TÌM HIỂU VAI TRÒ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI CHỒI IN VITRO TỪ MÔ PHÂN SINH NGỌN CỦA CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS (WILLD.) OHWI ET OHASHI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

PHẠM MỸ NGỌC

TÌM HIỂU VAI TRỊ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT
SINH HÌNH THÁI CHỒI IN VITRO TỪ MÔ PHÂN SINH
NGỌN CỦA CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS (WILLD.)
OHWI ET OHASHI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS BÙI TRANG VIỆT
TS. LÊ THỊ TRUNG

Thành phố Hồ Chí Minh - 2011


LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
PGS. TS. Bùi Trang Việt, Trưởng Bộ môn Sinh lý Thực vật Trường Đại học Khoa học
Tự nhiên - ĐHQG Tp. HCM, người đã giảng dạy, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, tận tình
hướng dẫn em trong suốt q trình học tập và hồn chỉnh bài luận văn.
TS. Lê Thị Trung đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều
kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành luận văn.

TS. Trần Thanh Hương, Th.S Trần Thị Thanh Hiền, Th.S Phan Ngô Hoang, Th.S
Trịnh Cẩm Tú đã tận tình giúp đỡ và đóng góp những ý kiến chân tình, những kinh nghiệm bổ ích
cho luận văn của em.
Quý thầy cô trong hội đồng đã dành thời gian đọc và đóng góp nhiều ý kiến cho luận
văn của em.
Ban chủ nhiệm và toàn thể quý thầy cô khoa Sinh Học trường ĐHSP thành phố Hồ
Chí Minh.
Các bạn cao học khố 19, CN. Hồ Thị Mỹ Linh (Chun viên Phịng thí nghiệm khoa
Sinh trường ĐHSP thành phố Hồ Chí Minh) đã động viên, chia sẻ và giúp đỡ tơi trong q trình
thực hiện luận văn.
Em Như (Cao học khoá 18 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh)
và các em Huyên, Phước, Quỳnh sinh viên năm thứ IV đang thực hiện đề tài tại Bộ môn Sinh lý
Thực vật Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, đã hỗ trợ tơi trong việc tìm
kiếm sách và tài liệu tham khảo.


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................... 1
7T

T
7

MỤC LỤC ............................................................................................................................ 2
7T

T
7

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................. 6

7T

7T

MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 7
7T

T
7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 8
7T

T
7

1.1. Giới thiệu về cây Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi ................................. 8
7T

T
7

1.1.1. Phân loại học ........................................................................................................ 8
T
7

7T

1.1.2. Mơ tả đặc điểm hình thái cây Đậu ........................................................................ 8
T

7

T
7

1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật .................................................................................... 8
7T

7T

1.2.1. Khái niệm............................................................................................................. 8
T
7

7T

1.2.2. Mô phân sinh ngọn chồi ....................................................................................... 9
T
7

7T

1.2.2.1. Đặc điểm ....................................................................................................... 9
T
7

7T

1.2.2.2. Cấu trúc của mô phân sinh ngọn chồi .......................................................... 10
T

7

T
7

1.2.2.3. Sự phân bào của mô phân sinh ngọn chồi .................................................... 11
T
7

T
7

1.2.3. Hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi .............................................................. 11
T
7

T
7

1.2.3.1. Trong giai đoạn nảy mầm của hạt và tăng trưởng của cây mầm ................... 11
T
7

T
7

1.2.3.2. Trong giai đoạn sinh sản của cây trưởng thành ............................................ 12
T
7

T
7

1.2.4. Sự phát triển chồi ............................................................................................... 12
T
7

7T

1.2.4.1. Sự phát triển chồi nách ................................................................................ 12
T
7

7T

1.2.4.2. Sự hình thành và phát triển chồi bất định..................................................... 13
T
7

T
7

1.3. Vai trò của auxin và các chất điều hoà tăng trưởng thực vật trong sự phát sinh hình
7T

thái ngọn chồi .................................................................................................................. 14
7T

1.3.1. Vai trò của auxin ................................................................................................ 14
T

7

7T

1.3.2. Vai trò của cytokinin .......................................................................................... 16
T
7

7T


1.3.3. Sự phối hợp auxin và cytokinin trong phát sinh chồi .......................................... 17
T
7

T
7

1.3.3.1. Tăng sinh chồi bên ...................................................................................... 17
T
7

7T

1.3.3.3. Sự hình thành rễ .......................................................................................... 18
T
7

7T

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .............................................................. 19
7T

T
7

2.1.Vật liệu ...................................................................................................................... 19
7T

T
7

2.2.Phương pháp .............................................................................................................. 19
7T

7T

2.2.1.Quan sát sự tăng trưởng cây Đậu đỏ Vigna angularis ở trong vườn ..................... 19
T
7

T
7

2.2.2.Khử trùng hạt ...................................................................................................... 19
T
7

7T

2.2.3. Ảnh hưởng của AIA theo nồng độ lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây
T
7

Đậu đỏ ......................................................................................................................... 19
T
7

2.2.4. Ảnh hưởng của AIA 2 mg/l theo thời gian lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn
T
7

chồi cây Đậu đỏ ........................................................................................................... 20
7T

2.2.5. Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái chồi ..................... 21
T
7

T
7

2.2.5.1. Ảnh hưởng của BA riêng rẽ lên sự phát triển của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu
T
7

đỏ in vitro 6 ngày tuổi .............................................................................................. 21
7T

2.2.5.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa AIA 2 mg/l và BA theo thời gian lên sự tăng

T
7

sinh và tăng trưởng chồi ........................................................................................... 21
7T

2.2.6. Quan sát hình thái giải phẫu ............................................................................... 22
T
7

T
7

2.2.7. Đo cường độ quang hợp và cường độ hô hấp ..................................................... 23
T
7

T
7

2.2.8. Đo hoạt tính các chất điều hồ tăng trưởng thực vật ........................................... 23
T
7

T
7

2.2.9.Xử lý số liệu ........................................................................................................ 23
T
7

7T

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 24
7T

T
7

3.1. Kết quả ...................................................................................................................... 24
7T

T
7

3.1.1. Quan sát sự tăng trưởng của cây trong vườn....................................................... 24
T
7

T
7

3.1.2. Nuôi cấy hạt để tạo cây in vitro trên môi trường MS .......................................... 26
T
7

T
7

3.1.3. Sự phát triển chồi mầm ...................................................................................... 26

T
7

7T


3.1.3.1. Trong giai đoạn hạt nảy mầm ...................................................................... 26
T
7

T
7

3.1.3.2. Sự thay đổi trọng lượng tươi và trọng lượng khô theo thời gian từ giai đoạn
T
7

hạt đến cây mầm 5 ngày tuổi .................................................................................... 27
7T

3.1.3.3. Ảnh hưởng của các chất điều hoà tăng trưởng thực vật lên sự phát triển chồi
T
7

mầm ......................................................................................................................... 28
T
7

3.1.4. Các biến đổi hình thái của mơ phân sinh ngọn chồi trong quá trình phát sinh chồi
T

7

T
7

..................................................................................................................................... 30
3.1.5. Sự phát triển chồi nách từ cây in vitro và cây trong vườn ................................... 33
T
7

