quy trình tinh urease hiệu từ đậu nành nguồn nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm

Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT

Đất nước ngày càng phát triển, mức sống của người dân cũng được nâng cao nên
nhu cầu về ăn, mặc, đáp ứng các dịch vụ cũng tăng lên. Để đáp ứng đầy đủ nhu cầu
dinh dưỡng thì cơ thể cần cung cấp đầy đủ các acid amin nên protein là nguồn dinh
dưỡng rất quan trọng cho con người nói riêng và vi sinh vật nói chung. Ngoài ra
protein còn là chất xúc tác quan trọng cho các phản ứng sinh học trong sản xuất và
được gọi là enzyme.
Từ trước tới nay chúng ta thường bảo quản thực phẩm bằng các loại hóa chất điều
này có thể gây nguy hiểm đối với người tiêu dùng, do đó việc bảo quản thực phẩm
bằng enzyme đã đem lại ý nghĩa hết sức to lớn vì nó có độ an toàn cao, tuy nhiên quy
trình thực hiện để thu nhận và bảo quản enzyme cho việc sử dụng vẫn còn khó khăn,
nó đòi hỏi công nghệ tiên tiến và kỹ thuật cao. Bên cạnh đó, enzyme được dùng trong
lĩnh vực y dược để chuẩn đoán bệnh như: tiểu đường, bệnh thận qua các phép định
lượng sinh hóa
Enzyme urease là một loại enzyme thuỷ phân ure hình thành NH 3 và CO2, được
ứng dụng rất nhiều trong Y học và Công nghiệp thực phẩm để định lượng ure trong
các mẫu bệnh phẩm và nước chấm. Hiện nay vẫn phải nhập chế phẩm urease và kit
urease từ nước ngoài với giá thành rất cao. Do đó chúng tôi tìm hiểu đề tài này nhằm
tìm ra một quy trình tinh sạch urease hiệu quả nhất từ đậu nành, một nguồn nguyên
liệu rẻ tiền và dễ kiếm.

1


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Kỹ thuật tinh sạch protein

1.2.1 Khái niệm

Trong các tổ chức của cơ thể sống, protein có thể ở dưới dạng tự do trong các dịch
sinh vật hoặc dưới dạng kết hợp, hoặc bị cầm trong các tế bào. Hơn nữa, trong tế bào có
chứa hàng nghìn loại protein khác nhau, nếu ta cần nghiên cứu từng loại protein, trước
hết phải chiết rút và tinh sạch chúng. Chính vì vậy, các kỹ thuật chiết rút, tinh sạch và
nghiên cứu protein luôn ở vị trí trung tâm của các nghiên cứu hóa sinh và luôn được cập
nhật và hiện đại hóa [2]
Protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về
tiến hóa giữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh
hóa của các protein đó [2]
Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa protein chỉ có thể thực hiện với những protein tinh
sạch và từ những tinh thể đó chúng ta sẽ biết được cấu trúc bậc 4 cũng như các đơn vị
chức năng của protein thông qua dữ liệu chiếu xạ tia X [2]
1.2.2 Nguyên tắc
Protein được tinh sạch ở dạng có hoạt tính dựa trên những đặc tính căn bản như
độ hòa tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực [3]
Hỗn hợp protein trải qua nhiều giai đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên một
đặc tính nhất định, để cuối cùng là một protein tinh sạch [3]
1.2 Giới thiệu một số kỹ thuật phân tách protein
1.2.1 Phương pháp ly tâm [3]
Một trong những kỹ thuật không thể thiếu được trong việc tách chiết và tinh chế
protein là ly tâm. Máy ly tâm được sử dụng để tách các phần khác nhau khỏi dung
dịch, sự ly tâm tăng tốc độ kết tủa của những tiểu phần rắn nhờ lực ly tâm. Sự sai
khác về tỷ trọng của nguyên liệu lơ lửng so với chất lỏng càng lớn thì tốc độ kết tủa sẽ
càng cao.
Máy ly tâm hoạt động theo nguyên tắc cân bằng đối xứng khi ly tâm và thăng
bằng máy ly tâm khi hoạt động.

2

Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT
Do tính chất không bền với nhiệt của phần lớn các protein enzyme, khi tách chiết
tinh chế chúng, cần sử dụng máy ly tâm lạnh hoặc duy trì mẫu ở nhiệt độ thấp trước
khi ly tâm…
1.2.2 Phương pháp thẩm tích
Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất
keo hòa tan (protein, một số các polysaccharid) nhưng thấm đối với các dạng dịch các
tinh thể. Các protein enzyme có thể khuếch tán qua màng theo định luật Fick.
Nước sẽ khuếch tán từ dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường là dung dịch rửa)
vào dung dịch keo, trong khi đó các ion (cation và anion) và các chất phân tử nhỏ sẽ
chuyển vào dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường chuyển vào dung dịch rửa).
Tiến hành: cho dung dịch protein vào túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm
(túi colodion hoặc cellophane) sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn nước hoặc
lượng lớn dung dịch đệm được pha loãng (đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M).
Khi đó muối sẽ khuyếch tán vào nước hoặc dung dịch đệm loãng, còn nước hoặc đệm
loãng sẽ di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein. Protein là những đại phân tử
không thể vượt qua túi thẩm tích và được giữ lại trong túi. Bằng cách thay đổi thường
xuyên dung dịch rửa có thể tẩy sạch muối ammonium sulphate ra khỏi protein.

