BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH TÁCH VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC PHÔI CHUỘT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HCM
KHOA SINH HỌC
*****  *****

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

ĐỀ TÀI :

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH TÁCH
VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC PHÔI CHUỘT
MÃ SỐ : CS.2004.23.64

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI:

TS. Dương Thò Bạch Tuyết

Thành Phố Hồ Chí Minh - 12/2005


Cộng tác viên:

ThS.Phan Kim Ngọc
ThS.Nguyễn Đăng Quân
CN.Phạm Văn Phúc
(ĐHKHTN Tp. HCM)
CN.Lê Phan Quốc
CN.Trương Văn Trí
(ĐHSP Tp.HCM)

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AS

Adult stem cell

Tế bào mầm trưởng thành

D`MEM

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

Môi trường D`MEM

dpc

day postcoitum

Ngày sau giao phối

Ebs

Embryonic bodys

Thể phôi

EC

Embryonic carcinoma

Tế bào khối u

EGC

Embryonic germ cell

Tế bào mầm phôi

ES

Embryonic stem cell

Tế bào gốc phôi

FBS

Fetal bovine serum

FGF

Fibroblast growth factor

GC

Germ cell

Tế bào mầm

ICM

Inner mass cell

Khối tế bào bên trong

LIF

Leukimia inhibitory factor

MEF

Mouse embryonic fibroblast

MHC

Major Histocompatibitity complex

PGC

Primordial germ cell

Huyết thanh bào thai bò
Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi

Nhân tố ức chế bạch cầu
Tế bào fibroblast phôi chuột
Phức hợp tương hợp mô
Tế bào mầm sinh dục sơ khai


LỜI MỞ ĐẦU

Thế kỷ 21 - với sự bùng nổ của thành tựu Công Nghệ Sinh học đã đem lại
nguồn lợi to lớn cho cuộc sống nhân loại. Con người không ngừng tìm kiếm những
hướng nghiên cứu mới trong Sinh học Phân tử và Sinh học tế bào. Đặc biệt là việc
nghiên cứu tế bào gốc (Stem cell) nhằm tận dụng nguồn giá trò vô tận của loại tế
bào này trong công tác chữa bệnh nhất là bệnh nan y.
“Tế bào gốc” đã trở thành một khái niệm không còn xa lạ trong lónh vực YSinh học do những đặc tính ưu việt của nó. Tuy nhiên Công nghệ tế bào gốc (Stem
cell biotech) cũng đã trở thành nỗi băn khoăn cho nhân loại khi nó được nghiên cứu
và thao tác trên chính con người.
Nhiều quốc gia trên thế giới đã cho phép tiến hành các thao tác trên tế bào gốc
phôi người (Human embryo) và cũng có nhiều nước cấm, trong đó có Việt Nam.
Vấn đề này còn đang có nhiều tranh cãi và hiển nhiên sẽ còn bò hạn chế cho đến khi
tìm ra các phương pháp kiểm soát chặt chẽ.
Trong các đối tượng nghiên cứu phổ biến hiện nay, chuột nhắt trắng có lẽ là khá
quen thuộc trong phòng thí nghiệm vì những đặc tính thuận lợi của nó: kích thước
nhỏ, vòng đời ngắn, đặc điểm sinh lý gần với người …
Việc thu nhận tế bào gốc từ phôi chuột đã được thực hiện từ rất lâu trên thế giới
và đã đạt được nhiều thành tựu. Tuy nhiên, lónh vực nghiên cứu này còn rất hạn chế
ở Việt Nam.
Để bắt đầu tiếp cận với đối tượng nghiên cứu mới này, chúng tôi bước đầu
nghiên cứu qui trình tách và nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột.


Mặc dù bước đầu đã đạt được một số kết quả nhất đònh nhưng chắc chắn rằng
còn nhiều điều chưa hoàn thiện. Rất mong sự quan tâm và góp ý của những ai quan
tâm đến vấn đề này để đề tài được hoàn thiện hơn.

Chân thành cảm ơn.