T
7

3.1.5.1. Sự phát triển chồi nách từ nách tử diệp của cây in vitro ............................... 33
T
7

T
7

3.1.5.2. Sự phát triển chồi nách từ nách lá của cây in vitro và cây trong vườn.......... 33
T
7

T
7

3.1.6. Quan sát hình thái giải phẫu của chồi nách ......................................................... 36
T
7

T
7

3.1.7. Ảnh hưởng của AIA theo nồng độ lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây
T
7

Đậu đỏ ......................................................................................................................... 45
T
7

3.1.8. Ảnh hưởng của AIA 2 mg/l theo thời gian lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn
T
7

chồi cây Đậu đỏ ........................................................................................................... 47
7T

3.1.8.1. Khảo sát sự tăng trưởng chồi trên môi trường AIA 2 mg/l và sau đó chuyển
T
7

sang mơi trưịng MS theo thời gian .......................................................................... 47
T
7

3.1.8.2. Khảo sát sự tăng trưởng chồi trên mơi trường MS và sau đó chuyển sang mơi
T
7

trưịng AIA 2 mg/l theo thời gian ............................................................................ 51
T
7

3.1.9. Sự thay đổi cường độ quang hợp và hô hấp của chồi ngọn sau khi xử lý AIA 2
T
7

mg/l theo thời gian ....................................................................................................... 54
7T

3.1.10. Hoạt tính các chất điều hồ tăng trưởng thực vật nội sinh trong quá trình tăng
T
7

trưởng chồi................................................................................................................... 55
7T

3.1.11. Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái chồi ................... 57
T
7

T
7

3.1.11.1. Ảnh hưởng của BA riêng rẽ lên sự phát triển của khúc cắt ngọn chồi cây
T
7

Đậu đỏ in vitro 6 ngày tuổi....................................................................................... 57
7T

3.1.11.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa AIA 2 mg/l với BA theo thời gian lên sự
T
7

tăng sinh và tăng trưởng chồi ................................................................................... 62
7T


3.2. Thảo luận .................................................................................................................... 1
7T

7T

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 12
7T

T
7

4.1. Kết luận..................................................................................................................... 12
7T

T
7

4.2. Đề nghị ..................................................................................................................... 12
7T

T
7

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 14
7T

7T

PHỤ LỤC ........................................................................................................................... 18
7T

T
7


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABA

: Abcisic acid

AIA

: Acetic indol acid

BA

: Benzyl Adenin

CĐHTTTV

: Chất điều hoà tăng trưởng thực vật

G1

: ( G : gap, khoảng gián đoạn) - Tế bào ở trạng thái trưởng thành

R

R

GA 3
R

R

: Giberelic acid

IBA

: Indol Butyric acid

MS

: Murashige và Skoog

TLT

: Trọng lượng tươi

TLK

: Trọng lượng khô

cs

: cộng sự


MỞ ĐẦU

Phát sinh hình thái là cơ sở cho việc vi nhân giống thực vật mà hiện nay đang rất được
quan tâm. Sự phát sinh hình thái thực vật liên quan tới sự phát sinh liên tục mô và cơ quan mới ở
thực vật nhờ hoạt động của các nhóm tế bào gốc khơng phân hóa (undifferentiated stem cells) được
gọi là mơ phân sinh. Hơn nữa, kiểm sốt hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi ở mức phân tử dưới
tác động của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, đặc biệt là auxin và cytokinin, gần đây được
nghiên cứu bởi nhiều tác giả.
Do đó, đề tài tập trung nghiên cứu trên cây Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi,
rất thông dụng ở Việt Nam, để hiểu về hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi dưới tác động của
auxin riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin. Việc khảo sát ảnh hưởng của auxin lên sự phát sinh hình
thái chồi ở cây Đậu được thực hiện dưới các khía cạnh hình thái học và sinh lý học, qua đó bổ sung
thêm kiến thức phục vụ cho công tác nghiên cứu, ứng dụng trong sự vi nhân giống và giảng dạy.


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi
1.1.1. Phân loại học
Cây Đậu được dùng trong đề tài này là cây Đậu đỏ, được phân loại như sau:
Ngành

:

Lớp

:

Bộ

:

Họ

:

Chi

:

Loài

:

5T

Magnoliophyta
7T

Magnoliopsida
7T

Fabales
7T

T
7

T
7

Fabaceae
7T

T
7

T
7

Vigna
5T

Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi (Phạm Hồng
5T

Hộ, 1999)

1.1.2. Mơ tả đặc điểm hình thái cây Đậu
Cây Đậu đỏ (adzuki bean) là loại cỏ nhất niên, đứng
hay leo. Cây có chiều cao trung bình 50-80 cm, có cạnh và lơng

dài. Cuống lá dài 10-12 cm, có lơng. Lá thường có hình xoan,
đầu trịn, có thùy, dài 6-8 cm và có lơng. Mỗi lá gồm 4-5 cặp
gân phụ. Hoa mọc thành chùm ở nách lá, dài 3-10 cm, có màu
vàng nhạt. Đài hoa có 5 răng ngắn. Trái dài 6-10 cm và rộng
0,7 cm, có chót nhọn. Hột dài 6-10 mm, có màu nâu. Bộ nhiễm
sắc thể của Đậu đỏ 2n = 22.
Cây Đậu đỏ được trồng nhiều ở Nha Trang, Sài
Gòn,… và được trồng để lấy hạt.
Công dụng của cây Đậu đỏ : rễ dùng để đắp trị sưng;
hột giúp lợi tiểu, trị kiết… (Phạm Hồng Hộ, 1999).

1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật

Ảnh 1.1. Cây Đậu đỏ
Vigna angularis (Willd.) Ohwi
et Ohashi
( />sp?param=news&newsid=934)

1.2.1. Khái niệm
Sự phát sinh hình thái thực vật là sự phát triển cơ thể thực vật theo thời gian để hoàn tất
chu trình phát triển. Phát triển chỉ những thay đổi của tế bào, mô hay cơ quan từ lúc khởi đầu cho


đến lúc trưởng thành. Phát sinh hình thái thực vật bao gồm phát sinh mô (histogenesis), phát sinh cơ
quan (organogenesis) và phát sinh phôi (embryogenesis) (Bùi Trang Việt, 2000).
Trong sự phát sinh cơ quan in vitro, có thể tạo các cơ quan theo con đường phát sinh cơ
quan trực tiếp (các cơ quan tạo ra trực tiếp từ mẫu cấy) hay gián tiếp (mẫu cấy tạo mơ sẹo, sau đó
các cơ quan tạo ra từ mô sẹo này) (Bùi Trang Việt, 2000).
Sự phát sinh hình thái thực vật tùy thuộc hai q trình căn bản sau:
-

Sự điều hồ hướng kéo dài tế bào.

-

Sự kiểm sốt vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia của tế bào.