Hình 1.1 Thẩm tích để loại muối (NH 4)2SO 4 trong kết tủa protein.
- Ưu điểm: Kỹ thuật này dùng để loại bỏ muối hay tách những phân tử nhỏ
- Nhược điểm: Kỹ thuật này không phân biệt được các loại protein với nhau
2.3 Phương pháp sắc ký
2.3.1 Phương pháp sắc ký lọc gel
Sắc ký lọc gel là một trong những kỹ thuật sắc ký cột được dùng phổ biến trong
tách chiết và tinh sạch protein.

3


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT
Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng
và phân tử lượng của protein enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra.
Để đảm bảo cho việc tách protein enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất
trơ, không phản ứng với protein enzyme, không hòa tan và tương đối bền với các yếu
tố về cơ học cũng như sinh học. Chất được sử dụng để lọc phân tử phải là chất không
có tính đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước.
Gel sephadex là chất thỏa mãn các yếu tố trên. Sephadex là chế phẩm dextran do
các loài vi sinh vật khác nhau là Leuconostoc tạo ra khi chúng được nuôi cấy trên môi
trường chứa saccharose hoặc sucrose.
Phương pháp lọc phân tử trên Sephadex được tiến hành như trên: cho Sephadex
vào cột thủy tinh dài và cân bằng bằng dung dịch đệm có pH nhất định. Sau đó cho
dung dịch protein enzyme lên cột. Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp, các phân
tử có trọng lượng phân tử nhỏ (các muối) sẽ khuyếch tán chậm chạp qua các lỗ nhỏ
của các hạt Sephadex bị trương phồng, còn chất có trọng lượng phân tử lớn hơn
(protein enzyme) không có khả năng đi vào mà lách nhanh qua các hạt Sephadex và sẽ
được chiết nhanh ra khỏi cột. Vì vậy ta có thể tách được chất có trọng lượng phân tử
cao hơn thoát ra khỏi cột gel trước so với chất có phân tử lượng nhỏ.
Phương pháp lọc rây phân tử trong quá trình tinh chế protein enzyme, chúng còn
được sử dụng để cô đặc dung dịch protein enzyme.

Hình 1.2 Hoạt động của lọc
phân tử sephadex

4

Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT

Hình 1.3 Tách các phân tử theo kích thước bằng sắc ký lọc gel.

Hình 1.4 sắc ký lọc gel [6]
2.3.2 Phương pháp sắc ký trao đổi ion
Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của
các protein enzyme. Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trên cơ sở của
phản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và
các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân (nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa có
tích nhóm sinh ion hoặc là chất ionit. Đây là những chất giá trơ, không tan trong
nước, có bản chất là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex,
Molselect) hoặc là chất nhựa polistirol. Chất giá thể này thường kết hợp với các nhóm

5


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT
ion hóa. Các chất trao đổi ion có chất giá là cellulose, Sephadex, molselect thông
thường được dùng để tách protein enzyme, còn các chất trao đổi ion có chất giá là
polistirol chỉ dùng để tách các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn.
Các chất trao đổi ion có chất giá cellulose
+ Cationit CM - cellulose (carboxylmetyl - cellulose) là một dẫn xuất este của
cellulose
+ Anionit DEAE - cellulose (diethylamino - ethyl - cellulose) là dẫn xuất este
của cellulose
Nếu chất giá là Sephadex thì chúng ta có chất trao đổi ion Sephadex

+ DEAE – sephadex
+ CM - sephadex
- Ưu điểm: vừa tách được protein enzyme về kích thước và về điện tích tổng số
của các protein enzyme

6


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT
Hình 1.5 Sắc ký trao đổi ion

Hình 1.6 Cơ chế giữa protein trong hệ sắc ký trao đổi ion
(a) Những hạt mang điện tích dương sẽ trao đổi ion âm với dung dịch đệm. Protein
tích điện âm cũng ion dương tương tác với nó
(b) Khi protein gắn với hạt, protein thay thế những ion âm tương tác với hạt cũng như
hạt thay thế những ion dương tương tác với protein
2.3.3 Phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học hay là phương pháp
sắc ký ái lực (affinity Chromatography) [5]
Sắc ký ái lực là một phương pháp dùng để tách hỗn hợp các chất dựa vào tương
tác đặc hiệu cao.
Nguyên tắc của phương pháp sắc ký ái lực là dựa vào cấu hình không gian của
protein
Sau khi protein liên kết với chất có cấu hình không gian khớp với nó. Dùng đệm
để rửa bỏ những liên kết không đặc hiệu. Ta thu sản phẩm mục tiêu bằng cách thay
đổi pH, lúc này liên kết ái lực sẽ bị phá vỡ.

