Nghiên cứu quá trình tạo màng BC từ chủng gluconacetobacter ứng dụng làm bao bì bảo quản thực phẩm và thay thế túi nilông

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

IC
Bằng tất cả tấm lòng kính trọng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc đến PGS TS

inh Thị Kim Nhung đ tận tình hướng dẫn em hoàn thành

luận văn này, cùng toàn thể thầy cô trong tổ vi sinh vật, khoa Sinh – KTNN,
trường

ại học Sư phạm Hà Nội 2 đ nhiệt tình giảng dạy và khuyến khích

em trong thời gian học tập. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường
ại học Sư phạm Hà Nội 2 và Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN đ tạo điều
kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn!
ội ng

th ng

n m

Sinh viên

Trần Thị Mai

Trần Thị Mai

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

I CA

ĐOA

Em xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật

ây

là kết quả nghiên cứu của riêng em. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ
thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt,
không trùng với kết quả đ công bố.
Nếu sai em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
ội ng

th ng

n m

Sinh viên

Trần Thị Mai

Trần Thị Mai

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

ỤC ỤC
L IC M N
L I CAM OAN
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, B NG, HÌNH
Từ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục bảng hình
MỞ ẦU...........................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................ 1
2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2
3. Nội dung .................................................................................................... 2
4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .................................................................... 3
. . Ý nghĩa khoa học ..................................................................................... 3
. . Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 3
. . Điểm mới ................................................................................................. 3
CHƯ NG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. ........................................................ 4
1.1. Vị trí, đặc điểm phân loại chủng Gluconacetobacter trong sinh giới ....... 4
1.1.1. Phân loại vi khuẩn Gluconacetobacter ................................................. 4
. . . Đặc điểm phân loại của chủng Gluconacetobacter ............................... 6
1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của chủng Gluconacetobacter ................................. 8
1.2.1. Nhu cầu nguồn cacbon ......................................................................... 8
1.2.2. Nhu cầu nguồn nitơ .............................................................................. 8

1.2.3. Nhu cầu nguồn phospho ....................................................................... 9
1.2.4. Các chất kích thích sinh trưởng ............................................................ 9
1.3. ặc điểm và cơ chế hình thành màng BC .............................................. 10
. . . Đặc điểm cấu trúc của cenllulose và màng BC ................................... 10

Trần Thị Mai

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

. . . . Đặc điểm cấu trúc của cellulose ...................................................... 10
1.3.1.2. Đặc điểm cấu trúc của màng BC .................................................... 11
. . . Cơ chế tổng hợp màng BC .................................................................. 12
1.4. Tình hình nghiên cứu màng BC ............................................................. 13
1.4.1. Tình hình nghiên cứu màng BC trên thế giới ...................................... 13
1.4.2. Tình hình nghiên cứu màng BC ở Việt Nam ........................................ 14
CHƯ NG 2. PHƯ NG PHÁP NGHIÊN CỨU. .......................................... 15
2.1. ối tượng nghiên cứu và hóa chất ......................................................... 15
. . . Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 15
2.1.2. Thiết bị và hóa chất ............................................................................ 15
2.1.2.1. Hóa chất .......................................................................................... 15
2.1.2.2. Dụng cụ, thiết bị .............................................................................. 15
. . . . Môi trường nghiên cứu .................................................................... 16
2 2 Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 16
2.2. . Phương ph p vi sinh ........................................................................... 16
. . . . Phương ph p phân biệt tế bào chủng Gluconacetobacter bằng

phương ph p nhuộm Gram ........................................................................... 16
. . . . Phương ph p bảo quản chủng Gluconacetobacter trên môi
trường thạch nghiêng ................................................................................... 16
. . . . Phương ph p hoạt hoá giống ........................................................... 17
2.2.1.4. Phương ph p lên men tạo màng BC ................................................ 17
. . .5. Phương ph p nghiên cứu tìm tỷ lệ diện tích thiết bị lên m ng đến
khả n ng tạo màng BC tốt nhất từ chủng Gluconacetobacter ....................... 17
2.2.1.6.