TP HCM, tháng 12/2005
Thay mặt nhóm tác giả

Dương Thò Bạch Tuyết


PHAÀN 1

TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU


1. TẾ BÀO GỐC
1.1. Khái niệm
Tế bào gốc là một loại tế bào chưa chuyên hoá, có khả năng phân chia vô hạn
trong các tổ chức sống, có nguồn gốc từ phôi, bào thai hay mô cơ thể trưởng thành.
Dưới điều kiện thích hợp hay có tín hiệu kích thích, tế bào gốc sẽ phát triển thành
nhiều loại tế bào chuyên hoá tạo thành các cơ quan hay tổ chức của cơ thể. [1][2]
1.2. Đặc điểm
 Có khả năng phân chia vô hạn.
 Cấu trúc di truyền (Bộ NST lưỡng bội) trong các tế bào vẫn duy trì và ổn
đònh với mỗi loài.
 Có thể biệt hoá thành các loại tế bào chuyên hoá khác nhau thu từ 3 lớp
mầm nguyên thủy.
 Có khả năng nhân dòng tế bào.[1][2]
1.3. Phân loại
Gồm 2 nhóm chính : [7][9]
 Tế bào gốc phôi (Embryonic Stem Cell – ES)
 Tế bào gốc phôi – ES
 Tế bào mầm phôi (Embryonic Germ Cell – EGC)
 Tế bào gốc trưởng thành (Adult Stem Cell – AS)

1.4. Sơ lược tình hình nghiên cứu

Các tế bào gốc phôi (ES _ Embryo stem cell, ) lần đầu tiên được cô lập vào
những năm 1980 bởi nhiều nhóm nghiên cứu làm việc độc lập. Những nhà nghiên
cứu này đã nhận ra đặc tính biệt hóa đa hướng của tế bào ES để cho ra các loại tế
bào của cả ba lớp mầm sơ khởi.


Gossler và cộng sự đã miêu tả khả năng và lợi điểm của việc dùng tế bào ES để
tạo ra được các động vật chuyển gene. Thomas và Capechi đã báo cáo về khả năng
biến đổi bộ gene của các tế bào ES bằng tái tổ hợp tương đồng.
Smithies và các đồng nghiệp sau đó đã chứng minh rằng các tế bào ES được biến
đổi gen khi vào Blastocyst, có thể truyền lại những biến đổi di truyền này qua các
dòng tế bào .
Ngày nay các biến đổi di truyền trên bộ gene chuột bằng kỹ thuật tế bào ES là
một cách tiếp cận quan trọng để tìm hiểu chức năng của các tế bào động vật hữu
nhũ in vivo. Các nghiên cứu về các tế bào ES của các động vật hữu nhũ: chuột đồng,
chuột, chồn, heo và bò đã được công bố; tuy nhiên, chỉ có tế bào ES chuột là thành
công trong việc truyền lại các biến đổi di truyền từ tế bào ES thông qua dòng tế bào
mầm sinh dục.
Gần đây, các quan tâm về các tế bào gốc đã tăng mạnh nhờ những báo cáo về
cô lập tế bào ES ở người và linh trưởng.
Các công trình tạo phôi lai giữa người và thỏ, biến tế bào gốc thành trứng và tinh
trùng, thu tế bào mầm mà không làm chết phôi … đã thu được nhiều kết quả khả
quan trong hai thập kỷ qua.
Đặc biệt, vào tháng 5/2004 A. Melton và cộng sự đã biệt hoá 17 loại tế bào
khác nhau từ ES thu nhận từ khối tế bào bên trong của blastocyst ở người.
Các nhà khoa học Hàn quốc đã tỏ ra vượt trội và đã có các công trình có tính
tiên phong trong lónh vực thu nhận tế bào gốc phôi người.
Tính đến nay, trên thế giới, ít nhất đã có 4 ngân hàng tế bào gốc ra đời và đi
vào hoạt động (Hàn quốc, Anh, Mỹ, Trung quốc).