7

Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT
Phương pháp này cho hiệu quả tinh sạch cao
- Các
tương
tác

giữa
kháng
nguyên kháng

thể;

enzyme -

cơ

chất; thụ

thể -

chất gắn

thụ

thể.
- Cơ sở

của

phương

pháp này là người ta gắn những phân tử gắn (ligand) vào chất mang rắn (chất giá)
bằng liên kết cộng hóa trị mà protein enzyme cần tách sẽ tương tác đặc hiệu với nó.
Những chất đó có thể là cơ chất (Substrate) hoặc chất ức chế (inhibitor) cạnh tranh.
- Ở trên cột giá thể hay chất mang chứa cơ chất cố định ở pH và lực ion phù hợp
hoặc có thể bằng cách thêm chất ức chế cạnh tranh đã được hòa tan vào thì có thể tách
được protein enzyme khỏi cột ở trạng thái sạch.
- Sắc ký ái lực là phương pháp tinh sạch hiệu quả nhất khi tương tác giữa protein
và phân tử được dùng như mồi bắt protein có độ chuyên biệt cao.

8


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT

Hình 1.7 Cơ chế tinh sạch Concanavalin A bằng sắc ký ái lực
2.3.4 Sắc ký lỏng cao áp (sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC) [7]
Sắc ký hiệu năng cao là một phương pháp chia tách, trong đó pha động là chất
lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân
hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi
bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ
chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử).
Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC): HPLC là một sắc ký cột (column
chromatograph ) đi kèm với một detector nhạy để có thể phát hiện được các chất tách ra
trong quá trình chạy sắc ký. Với những tiến bộ kỹ thuật về cột, detector đã chuyển sắc ký
cột thành phương pháp phân tích có tốc độ nhanh và hiệu suất cao. Loại này cần phải có hệ
thống bơm cao áp để đẩy pha động với áp suất cao đến khoảng 30Mpa (300 atm) nhằm tạo
dòng chảy với lưu lương vài ml/ phút. Số lượng mẫu phân tích bằng HPLC chỉ cần khoảng

20 microlit [7]
Phương pháp sắc ký khí: điểm phân biệt giữa sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và sắc ký
khí (GC) là trong phương pháp HPLC, mẫu chỉ cần làm hoà tan mà không cần làm bay hơi,
do đó HPLC có thể phân tích được các chất mà không sợ gây ra sự phân hủy do nhiệt độ
trong quá trình phân tích [7]
Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột
- Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và
loại sắc ký
+ Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo
+ Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion
+ Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết
+ Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có sắc ký Gel hay Rây phân tử
* Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có một
pha động

9


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT
* Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C
… vào cột phân tích, kết quả các chất A, B, C … sẽ tách ra khỏi nhau sau khi đi qua
cột. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác

Cháút phán têch A +B+C
F1
Pha ténh

F2
F3

Pha âäüng

* Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột
trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại.
* Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được quy định bởi 3 lực F1, F2, F3. Trong đó F1
và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn.
* Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột. F2 là lực kéo của pha động đối
với chất phân tích ra khỏi cột
* Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau, kết quả là các chất
khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra
khỏi cột

10


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT

Pha âäüng

Thåìi gian

A

B

Hình 1.8 Quá trình tách các chất A và B trong cột tách sắc ký
2.4 Phương pháp kết tủa
Phương pháp kết tủa thường được sử dụng dựa trên tính chất điện tích của sản

phẩm hoặc dựa trên những phản ứng hóa học
Đối với các protein, enzyme người ta thường dùng biện pháp điều chỉnh pH đến
điểm đẳng điện để kết tủa protein
Đối với acid amin, kháng sinh hoặc các acid hữu cơ người ta thường dùng những
chất tương tác với chúng để tạo kết tủa, sau đó phá kết tủa này và tinh chế để tạo sản
phẩm sạch
Ở nồng độ muối cao, phần lớn protein sẽ giảm tính hòa tan, hiện tượng này gọi là
tủa bằng muối (salting out). Mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ muối nhất định.
Vì vậy, hiện tượng tủa bởi muối có thể được dùng để phân đoạn protein. Ví dụ như
fibrinogen tủa ở nồng độ muối ammonium sulfate 0.8 M trong khi phải đến nồng độ
2.4 M, albumin mới kết tủa. Hiện tượng này được sử dụng để tăng nồng độ của một
dung dịch protein loãng chứa các phân đoạn có hoạt tính của các bước tinh sạch trước.
Nếu cần thiết, lượng muối có thể được loại bỏ bằng sự thẩm tách
Phương pháp này đơn giản cho kết quả kết tủa sạch. Tuy nhiên muốn có sản phẩm
sạch, tinh khiết phải tiến hành các biện pháp phân đoạn theo những phương pháp hóa
lý riêng