Chính kiểu tăng trưởng của mọi tế bào riêng rẽ quyết định hình thái của cơ quan và cơ thể
thực vật (Bùi Trang Việt, 2000).
Sự phát triển ở mức tế bào thể hiện qua hai chuỗi thay đổi: tăng trưởng (phân chia và kéo
dài tế bào) và phân hóa tế bào. Ở thực vật, sự phân chia và kéo dài tế bào tách biệt nhau theo không
gian và thời gian (Bùi Trang Việt, 2000).
Môn phát sinh hình thái là mơn học nhằm mơ tả các biến đổi hình thái và cấu trúc, phân
tích các yếu tố nội sinh và ngoại sinh, và nghiên cứu sự điều hịa hình thái thực vật.
Sự phát sinh hình thái liên quan một cách toàn diện đến nguồn gốc và sự phát triển hình
thái thực vật. Do đó, khơng có một kỹ thuật hay phương pháp riêng rẽ nào có thể chứng minh được
tất cả mọi khía cạnh của nó. Những kỹ thuật của nhiều lĩnh vực khác nhau như mô học, giải phẫu
học, sinh lý học, tế bào học và di truyền học đều có thể giúp tìm hiểu hiện tượng phát sinh hình thái.
Trong số các phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp được dùng nhiều nhất là:
-

Cắt bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh và theo dõi các biến đổi phát triển sau đó.

-

Ni cấy in vitro trong điều kiện vơ trùng và có kiểm soát các phần tách rời của một

cơ thể thực vật.
Trong các thí nghiệm in vitro, các nghiên cứu sinh lý học thường khó tiến hành do kích
thước q nhỏ bé của các loại mô cấy, nên sự áp dụng các chất điều hoà sinh trưởng thực vật ngoại

sinh là cách hữu hiệu để tìm hiểu về sự phát sinh hình thái thực vật (Bùi Trang Việt, 2000).
Sự phát sinh hình thái thực vật liên quan tới sự phát sinh liên tục mô và cơ quan mới ở
thực vật nhờ hoạt động của các nhóm tế bào gốc khơng phân hóa (undifferentiated stem cells) được
gọi là mơ phân sinh (Vernoux và cs, 2010).

1.2.2. Mô phân sinh ngọn chồi
1.2.2.1. Đặc điểm


Các mô phân sinh là những vùng riêng biệt luôn hiện diện trong đời sống thực vật. Các tế
bào ở vùng mơ phân sinh có khả năng phân chia khơng ngừng, tế bào nhỏ, xếp sát nhau và khơng có
khoảng gian bào. Tế bào chất của tế bào mô phân sinh có độ nhớt cao, có nhiều khơng bào nhỏ li ti,
số lượng các bào quan (ribosome, ty thể, lạp thể) nhiều. Nhân lớn chiếm vị trí trung tâm. Như vậy,
cấu tạo của tế bào mơ phân sinh nói lên hoạt tính sinh lý cao của chúng (Bùi Trang Việt, 2000).
Mơ phân sinh là cơ sở hình thành các mơ vĩnh viễn. Nhờ hoạt động của mô phân sinh mà
cây sinh trưởng và phát triển. Trong q trình sinh phơi, mô phân sinh ngọn chồi phát triển ở vùng
giữa hai sơ khởi lá mầm (đối với cây hai lá mầm) hay ở gốc của thuẫn (đối với cây một lá mầm).
Mơ phân sinh ngọn chồi có đường kính 100 – 200 µ m (Bùi Trang Việt, 2000).
Khi cây trưởng thành, mơ phân sinh ngọn nằm ở ngọn của chồi chính, chồi bên của thân
và ở ngọn rễ. Các mô phân sinh ngọn hoạt động phân chia suốt cả đời sống của cây, giúp cây dài ra
(Nguyễn Như Khanh, 2009).

1.2.2.2. Cấu trúc của mơ phân sinh ngọn chồi
Có nhiều quan điểm về tổ chức của mô phân sinh ngọn chồi, trong đó quan điểm thường
gặp nhất là sự tổ chức của mô phân sinh ngọn chồi thành các vùng hay lớp phân biệt (Esau, 1967).
Mơ phân sinh ngọn chồi Arabidopsis có ba lớp: L1, L2, và L3. L1 là lớp ngoài cùng (lớp
ngoại vi), L2 là lớp bên trong lớp ngoại vi. L1 và L2 tạo nên vỏ. L3 là lớp thể và ở giữa là vùng
đỉnh. Vỏ cho các lớp biểu bì và dưới biểu bì của thân và lá. Một số ít tế bào từ các phân chia trong
vỏ và thể cho sơ khởi lá, thân, nụ nách và các bộ phận của hoa (nếu là nụ hoa) (Bùi Trang Việt,
2000).

Nếu chia mô phân sinh ngọn chồi theo vùng thì mơ phân sinh ngọn chồi được chia thành
ba vùng chính:
-

Vùng đỉnh (vùng mơ phân sinh chờ) chứa các tế bào có khơng bào lớn, tế bào chất

chứa ít rRNA, chu kì tế bào rất dài, hoạt tính phân chia thấp, tế bào chủ yếu ở pha G 1 . Vùng này cịn
R

R

được gọi là mơ phân sinh chờ vì chúng chỉ hoạt động khi mô phân sinh ngọn chuyển sang trạng thái
sinh sản.
-

Vùng bên (vùng khởi sinh, hay vùng phát sinh cơ quan) chứa các tế bào nhỏ hơn với

khơng bào nhỏ, giàu rRNA, có hoạt tính phân chia cao. Chu kì tế bào (pha G 1 ) ngắn. Đây là vùng
R

R

phát sinh lá và các mô của thân (bao gồm các mô dẫn).
-

Vùng lõi (vùng phát sinh mô) nằm dưới vùng đỉnh, chứa các tế bào có khơng bào lớn,

hàm lượng rRNA ít hơn so với vùng đỉnh, hoạt tính phân chia và chu kì phân chia tế bào của vùng
này ở mức trung gian so với vùng đỉnh và vùng bên (Bùi Trang Việt, 2000; Taiz và Zeiger, 2002).

Vùng lõi là vùng phát sinh mô lõi của thân trong khi các cơ quan khác đều xuất phát từ vùng bên
(Esau, 1967).
Theo một cách phân chia khác, tổ chức mô phân sinh ngọn chồi gồm tunica (vỏ) và
corpus (thể). Ở Arabidopsis và hầu hết cây hai lá mầm, tunica gồm lớp L1 bao phủ phía ngồi mơ
phân sinh ngọn chồi và lớp L2 nằm ngay dưới lớp L1. Corpus (được gọi là L3) không phải là một
lớp tế bào đơn lẻ mà là nhóm các tế bào ngay dưới tunica (Evert, 2006).

1.2.2.3. Sự phân bào của mô phân sinh ngọn chồi
Các tế bào ở lớp áo bọc ngoài hay tunica (hai hay ba lớp) xếp đều dặn, bao quanh các tế
bào trung tâm, và phân chia theo những mặt phẳng vng góc với bề mặt của phơi (anticlinial
division). Các lớp tế bào trung tâm (thể corpus) phân bố không đều đặn và phân chia theo các mặt
phẳng khác nhau (Nguyễn Như Khanh, 2009).