Hình 1.1 : a) Blastocyst

b) phôi người giai đoạn 8 tế bào

Riêng ở Việt Nam, việc nghiên cứu tế bào gốc chỉ mới đang trong giai đoạn
khởi đầu và được tập trung chủ yếu tại hai trung tâm lớn (Đại học Khoa học Tự
nhiên Hà nội và Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM). Mặc dầu vậy, các phòng
Thí nghiệm công nghệ cao của hai Trường nói trên cũng đã đạt được một số thành
tựu làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về tế bào gốc. Chẳng hạn như xây dựng
các quy trình thu nhận nguồn phôi in vitro, in vivo từ động vật làm nguyên liệu cho
khai thác tế bào gốc, cấy ghép da thu được từ nuôi cấy tế bào để điều trò các ca
bỏng, ghép tế bào gốc CD34+ máu ngoại vi để để điều trò bệnh lý ác tính, thu tế
bào gốc sinh máu từ tuỷ xương, cuống rốn … [7][9]

2. TẾ BÀO GỐC PHÔI
2.1. Khái niệm và đặc điểm
Tế bào gốc phôi được đònh nghóa bởi nguồn gốc của nó, chúng có nguồn gốc từ
dạng blastocyst của phôi. Blastocyst là một dạng phát triển tất yếu của phôi trước
khi bám vào thành tử cung. Ở giai đoạn này, phôi chuột gồm lớp tế bào ngoài (ngoại
phôi bì), khoang phôi và khối tế bào bên trong.


Tế bào gốc tăng nhanh về số lượng và biệt hóa chức năng thành các cơ quan
trưởng thành. Nếu tách tế bào gốc ra khỏi phôi và chuyển chúng vào một cơ quan
khác hay cơ thể trưởng thành, chúng có thể hòa nhập, tiếp tục phân chia và thể hiện
khả năng chuyên biệt theo cơ quan đó.
Tương tự, nếu các tế bào này được cô lập invitro, tạo dòng (colony) và tác động
biệt hóa, chúng sẽ có khả năng biến đổi hình thái và đặc điểm sinh lý để cho các
dạng tế bào khác trong phòng thí nghiệm.[1][2]

Hầu hết những tế bào trong cơ thể đều có nguồn gốc từ sự tự sao chép tế bào
gốc. Do đó, các nhà khoa học nhận thấy cần phải phát triển đặc điểm đặc biệt này
để giúp tế bào gốc biệt hóa tốt hơn. Austin Smith đã xác đònh các đặc điểm cụ thể
của tế bào gốc phôi như sau:
 Chuyển hóa từ lớp tế bào bên trong hay nội phôi bì của blastocyst.
 Tồn tại và duy trì ổn đònh bộ nhiễm sắc thể ở dạng lưỡng bội.
 Có thể phát triển thành các loại tế bào khác nhau và xuất phát từ 3 lớp mầm
riêng biệt của phôi (nội bì, trung bì và ngoại bì).
 Có khả năng hợp thành một thể thống nhất trong tất cả các mô thai trong suốt
thời kỳ phát triển.
 Có khả năng nhân dòng tế bào và phát triển thành tế bào trứng và tinh trùng.
 Biểu hiện nhân tố sao chép Octo-4, làm hoạt hóa hay kìm hãm một gene đích
và duy trì sự phát triển nhanh của tế bào gốc phôi không biệt hóa.
 Có thể tiếp tục phát triển và tự đổi mới chính nó.
 Dòng các tế bào gốc phôi đơn bào có thể phát triển thành dòng tế bào thuần
hay dòng tế bào có nguồn gốc như nhau.
 Trong tổng hợp DNA, khác với tế bào sinh dưỡng, tế bào gốc phôi không đòi
hỏi các tác nhân kích thích bên ngoài khi bắt đầu sao chép DNA.