11


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT

2.5 Phương pháp kết tinh protein
Đây là phương pháp đặc hiệu tốt nhất để tách từng phần protein enzyme ở giai
đoạn tinh chế cuối cùng.
Khi protein enzyme đã được làm tinh khiết hoàn toàn, trong những trường hợp
riêng biệt, người ta có thể tiến hành kết tinh chúng. Một điều cần chú ý là protein
enzyme ở trạng thái tinh thể không thể được coi là bằng chứng về sự tinh khiết. Các
tinh thể protein enzyme kết tinh lần đầu đôi khi có độ sạch không vượt quá 50% và có

thể chứa các protein enzyme khác. Người ta thường tiến hành kết tinh protein enzyme
trong dung dịch (NH 4)2SO4. Quá trình kết tinh có thể tiến hành từ từ kéo dài vài ngày
thậm chí hàng tuần nếu muốn nhận được các tinh thể tốt. Thông thường là thêm muối
(NH 4)2SO4 vào dung dịch protein enzyme khá đậm đặc cho đến khi làm vẫn đục nhẹ
nhàng dung dịch. Sau đó đặt dung dịch vào một nơi, đồng thời tăng rất từ từ nồng độ
muối trong dung dịch. Có thể tiến hành tăng nồng độ muối theo nhiều cách, thêm
dung dịch muối đậm đặc hơn vào dung dịch protein enzyme theo từng giọt, thêm
muối qua màng bán thấm hoặc có thể cho bay hơi chậm chạp dung dịch protein
enzyme. Trong quá trình kết tinh có thể thay đổi chỉ số pH hoặc nhiệt độ. Để kết tinh
protein enzyme được dễ dàng, ở những giai đoạn trước đó, người ta thường tách từng
phần các protein enzyme bằng các dung môi hữu cơ. Điều này có lẽ liên quan đến việc
các chất cơ bản, chất lipid bị loại ra khỏi dung dịch protein enzyme tạo điều kiện tốt
cho quá trình kết tinh.
2.6 Làm khô và bảo quản chế phẩm protein
Tính cố định cấu trúc của protein được bảo đảm nhờ khả năng liên kết nước của
chúng. Nếu dung dịch protein enzyme bị khô ở nhiệt độ trong phòng thì đa số protein
enzyme bị biến tính. Protein enzyme chỉ có thể được giữ ở dạng khô trong trường hợp
nếu việc sấy khô được tiến hành vô cùng nhanh hoặc ở nhiệt độ thấp. Nhiều protein
như chúng ta đã biết, ở nhiệt độ thấp có thể được kết tủa bằng rượu hoặc acetone. Nếu
kết tủa thu được bằng cách đó đem xử lý bằng rượu tuyệt đối, bằng acetone hoặc bằng
ether và sau đó làm khô thật nhanh thì protein sẽ không bị biến tính. Ở dạng khô, bột

12


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT
protein có thể giữ một thời gian lâu, khi hòa tan nó trong nước nó thể hiện những tính
chất ban đầu của mình.
Tuy nhiên, nhiều protein không chịu được cách xử lý như vậy. Vì vậy, người ta sử

dụng phương pháp làm đông khô là phương pháp làm khô protein thận trọng nhất,
phương pháp này có thể sử dụng được cho hầu hết protein.
Dung dịch protein đã được thẩm tích được làm đóng băng và làm thăng hoa băng
ở áp suất 0,01-0,001 mm thuỷ ngân (được tạo ra nhờ máy hút chân không mạnh). Nơi
nước được tạo ra đều được đóng băng trong bầu dự trữ ở độ nhiệt thấp hơn (-70,
o

-80 C). Sau một vài giờ chỉ còn lại bột protein. Sau đó bột này (trong chân không) có
thể được giữ ở độ nhiệt cao hơn. Protein đã được làm đông khô bằng cách như thế khi
hoà tan trong nước cất sẽ cho dung dịch protein (nguyên thể) ngay sau một vài năm.
Người ta đã bảo quản huyết thanh máu bằng phương pháp như thế, huyết thanh khô
này có thể được sử dụng trong mục đích truyền máu.

13


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH PROTEIN BẰNG (NH 4)2SO 4
2.1 Cơ sở lý thuyết kết tủa protein [13]
2.1.1 Khái niệm
Đây là phương pháp đơn giản được dùng để tủa protein. Khả năng hòa tan của protein
tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của
muối…
Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ
muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out).
Đầu tiên, giả thuyết salting in ở nồng độ muối thấp được giải thích bởi Debye - Huckel.
Trong dung dịch, protein được bao bọc xung quanh bởi các ion muối mang điện tích trái
dấu. Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính của các dung môi, làm giảm các phân tử protein

không mang điện tích, do đó làm tăng tính tan của protein trong dung môi. Giả thuyết của
Debye – Huckel cho rằng: tính tan của protein được biểu diễn bằng một hàm logarid, giá trị
của hàm tỉ lệ với căn bậc hai của cường độ ion trong dung dịch.
Thuật ngữ salting out trong môi trường có nồng độ muối cao được giải thích bởi
Kirkwood. Sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình Solvate hóa,
giảm tính hòa tan của protein dẫn đến sự tủa.
Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau của Cohn:
log S = B - KI
Trong đó
S: độ hòa tan của protein
B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ)
K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối có trong dung
dịch)
I: cường độ ion của muối.
Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của protein biến thiên theo nồng độ muối:

14


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT

Hình 2.1 Độ tan theo nồng độ muối
Những đường biểu diễn khác nhau tùy theo từng protein khác nhau. Vì thế, khi muốn
tách 1 protein từ một hỗn hợp gồm nhiều protein khác nhau, ta có thể lựa chọn nồng độ
muối thích hợp sao cho phù hợp nhất với protein mục tiêu.
Độ dốc của đường salting out mô tả ở trên phụ thuộc vào chức năng của protein và
nồng độ muối, không phụ thuộc vào nhiệt độ và độ pH. Ngoài ra, nếu trọng lượng phân tử
của protein tăng thì lượng muối cần cho phương pháp tủa giảm xuống.
Hiệu quả tủa protein của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp theo thứ

tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate >
thiocyanate.
2.1.3 Cơ chế của quá trình kết tủa protein bằng dung dịch muối có nồng độ
cao [14]
Hầu hết enzyme tồn tại trong dịch tế bào đều là những protein ở dạng hòa tan do
đó chúng tan tốt trong dung dịch muối sinh lý có nồng độ ion khoảng 0,5-0,2M và ở
pH trung tính. Khi tiến hành tách chiết protein ra khỏi tế bào thì các điều kiện môi
trường thay đổi dẫn đến protein bị kết tủa
Độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác có cực của protein với dung
môi, sự tương tác ion của protein với các phân tử muối hiện diện trong dung dịch và
sự tương tác tĩnh điện giữa phân tử mang điện tích hay những nhóm phân tử mang
điện tích của protein kết dính lại với nhau. Quá trình kết tủa protein bằng dung dịch
muối có nồng độ cao phụ thuộc rất lớn vào tính kỵ nước của phân tử protein
Trong dung dịch, các gốc kỵ nước của phân tử protein tập trung trên bề mặt, tiếp
xúc trực tiếp với các phân tử nước. Các phân tử nước này ngăn cản quá trình hình
thành liên kết để tạo kết tủa giữa các phân tử protein như nhau

15


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT
Khi nồng độ dung dịch muối tăng, các phân tử muối bị solvate hóa làm giảm số
phân tử nước xung quanh bề mặt các phân tử protein tạo điều kiện cho các bề mặt kỵ
nước tiến đến gần nhau và kết tủa xuống
Mặc dù quá trình kết tủa bằng dung dịch muối có nồng độ cao phụ thuộc nhiều
vào các phần tử kỵ nước của protein nhưng các yếu tố khác như pH, nhiệt độ cũng gây
ảnh hưởng đến quá trình này. Ở pH gần điểm đẳng điện pI thì quá trình kết tủa xảy ra
dễ dàng hơn và khi nhiệt độ tăng ở nồng độ muối cao thì độ hòa tan của protein cũng
giảm.

Ngoài ra, trong quá trình kết tủa protein bằng muối có nồng độ cao cần lưu ý đến
bản chất của muối dùng để kết tủa. Những loại muối có gốc anion tích nhiều điện tích
2-

3-

âm như: SO 4 , PO 4 ... là những loại muối làm tăng hiệu quả của quá trình kết tủa.
Gốc cation tuy không ảnh hưởng lắm nhưng cần lưu ý không sử dụng các ion phức
hoặc các ion có khả năng hình thành liên kết với phân tử protein. Do đó, những ion
+

+

+

NH4 , Na , K ... thường được sử dụng.
2.1.3 Đặc điểm của muối trung tính (NH4)2SO4
Dùng muối (NH4)2SO4 để tủa protein vì các muối này vừa làm trung hòa điện (do các
ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân
tử protein. Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau, vì vậy có
thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng.
Protein được kết tủa thuận nghịch và kết tủa không thuận nghịch. Khi dùng muối
(NH4)2SO4 để kết tủa protein thì khi không còn tác nhân muối thì protein trở lại trạng thái
hòa tan [2]
Muối trung tính có ảnh hưởng rõ tới độ hòa tan của protein hình cầu, với nồng độ thấp
chúng làm hòa tan nhiều protein. Tác động của muối trung tính không phụ thuộc vào bản
chất của muối trung tính mà phụ thuộc vào nồng độ muối và số điện tích của mỗi ion trong
dung dịch. Các muối có ion hóa trị 2 (MgCl 2, MgSO4, (NH4)2SO4 ...) làm tăng đáng kể độ
tan của protein hơn các muối có ion hóa trị 1 (NaCl, KCl ...). Khi tăng đáng kể nồng
độ muối trung tính thì độ tan của protein bắt đầu giảm và ở nồng độ muối rất cao,

protein có thể bị tủa hoàn toàn [10]
Các protein khác nhau bị kết tủa ở những nồng độ muối trung tính khác nhau. Người ta
sử dụng tính chất này để chiết xuất và tách riêng protein khỏi hỗn hợp. Ví dụ dùng muối