1.2.3. Hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi
1.2.3.1. Trong giai đoạn nảy mầm của hạt và tăng trưởng của cây mầm
Từ hợp tử, sự phát triển phơi trong hạt được kiểm sốt theo thời gian và khơng gian qua
hai giai đoạn chính: sinh phơi và trưởng thành của phôi. Kết quả của sự phát triển phôi trong nỗn là
hạt chín, vỏ nỗn sẽ mất hầu hết nước và tạo nên vỏ hạt bền chắc bao quanh phơi và nội nhũ. Vào
lúc đó, phơi ngừng phát triển và hạt ở vào trạng thái ngủ. Hạt sẽ không phát triển tiếp cho đến khi
nảy mầm. Như vậy, sự nảy mầm của hạt thường chỉ xảy ra sau một giai đoạn khô (giai đoạn ngủ) ở
cuối giai đoạn trưởng thành của phôi. Phôi đang ngủ bao gồm thân mầm và rễ mầm chứa mô phân
sinh đỉnh. Các mô phân sinh sẽ tạo ra các tế bào làm cho phôi dài ra khi hạt nảy mầm (Bùi Trang
Việt, 2000).
Sự nảy mầm của hạt được xem như là sự tái lập tăng trưởng của phơi. Q trình này bắt
đầu từ sự tái thu nước của hạt cho tới sự lú rễ mầm ra khỏi hạt. Các đặc tính quan trọng nhất của sự
nảy mầm là: hấp thu nước mạnh, hoạt tính biến dưỡng mạnh, và phát sinh nhiệt mạnh (Bùi Trang
Việt, 2000).
Sự nảy mầm cuả hạt gồm ba giai đoạn chính:
- Giai đoạn thu nước (6 – 12 giờ tùy loại hạt)

Hạt (nhất là phôi) thu nước mạnh, phồng lên và tăng trọng lượng tươi. Sự thu nước đi
kèm với sự gia tăng cường độ hô hấp, biểu hiện của sự tái lập hoạt tính biến dưỡng.
- Giai đoạn nảy mầm theo nghĩa hẹp (12 – 48 giờ)


Giai đoạn này bắt đầu bởi sự bão hòa nước và cường độ hô hấp ở mức cao của hạt, các
phản ứng biến dưỡng bắt đầu, các chất dự trữ bị thủy giải và được phơi đồng hóa. Kế đó, phôi tái
lập sự phân chia tế bào, vỏ hạt bị rách, rễ mầm lú ra khỏi các vỏ hạt (1 – 2 mm), thân mầm kéo dài
ra.
- Giai đoạn tăng trưởng của cây mầm
Trong giai đoạn này, hạt thu thêm nước và tăng thêm cường độ hô hấp, tương ứng với sự
tăng trưởng đáng kể của rễ mầm và thân mầm. Hoạt tính biến dưỡng của cây mầm (từ phơi) tăng
mạnh, nhưng hoạt tính biến dưỡng của mơ dự trữ (phôi nhũ, tử diệp) giảm mạnh, các chất dự trữ cạn
dần. Ở trạng thái này, sự khử nước làm hạt chết (Bùi Trang Việt, 2000).

1.2.3.2. Trong giai đoạn sinh sản của cây trưởng thành
Hoa được thành lập từ chồi ngọn hay chồi nách. Để một chồi dinh dưỡng trở thành sinh
sản, thực vật cần phải đạt tới trạng thái phát triển tối thiểu hay trưởng thành ra hoa. Sự chuyển tiếp
ra hoa gây nên các biến đổi sâu sắc của mô phân sinh ngọn, từ mô phân sinh dinh dưỡng thành mơ
phân sinh tiền hoa. Q trình ra hoa biểu thị qua sự thay đổi về hình thái và sinh lý của mô phân
sinh ngọn chồi (Bùi Trang Việt, 2000).
Như vậy, mô phân sinh ngọn chồi khi đã đạt đến một trạng thái nhất định nó sẽ diễn ra
các hoạt động biến đổi từ trạng thái tăng trưởng sinh dưỡng không hạn định sang trạng thái phát
triển sinh sản hạn định. Các biến đổi trong giai đoạn này thường không quan sát được bằng mắt
thường hoặc kính hiển vi, chỉ biết được bởi các phân tích bằng tế bào học hay sinh hố học, với sự
tăng mạnh hoạt tính biến dưỡng: rút ngắn chu kỳ tế bào, gia tăng hoạt tính phân chia, đặc biệt trong
vùng đỉnh (Bùi Trang Việt, 2000).
Mô phân sinh ngọn chồi tăng cường tổng hợp RNA, tăng tốc độ tổng hợp protein, các
enzym chuyển hóa (invertase) tăng cường hoạt động, số lượng ti thể gia tăng, hàm lượng sucrose và
ATP cũng tăng. Bên cạnh đó, chu trình tế bào ở mơ phân sinh được rút ngắn lại, tăng tỷ lệ phân chia

tế bào. Ở mô phân sinh dinh dưỡng, các tế bào ở vùng đỉnh phân chia rất chậm. Chính sự phân chia
nhanh của vùng đỉnh khiến cho mô phân sinh hoa lớn hơn mô phân sinh dinh dưỡng (Taiz và
Zeiger, 2002). Sự biến đổi này thể hiện rất rõ ở bộ máy dinh dưỡng, đặc biệt là sự kéo dài lóng thân
do sự phân chia tế bào mạnh của vùng dưới ngọn của mô phân sinh tiền hoa. Các biến đổi chỉ ở mức
tế bào nhưng rất quan trọng, quyết định sự biến đổi ở mức cơ quan sau này (Bùi Trang Việt, 2000).

1.2.4. Sự phát triển chồi
1.2.4.1. Sự phát triển chồi nách


Chồi nách hiện diện ở nách lá, được tạo bởi mô phân sinh ngọn và các phát thể lá xếp
chồng lên nhau. Sự phát triển của chồi nách (sự phát sinh chồi) bao gồm sự tổ chức của một mô
phân sinh ngọn chồi (có cấu trúc giống với mơ phân sinh ngọn của thân chính), sự kéo dài và sự
phân hố các mơ. Chồi nách có nguồn gốc ngoại sinh, ngược với nguồn gốc nội sinh của rễ nhánh
(Bùi Trang Việt, 2000).
Các chồi nách thường bị cản phát triển do bị chồi ngọn ức chế (hiện tượng ưu thế ngọn).
Hiện tượng này có thể do auxin tổng hợp ở ngọn di chuyển đến chồi nách và cản sự phát triển của
chồi nách (do hiệu ứng cản tăng trưởng của auxin) hoặc do có sự cạnh tranh dinh dưỡng (chồi ngọn
thu hút chất dinh dưỡng mạnh về phía nó) hoặc do auxin kích thích sự tiết chất cản (etylen hoặc
ABA) cản sự phát triển của chồi (Bùi Trang Việt, 2000).
Các chồi bên có thể được cảm ứng phát triển bằng cách phá bỏ ưu thế ngọn. Cho nên
người ta có thể cắt bỏ chồi ngọn để chồi nách phát triển. Trong ni cấy in vitro, các chồi nách có
thể được kích thích phát triển mạnh bởi việc bổ sung cytokinin vào mơi trường. Vai trị của
cytokinin lúc này là hạn chế ưu thế ngọn để các chồi bên có thể phát triển (Bùi Trang Việt, 2000).
Sự phát triển thân và nhánh: Thân phát triển từ chồi ngọn, nhánh từ chồi nách. Sự tăng
trưởng chồi nhờ mô phân sinh ngọn được bổ sung bởi sự tăng trưởng lóng nhờ mơ phân sinh lóng
(Bùi Trang Việt, 2000).
Sự phát triển lá: Lá bắt nguồn từ bề mặt của mơ phân sinh đỉnh dạng nón và do sinh
trưởng sơ cấp tạo nên. Lá có sự tăng trưởng bề mặt và đời sống giới hạn. Các tế bào trong sơ khởi lá
tiếp tục phân chia và gia tăng kích thước tạo nên cuống và phiến lá (Bùi Trang Việt, 2000).

