhánh, không
hình thành khuẩn ty khí sinh. Đường kính khuẩn ty từ 0,4-0,8 |im . Khi chưa

hình thành bào tử bề mặt khuẩn lạc có màu vàng sáng đến da cam ,nâu đỏ
tuỳ thuộc môi trường và điều kiện nuôi cấy. ở giai đoạn bào tử xuất hiện bề
mặt khuẩn lạc trở nên sẫm mầu: nâu tối đến sẫm đen. Bào tử xuất hiện cả
trong nuôi cấy chìm và trên môi trường thạch đặc. Bào tử hình tròn oval, hoặc
các dạng khác, có thể nằm trên cuống sinh bào tử hoặc không có cuống.
Cuống bào tử có hai dạng chính: đơn độc (monopodial) và chùm (sympodial).
Bề mặt bào tử có thể nhẵn ,có gai hay xù xì.
1.1.3. Đặc điểm sinh lý của Mỉcromonospora
Micromonospora có vai trò vô cơ hoá nguyên liệu hữu cơ trong quá
trình mùn hoá. Ngoài ra, Micromonospora còn có thể phân huỷ cellulose,
peptid, kitin, xylan, lignin, casein, tinh bột.

2


Khoảng 6 - 45°c là nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của
Micromonospora, và 20 - 40°c là nhiệt độ tối ưu. Tất cả các loài
Micromonospora đều không phát triển được ở nhiệt độ trên 50°c.
Bào tử Micromonospora khá bền với dung môi hữu cơ và nhiệt. Bào tử
tồn tại trong pH = 6 - 8 nhưng khi quá acid thì thường bị mẫn cảm.
Micromonospora không ưa acid, là vi khuẩn Gram (+) có thành tế bào kiểu II
với thành phần chính là acid meso - diaminopimelic và glycin. Thành phần
đường là xylose, arabinose còn glucose, galactose, maltose thì khác nhau đối
với mỗi loài.
1.1.4. Sự tạo thành sắc tố của Mỉcromonospora
Micromonospora tạo ra sắc tố cơ chất màu da cam. Ngoài ra, còn tạo
sắc tố hoà tan với những màu sắc khác nhau trên các môi trường nuôi cấy
khác nhau ở những loài khác nhau. Ví dụ như sắc tố hoà tan màu vàng là đặc
trưng của loài Micromonospora chalcea các sắc tố vàng này khuếch tán khắp
nơi trên thạch tạo ra sự phát dạ quang vàng mạnh khi chiếu tia tử ngoại.

Micromonospora fusca được đặc trưng bằng các sắc tố khuếch tán màu nâu
sẫm, Micromonospora purpurea và Micromonospora echinospora tạo sắc tố
bám trên hệ sợi màu nâu sẫm.
1.1.5. Kháng sinh được tạo thành từ Micromonospora
Một số kháng sinh quan trọng tạo ra từ Micromonospora được phát
hiện và nghiên cứu (nhiều chất được ứng dụng trong y học) gồm:
-

Kháng sinh nhóm aminosid:
+ Gentamicin sản xuất từ Micromonospora echinospo ra và

purpurea (Weintein và cộng sự 1963, Lucdemen và Brodsky 1964).

3


*+ Sisomicin sản xuất M.inyoenis (Weinstein và cộng sự, 1973)
+ Neomycin - B sản xuất từ M. sp 69 - 683 (Wagman và cộng sự,
1973)
+ Fortimicin A và B sản xuất từ M. olivoasterospopra (Naro và
cộng sự 1977)
- Kháng sinh nhóm Macrolid:
+ Megalomycin do M. megalomycea (Weinstein và cộng sự,
1969)
+ Rososamicin do M. rosaria ( Wagman và cộng sự, 1972)
+ Erythromycin B do M.sp 1225 (Harquicz 1976).
- Kháng sinh nhóm Polipepid:
+ Chalcidin do M. chalcea H85 ( Gause và cộng sự 1970)
- Kháng sinh nhóm ansamycin:
+ Halomycin do M. halophytica (Weinstein và cộng sự 1968,

Lucdeman và cộng sự 1970)
+ Rifamicin do M. ellipsospora
1.2. CẢI TẠO CHỌN GIỐNG VI SINH VẬT [ 1,2,3,7,11 ]
1.2.1. Đại cương về cải tạo chọn giống vi sinh vật sinh kháng sinh
Các chủng vi sinh vật được phân lập từ tự nhiên, khi mới được phân lập
gọi là các chủng nguyên thủy hay các chủng hoang dại. Các chủng này chưa