 Ở mỗi tế bào sinh dưỡng của động vật hữu nhũ cái, một trong hai nhiễm xắc
thể X trở nên bất hoạt hoàn toàn , nhưng sự bất hoạt của nhiễm sắc thể X không
xuất hiện ở tế bào ES.[1][2][7][9]

Hình 1.2: Sơ đồ biệt hóa các tế bào từ túi phôi ở người


2.2. Nguồn gốc của tế bào gốc phôi
Phôi động vật có vú khi phát triển thì từng đám tế bào trong đám đại phôi bào
chìm xuống, trước khi phôi bám vào thành tử cung. Đây là các tế bào đa năng, có

nghóa là chúng có khả năng phát triển thành các tế bào của 3 lớp mầm sơ cấp.
Các tế bào đa năng này được hình thành từ khối tế bào bên trong của phôi ở giai
đọan túi phôi, sau đó một số trong chúng di chuyển ra phía ngoài để tạo ngoại phôi
bì.
Mặt khác các tế bào đa năng này cũng có khả năng kéo dài sự tự đổi mới tức là
chúng có thể không biệt hóa theo sơ đồ đònh sẵn.
Các tế bào ở vùng nằm sát giữa ngoại phôi bì và khối tế bào bên trong sẽ tạo ra
tế bào gốc phôi tốt nhất.[9][10]

3. TẾ BÀO MẦM SINH DỤC
3.1. Khái niệm
Tế bào mầm sinh dục (gọi tắt tế bào mầm – Germ Cell ) là những tế bào gốc đa
năng có thể phân chia liên tục vừa tự làm mới vừa biệt hóa tạo thành các giao tử
(tinh trùng, trứng) từ đó tạo ra cơ thể mới.[5]
3.2. Sự hình thành và tồn tại của các tế bào mầm
Trong quá trình phát triển của phôi, hợp tử sau khi được tạo thành, qua những
lần phân chia đầu tiên các tế bào con được sinh ra. Những tế bào này sẽ phát triển
theo các hướng khác nhau với cấu trúc và chức năng riêng biệt.
Một trong những hướng biệt hóa là hướng hình thành nên các tế bào mầm sơ
khai (tế bào mầm sinh dục sơ khai – Primordial Germ Cell – PGC ). Nguyên nhân
tạo ra hướng biệt hóa là vì trong tế bào chất của hợp tử chứa nhiều nhân tố ‘‘quyết
đònh’’ (determint factor), các nhân tố này lại phân bố không đồng đều. Do đó, khi
hợp tử phân cắt thì mỗi tế bào con sẽ nhận được một phần tế bào chất có chứa các
nhân tố ‘‘quyết đònh’’ có thành phần và hàm lượng không giống nhau.


Những tế bào con nào nhận được nhân tố này sẽ biệt hóa theo hướng mà nhân tố
quyết đònh quy đònh.[4][5]
Các tế bào mầm sinh dục xuất hiện từ giai đoạn khá sớm trong sự phát triển của
phôi, đó là giai đoạn phôi vò hóa (phôi ba lá). Các tế bào ở rãnh sinh dục (PGC) là

nền tảng cho dòng tế bào mầm sinh dục. Thế hệ con cháu của chúng sẽ hình thành
nên các giao tử ở động vật trưởng thành. Các tế bào PGC giữ vai trò quan trọng
trong sự sống sót của một loài.
Ở động vật hữu nhũ nói chung và chuột nói riêng, PGC là một quần thể các tế
bào di động. Chúng được hình thành trong quá trình phát triển của phôi, sau đó di
chuyển, khếch đại và đònh cư ở bộ phận sinh dục.
Các tế bào mầm lần đầu tiên được xác đònh khi có một dấu hiệu yếu của những
tế bào dương tính với phản ứng alkaline phosphatase tại rãnh sinh dục nguyên thủy
vào ngày 7 dpc (day postcoitum). Số lượng tế bào mầm sinh dục nguyên thủy chừng
50 – 80 tế bào vào cuối giai đoạn phôi vò hóa (giai đoạn ba lá phôi).
Vào giai đoạn 8 – 8,5 dpc thì số lượng tế bào của chúng chừng 100 tế bào, đònh
vò tại lớp trong ruột sau và di chuyển lên lớp biểu mô ruột sau vào ngày 9 – 9,5 dpc,
tại đây số lượng của chúng tăng lên chừng 350 tế bào. Từ đây, chúng di chuyển theo
hướng lưng dọc theo các niêm mạc ruột sau về phía cầu sinh dục phát triển (genital
ridge) và đònh cư ở đây vào ngày 10,5 dpc, khi đó số lượng của chúng khoảng 1000.
Bên trong bộ phận sinh dục, các tế bào mầm sinh dục tiếp tục phân chia và quần thể
tế bào đạt chừng 25000 tế bào vào ngày 13,5 dpc. [5]
Cầu sinh dục (genital ridge) là tiền thân của cơ quan sinh dục sau này. Các tế
bào mầm tồn tại trong cầu sinh dục sẽ di chuyển về cơ quan sinh dục đang hình
thành trong các giai đoạn phát triển của phôi.
Ở giai đoạn 12.5 dpc, cầu sinh dục bám vào trung thận (mesonephros) hay còn
gọi là thận thai (fetus kidney). Sau khi bỏ hết phần nội quan, cầu sinh dục và trung