16


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT
(NH 4)2SO4 50% bão hòa kết tủa globulin và dung dịch (NH 4)2SO4 bão hòa để kết tủa
albumin từ huyết thanh [11]
Các muối trung tính có thể dùng là (NH4)2SO4, Na 2SO4, MgSO4 ...Tuy nhiên, người
ta đã nhận thấy muối (NH 4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm
bền) hầu hết các loại protein enzyme. Loại muối này lại rẻ tiền và phổ biến. Độ hòa
o

tan của nó lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở 25 C). Nồng độ (NH 4)2SO4 cần thiết để kết tủa
protein enzyme khác nhau thì khác nhau
Có thể dùng (NH 4)2SO4 ở cả 2 dạng: dạng bột và dạng dung dịch bão hòa [12]
+ Dạng bột: khi dùng bột người ta cho từng ít một vào dịch chiết protein enzyme.
Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của protein enzyme. Khi cho
muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm bảo sự hòa tan của muối [12]
+ Dung dịch bão hòa: trong nhiều sách về phương pháp nghiên cứu, người ta đưa
ra bảng tính số lượng muối cần thiết để pha các dung dịch có độ bão hòa khác nhau ở
những nhiệt độ nhất định [12]
Nếu thêm từng phần các dung môi hữu cơ hoặc từng phần muối (NH 4)2SO4 (có
nồng độ bão hòa khác nhau) thì ta có thể tách từng phần hỗn hợp protein enzyme. Tuy
nhiên, để phân chia hoàn toàn những hỗn hợp phức tạp, phương pháp này không cho
kết quả tốt vì độ hòa tan của một số protein bị tăng lên. Mặc dầu vậy, cách kết tủa
từng phần này cũng rất có lợi, đặc biệt là đối với giai đoạn đầu của việc tách chiết và

làm sạch protein enzyme, vì phương pháp khá đơn giản
2.2 Thí nghiệm kết tủa enzyme Bromelain từ thân Dứa
2.2.1 Dụng cụ và hóa chất
+ Dụng cụ
- Pipet 5ml, 10ml
- Becher 50ml, 100ml, 250ml
- Bình tia
- Máy ly tâm
+ Hóa chất
- Nguyên liệu thơm (dứa)
- Muối (NH4)2SO4
+ Thí nghiệm

17


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT
Cân khoảng 80g đến 100g nguyên liệu, giã nát (hoặc nghiền rồi hòa tan với nước đối
với mẫu rắn) sau đó vắt lấy nước rồi ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút rồi đong xem
thể tích của nước thơm là bao nhiêu, ghi nhận thể tích V. Sau đó lấy thể tích V nước vừa
thu được tiến hành tủa protein bằng tác nhân tủa muối (NH4)2SO4
2.2.2 Tiến hành
2.2.2.1 Quy trình

Chồi ngọn, vỏ quả

Làm sạch

Nghiền ép, xay nhuyễn

Lọc
B
ã
Ly tâm 6000v/p, 15-20 phút
(NH4)2SO4 bão hòa

Dịch trong

Hỗn hợp dịch dứa, để ở
nhiệt độ phòng 30 phút
Ly tâm 6000 v/p, trong
15 phút

Thu tủa

Sấy khô

18 Bromelin

Bỏ dịch trong


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT
2.2.2.2 Thuyết minh
Chồi ngọn, vỏ quả được làm sạch bằng nước rồi đem đi nghiền ép, xay nhuyễn
bằng cối xứ hay bằng máy tùy theo quy mô công nghiệp hay quy mô phòng thí
nghiệm. Ta dùng dung môi hữu cơ thích hợp để trích ly hoàn toàn enzyme trong bã
Ta đem đi lọc để tách bã và lấy dung dịch có enzyme

Dung dịch đem đi ly tâm 6000 vòng/ phút trong thời gian 15-20 phút, dưới tác
dụng của lực ly tâm dung dịch được phân làm 2 lớp, lớp bã được lắng ở dưới và được
tách ra ngoài. Còn dung dịch trong được giữ lại
Dung dịch trong được cho (NH 4)2SO4 bão hòa vào để tủa enzyme và để hỗn hợp
ở nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút
Ta đem hỗn hợp đi ly tâm 6000 vòng/ phút trong thời gian 15 phút để tủa được
lắng. Ta tách pha rắn sau ly tâm đem sấy khô ta được bromelain, còn dịch trong thì bỏ
2.3 Kết quả
- Thu được protein tinh khiết
- Chất lượng protein cao, không bị mất các hoạt tính do tác nhân tủa
- Phương pháp đơn giản nên nhanh, tiết kiệm thời gian

19


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT

Chương 3: ỨNG DỤNG KHẢO SÁT CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH
UREASE TỪ ĐẬU NÀNH [1]
3.1 Urease
Urease là một loại enzym thuỷ phân urea hình thành NH 3 và CO 2, được ứng dụng
rất nhiều trong Y học và Công nghiệp thực phẩm để định lượng urea trong các mẫu
bệnh phẩm và nước chấm. Trước đây, đã có rất nhiều nghiên cứu về enzyme urease và
đã đưa ra nhiều phương pháp tinh sạch urease, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào so
sánh giữa các phương pháp tinh sạch khác nhau. Ở nước ta, cũng đã có một số nghiên
cứu tinh sạch enzym urease từ đậu nành nhưng cũng chưa đưa được quy trình tinh
sạch hiệu quả và chưa được ứng dụng trong sản xuất chế phẩm urease. Ngành Y học
và Thực Phẩm ở nước ta hiện nay vẫn phải nhập chế phẩm urease và kit urease từ
nước ngoài với giá thành rất cao.