đáp ứng được đầy đủ các yêu cầu dùng cho sản xuất công nghiệp. Thông
thường, chúng được nghiên cứu tuyển chọn cải tạo giống để xác định các đặc
tính sinh lý, sinh hoá và các điều kiện thích hợp để sao cho có hoạt tính cao và
thực hiện được một quá trình lên men có tính kinh tế, hiệu quả.
Công việc chọn giống có thể được tiến hành dựa vào hai cơ chế làm
thay đổi thông tin di truyền :
- Một cơ chế liên quan đến sự phát sinh đột biến, ứng dụng tiến hành
chọn giống bằng đột biến gây tạo kết hợp với sàng lọc.
- Cơ chế liên quan đến tái tổ hợp di truyền ứng dụng tiến hành chọn
giống bằng phương pháp lai với mục đích tổ hợp những tính chất quí giá từ bố
mẹ vào con cái trên cơ sở tái tổ hợp lại hệ gen.
Nếu sử dụng phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên đột biến tự phát hiệu
quả thường rất thấp vì tần số đột biến này không cao ( 10'8- 10'10). Chỉ khi áp
dụng phương pháp đột biến gây tạo mới thực sự cho hiệu quả trong nghiên cứu
và sản xuất kháng sinh.
- Đột biến tự phát: là những thể đột biến phát sinh không có sự can
thiệp của các tác nhân đột biến. Một trong những nguyên nhân gây nên đột
biến là do sự ngẫu nhiên khi liên kết các nucleotil trong quá trình sao chép.
- Đột biến gây tạo: là những thể đột biến được tạo ra bởi các tác nhân
đột biến với mục đích làm nâng cao tần suất xuất hiện đột biến. Tác nhân đột
biến thuộc nhiều loại khác nhau:
+ Tác nhân vật lý : tia X, tia a, ánh sáng uv...

+Tác nhân hoá học : N-musta, ethylenimin, nitrozoguanidin(NG),
HN0 2.

5


+ Tác nhân sinh học : đột biến do hiện tượng thiếu các basenitơ hay do
tác động của các gen gày đột biến.
1.2.2. Đột biến bằng ánh sáng u y
Ánh sáng u v là bức xạ nhìn thấy, có bước sóng từ 136 - 3900A° khả
năng đâm xuyên kém nhưng với vi sinh vật có kích thước nhỏ (0,3 - 3 |im) thì
có thể đâm xuyên tới nhân vì vậy ánh sáng u v được dùng phổ biến trong di
truyền chọn giống vi sinh vật. Ánh sáng u v tác dụng lên ADN và mạnh nhất
ở bước sóng 260nm dẫn đến dime hoá thymin. ở đây hai thymin gần nhau
được liên kết cộng hoá trị ở các số 5 và số 6. Hậu quả là sao chép bị sai lệch vì
ADN - polymerase dễ lắp một nucleoid không đúng vào vị trí trên. Do tác
dụng của ánh sáng u v trên ADN cũng xuất hiện một dimepyrimidin khác gọi
là quang sản phẩm 6-4. ở đây c 6 của pyrimidin 5’ (thymin hoặc cytozin) được
liên kết với c 4 của pyrimidin 3’ (thường là cytozin). Các sản phẩm này là
nguyên nhân chủ yếu của đột biến gây nên bởi tia u v .
Một số yếu tố sau đây ảnh hưởng đến hiệu quả gây chết và tần số phát
sinh đột biến khi xử lý vi sinh vật với ánh sáng ƯV:
- Liều lượng chiếu: Được đặc trưng bởi thời gian chiếu, khoảng cách
chiếu và độ pha loãng của bào tử có ảnh hưởng tới chiều hướng của đột biến
âm hay dương, ở liều lượng chiếu có độ sống sót từ 0,1-1% thường xuất hiện
đột biến dương.
- Ánh sáng thường: Hiện tượng “quang phục hoạt” đó là hiện tượng làm
mất tác dụng đột biến của ánh sáng u v do ánh sáng thường. Khi dịch bào tử
đã chiếu ánh sáng ƯV được đem để ra nơi có ánh sáng thường thì độ sống sót
của bào tử sẽ tăng lên so với khi để trong bóng tối.

6


- Các yếu tố khác: pH, thành phần môi trường, trạng thái sinh lý của
bào tử đem đột biến cũng ảnh hưởng đến hiệu quả chiếu ánh sáng u v .
1.2.3. Phương pháp sàng lọc
Sử dụng phương pháp “sàng lọc” đem lại hiệu quả trong việc phân lập
các chủng thuần khiết, xác định được nhanh chóng tính kháng khuẩn, kháng
nấm, virus hoặc kháng ung thư của một chủng được phân lập. Phương pháp
này thường dùng hai kiểu kỹ thuật:
- Lấy một mẫu thử để xác định khảo sát tác dụng với nhiều chủng vi
sinh vật kiểm định.
- Lấy nhiều mẫu thử để khảo sát tác dụng với cùng một chủng vi sinh
vật kiểm định.
1.2.4. Chọn giống bậc thang
Phương pháp này chọn giống bằng sử dụng các tác nhân đột biến kết
hợp với sàng lọc. Trong thực tế để nâng cao hoạt tính của các chủng thường
được thực hiện bằng cách tích luỹ các tăng trưởng nhỏ qua từng bậc chọn lọc.
1.3. LÊN MEN SINH TổNG HỢP KHÁNG SINH [ 3,7,10,11,13 ]
Với các chủng vi sinh vật mới phát hiện có khả năng sinh tổng hợp
kháng sinh thì việc nghiên cứu lên men trong phòng thí nghiện là rất quan
trọng bởi ngoài mục đích khảo sát các điều kiện nuôi câý thích hợp: pH, nhiệt
độ, thành phần môi trường, ôxy hoà tan, tiền chất, thời gian nuôi cấy... thì đây
còn là bước bắt buộc để có thể tiến hành những nghiên cứu tiếp theo: chiết
xuất - tinh chế, xác định tính chất lý, hoá, các đặc trưng tiền lâm sàng... của
chất kháng sinh đó .