thận nằm gần sát vào lưng. Có thể quan sát bằng mắt thường hay qua kính lúp hoặc
kính hiển vi soi nổi để thấy hai bộ phận này.
Kích thước của cầu sinh dục và trung thận chừng 1 – 2 mm tuỳ thuộc trọng
lượng, kích thước phôi. Khi chưa tách rời, cầu sinh dục và trung thận tạo thành hình
lưỡi liềm. Dưới kính hiển vi, lưỡi liềm có hai lớp: một lớp bên phía chiều cong bên
trong có màu sáng hơn là cầu sinh dục, một lớp có màu sẫm hơn là trung thận.

Hình 1.3: Sự đònh vò và tồn tại của tế bào mầm ở các giai đoạn phát triển của phôi
(Phần màu đỏ là các tế bào mầm sinh dục).


Để nghiên cứu GC in vitro, người ta dựa vào sự đònh vò của chúng trong phôi
theo tuổi mà thu nhận và nuôi cấy.
Sau 12,5 dpc, các tế bào mầm sinh dục tập trung vào các cơ quan sinh dục.
Buồng trứng nằm cạnh thận trong khi đó tinh hoàn thì nằm ở vò trí gần bóng đái.

Biểu đồ 1.1: Mối quan hệ giữa tuổi (dpc) và số lượng tế bào mầm sinh dục ở phôi
chuột Mus musculus var.Albino. Theo Tam và Snow (1981). [ 5]
3.3. Xác đònh tế bào mầm
Hiện tại có ba phương pháp xác đònh tế bào mầm sinh dục dựa vào:
(1) Đặc điểm hình dạng,
(2) Kháng thể nhận diện kháng nguyên đặc trưng cho tế bào GC
(3) Sự biểu hiện của enzym Alkaline phosphatase.
3.3.1. Đặc điểm hình dạng tế bào mầm
Các tế bào GC sau khi được rời ra từ các mảnh mô có thể phân biệt được chúng
với các tế bào sinh dưỡng khác khi xem dưới kính hiển vi soi nổi hay cắt lớp. Tế bào
mầm sinh dục vừa mới thu nhận thì sẽ có hình tròn, bề mặt láng và phản chiếu ánh


sáng. Chúng có đường kính từ 18 - 20 μm nên lớn hơn hầu hết các tế bào sinh
dưỡng. Chúng lăn tròn đều trên mặt đáy của giếng nuôi.
Sau một thời gian nuôi cấy ngắn, các tế bào sinh dưỡng bám vào đáy bình trong
khi đó các tế bào mầm sinh dục vẫn không bám vào đáy bình. Tế bào GC hầu như
không có màu do vậy có thể phân biệt với những tế bào hồng cầu không nhân,
không bám và có cùng kích thước với tế bào GC bởi các tế bào hồng cầu có màu đỏ
hồng nhạt.