Do đó tôi thực hiện đề tài này nhằm tìm ra một quy trình tinh sạch urease hiệu quả
nhất từ đậu nành, một nguồn nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm. Đồng thời sử dụng
phương pháp điện di trên gel acrylamide để nghiên cứu thành phần enzyme urease từ
đậu nành.
3.2 Urease

20


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT
3.2.1 Khái niệm
Urea là sản phẩm chính của sự trao đổi đạm thải ra với nước tiểu ở người, động
vật có vú, bò sát và vài loài cá. Urea được hình thành trong gan
Urease là một protein được tìm thấy trong vi khuẩn, nấm men và một số thực vật
bậc cao.
3.2.2 Tính chất
Urease là một enzyme xúc tác thủy phân urea thành carbon dioxide và amoniac
(NH 2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3
Urease đặc biệt được tìm thấy trong Helicobacter pylori, trong đó kết hợp bốn
trong sáu enzyme thường xuyên trong một tiểu đơn vị lắp ráp tứ diện tồn tại của thể
24 tiểu đơn vị α12β12.
- Có thể tác dụng với kim loại như: Nikel
- Phân tử khối: 480 kDa hoặc 545 kDa
o

- Độ pH thuận lợi: 60 C

Hình 3.1 Cấu tạo của urea
-

- Chất ức chế: kim loại nặng Pb và Pb

2+

- Enzyme đặc thù: urease và hydroxyurease

21


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT
Hình 3.2 Trung tâm hoạt động của urease
Quá trình thủy phân urea qua từng bước sau:

Hình 3.3 Cơ chế phân hủy urea
Sau đó cacbamil acid tự động phân hủy để tạo thành amoniac và carbon dioxide

Sử
dụng thuốc thử phenolphtalein thì dung dịch vừa tạo ra sẽ có màu đỏ do có sự xuất
hiện ion OH

-

Người ta sử dụng urease để xác định hàm lượng urea trong máu. Từ phương trình
phản ứng trên ta có thể định lượng hàm lượng urea dựa vào sản phẩm tạo thành là CO 2
hoặc NH 3 hoặc dùng NH 3 tác dụng với cetoglutarate
NH 3 + NADH → glutaric acid / NAD
Định lượng glutaric acid hay NAD để suy ra lượng urea trong máu
Phương trình tổng quát

Urea bị thủy phân bởi enzyme urease hình thành nên amoniac và carbon dioxide.
Từ đó phản ứng có thể được kiểm soát bởi sự thay đổi độ dẫn điện của các ion theo

22


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT
thời gian. Độ dẫn điện này tương ứng với nồng độ ion hình thành trong suốt quá trình
phản ứng.
3.3 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Nguyên liệu
Đậu nành loại bỏ các hạt xấu, bỏ sâu mọt, xay mịn, loại lipid, bảo quản lạnh.
Hoá chất: Urease chuẩn (urease Jack bean), Albumin bovine, Etherpetrolium,
acetone, glycine, Tris(base), Coomassie Brilliant Blue – G250 (Merck), Nessler,
EDTA, L-Cystein.HCl, Acrylamide và bisacrylamide, SDS, TEMED, Amonium
persulfate, Sephadex G 50, DEAE – Cellulose (Merck)…
3.3.2 Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp tủa sunfat amon
+ Phương pháp 1: tủa phân đoạn ở 2 nồng độ 65% và 55% bão hoà.
+ Phương pháp 2: tủa phân đoạn ở 2 nồng độ 20% và 55% bão hoà.
- Phương pháp sắc ký: tách liên tục từng vi phân của hỗn hợp chất
+ Sắc ký rây phân tử trên gel Cephadex G-50 (6×12cm)
+ Sắc ký trao đổi ion trên gel DEAE-Cellullose
- Phương pháp Bradford: xác định hàm lượng protein
- Phương pháp Nessler: xác định hoạt tính urease
- Phương pháp điện di: kiểm tra hiệu quả tinh sạch, điện di trên gel 10%
polyacrylamid với tốc độ dòng 20mA, gel được nhuộm với Coomassie Blue R-250.
- Phương pháp siêu lọc: sử dụng thiết bị lọc membrane Vivaflow.