7

Đối với các biến chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh với hiệu
suất cao thì việc nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp trở thành rất cần
thiết. Nếu đạt được các điều kiện tối ưu hiệu suất của chủng có thể tâng từ 2 31ần .
1.3.1. Lên men bề mặt
Theo phương pháp này giống vi sinh vật hiếu khí sau khi gieo cấy sẽ
phát triển trên bề mặt và dần dần lan xuống dưới theo các kẽ hở giữa các cấu
tử thành phần môi trường. Môi trường là rắn hay lỏng, bề mặt đủ rộng và lớp
môi trường dày 3 - 5cm, nuôi ở nhiệt độ thích hợp trong buồng nuôi cấy có độ
ẩm không khí là 90%.
Ưu điểm của phương pháp này là: đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư ban
đầu thấp. Nhược điểm là: tốn nhiều diện tích mặt bằng, khó cơ khí hoá, chi phí
nhân công cho một đơn vị sản phẩm cao. Do những nhược điểm này ngày nay
công nghiệp sản xuất kháng sinh không còn áp dụng lên men bề mặt mà chỉ
áp dụng cho nghiên cứu cải tạo giống trong phòng thí nghiệm.
1.3.2. Lên men chìm
Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng và phát triển trong toàn
bộ môi trường. Giống vi sinh vật dùng trong lên men phải là các tế bào sinh
dưỡng đang ở pha luỹ thừa có sức phát triển mạnh và khả nãng đồng hoá vật
chất cao. Vì vậy trước khi lên men phải có giai đoạn tạo giống lên men qua
các cấp nhân giống khác nhau (giống cấp I, cấp II, cấp III). Tỷ lệ giống so với
môi trường lên men thường dùng là 1-10%.
Thời gian lên men tuỳ thuộc vào khoảng thời gian sản phẩm được tạo ra
như vậy sẽ có sự khác nhau đối với từng chủng vi sinh vật dùng sản xuất.

8


Micromonospora N°9 theo những nghiên cứu trước đây thì thời gian tối ưu ở
đó hoạt lực kháng sinh mạnh nhất là 120 giờ.

Phương pháp này có một số ưu điểm : sử dụng triệt để môi trường dinh
dưỡng, hiệu suất lên men cao, tiết kiệm mặt bằng sản xuất, các thiết bị dề cơ
giới và tự động hoá. Song phương pháp cũng có một số nhược điểm : đòi hỏi
trang bị kỹ thuật cao, có nguy cơ bị nhiễm trùng toàn bộ. Vì vậy những thiết
bị lên men chìm cần chế tạo đặc biệt hợp quy cách, chịu áp lực cao, đảm bảo
kín và làm việc với điều kiện vô trùng tuyệt đối. Hệ thống lọc khí nén phức tạp
và dễ gây nhiễm cho môi trường nuôi cấy.
Lên men chìm được chia thành: lên men gián đoạn, lên men liên tục,
lên men bán liên tục... Lên men gián đoạn là lên men không có bất cứ một tác
động bổ xung nào vào hệ thống ngoại trừ việc thông khí, dùng đệm điều chỉnh
pH, chất phá b ọ t. Vi sinh vật sẽ phát triển qua 4 giai đoạn gọi là các pha: pha
tiềm tàng, pha log, pha dừng và pha suy tàn. Trong sản xuất, việc kết thúc lên
men ở pha nào phụ thuộc vào việc sinh tổng hợp hoạt chất bị dừng ở pha nào
trong chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật.
1.4. CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ [ 6,8,11,13 ]
Kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp. Tuỳ theo đặc tính của loài mà
sản phẩm thứ cấp đó được tiết vào môi trường nuôi cấy (penicillin,
streptomycin.v.v...) hay giữ lại trong tế bào (gramixidin, nystatin...) để thu lấy
các hoạt chất có độ tinh khiết cao cần tìm phương pháp chiết thích hợp. Có thể
sử dụng phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ (penicillin) hoặc sử dụng
phương kết tủa để chiết xuất, tinh chế kháng sinh (các tetraxiclin w...), hoặc
bằng nhựa trao đổi ion (kháng sinh nhóm aminoglycosid, polymyxin w...).
Đối với phương pháp kết tủa đòi hỏi phải tìm được chất phụ gia thích hợp cho
quá trình kết tủa (các amoni bậc 4), còn đối vói phương pháp trao đổi ion cần