Phương

ph p

xử

lý

màng

BC

sinh

từ

vi

khuẩn

Gluconacetobacter ....................................................................................... 17

2.2.2. Phương ph p vật lý............................................................................. 17
. . . . Phương ph p x c định dai (độ bền cơ học) của màng BC ............... 17

Trần Thị Mai

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

2.2.3. Phương ph p hóa học ......................................................................... 17
. . . . Phương ph p l m trắng và sạch các chất dư thừa trong quá
trình nuôi cấy ............................................................................................... 17
. . . . Phương pháp làm sạch tế bào trên màng BC ................................... 18
. . . . Phương ph p chuẩn độ pH của màng .............................................. 18
. . . Phương ph p bảo quản, ứng dụng ...................................................... 18
2.2.4.1. Phương ph p bảo quản màng BC sinh từ vi khuẩn
Gluconacetobacter ....................................................................................... 18
2.2.4.2. Phương ph p ứng dụng làm bao bì bảo quản thực phẩm ................. 18
2.2.5. Phương ph p thống kê và xử lý kết quả .............................................. 18
CHƯ NG 3 KẾT QU VÀ TH O LUẬN ................................................ 20
3.1. Nghiên cứu khả năng tạo màng BC từ chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter BHN2 ............................................................................ 20
3.1.1. Hình thái tế bào học v đặc điểm nuôi cấ trên môi trường thạch
đĩa của vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 .................................................. 20
3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ S/V tới khả n ng tạo màng BC từ
chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 trên diện tích lớn ......................... 21
3.2. Khảo sát khả năng bảo quản thực phẩm và thay thế túi nilông ............... 24

3.3. Ứng dụng bảo quản thực phẩm và thay thế túi nilông ............................ 25
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 29
1. Kết luận .................................................................................................... 29
2. Kiến nghị .................................................................................................. 29
TÀI LIỆU THAM KH O ............................................................................ 30
Tiếng Việt .................................................................................................... 30
Tiếng Anh .................................................................................................... 31

Trần Thị Mai

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

DA H

ỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, B

Khóa luận tốt nghiệp

G, HÌ H

Từ viết tắt
BC: Bacterial cellulose
Danh mục bảng

Bảng 1 1

ặc điểm phân biệt các chi thuộc họ Acetobacteraceae

Bảng 1 2

ặc điểm sinh hoá của chủng Gluconacetobacter

Bảng 1 3 Thành phần hóa học của nước dừa
Bảng 1.4. Các vitamin có trong nước dừa
Bảng 1.5. Các acid amin có trong nước dừa
Bảng 3 1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC khi
lên men trong chậu nhựa
Bảng 3 2 So sánh bảo quản cà chua bằng màng BC với túi nilông thông
thường và không bảo quản
Bảng 3 3 So sánh bảo quản một số loại quả bằng màng BC, túi nilông và
không bảo quản

Trần Thị Mai

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Danh mục hình
Hình 1.1. Sợi cellulose của màng BC
Hình 1.2. Sợi cellulose của thực vật
Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở chủng Gluconacetobacter
Hình 3.1. Hình thái tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 khi nhuộm
Gram và khuẩn lạc của vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 trên

MT1
Hình 3.2. Khối lượng màng BC tươi
Hình 3.3. Thu màng BC từ chậu nhựa
Hình 3.10. Bảo quản dưa chuột
Hình 3.11. Dưa chuột hỏng sau 5 ngày
Hình 3.12. Cam hỏng sau 10 ngày
Hình 3.14. Cà rốt hỏng sau 5 ngày
Hình 3.4. Cà chua bọc bằng màng BC
Hình 3.5. Cà chua hỏng sau 7 ngày
Hình 3.6. Cà chua bọc túi nilông hỏng sau 12 ngày
Hình 3.7. Cà chua bọc hỏng màng BC hỏng sau 23 ngày
Hình 3.8. Roi hỏng sau 4 ngày
Hình 3.9. Roi hỏng sau 10 ngày

Trần Thị Mai

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Ở ĐẦU
1. ý do chọn đề tài
Ngày nay, vấn đề ô nhiễm môi trường đ và đang ngày càng trở nên
nghiêm trọng.

có nhiều cảnh báo, Việt Nam đ và đang đứng trước nguy

cơ "ô nhiễm trắng” do túi nilông Nếu trung bình mỗi người Việt Nam dùng 1
túi/ngày, mỗi ngày có khoảng 86 triệu chiếc túi nilông được dùng, một năm
số túi nilông được dùng là 31,4 tỉ chiếc, có khối lượng tương đương với 1
triệu tấn nhựa không phân hủy, rõ ràng là một nguy cơ rất lớn đối với môi
trường và sức khỏe con người Theo các chuyên gia y tế và môi trường, túi
nilông chôn vùi dưới đất phải mất từ 400 - 600 năm mới có thể phân hủy hết
Túi nilông chứa 2 chất PE và PP, khi đốt sẽ tạo thành khí cacbonic, mêtan và
khí đioxin cực độc
Ở nước ta, việc nghiên cứu và sản xuất túi nilông tự phân huỷ gần đây
mới bắt đầu. Hiện nay, Trung tâm Nghiên cứu vật liệu Polime