Sau một vài giờ nuôi cấy trên lớp tế bào đơn (lớp feeder, thường là fibroblast),
chúng sẽ dính vào lớp tế bào bên dưới và thay đổi hình dạng – hình dạng của chúng
có vẻ như hình của fibroblast. Khi đó, chúng ta không thể nào xác đònh được chúng
qua hình dạng mà để xác đònh chúng phải thông qua kháng thể hay alkaline
phosphatase.
3.3.2. Xác đònh dựa vào kháng thể
Các tế bào mầm sinh dục thể hiện một số kháng nguyên bề mặt chuyên biệt
(Donovan và cộng sự, 1986). Các kháng nguyên này sẽ kết hợp được với kháng thể
TG-1 và SSEA-1. Sự hiện diện của các kháng nguyên này là một phương tiện đáng
tin cậy cho việc xác đònh tế bào GC sống trong nuôi cấy.
Tuy nhiên, thật cẩn thận rằng các phản ứng kháng thể không hoàn toàn đặc hiệu
cho tế bào GC. Một số kháng thể đa dòng được biết phản ứng chuyên biệt với tế
bào GC nhưng cũng đồng thời phản ứng với các kiểu tế bào khác. [5]
3.3.3. Xác đònh dựa vào Alkaline phosphatase
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các tế bào GC thể hiện sự hoạt động mạnh của
Alkaline phosphatase. Hoạt tính của Alkaline phosphatase đầu tiên được xác đònh
vào ngày thứ 7 dpc và tiếp tục biểu hiện cho đến cuối đời sống của phôi.[5]
Mặc dù trong phôi cũng có những tế bào khác cũng dương tính với alkaline
phosphatase nhưng sự hiện diện của tế bào dương tính với alkaline phosphatase thu


nhận từ mẫu mô sinh dục (như cầu sinh dục) là không thể nhầm lẫn được bởi vì
không có kiểu tế bào nào biểu hiện đặc tính này.
Tế bào mầm thu nhận từ cầu sinh dục được xác đònh bằng phương nhuộm
Alkaline phosphatase. Trạng thái chưa biệt hoá của tế bào mầm có thể được nhận
biết nhờ mức độ biểu hiện cao của enzym Alkaline Phosphatase. Enzym này hoạt
động tối ưu trong môi trường pH kiềm, do vậy gọi là Alkaline phosphatase (Alkaline
nghóa là kiềm). Trong tế bào, Alkaline phosphatase giữ vai trò rất quan trọng trong
việc phân giải các nhóm phosphate của các phân tử nucleotide, protein và akaloide.
Ở tế bào gốc và tế bào mầm trong một khoảng thời gian nhất đònh trong thời gian

phát triển của phôi thì enzym này hoạt động mạnh. Sự biểu hiện mạnh của enzym
này hầu như ít xảy ra ở các tế bào đã biệt hoá. Do vậy, sự biểu hiện mạnh của
enzym này là một dấu hiệu để xác đònh tế bào gốc và tế bào mầm.[5][9]

Cơ chế phản ứng
Đầu tiên, Naphthol AS-BI phosphaste sẽ bò cắt đi gốc Phosphate thành Naphthol
AS-BI. Sau đó, Naphthol AS-BI sẽ phản ứng trở lại với Fast Blue BB Salt và tạo ra
sản phẩm có màu xanh bám trên bề mặt tế bào. Màu xanh này có thể quan sát dưới
kính hiển vi.
Naphthol AS-BI phosphaste

APase

Naphthol AS-BI + Fast Blue BB Salt

Naphthol AS-BI
Blue Pigment (Sắc tố màu xanh).

4. NGUỒN GỐC THU NHẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN TẾ BÀO
GỐC ĐA NĂNG
Hầu hết các nhà khoa học sử dụng tế bào gốc đa năng (pluripotent stem cell hay
leuripotent stem cell) để chỉ những tế bào gốc thu nhận từ túi phôi. Từ pluri có
nguồn gốc từ tiếng Hy lạp là plures nghóa là nhiều. Do vậy, những tế bào gốc đa
năng có thể biệt hóa thành bất kì tế bào nào trừ các tế bào thu nhận từ màng phôi.


Đây là một đặc tính được quan sát trong điều kiện in vivo và cả trong điều kiện in
vitro.[5]
Các tế bào gốc đa năng có thể được thu nhận từ ba nguồn gốc:
 Các tế bào gốc phôi (ES) thu nhận từ phôi giai đoạn blastocyst.

 Các tế bào mầm sinh dục (GC) thu nhận từ phôi thai (chuột từ giai đoạn
8,5 – 12,5 dpc, người 5 – 7 tuần tuổi)
 Các tế bào khối u chứa nhiều loại tế bào khác nhau của các lớp mầm.