1.2.4.2. Sự hình thành và phát triển chồi bất định
Chồi bất định xuất hiện không chỉ liên hệ với mơ phân sinh chóp mà cịn xuất hiện gần
vết thương, gần chỗ vết cắt, gần vùng phát sinh libe-mộc hoặc ngồi biểu bì. Vì vậy chồi có thể có
nguồn gốc nội sinh hoặc ngoại sinh do một sự khử phân hóa các tế bào trưởng thành. Chúng cũng
khởi sự bằng những phân chia tế bào và sắp xếp tế bào giống như sinh mơ chóp và có mạch gắn liền
với mạch của thân (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001).
Mô phân sinh ngọn chồi có thể từ tế bào biểu bì, mơ hàng rào, mơ khuyết hay mơ bao
quanh mạch của mơ cấy. Trước khi phân hóa để hình thành tầng phát sinh chồi được tạo mới, tế bào
đã phân hóa phải trải qua q trình tái hoạt động. Sự tái hoạt động này có thể được cảm ứng trên cây
nguyên bằng cách đàn áp các hiệu ứng cản tương quan (gỡ ưu tính ngọn bằng cách cắt bỏ chồi
ngọn) hay trên mô cấy nhờ các môi trường nuôi cấy có bổ sung các chất điều hồ thích hợp. Có hai


giai đoạn xảy ra trong quá trình tái hoạt động: giai đoạn khử phân hóa và giai đoạn tái phân hoá
(Gautheret, 1966; Bùi Trang Việt, 2009).
Trong giai đoạn khử phân hóa, tế bào đã phân hóa bắt đầu phân chia, các cơ quan bên
trong tế bào biến đổi để trở về trạng thái của các tế bào mô phân sinh thứ cấp (hạch nhân, không bào
lớn dần và ty thể, lạp thể phân chia thành các bóng nhỏ). Sau đó là bước chuyển tiếp từ tế bào ở
trạng thái mô phân sinh thứ cấp sang trạng thái mô phân sinh sơ cấp có khả năng sinh cơ quan. Lúc
này khơng bào phân chia thành những không bào nhỏ. Tế bào có thể tích nhỏ dần, vách mỏng, tế
bào chất đậm đặc, nhân và hạch nhân rất to (Bùi Trang Việt, 2009).
Tiếp theo là giai đoạn tái phân hóa của mơ phân sinh sơ cấp. Tế bào trở lại trạng thái mơ
phân sinh thứ cấp. Sự tái phân hóa cũng qua hai bước: bước một, tế bào trở về trạng thái mô phân
sinh hoạt động, các không bào trương nước và hợp thành khơng bào trung tâm, kích thước tế bào
gia tăng, ty thể dần trở về hình dạng đặc trưng; bước hai, các lạp phân hóa, các chất sống căn bản
(hạch nhân, tế bào chất…), chất dự trữ, các chất tiết (tanin, tinh dầu…) được tổng hợp. Sau đó, các
tế bào này có thể trở lại giai đoạn phân chia tế bào mới hay trực tiếp phân hóa mà khơng qua sự
phân chia tế bào (Bùi Trang Việt, 2000).
Trong tự nhiên, sự tạo mới chồi trực tiếp có thể xảy ra ở các chỗ khuyết trên lá một số

loại sống đời, từ mô phân sinh trong gân lá dương xỉ (Bùi Trang Việt, 2000).
Tóm lại, sự phát sinh chồi bất định gồm các giai đoạn:
-

Đầu tiên là sự hình thành các khối sinh mơ (có liên hệ với trung tâm mô phân sinh
chồi hay các mô phân sinh)

-

Tiếp theo là sự hình thành sơ khởi chồi

-

Cuối cùng là chồi bất định được hình thành từ sơ khởi dạng kim và đỉnh vòm (Soh và
Bhojwani, 1999).

1.3. Vai trò của auxin và các chất điều hoà tăng trưởng thực vật trong sự phát sinh
hình thái ngọn chồi
1.3.1. Vai trị của auxin
Auxin đóng vai trị trung tâm trong hoạt động của mơ phân sinh ngọn chồi (cần thiết cho
sự phân chia và tăng trưởng của tế bào). Tuy nhiên auxin lại phân bố không đồng đều trong mô
phân sinh ngọn. Một trong những yếu tố điều hòa lượng auxin là các chất vận chuyển auxin thuộc
các họ PIN và AUX (Vernoux và cs, 2010).
Auxin rất cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên nó có vai trị quan
trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật. Auxin được tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân


sinh (ngọn và lóng) và lá non (tức là các nơi có sự phân chia tế bào nhanh). Sau đó, auxin di chuyển
tới rễ và tích tụ trong rễ (Taiz và Zeiger, 2002; Bùi Trang Việt, 2000).
Ở mức tế bào, auxin kiểm soát sự phân chia, kéo dài và phân hố tế bào. Các tế bào biểu

bì hay dưới biểu bì phản ứng mạnh nhất với auxin. Auxin kích thích mạnh sự phân chia của tế bào
tượng tầng (tầng phát sinh libe- mộc), nhưng hầu như không tác động trên mơ phân sinh sơ cấp. Do
đó auxin tác động trên sự tăng trưởng theo đường kính. Đồng thời auxin giúp sự phân hóa của các
mơ dẫn, và có khả năng cảm ứng trực tiếp sự phân hoá tế bào nhu mô thành các tổ chức mô dẫn
(Bùi Trang Việt, 2000).
Nồng độ của auxin có ảnh hưởng trong sự kéo dài tế bào. Auxin kích thích mạnh sự kéo
dài tế bào diệp tiêu và tế bào vùng kéo dài dưới ngọn của thân. Sự kéo dài tế bào rễ cần những nồng
độ thấp hơn nhiều so với tế bào thân. Trong cả hai trường hợp, hiệu ứng auxin giảm sau một nồng
độ tối hảo, và trở nên độc ở các nồng độ quá cao. Hoạt tính kéo dài tế bào của auxin là do auxin tác
động lên bơm proton màng nguyên sinh chất. Sự kéo dài tế bào là một quá trình phức tạp: hấp thu
nước, dãn dài vách dưới sức trương, đặt các hợp chất mới của vách giữa các mạng vi sợi celluloz,
sinh tổng hợp protein và các chất khác (Bùi Trang Việt, 2000).
Trong quá trình tạo chồi
Auxin ở nồng độ thấp cần cho sự tạo chồi. Auxin kết hợp với cytokinin giúp sự tăng
trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Ở nồng độ cao, auxin
cản sự phát triển của phát thể chồi vừa được thành lập hay của chồi nách (Bùi Trang Việt, 2000).
Sự vận chuyển hữu cực của auxin có vai trị thiết lập, duy trì tính hữu cực của thực vật và
các cơ quan của chúng. Việc cản sự vận chuyển hữu cực của auxin có thể dẫn tới nhiều tính bất
thường, trong phơi và có thể dẫn đến sự chết. Tác dụng của auxin tùy thuộc vào kiểu tăng trưởng
hoặc phát triển cần nghiên cứu; loại và hàm lượng auxin nội sinh có trong mẫu cấy; tính nhạy của
mơ thực vật với auxin; sự tương tác qua lại giữa auxin nội sinh và auxin ngoại sinh; sự kìm hãm
hoạt tính của auxin (bị oxy hố hay liên kết) trong môi trường và trong mô cấy (Machakova và cs,
2008).
Trong quá trình tạo rễ
Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ và ở nồng độ thấp cần cho sự tạo chồi.
Trong hầu hết các lồi thực vật, sự hình thành rễ bất định đều được khởi phát bởi auxin, nhưng
trong một vài loài thì auxin ngoại sinh dường như ít ảnh hưởng. Sự tăng lượng AIA cần thiết trong
giai đoạn cảm ứng tạo sơ khởi rễ, nhưng sự giảm hàm lượng AIA sau đó cho phép sự kéo dài sơ
khởi rễ. Như vậy auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ, nhưng cản sự tăng trưởng của
các sơ khởi này (Bùi Trang Việt, 2000).