ại học Bách

khoa Hà Nội đang tiến hành nghiên cứu công trình "sáng chế túi nilon tự huỷ"
và ứng dụng rộng rãi vào cuộc sống. Ngoài ra, PGS.TS. Trương Vĩnh, Trưởng
bộ môn Công nghệ hóa học ại học Nông Lâm TP. HCM đ tiến hành nghiên
cứu và sản xuất thành công một loại polymer sinh học mới được làm từ bột
khoai mì Sản phẩm này có triển vọng thay thế nhựa (nilông) không phân hủy
hiện đang gây nguy hại cho môi trường
Chủng Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt
buộc, hóa dưỡng thuộc chi Acetobacter, họ Acetobacteraceae. Khi nuôi cấy vi
khuẩn này trên môi trường dịch lỏng tĩnh sẽ hình thành trên bề mặt một lớp
màng BC. Màng sinh học BC có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose
của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β1,4glucorit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật ở chỗ: không chứa

Trần Thị Mai

1

Khoa Sinh – KTNN

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

các hợp chất cao phân tử do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo
dai, bề chắc [8], [9], [10].
Trên thế giới màng Bacterial cellulose (BC) đ được ứng dụng rất
nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách
cho quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế
bào, dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang,
trong lĩnh vực y học, màng BC đ được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da
trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điều trị các
bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người... [21], [22], [24].
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC mới chỉ là những
bước đầu. Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tưởng An, Trường
khoa,

ại học Bách

HQG - HCM đ bước đầu sử dụng màng mỏng cellulose vi khuẩn

(BC) hấp phụ bacteriocin để bảo quản thịt tươi qua sơ chế tối thiểu [2]. Trong
những năm gần đây phòng thí nghiệm Vi sinh Trường

ại học Sư phạm Hà

Nội 2 phân lập tuyển chọn được chủng Gluconacetobacter BHN2 có khả năng
tạo màng BC. Nhằm tìm kiếm nguồn nguyên liệu có bản chất polyme sinh

học để tạo cơ sở cho sản xuất túi nilông bảo quản thực phẩm tự hủy và nhiều
ứng dụng khác tôi quyết định chọn đề tài:“ ghiên cứu qu trình tạo m ng BC
từ chủng Gluconacetobacter ứng dụng l m bao bì bảo quản thực phẩm v
tha thế túi nilông”
2.

ục tiêu của đề tài
Nghiên cứu quá trình tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2
Ứng dụng làm bao bì bảo quản thực phẩm và làm túi thay thế túi nilông

3. ội dung
3.1. Nghiên cứu quá trình tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
BHN2

Trần Thị Mai

2

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

3 2 Khảo sát khả năng bảo quản thực phẩm trên cà chua của màng BC sau
khi xử lý
3 3 Ứng dụng bảo quản thực phẩm và thay thế túi nilông
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu quá trình tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2
trên dụng cụ lên men có diện tích lớn
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Ứng dụng màng BC làm bao bì bảo quản thực phẩm và thay thế túi
nilông
4.3. Điểm mới
Tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2 trên diện tích lớn
Ứng dụng màng BC làm bao bì bảo quản thực phẩm và làm túi thay thế
túi nilông.

Trần Thị Mai

3

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

CHƯ

G1

TỔ G QUA TÀI IỆU
1.1. Vị trí, đặc điểm phân loại chủng Gluconacetobacter trong sinh giới
1.1.1. Phân loại vi khuẩn Gluconacetobacter
có rất nhiều công trình phân loại vi khuẩn acetic như Rothenback
1898, Beijerinck 1898, Hoyer 1899, Hansen 1911, Heneberg 1926, Frateur

1950 [20]… Thuật ngữ “Gluconacetobacter” được dùng đầu tiên cho cấp độ
phân loại giống phụ trong giống Acetobacter khi Yamada và Kondo (1984)
nhận thấy thành phần ubiquinone chính trong thành phần màng tế bào vi
khuẩn sinh acetic khác nhau. Các chủng có Q – 10 là thành phần ubiquinone
chính được phân loại trong giống phụ Gluconacetobacter, trong khi Q – 9 là
thành phần ubiquinone chính trong màng tế bào vi khuẩn Acetobacter. Sau đó
giống phụ Gluconacetobacter được đưa lên thành giống thứ 4 trong họ
Acetobacteraceae dựa vào mối quan hệ phát sinh khi phân tích một phần trình
tự gen m hóa 16S rARN Do cách đặt tên Gluconacetobacter chưa đúng quy
cách nên Yamada (1998) đ sửa lại tên giống thành Gluconacetobacter nom.
corrig, theo khoản luật Rule 61 trong Bacteriological code [21] Ban đầu
giống Gluconacetobacter chưa được chấp nhận rộng r i do được công bố dựa
vào một phần trình tự mà không phải toàn bộ gen 16S rARN. Tuy nhiên,
Franke et al (1999) đ

xác nhận việc phân loại và đặt tên giống

Gluconacetobacter và đề nghị phân tích trình tự 16S rADN để chuyển các
loài đ

biết, định danh nhầm giống Acetobacter vào đúng giống

Gluconacetobacter. Cuối cùng Yamada (2000) đ kết luận sự hiện diện của
giống Gluconacetobacter dựa vào các đặc điểm phát triển được trên môi
trường thạch có nguồn cacbon duy nhất là D – mantose, sở hữu Q - 10 là
thành phần uniquinone chính và kết quả phân tích toàn bộ trình tự gen mã hóa