Hình 1.4 : Nguồn thu nhận các tế bào gốc đa năng
Do trong quá trình phát triển của phôi, tính từ lúc sau khi thụ tinh (Do) thì các sự
kiện tiếp theo xảy ra theo một thời gian có thể dự đoán trước. Nhờ đó mà người ta
có thể thực hiện các kỹ thuật vi thao tác để thu nhận một hỗn hợp tế bào chứa các tế
bào gốc phôi ES, tế bào mầm EG ở các giai đoạn phôi khác nhau từ các phôi thụ
tinh tự nhiên in vivo hoặc từ các phôi thụ tinh in vitro bằng cách theo dõi thời gian
phát triển của phôi.[9]


Từ hỗn hợp tế bào thu nhận được người ta tiến hành các phương pháp nuôi cấy
khác nhau để từ đó cấy chuyền, phân lập bằng nhiều phương pháp và cuối cùng thu
nhận được các dòng tế bào gốc đa năng.
Thường thì các nhà khoa học sử dụng các kỹ thuật công nghệ cao để phân lập
các tế bào gốc đa năng như việc sử dụng công cụ FACS (Fluorescen Activated Cell
Sorting) để phân loại các tế bào gốc rất hiếm từ hàng triệu tế bào khác. Với kỹ
thuật này, dòch huyền phù các tế bào được gắn với đuôi huỳnh quang (nghóa là chỉ
gắn lên các marker bề mặt của tế bào gốc các tag huỳnh quang thích hợp), sau đó
được chuyển đến một dụng cụ tạo ra sức ép xuyên qua miệng hẹp - rất hẹp đến nỗi
các tế bào phải xuyên qua từng cái một tại một thời điểm. Nhờ vào việc thoát khỏi
miệng, các tế bào sau đó chuyển qua, từng cái một, xuyên qua một nguồn ánh sáng,
thường là laser, và sau đó xuyên qua một trường điện từ. Các tế bào huỳnh quang
tích điện âm, trong khi các tế bào không huỳnh quang tích điện dương, sự khác điện
tích cho phép các tế bào gốc được tách ra khỏi các tế bào khác.
Công cụ này còn được dùng để phân lập tế bào gốc dựa vào sự khác nhau về độ
lớn tế bào, hình dạng bề mặt, độ trong suốt, độ đậm đặc NST, các marker bề mặt,
marker bên trong của tế bào …

Hình 1.5: Phương pháp phân loại tế bào có hoạt tính phát huỳnh quang FACS

5. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC
Tế bào ES đã mở ra rất nhiều ứng dụng. Vấn đề được xem là nóng bỏng nhất là
sử dụng tính đa thế của tế bào này trong liệu pháp cấy ghép – nghóa là thay thế
hoặc phục hồi mô đã bò phá hủy, bò thương hoặc bệnh tật. Các bệnh có thể sử dụng
tế bào ES để điều trò gồm: Parkinson, tiểu đường , chấn xương cột sống , sự suy
thoái tế bào, loạn dưỡng cơ, tim và tạo xương. Tuy nhiên, tùy theo mục đích điều trò
cho mỗi loại bệnh mà tế bào ES phải được điều khiển để biệt hóa thành các tế bào
chuyên biệt trước khi cấy ghép. Các nghiên cứu này đang được tiến hành, tuy nhiên
số lượng phòng thí nghiệm ES người thì rất ít.