9


các cationit có dung lượng trao đổi lớn, dễ phản hấp phụ để không phá huỷ
hoạt chất. Kỹ thuật chiết xuất và tinh chế kháng sinh thích hợp làm cho sản

phẩm đạt chất lượng cao bảo quản được lâu hơn đồng thời còn làm tăng tỷ lệ
thu hồi và hạ giá thành sản phẩm.
Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh thường áp dụng một số phương
pháp chiết tách, tinh chế như : lọc, chiết, hấp phụ và sắc ký lớp mỏng, sắc ký
cột...
1.4.1. Chiết xuất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ
Nguyên tắc cơ bản của nguyên tắc này là dựa vào sự phân bố của chất
kháng sinh giữa hai pha không đổng tan với nhau gồm dung môi chiết với
dịch lọc dịch lên men hay sinh khối để tách lấy riêng chất kháng sinh (có thể
là một chất hay một nhóm chất).
Với kháng sinh ngoại bào tồn tại trong dịch lên men ta ứng dụng
phương pháp chiết lỏng - lỏng với một số phương pháp chiết: chiết đơn, chiết
lặp, chiết ngược dòng...
1.4.2. Sắc ký lớp mỏng
Đây là phương pháp rất quan trọng trong quá trình tinh chế và chiết tách
sản phẩm. Mặc dù không trực tiếp là khâu tinh chế sản phẩm nhưng với kết
quả của sắc ký lớp mỏng sẽ cho ta những bước khảo sát đầu tiên, làm cơ sở
cho giai đoạn tinh chế sản phẩm sau này.
Nhược điểm của phương pháp chính là đòi hỏi người thực hiện cần có
sự kiên trì khéo léo, lựa chọn được hệ dung môi thích hợp tách tốt sản phẩm .
1.4.3. Sắc ký cột

10


về mặt lý thuyết, chủng loại các pha tĩnh, pha động cũng như ứng dụng
sắc ký lớp mỏng và sấc ký cột khá giống nhau. Với những kết quả khả quan
của sắc ký lớp mỏng, chúng ta có thể tách riêng từng thành phần hỗn hợp bằng
sắc ký cột.
Ngoài sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột ra, còn có một số phương pháp

phổ biến như: trao đổi ion, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) w...
1.5. CÁC NGHIÊN CỨU VỂ KHÁNG SINH
1.5.1. Vi khuẩn kháng thuốc và ý tưởng mới về kháng sinh [4]
Những năm vừa qua, trên phạm vi thế giới, người ta thấy tái xuất hiện
các bệnh nhiễm trùng, trong đó có bệnh tả, sốt rét, sốt rét vàng, bạch hầu.
Thêm vào đó lao và HIV như một “cặp bài trùng” đang hoành hành và việc
khống chế bệnh lao ở những người bị nhiễm HIV rất khó khăn. Việc sử dụng
thường xuyên và không hợp lý thuốc kháng sinh, cả cho người lẫn súc vật, là
một trong số các yếu tố chủ yếu làm tăng khả năng kháng thuốc. Các thuốc
kháng sinh trở thành nạn nhân của chính sự thành công của nó. Có khoảng
40% Streptocoques gây ra bệnh viêm phổi đã kháng lại thuốc penicillin. Một
thực tại đáng lo ngại là Staphylococcus aureus hiện đã kháng lai thuốc kháng
sinh, trừ vancomycin . Theo một số nhà khoa học, nếu như sự kháng thuốc này
lan sang các vi khuẩn khác thì người ta sợ sự tái xuất hiện các bệnh “đã rơi
vào quên lãng”.
Việc tìm kiếm những thuốc kháng sinh mới là một trong những việc
làm cần thiết. Hiện có khoảng 160 thuốc kháng sinh có trên thị trường và
nhiều thuốc kháng sinh đang được triển khai. Theo các nhà khoa học thì
oxazolidones là các dẫn chất mói đầy hứa hẹn. Cấu trúc hoá học của nó khác
với cấu trúc thuốc kháng sinh hiện nay. Nó phát huy tác dụng bằng cách ức

11


chế việc tổng hợp protid ở giai đoạn rất sớm . Một loạt các tác nhàn mới gốc
peptid và steroid tìm thấy ở cá mập và ếch đã thu hút sự chú ý của Magainin
Inc...một công ty công nghệ sinh học Hoa Kỳ. Một tác nhân chống vi khuẩn
everninomicin, tách ra từ vi khuẩn đất, tỏ ra rất hứa hẹn. Cubist
Pharmaceuticals kết hợp việc chọn lọc các phân tử vi khuẩn với việc mô hình
hoá phân tử để cho ra một chất ngăn chặn sự hợp thành (synthetase) vi khuẩn .