Số lượng rễ trên mỗi chồi thường tăng theo nồng độ auxin xử lý. Nhưng nếu nồng độ
auxin quá cao sẽ có sự hình thành callus, rễ có hình dạng khơng bình thường và khơng kéo dài, sau
đó thì sự tăng trưởng của chồi sẽ bị giảm (George, 1996). Điều này cho thấy, trong cùng một quá
trình sinh lý, auxin có thể có những hiệu ứng khác nhau, thậm chí đối nghịch tùy theo nồng độ và cơ
quan nuôi cấy. Ở một nồng độ nào đó, auxin có hiệu ứng khác nhau đối với các quá trình sinh lý
khác nhau của một cơ quan (như sự kéo dài và phát triển rễ), hay đối với một quá trình sinh lý của
những cơ quan khác nhau (như sự kéo dài của thân và rễ, sự phát triển chồi và rễ). Đối với sự phân
hóa cơ quan, auxin có hiệu ứng thay đổi theo thời gian, vì hàm lượng auxin thay đổi theo sự phát
triển (Bùi Trang Việt, 2000).
Tóm lại, auxin có vai trò quan trọng trong sự đáp ứng của thực vật đối với các tín hiệu từ
mơi trường như ánh sáng và trọng lực; sự kiểm soát các mối tương quan trong ưu thế ngọn; sự acid
hóa vách tế bào, sự tăng trưởng kéo dài tế bào; sự phân chia tế bào; sự hình thành mơ sẹo; sự phân
hóa mơ dẫn và phát triển rễ… (Bùi Trang Việt, 2000).

1.3.2. Vai trị của cytokinin
Cytokinin được tổng hợp chủ yếu ở mơ phân sinh ngọn rễ và được vận chuyển trong
xylem đến chồi.
Hoạt động của cytokinin trong sự tăng trưởng tế bào:
+ Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin. Cytokinin tác động
trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào.
+ Cytokinin giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein. Trong thân và rễ,
cytokinin cản sự kéo dài nhưng kích thích tăng rộng tế bào (sự tăng trưởng củ). Cytokinin ngăn cản
sự lão hóa, thúc đẩy sự trưởng thành của diệp lạp và là nhân tố chính điều khiển q trình tái sinh
mạch giúp cho sự tạo chồi (Taiz và Zeiger, 2002; Bùi Trang Việt, 2000).
Hoạt động của cytokinin trong sự tạo cơ quan:
+ Ở nồng độ cao, cytokinin giúp tạo các cụm chồi. Số lượng chồi hình thành tùy thuộc
vào nồng độ cytokinin. Tuy nhiên cũng có những bất lợi nhất định trong việc điều chỉnh nồng độ để
cảm ứng tạo nhiều chồi: Chồi được tạo ra trở nên nhỏ, không thể kéo dài đến một kích thước nhất

định để có thể được tách ra cho sự hình thành rễ, và tạo ra những lá bất thường (Edwin, 1996).
+ Ở nồng độ thấp, cytokinin kích thích sự phát triển chồi nách. Nồng độ cao hơn sẽ cảm
ứng hình thành chồi bất định nhưng chồi rất khó ra rễ.
+ Ở một số lồi thực vật, mặc dù sự hình thành chồi được cảm ứng bởi cytokinin nhưng
chồi không xuất hiện cho đến khi khúc cắt được chuyển sang mơi trường giảm hoặc khơng có
cytokinin. Cytokinin cần cho giai đoạn cảm ứng tạo chồi nhưng kìm hãm sự kéo dài của chồi.


Những vấn đề này có thể khắc phục bằng cách giảm nồng độ CĐHTTTV sau một hoặc vài lần cấy
chuyền để chồi được phát triển tốt nhất (Edwin, 1996).
Cytokinin kích thích sự tăng trưởng của chồi nách và giảm ưu thế ngọn. Do đó trong ni
cấy, người ta thường bổ sung một hay vài loại cytokinin vào môi trường để cảm ứng tăng trưởng
của một vài chồi nhỏ từ mỗi mẫu cấy (Bùi Trang Việt, 2000).
Ảnh hưởng của cytokinin trong sự nuôi cấy mô và cơ quan tùy thuộc vào loại cytokinin
được sử dụng, kiểu mô cấy, loại thực vật được ni cấy, tình trạng mơ cịn non hay đã già. Trong
nuôi cấy chồi, hầu hết các mẫu cấy từ các lồi thực vật khác nhau đều cần có cytokinin. BA kích
thích sự tăng sinh chồi nách ở cây Castanea trong thí nghiệm của Vieitez và cs (1985) trong khi đó
kinetin thì khơng có ảnh hưởng. Ở cây Corylus avellana, BA 5 mg/l cho tỷ lệ tăng sinh chồi cao
nhất từ những mẫu cấy non, nhưng những mẫu cấy đã trưởng thành cần zeatin 10 mg/l (Staden và
cs, 2008).

1.3.3. Sự phối hợp auxin và cytokinin trong phát sinh chồi
1.3.3.1. Tăng sinh chồi bên
Tỷ lệ tăng sinh chồi trong nuôi cấy chồi thường tùy thuộc vào nồng độ cytokinin áp dụng.
Ở một số thực vật, sự kết hợp giữa cytokinin và auxin giúp hiệu quả tăng sinh chồi cao hơn. Khi
cytokinin q cao, nhiều chồi nhỏ hình thành nhưng khơng thể kéo dài được hoặc có lá bị biến dạng
(Staden và cs, 2008). Dưới ảnh hưởng của tỉ lệ cytokinin cao, chồi hình thành dễ bị hiện tượng thủy
tinh thể. Mặt khác, chồi hình thành trên mơi trường có nồng độ cytokinin cao thường rất khó tạo rễ
(George, 1996).
1.3.3.2. Sự hình thành chồi bất định

Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô
phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Tuy nhiên, ở nồng độ cao, auxin cản sự phát triển của phát thể chồi
vừa thành lập hay của chồi nách, các chồi bây giờ vào trạng thái tiềm sinh. Như ở cỏ ba lá,
cytokinin riêng rẽ cảm ứng tạo chồi và số lượng chồi tăng nhanh, nhưng sự thêm auxin vào môi
trường ni cấy sẽ làm cho chồi khó hình thành hoặc tạo những mô sẹo không mong muốn
(Bhojwani, 1981 trong Edwin, 1996). Ở Brassica alboglabra, số lượng chồi hình thành trên mơi
trường có kinetin sẽ giảm mạnh nếu bổ sung AIA, IBA hoặc NAA (Pua và cs, 1989 trong Edwin,
1996).
Cytokinin có hiệu quả trong việc tạo chồi trực tiếp hay gián tiếp. Tác dụng này của
cytokinin có khi hiệu quả hơn khi phối hợp với auxin ở tỉ lệ thích hợp. Tỷ lệ cytokinin với auxin
quyết định kiểu tái sinh cơ quan từ mơ sẹo chưa phân hóa in vitro: tỷ lệ auxin/cytokinin cao giúp sự


tạo rễ; tỷ lệ auxin/cytokinin thấp giúp sự tạo chồi. Một tỷ lệ cân bằng giữa hai chất ĐHTTTV trên sẽ
chỉ tạo nên khối mơ sẹo khơng phân hóa (Mok và cs, 1994).
Như vậy, cytokinin hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng, nhưng đồng thời cũng có sự đối
kháng giữa auxin (giúp sự tạo rễ) và cytokinin (giúp sự tạo chồi); sự cân bằng giữa hai hormon này
là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển (Bùi Trang Việt, 2000).

1.3.3.3. Sự hình thành rễ
Nồng độ cytokinin cao (0,5–10 mg/l) thường cản hay làm trì hỗn sự hình thành rễ, đồng
thời cản sự tăng trưởng rễ, và làm giảm hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin. Vì vậy, cytokinin
thường khơng được sử dụng trong kích thích tạo rễ của chồi. Đôi khi người ta cũng thấy cytokinin
cảm ứng tạo rễ và kích thích tăng trưởng rễ hoặc kích thích sự hình thành rễ bất định khi mơi trường
khơng có auxin. Trong hầu hết các trường hợp này thì lượng cytokinin cần rất thấp. Ví dụ chồi của
củ cải đường tạo rễ trên mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l kinetin. Hay ở cây Rosa hybrida thì cần
thiết phải thêm BA 1 mg/l cùng với IBA để cảm ứng hình thành và phát triển rễ (Staden và cs,
2008).
Khơng chỉ auxin và cytokinin mà vách tế bào, bộ xương vi ống (microtubule
cytoskeleton) cũng liên quan tới sự phát sinh hình thái thực vật nói chung và hoạt động của mô phân

sinh ngọn chồi (Ferguson và Beveridge, 2009; Fleming, 2005; Hamant và cs, 2008).


CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1.Vật liệu
- Hạt Đậu đỏ Vigna angularis (được đóng gói tại cơng ty TNHH Xuân Hồng 44/12 Phan
Xích Long Phường 16. Quận 11. Thành phố Hồ Chí Minh).
- Cây in vitro 6 ngày tuổi được cấy từ hạt Đậu đỏ.

2.2.Phương pháp
2.2.1.Quan sát sự tăng trưởng cây Đậu đỏ Vigna angularis ở trong vườn
Gieo hạt đã nảy mầm (rễ mầm dài 1-2 mm) vào các chậu (đường kính: 20 cm, chiều cao:
30 cm), mỗi chậu gieo 7 hạt. Lặp lại 3 lần. Theo dõi sự tăng trưởng của cây Đậu về chiều dài cây,
chiều dài lá, dạng lá, số lượng nhánh, thời gian tăng trưởng của cây, thời gian ra hoa kết quả, thời
gian thu hoạch hạt.

2.2.2.Khử trùng hạt
Hạt Đậu đỏ được rửa sạch dưới vòi nước 30 phút, rửa lại bằng xà phòng trong 5 phút, rửa
sạch xà phòng và rửa lại với nước cất 4 lần. Sau đó hạt được chuyển vào Erlen. Lắc hạt với cồn 700
P

trong vòng 1 phút và rửa sạch cồn bằng nước cất. Tiếp tục khử trùng bằng dung dịch HgCl 2 0,1 %
R

R

trong 5phút. Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng (5 lần). Sau đó cấy hạt vào các
ống nghiệm có đường kính 22 mm, dài 20 cm, chứa 10 ml môi trường MS (Murashige và Skoog,
1962).

2.2.3. Ảnh hưởng của AIA theo nồng độ lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi
cây Đậu đỏ
Khúc cắt ngọn chồi với chiều dài 5 mm (đã cắt bỏ 2 lá thứ nhất) từ cây in vitro 6 ngày
tuổi trên các môi trường MS bổ sung AIA riêng rẽ ở các nồng độ 0,01; 0,1; 1; 2; 5; và 10 mg/l để
khảo sát sự tăng trưởng chồi. Mỗi môi trường nuôi cấy gồm 5 mẫu cấy với 3 lần lặp lại. Kết quả
được ghi nhận là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại (15 mẫu cấy).
Sau 10 ngày nuôi cấy, các chỉ tiêu sau được ghi nhận:
- Chiều dài khúc cắt (từ vị trí gốc cắt đến chồi ngọn)
- Chiều dài lá (từ vị trí cuống lá đến ngọn lá)
- Số lượng rễ / khúc cắt
- Chiều dài trung bình của rễ / khúc cắt

P


Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ 25 ± 20 C , quang kỳ 12 giờ, ánh sáng 2.500 ± 200 lux, độ ẩm
trung bình 70 %.
Thí nghiệm này được dùng để xác định nồng độ auxin (cản sự tăng trưởng của chồi) được
sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.

2.2.4. Ảnh hưởng của AIA 2 mg/l theo thời gian lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn
chồi cây Đậu đỏ
+ Khảo sát sự tăng trưởng chồi trên môi trường AIA 2 mg/l và sau đó chuyển sang mơi
trưịng MS theo thời gian
Nuôi cấy khúc cắt ngọn chồi trên môi trường AIA 2 mg/l, sau đó chuyển khúc cắt ngọn
chồi qua môi trường MS sau 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày nuôi cấy. Mỗi mốc thời gian được thực hiện
trên 5 mẫu cấy với 3 lần lặp lại. Kết quả ghi nhận là giá trị trung bình từ 3 lần lặp lại (15 mẫu cấy).
Sau 7 ngày nuôi cấy, ghi nhận các chỉ tiêu như sau:
- Chiều dài khúc cắt (từ vị trí gốc cắt đến chồi ngọn)
- Chiều dài lá (từ vị trí cuống lá đến ngọn lá)

- Chiều dài trung bình của rễ / khúc cắt
- Số lượng rễ / khúc cắt
Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ 25 ± 20 C , quang kỳ 12 giờ, ánh sáng 2.500 ± 200 lux, độ ẩm
trung bình 70 %.
+ Khảo sát sự tăng trưởng chồi trên môi trường MS và sau đó chuyển sang mơi trưịng
AIA 2 mg/l theo thời gian
Nuôi cấy khúc cắt ngọn chồi trên môi trường MS và sau đó chuyển sang mơi trường AIA
2 mg/l, được xử lý theo các mốc thời gian sau 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày. Mỗi mốc thời gian được
thực hiện trên 5 mẫu cấy với 3 lần lặp lại. Kết quả ghi nhận là giá trị trung bình từ 3 lần lặp lại (15
mẫu cấy).
Sau 7 ngày nuôi cấy ghi nhận các chỉ tiêu như sau:
- Chiều dài khúc cắt (từ vị trí gốc cắt đến chồi ngọn)
- Chiều dài lá (từ vị trí cuống lá đến ngọn lá)
- Chiều dài trung bình của rễ / khúc cắt
- Số lượng rễ / khúc cắt
Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ 25 ± 20 C , quang kỳ 12 giờ, ánh sáng 2.500 ± 200 lux, độ ẩm
trung bình 70 %.