3.3.3 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
Chiết xuất lấy enzyme: Nghiền kỹ bột đậu trong dung dịch HCl 0,4% có thêm
-3

-3

EDTA (trilon B, complexon III) 5.10 M và L. cystein 5.10 M. Sau đó ly tâm tách bã
lấy dịch chiết.
o

Xử lý nhiệt: Nâng nhiệt nhanh đến 60 C, giữ trong 30 phút đem ly tâm tách bỏ cặn
kết tủa
Siêu lọc: Dịch ly tâm được lọc qua màng siêu lọc để loại bỏ peptid và polypeptid
có trọng lượng phân tử bé (M>500)

23


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT
Kết tủa bằng aceton: Dịch lọc được xử lý bằng aceton lạnh (tỷ lệ 1:1), ly tâm tách
kết tủa. Phần kết tủa đem hòa tan trong trisbuffer 0,1M, pH = 7 chứa EDTA và L.
-3

cystein 5.10 M.
Sắc ký trao đổi ion: Dịch enzyme được chạy sắc ký trao đổi ion trên cột chứa
DEAE - cellulose với gradien nồng độ NaCl từ 0-1M. Phân đoạn chứa enzyme được
sấy thăng hoa (đông khô) với chất saccharose làm chất ổn định với tỷ lệ 2,5mg/1mg
enzyme. Chế phẩm thu được có hoạt tính tăng 25 lần so với ban đầu và hiệu suất thu
hồi 43%

3.4 Kết quả
3.4.1 Khảo sát các phương pháp tinh sạch urease từ đậu nành
3.4.1.1 Khảo sát nồng độ aceton để kết tủa enzyme
Kết quả so sánh độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi enzym urease khi tủa với các
nồng độ aceton từ 30% - 60% được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả so sánh hiệu quả tủa enzym ở các nồng độ aceton khác nhau
Giai đoạn
Trích ly
Aceton 30%
Aceton 40%
Aceton 50%
Aceton 60%

V dịch , ml

P, mg/ml

m bột , mg

(mg/mg)

150.00
882.75
2976.00
3313.24
3788.25

19.69
0.21

0.46
0.45
0.44

Pt, mg
2953.50
185.38
1368.96
1490.96
1666.83

A, UI/ml
(UI/mg)
104.40
1.36
1.79
1.87
2.91

At, UI
15660.00
1200.54
5327.04
695.76
11023.81

Ap
UI/mg Pr
5.30
6.48

3.89
4.16
6.61

Độ tinh
H, %
sạch
1.00
1.22
0.73
0.78
1.25

100
7.67
34.02
39.55
70.39

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy độ tinh sạch của mẫu tủa 30% và 60% aceton gần
bằng nhau và lớn hơn 1, nhưng hiệu suất thu hồi ở nồng độ aceton 60% nhiều gấp 10
lần so với nồng độ aceton 30%. Ở mẫu tủa 40% và 50% aceton có độ tinh sạch thấp
nhỏ hơn 1 và hiệu suất thu hồi enzym cũng không cao. Kiểm tra 5 mẫu qua điện di
trên gel acrylamid 10%, kết quả được trình bày ở hình 3.1

24


Đồ án công nghệ 1
Nguyễn Thị Thúy - 11SHLT

Hình 3.4 Kết quả điện di urease tủa ở các nồng độ aceton khác nhau
Điện di đồ trên hình 3.4 cho thấy: urease đậu rựa dù đã ở dạng rất tinh khiết vẫn
xuất hiện 3 vạch rõ ràng, điều đó chứng tỏ urease của đậu rựa là một loại enzyme
heterogeneous. Điện di đồ đậu nành chứa đủ các vệt có trong điện di đồ đậu rựa.
Ngoài ra điện di đồ đậu nành còn chứa một số vạch khác cũng rất rõ ràng, đặc biệt
vạch thứ 6 với độ đậm tăng dần từ nồng độ aceton 30% - 60%. Kết quả chạy điện di
cho thấy phương pháp tủa bằng aceton có hiệu quả tinh sạch chưa cao, còn lẫn nhiều
protein tạp nên các mẫu điện di chưa có sự phân tách rõ ràng. Như vậy từ kết quả
kiểm tra hiệu quả tinh sạch trên cho thấy nồng độ aceton 60% là nồng độ dung môi
làm tủa enzyme urease có hiệu quả nhất về độ tinh sạch cũng như hiệu suất thu hồi
enzyme.
3.3.1.2 Khảo sát kết tủa phân đoạn bằng (NH 4)2SO4
Kết quả xác định độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi của hai phương pháp tủa phân
đoạn sunfat amon được trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2 So sánh hiệu quả tinh sạch của 2 phương pháp tủa phân đoạn (NH 4)2SO4
Giai đoạn
Trích ly
P. Pháp 1
P. Pháp 2

V dịch , ml

P, mg/ml

m bột , mg
150.00
1896.72
1214.25

(mg/mg)
19.69
0.19
0.19

Pt, mg

A, UI/ml
(UI/mg)
104.40
1.60
1.36

2953.50
360.38
230.71

A t, UI

Ap , UI/mg pr

Tinh sạch

H, %

15660.00
3034.75
1651.38

5.30

8.42
7.16

1.00
1.59
1.35

100
19.38
10.55

Các số liệu thực nghiệm cho thấy ở phương pháp 1 có độ tinh sạch enzyme và
hiệu suất thu hồi enzyme đều cao hơn so với phương pháp 2. Tuy nhiên hiệu suất thu

25