Các nhà khoa học khác lại tìm cách thay đổi cấu trúc hoá học của các hợp chất
hiện nay nhằm lẩn tránh cơ chế kháng thuốc. Đó là cách tiếp cận của PhonePoulenc với streptogramin. Còn Elililly thì dùng “vancomycin” mới chất này,
vói mã hiệu LY 333328 là glycopeptid bán tổng hợp, phát huy tác dụng bằng
cách cản trở việc tạo nên vách vi khuẩn, nó có tác dụng với cả các vi khuẩn
kháng được vancomycin. Người ta đang tiến hành các công trình nghiên cứu
để tìm ra một loại thuốc ngăn chặn sự kháng thuốc isoniazid của trực khuẩn
lao (Mycobacterium tuberculosis).
1.5.2. Hướng nghiên cứu mới trong tinh chế kháng sinh nhóm
Vancomycin [ 15 ]
Trong những năm trở lại đây, trước tình hình vi khuẩn đang kháng
thuốc ngày một nhiều thì vancomycin được xem như một nhóm kháng sinh rất
quan trọng trên lâm sàng , đặc biệt trong điều trị với Staphylococus aureus.
Do đó việc nghiên cứu nhóm kháng sinh này đang được các nhà khoa
học trên thế giới rất quan tâm. Trong một công bố gần đây, các nhà khoa học
Trung Quốc đã đưa ra một phương pháp tinh chế kháng sinh nhóm
vancomycin độc đáo. Nguyên tắc của phương pháp dựa trên chính cơ chế tác
dụng của vancomycin :kháng sinh nhóm vancomycin diệt vi khuẩn Gram (+)
bằng cách liên kết với vách tế bào peptidoglycan của vi khuẩn ở c cuối cùng
trong chuỗi D - Ala - D - Ala. Dựa trên cơ sở đó, các chuỗi hấp phụ nhóm

12


kháng sinh vancomycin được tạo nên bởi các đoạn giống như peptidoglycan D
- Ala - D - Ala, succinyi - D - Ala và - succinyl - Gly kết nối với một polymer
V

(N, N - dimethylacrylamide). Polymer này trước đó đã được tổng hợp từ các
acid amin. về phương pháp này, Corti và Cassani cũng đã từng tiến hành, họ
sử dụng CH - sepharose 4B hoạt hoá để cố định D - Ala - D - Ala trong tinh

chế teicoplanin. Hay như Folena - Wasserman và cộng sự sử dụng polymer tự
nhiên là N - hydroxysuccinimide. Tuy nhiên, sử dụng polyme tự nhiên giá
thành rất đắt, đồng thời giá thành chất tương tự vách tế bào cũng đắt đó là hạn
chế của phương pháp. Đối cới các nhà khoa học Trung Quốc, họ đã khéo léo
tổng hợp polyme liên kết bằng các acid amin sau đó mới gắn với đoạn chất
tương tự vách tế bào để làm chất hấp phụ ái lực. Việc làm này giúp họ hạ giá
thành của phương pháp, hơn nữa chất hấp phụ đạt được sự ổn định cả về mặt
sinh học và hoá học.
Sau khi kháng sinh được hấp phụ, họ tiến hành phản hấp phụ bằng một
số hệ phản hấp phụ như: NaCl 0,5 M; nước - acetonitrile (7:3;v/v)(2); 0,4M
NH^acetonitrile (5:5,v/v)(3), Na2C03 0,4M/acetonitrile (7:3;v/v)(4). Đối với hệ
thân nước (ionic)(1) làm giảm khả năng phản hấp phụ, đối với hệ sơ nước (2)
cho phần trăm phản hấp phụ thấp, hệ kết hợp (3), (4) cho phần trăm phản hấp
phụ cao hơn, trong đó nếu sử dụng dung dịch điện ly mạnh Na2C03 thì phần
trăm phản hấp phụ cao hơn sử dụng điện ly yếu là NH3.
1.5.3. Actinohỉvin kháng sinh chống HIV bằng cách ngăn cản sự xâm
nhập virus vào tế bào [ 16 ]
Vài năm trước, giống WK-3419 và FO-2338 đã được tìm thấy sản xuất
ra hai hợp chất mới là: Chloropeptin và isochormophilone I và II. Cả hai hợp
chất mới này đều có tác dụng chống HIV dựa trên khả năng ức chế gp 120 CD4. Gần đây, theo một nghiên cứu mới nhất, Viện Kitasato - Nhật Bản công

13


bố một chất mới với tên gọi actinohivin. Actinohivin được sinh tổng hợp bởi
chủng Actinomyces K97-0003.Nhóm nghiên cứu đã tiến hành nhiều thử
nghiệm để kiểm tra hoạt tính sinh học và cơ chế tác dụng của actinohivin. Họ
đã thử nghiệm sự liên kết của actindhivin với các loại protein vỏ ngoài HIV-1
bao gồm cả phần không đường và gpl30 của SIV . Kết qủa ,actinofũvin đã liên
kết với mọi glycoprotein ngoại trừ phần không đường.Kết quả này chỉ ra rằng,