2.2.5. Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái chồi
Khúc cắt ngọn chồi với chiều dài 5 mm (đã cắt bỏ 2 lá thứ nhất) từ cây in vitro 6 ngày
tuổi được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA riêng rẽ hay AIA phối hợp với BA. Các xử
lý được thực hiện theo thời gian để khảo sát sự tăng sinh và tăng trưởng chồi. Mỗi môi trường nuôi
cấy gồm 5 mẫu cấy với 3 lần lặp lại. Kết quả ghi nhận là giá trị trung bình từ 3 lần lặp lại (15 mẫu
cấy).
Sau 14 ngày nuôi cấy, ghi nhận các chỉ tiêu sau:
-

Chiều dài lá (chiều dài của lá tính từ cuống lá đến ngọn lá )

-

Chiều dài khúc cắt (từ gốc khúc cắt đến vị trí cuống lá thứ 1)

-

Chiều dài chồi (từ vị trí cuống lá thứ 1 đến đỉnh ngọn chồi )

-

Số chồi nách / khúc cắt

-

Số lượng rễ / khúc cắt

-

Chiều dài trung bình rễ / khúc cắt

Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ 25 ± 20 C , quang kỳ 12 giờ, ánh sáng 2.500 ± 200 lux, độ ẩm
trung bình 70 %.

2.2.5.1. Ảnh hưởng của BA riêng rẽ lên sự phát triển của khúc cắt ngọn chồi cây
Đậu đỏ in vitro 6 ngày tuổi
Khúc cắt ngọn chồi với chiều dài 5 mm (đã cắt bỏ 2 lá thứ nhất) từ cây

in vitro 6

ngày tuổi được nuôi cấy trên mơi trường MS có bổ sung BA ở các nồng độ 0,1; 0,5; và 1 mg/l để

khảo sát sự tăng sinh chồi.

2.2.5.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa AIA 2 mg/l và BA theo thời gian lên sự tăng
sinh và tăng trưởng chồi

* Xử lý AIA 2 mg/l kết hợp BA ở các nồng độ 0,1 mg/l; 0,5 mg/l; 1 mg/l trong 14
ngày.
Số ngày xử lý
AIA và BA

Ngày 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14


* Xử lý AIA 2 mg/l kết hợp BA ở các nồng độ 0,1 mg/l; 0,5 mg/l; 1 mg/l trong 1 ngày
và chuyển sang môi trường MS trong 13 ngày tiếp theo.
Số ngày xử lý
AIA và BA

Ngày 0

1

MS

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

* Xử lý AIA 2 mg/l kết hợp BA ở các nồng độ 0,1 mg/l; 0,5 mg/l; 1 mg/l trong 4 ngày và
chuyển sang môi trường MS trong 10 ngày tiếp theo.
Số ngày xử lý
AIA và BA

Ngày 0

1

2

3

MS

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

* Xử lý AIA 2 mg/l trong 1 ngày và chuyển sang môi trường bổ sung BA 0,1 mg/l;
0,5 mg/l; 1 mg/l trong 13 ngày tiếp theo.
Số ngày xử lý
AIA

Ngày 0

BA

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

* Xử lý AIA 2 mg/l trong 4 ngày và chuyển sang môi trường bổ sung BA 0,1 mg/l;
0,5 mg/l; 1 mg/l trong 10 ngày tiếp theo.
Số ngày xử lý
AIA

Ngày 0

1

2

BA

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Tất cả các thí nghiệm trên được tiến hành trong điều kiện: Nhiệt độ 25 ± 20 C , quang kỳ
12 giờ, ánh sáng 2.500 ± 200 lux, độ ẩm trung bình 70 %.

2.2.6. Quan sát hình thái giải phẫu
Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển chồi và chồi nách được quan sát dưới
kính hiển vi quang học thơng qua sự cắt và nhuộm hai màu đỏ carmine - xanh iod.


2.2.7. Đo cường độ quang hợp và cường độ hô hấp
Cường độ quang hợp và cường độ hô hấp của chồi ngọn từ khúc cắt ngọn chồi được đo
bằng máy Leaflab 2/LD2 (Hansatech) ở nhiệt độ 270C ± 0,50C
P

P

P

P

Cường độ quang hợp được đo dưới ánh sáng 2.500 ± 200 lux, được thể hiện bằng lượng
khí O 2 thải ra (µmol O 2 /g TLT/phút) và là giá trị trung bình của 5 lần lặp lại.

R

R

R

R

Cường độ hơ hấp được đo ở trong tối, được thể hiện bằng lượng khí O 2 thu vào (µmol
R

R

O 2 /g TLT/phút) và là giá trị trung bình của 5 lần lặp lại.
R

R

2.2.8. Đo hoạt tính các chất điều hồ tăng trưởng thực vật
Khúc cắt ngọn chồi 6 ngày tuổi in vitro trên ba môi trường: MS (đối chứng); AIA 2
mg/l trong 1 ngày trước khi chuyển sang MS; AIA 2 mg/l trong 7 ngày ni cấy liên tiếp được dùng
để đo hoạt tính CĐHTTTV nội sinh và được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng cao năng
(HPLC) tại phịng thí nghiệm Phân tích trung tâm của trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành
phố Hồ Chí Minh (Phụ lục bảng 1).

2.2.9.Xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình Statistical Program Scientific System
(SPSS), phiên bản 11.5 dùng cho Windows. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức xác suất p = 0,05 (p:
probability) của giá trị được biểu hiện bằng các mẫu tự khác nhau.

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả
3.1.1. Quan sát sự tăng trưởng của cây trong vườn
Cây Đậu đỏ thường phân nhánh ở nách cuống lá thứ ba hoặc thứ tư trở lên ngọn (Ảnh
3.1). Thời gian tăng trưởng của cây khoảng 5- 6 tuần. Cây bắt đầu ra hoa từ tuần thứ 6. Hoa mọc
thành từng chùm ở nách lá hoặc đầu cành. Chùm gồm 5-6 hoa, nhưng thường chỉ có 2 hoa trong
mỗi chùm thụ phấn và kết trái nên mỗi nhánh chỉ có 2 trái (Ảnh 3.2).
Hoa có màu vàng nhạt, dài 2,5 ± 1 cm. Trái dài 12 ± 2 cm, chứa 12 ± 2 hạt. Hạt có màu
nâu đỏ (Ảnh 3.3). Từ khi trái được hình thành cho đến khi trái chín và thu hoạch khoảng 2-3 tuần.
Như vậy, thời gian từ khi gieo hạt cho đến khi thu hoạch trái của cây Đậu đỏ là 70- 80 ngày.
Rễ của cây Đậu đỏ đang tăng trưởng có các nốt sần do vi sinh vật cộng sinh cố định đạm
Rhizobium sp. (Ảnh 3.4).

Ảnh 3.1. Nhánh và lá của cây Đậu đỏ trong giai đoạn ra hoa.