Như vậy, việc sử dụng tế bào ES vẫn còn là tiềm năng và cần tính thực nghiệm cao.
Thuận lợi khác của tế bào ES là nó có khả năng tăng sinh vô hạn trong ống
nghiệm, do vậy nó có nhiều triển vọng để phát triển thành nhiều dạng tế bào thông
qua sự điều khiển biệt hóa, sau đó được cấy ghép để thay thế hoặc phục hồi các cơ
quan bò tổn thương. Các tế bào ES thuận lợi cho việc cấy ghép nếu chúng không bò
hệ thống miễn dòch của cơ thể thải loại .
Tế bào gốc phôi người có thể được dùng để nghiên cứu các bất thường trong sự
phát triển của phôi người: khuyết tật bẩm sinh, quái thai và nhất là sẩy thai… Việc
nghiên cứu tế bào ES người có thể được xác đònh bởi các nguyên nhân ở mức độ
phân tử và mức độ tế bào.
Tế bào ES cũng có thể được dùng để thăm dò tác động của nhiễm sắc thể bất
thường trong sự phát triển của phôi sớm. Điều này bao gồm khả năng kiểm soát sự
phát triển của các mô ung thư giai đọan sớm. Tế bào gốc phôi còn dùng để kiểm tra
các loại thuốc trò bệnh mới, sàng lọc các độc tố tiềm ẩn.
Cuối cùng tế bào ES người có thể được sử dụng để phát triển các phương pháp

mới cho kỹ thuật di truyền như tái tổ hợp tương đồng.[5][9]

Hình 1.6 : Chiến lược ghép tế bào gốc


Hình 1.7: Chiến lược dùng tế bào gốc trong liệu pháp gene.
Đối với tế bào mầm ( cũng là tế bào gốc đa năng và là nguồn gốc cho các tế bào
sinh dục) thì ngoài ứng dụng của một tế bào gốc đa năng thì tế bào mầm được sử
dụng vào những mục đích chuyên biệt như :
 Điều trò bệnh vô sinh bằng cách nuôi mô sinh dục để thu nhận tế bào mầm
và cho biệt hoá thành tế bào sinh dục hoàn chỉnh để có thể tham gia thụ
tinh.
 Nuôi cấy biệt hóa tế bào mầm còn có ý nghóa trong bảo tồn giống. Những
loài động vật quý hiếm sau khi bò chết có thể thu nhận tế bào cơ quan sinh
dục để trữ lạnh. Sau đó, những tế bào này có thể biệt hóa và cho thụ tinh
để sinh con. Điều này có ý nghóa lớn nếu con vật chưa trưởng thành.


Sử dụng tế bào mầm sinh dục làm mô hình cho việc kiểm nghiệm các chất
gây vô sinh.


PHAÀN 2

VAÄT LIEÄU – PHÖÔNG PHAÙP


2.1. VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chuột nhắt trắng (Mus musculus var. Albino) : từ hai đến ba tháng tuổi, cân nặng

từ 20 – 30g, có sức sống khỏe mạnh, sạch bệnh, do Viện Pasteur TP.HCM cung cấp.
(chuột đực và cái đều trưởng thành về sinh dục),

Hình 2.1: Chuột nuôi trong chuồng
2.1.2. Dụng cụ – thiết bò
2.1.2.1.Dụng cụ
 Chuồng nuôi chuột: Kích thước 30cm x 20cm x 20cm, nắp đậy bằng lưới
thép, có lót trấu khô, thoáng, khô
 Dụng cụ giải phẫu:
-

Khay inox

-

Tấm lót cao su

-

Ghim cố đònh chuột

-

Kéo thẳng và kéo cong

-

Kẹp thẳng và kẹp cong

-

Becher (200ml,100ml)


 Dụng cụ tách và thu nhận tế bào
-

Ống tiêm 1ml, 5ml

-

Đầu kim tiêm 26G

-

Màng lọc tế bào Cell Strainer 70μm

-

Đóa Petri nhựa (đường kính 35 x10 mm)

-

Micropipette (100 – 1000μl, 40 – 200 μl)

-

Đầu tip (1000 μl, 100 μl)

-

Eppendorf 1,5ml

-

Buồng đếm hồng cầu

-

Bình Roux (25cm2, 75cm2)

-

Đóa nuôi 24 giếng

-

Lame, lamelle

-

Phin lọc vô trùng 0,22 μm

2.1.2.2.Thiết bò
-

Laminar

-

Hệ thống kính vi thao tác

-

Kính hiển vi đảo ngược

-

Kính hiển vi quang học

-

Máy vi tính

-

Máy đo pH

-

Cân phân tích

-

Hệ thống chụp ảnh

-

Tủ lạnh mát

-

Tủ lạnh – 20oC

-

Tủ ấm CO2