actinohivin liên kết với saccharide của protein .
Tiếp đến, họ kiểm tra ái lực của actinohivin với gpl20. Actinohivin
được cho vào 96 vi giếng đã gắn sẵn gpl20 tái tổ hợp, CD4 tái tổ hợp hoặc
BSA, nhận thấy actinohivin liên kết với gp 120 tái tổ hợp nhưng không liên kết
với CD4 và BSA. Họ cũng đã kiểm tra ảnh hưởng của một vài đường và
protein tới sự liên kết giữa actinohivin và gpl20 . Chỉ duy nhất men malt là ức
chế sự liên kết này còn manóse hay methy-a manopyranosid đều không ảnh
hưởng .Đối với gpl20 , phần carbonhydrat chiếm xấp xỉ 50% tổng trọng
lượng phân tử. Phần carbonhy drat của gp 120 bao gồm 24 cầu Noligosaccaride có 11 manóse cao và 13 kiểu phức hợp. Sự kết hợp đặc hiệu của
actinohivin và 13 kiểu phức hợp. Sự kết hợp đặc hiệu của actinohivin với các
glycoprotein có cầu N đã được xác định bởi phương pháp ELISA. Như vậy,
actinohivin liên kết với một vài glycoprotein có chứa manóse tỷ lệ cao kiểu
oligosaccaride . Phát hiện này đã mở ra một đích mới cho liệu pháp và thuốc
ngăn ngừa HIV/ADS/gần đây, M. Boyd và cộng sự cũng đã đưa ra một chất có
tác dụng theo cơ chế tương tự là cyanovirin - N, nó có chứa 101 aminoacid.
Hiện naỵ, theo số liệu điều tra mỗi ngày có hơn 15000 trường hợp nhiềvnHIV,
95% ở những nước phất triển. Việc tìm ra actinohivin và cyanovirin - N hy
vọng mở ra một bước tiến mới trong việc sử dụng những vi khuẩn điển hình
hữu ích ngăn chặn lây nhiễm HIV.
1.5.4. Phát hiện mới về Boromycin [ 17 ]

14


Trong đợt sàng lọc khả năng chống HIV của hệ thống vi sinh vật, với
hơn 1000 mảu dịch chiết butanol của các dịch lên men được kiểm tra, các nhà
khoa học Nhật Bản đã tìm thấy Streptomyces. sp A 3376 sản xuất một chất có
tác dụng chống HIV gọi là TMC - 25. TMC - 2 5 đã được xác định nghiên cứu
về cấu trúc và .

cho thấy TMC - 25 giống như boromycin, một kháng sinh

polyether -macrolid. Boromycin đã từng được biết đến như một kháng sinh
chống virus, nấm. Phát hiện mới về khả năng kháng HIV mở ra một hướng sử
dụng mới đối với boromycin. về cơ chế chống HIV của boromycin, họ cho
rằng kháng sinh này tham gia ngăn cản giai đoạn chín trong kỳ phát triển của
HIV.
1.5.5 Adriamycin một kháng sinh chống ung thư mới [18 ]
Streptomyces peucetius var caesius xuất phát từ chủng S.peucetius, là
nhóm vi sinh vật sản sinh daunomycin. Daunomycin là một kháng sinh điều
trị ung thư đã được chứng minh có hiệu quả tốt trên lâm sàng đặc biệt trong
điều trị leucemi ở trẻ em. Bằng việc đột biến với tác nhân N - nitroso - Nmethyluretan, đã thu được biến chủng mới dẫn đến sự khác nhau trong qua
trình hình thành hệ sợi sinh trưởng, đặc biệt, đó là có sự tích luỹ adriamycin
kháng sinh có cấu trúc khác với daunomycin, ở giai đoạn này. Các tác giả đã
nghiên cứu điều kiện lên men điển hình để tạo adriamycin . Speucetius var.
caesius được phát triển trong 10 ngày ở 28°c . Đến giai đoạn phát triển hệ sợi
xuất hiện màu đỏ . Lấy biến chủng giai đoạn này làm giống để nhân giống
cho bình lên men 8001. Giống được nuôi cấy cho phát triển 48 giờ (501/801)
rồi cấy sang bình lên men 8001 chứa 5001 môi trường lên men và lên men
120giờ. Adriamycin được phân lập có cấu trúc 14 hydroxy daunomycin, tác
dụng ức chế ung thư biểu mô, saccom và ung thư tuỷ ác tính . Hiện nay, liệu
pháp sử dụng adriamycin điều trị phổ biến hơn daunomycin.

15


1.5.6 .Micromonospora echinospora (ATCC15331) sản xuất kháng sinh
[ 19]
Ngược lại với Strytomyces, chi Micromonospora ít được quan tâm
nghiên cứu mặc dù tầm quan trọng công nghiệp của nó không phải nhỏ.

Gemtamycin là một kháng sinh quan trọng của nhóm aminoglycosid được sản
xuất từ chi Micromonospora. Gần đây, hợp chất mới giữa megalomicin và
calicheamicin đã được phân lập từ loài Micromonospora và nhận thấy có tác
dụng chống ung thư, virus, ký sinh trùng. Qua các theo dõi trong suốt quá
trình phát triển với Micromonospora echinospora, người ta nhận thấy chủng
này cũng có khả năng sinh gentamycin. Sản phẩm kháng sinh xuất hiện sau
72giờ đạt nồng độ khoảng 0,032|ig/ml và lập tức giảm nhanh tới 0 Ịig/ml sau
144giờ. Theo các nhà khoa học, điều này cho thấy sự phân biệt rõ ràng giữa
pha sinh trưởng và quá trình tạo bào tử, hai quá trình này hoàn toàn được điều
khiển biệt lập. Nó đưa ra thực tế rằng, sự sản xuất kháng sinh đòi hỏi phải có
quá trình hình thành hệ sợi vi sinh vật và quá trình tạo bào tử sẽ chấm dứt quá
trình sản xuất kháng sinh.
1.5.7 Kháng sinh nhóm polyen chống nấm từ cơ chất Việt Nam [5 ]
Từ 125 mẩíi đất của tỉnh Quảng Nam và Thành phố Đà Nẵng, Đỗ Thu
Hà và các cộng sự đã phân lập được 58% chủng xạ chuẩn chi Streptomyces.
Nhóm nghiên cứu đã sơ bộ tìm thấy 90 chủng hoạt tính kháng sinh nhóm
polyen chống nấm chiếm tỷ lệ 15,33%, trong đó có nhiều chủng có khả năng
sinh các chất kháng sinh có thể có giá trị còn ít được thông báo trên thế giới
và ở Việt Nam . Đây chính là nguồn gen quí hiếm để có thể chọn lựa những
chủng có hoạt tính kháng sinh cao, hoạt phổ rộng, ứng đụng trong sản xuất
dịch kháng sinh thô dùng trong trổng trọt và chăn nuôi tại khu vực Quảng
Nam-Đà Nẵng rất tốt.

16


PHẦN II THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
♦ Giống xạ khuẩn:

Chủng Micromonospora N °9 được phân lập từ cơ chất ở Việt Nam có
độ ổn định sinh học cao, có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đã qua một số
lần đột biến cải tạo giống do phòng thí nghiệm vi sinh kháng sinh bộ môn
Công nghiệp dược và Tổ môn Vi nấm kháng sinh trường Đại học Dược Hà
Nội cung cấp.
♦ Chủng vi sinh vật kiểm định:
Hai chủng vi sinh vật có độ mẫn cảm cao với kháng sinh từ
Micromonospora N °9 được dùng làm vi sinh vật kiểm định là: Bacilus
pumilus ATCC 1G241 (G+) và Escherichia colỉ ATCC 25922 (G -).
♦ Các môi trường đã sử dụng:
- Môi trường Gauze 1 (MTl):tinh bột 20g;K2HP04 0,5g;MnS04.7H20
0,5g; NaCl 0,5g; KN03 lg; FeS04.7H20 lOmg; thạch 18g; nướcmáy

vđ

1000ml pH 7,0-7,2, tiệt trùng ở latt/30 phút.
- Môi trường Gauze 1 lỏng (MT2): tinh bột 20g; K2HPO4 0,5g;
MgS04.7H20 0,5g; NaCl 0,5g; KN03 lg; FeS04.7H20 lOmg; nước máy vđ
1000ml pH 7,0-7,2 tiệt trùng ở latt/30 phút.
- Môi trường lên men tối ưu II (MT4): tinh bột54,Og; K2HPO42,8g;
MgS04.7H20 0,5g; NaCl 0,5g; KN03 2,0g; FeS04.7H20 lOmg; nước máy vđ
1000ml pH 7,0-7,2 tiệt trùng ở latt/30 phút.
- Môi trường thạchthường (MT5): pepton 5g; NaCl 5g; cao thịt 3g; thạch
18g; nước máy vđ 1000ml pH 7,0-7,2 tiệt trùng ở 0,9att/30 phút.

17


- Môi trường canh thang (MT6): pepton 5g; NaCl 5g; cao thịt 3g; nước
máy vđ tiệt trùng ở 0,9 att/30 phút.

♦Các dung môi

đã sử dụng:

- Dung môi chết: Cloform (d = 1,475-1,471; t°s= 60-62°C).
Dung môi khác: Dimethylformamid, ethylacetat, rv-butanol, ethanol,
methanol, ìvhexan, aceton.
♦ Tác nhân đột biến: ánh sáng u v với nguồn phát là đèn điện tử ngoại
Toshiba.
♦ Nguyên liệu dùng cho sắc ký:
- Bản mỏng sắc ký tráng sẵn Sillicagel 60F254 (Merck).
- Sillicagel, Kieselgel (0,05-0,2mm) Merck AG.Germany nhồi cột sắc
ký.
♦ Một số dụng cụ thiết bị đã sử dụng:
Máy lắc tròn 150-300 vòng/phút (Việt Nam); tủ cấy vô trùng Sanyo
clean bench; kính hiển vi quang học A.Kruss optronic Hamburg Germany;
cân phân tích Sartorius; nồi hấp Hirayama HL 3030eJapan; tủ ấm Memert
Germany; tủ sấy Memert Germany; máy đo pH Mettler Toledo MP 220 pH
Meter.
2.1.2.Phương pháp nghiên cứu
♦ Phương pháp tạo giống: Cải tạo giống bằng phương pháp đột biến gây tạo
kết hợp với sàng lọc ngẫu nhiên.
, ,

'

,

............................................. ....

a) Phương pháp gây đột biến bằng ánh sáng ƯV:

18

(Ị


- Pha hỗn dịch bào tử: dùng que cấy vô trùng lấy một vòng que cấy bào
tử Micromonospora N °9 cho vào 10ml nước muối đẳng trương vô trùng lắc
cho bào tử phân tán đều. Dùng 9ml hỗn hợp dịch bào tử này cho vào một đĩa
petri vô trùng.
- Chiếu ánh sáng UV: đĩa petri chứa hỗn dịch bào tử đem chiếu ánh
sáng UVvới liều lượng xác định. Để đĩa petri chữa hỗn hợp dịch bào tử sau
chiếu ánh sáng u v vào chỗ tối 2 - 4 giờ, sau đó dùng pipet vô trùng pha loãng
đến nồng độ 10'5'
- Cấy các bào tử sau đột biến: dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml
hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 1 er4 và 10'5 nhỏ vào bề mặt môi trường
Gauze 1 trong đĩa petri,dàn đều bằng que trang.Mỗi độ pha loãng làm
3đĩa.Tiến hành tương tự với mẫu chứng ở nồng độ 10'6.Các đĩa được ủ ở 32°c
trong 6 ngày.
- Đếm số khuẩn lạc để xác định % độ sống sót theo công thức:
% Độ sống sót = JÏLxl00%
m
Ni : là số khuẩn lạc trung bình sau đột biến
NO : là số khuẩn lạc trung bình trong mẫu chứng.
♦ Phương pháp sàng lọc sau đột biến:
Các khuẩn lạc sau đột biến khi đã đủ thòi gian nuôi cấy 6 ngày được lựa
chọn ngẫu nhiên và cấy zigzac lên bề mặt môi trường Gauze 1 trong đĩa petri
ủ ở 32°c trong 6 ngày rồi lấy ra thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp
khối thạch. Làm tương tự với mẫu chứng, % biến đổi hoạt tính được xác định

theo công thức:

19


% Biến đổi hoat tính = =*100%
DO
Di: là đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng
DO: là đường kính trung bình vòng vô khuẩn của chủng chứng
Dựa vào kết quả, ta lựa chọn các biến chủng có % biến đổi hoạt tính
dương cao để tiếp tục nghiên cứu.
♦ Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh:
Hoạt tính kháng sinh được thử theo phương pháp khuếch tán với 3 cách
khác nhau tuỳ thuộc vào mẫu cần thử (khoanh giấy lọc, đục lỗ thạch và khối
thạch).
Nguyên tắc của phương pháp khuyếch tán: trên lớp thạch dinh dưỡng đã
cấy vi sinh vật kiểm định ta cho mẫu thử vào theo các cách trên. Trong thời
gian nuôi cấy kháng sinh sẽ khuyếch tán trên lớp thạch ức chế sự phát triển
của vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
a) Tiến hành:
- Chuẩn bị giống vi sinh vật kiểm định: vi sinh vật kiểm định được cấy từ
ống giữ giống thạch nghiêng sang ống nghiệm chứa 5ml môi trường canh
thang, ủ 37°c trong 1 ngày.
- Cấy vi sinh vật vào môi trường thạch thường: môi trường thạch thường
sau khi đã pha chế được tiệt trùng và chờ nguội đến 45 - 50 0c, rồi cho mồi
trường giống vi sinh vật kiểm định theo tỷ lệ Vgiống / Vthạch thường =
5/200, lắc đều. Mỗi đĩa petri vô trùng cho 20ml.
- Đưa mẫu thử vào: mỗi đĩa petri cho 6 mẫu.

20

+ Mẫu thử là các mẫu thạch chứa kháng sinh: dùng patuyn vô trùng
chuyển

các khối thạch ((ị) = 6mm ) đặt trực tiếp lên bề mặt thạch chứa vi

sinh vật kiểm định.
+ Mảu thử là các khoanh giấy lọc: tẩm chất cần thử lên khoanh giấy
lọc. Làm 1-3 lần, mỗi lần 5 phút, sấy nhẹ cho khô (< 50 0 C). Dùng panh vô
trùng đặt các khoanh giây đã tẩm lên bề mặt môi trường chứa vi sinh vật kiểm
định.
+ Mẫu thử là các dung dịch (dịch lên men, dịch chiết nước...): Dùng bộ
dụng cụ đục lỗ thạch ((ị) = 6mm) trên mặt thạch. Dùng pipet vô trùng nhỏ vào
mỗi lỗ 0,05ml dịch cần thử có độ pha loãng thích hợp.
Để các đĩa petri đã đặt mẫu thử ở nhiệt độ 37°c trong 18-24giờ cho vi
sinh vật kiểm định phát triển. Đường kính vòng vô khuẩn được đo bằng thước
kẹp panmer độ chính xác 0,02mm.
c) Đánh giá kết quả: mỗi mẫu thử trên 4 đĩa đối với một loại vi sinh vật
kiểm định để có 4 số liệu song song. Kết quả được xử lý theo phương pháp
toán thống kê.
♦ Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng:

I

a) Chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường: pha môi trường Gauze, chỉnh
pH, phân đều vào các ống nghiệm mỗi ống 5-6ml. Tiệt trùng ở 1200C/30 phút
rồi đặt thạch nghiêng.
b) Cấy giống vào ống môi trường: khi môi trường nguội dùng que cấy vô
trùng cấy zigzac các bào tử Micromonospora N°9 đã chọn và không bị

lâynhiễm lên bề mặt môi trường ủ ở 32°c trong 6-14 ngày rồi đem cất giữ
trong tủ lạnh 4-10°C trong 3-6 tháng hoặc tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.

21