Trần Thị Mai

4

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

rARN. Các loài thuộc giống Gluconacetobacter có đặc điểm hình thái học tế
bào khác nhau nhưng không rõ rệt lắm và được phân loại chủ yếu dựa trên
mối quan hệ phát sinh loài trên cơ sở phân tích vùng trình tự 16S rADN và
mức độ tương đồng ADN.
Theo Bergey (2005) [16], G.intermedius được xếp vào chi
Gluconacetobacter thuộc họ vi khuẩn Acetobacteraceae. Họ này gồm 6 chi:
Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconobacter, Gluconacetobacter và
Kozakia

ặc điểm phân loại giữa các chi được trình bày ở bảng 1.1:

Bảng 1.1. Đặc điểm phân biệt các chi thuộc họ Acetobacteraceae
Đặc điểm

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

Oxy hóa ethanol thành acid acetic

+

+

-/w

+

+

+

Oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O

+

+

+

+

-

w

Oxy hóa lactate thành CO2 và H2O

+

w

+

+/-

-

w

+

+

-

+

+

+

Sinh trưởng trên D-manitol

+/-

w

+/-

+/-

+

+

Sinh trưởng trên methanol

-/w

+

-

-

-

-

-

-

-

+/-

-

-

+/-

w

-/w

+/-

+

+

D-manitol

-/+

-

+/-

+/-

+

-

Glycerol

-/+

-

+

+

+

+

Raffinose

-

nd

-

-

-

+

Q-9

Q-10

Q-10

Q-10

Q-10

Q-10

Sinh trưởng trong môi trường chứa
0,35% acid acetic

Tổng hợp cellulose
Oxy hóa glycerol thành
dihydroxyaceton
Hình thành acid từ:

Loại Ubiquinon

52 – 60 63 – 66 59 – 61 55 – 66 54 – 63 56 – 57

% mol G+C
Chú thích:

Trần Thị Mai

(1): Acetobacter

(4): Gluconacetobacter

(2): Acidomonas

(5): Gluconobacter

(3): Asaia

(6): Kozakia

+: Kết quả dương tính

-: Kết quả âm tính

w: Yếu

nd: Chưa xác định

5

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.1.2. Đặc điểm phân loại của chủng Gluconacetobacter
Vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 được tác giả Nguyễn Thị Thùy Vân
[9], [10] phân lập từ nguồn Bia Hà Nội, tại trường ại học Sư phạm Hà Nội 2,
năm 2009

ến năm 2011, tác giả Dương Minh Lam và cs [1], [3], [14] phân lập

và tiến hành định loại bằng sinh học phân tử chủng vi khuẩn A. xylinum BHN2
trên (chủng số 21 là chủng sinh trưởng nhanh, có khả năng tạo màng BC có tiềm
năng ứng dụng lớn) tại trường ại học Sư phạm Hà Nội, bằng việc giải trình tự
các nucleotide của một đoạn gen của gen 16S rARN. Kết quả phân tích đoạn
trình tự gen 16S rDNA cho thấy chủng BHN2_21 có quan hệ gần gũi với các
loài Gluconacetobacter intermedius AB166739, Gluconacetobacter intermedius
AB099296, Gluconacetobacter intermedius AB099297. Từ kết quả phân tích
ADN khẳng định chủng Gluconacetobacter BHN2_21 là Gluconacetobacter
intermedius [1].
Đặc điểm hình thái, tế bào học
Chủng Gluconacetobacter có dạng hình que (hoặc hình cầu), thẳng hay
hơi cong, kích thước khoảng 2 μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng
chuỗi, không có khả năng di động, không sinh bào tử. Các tế bào được bao
bọc bởi chất nhày tạo váng nhăn và dày Váng có chứa hemicellulose nên khi
gặp H2SO4 và thuốc nhuộm iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của
hemicellulose), chúng tích luỹ 4,5% acid acetic trong môi trường. Khi nồng
độ acid acetic vượt giới hạn cho phép, nó ức chế hoạt động của vi khuẩn [15].
Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa, chủng Gluconacetobacter hình thành khuẩn
lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng
hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường.
Chủng Gluconacetobacter khi nuôi cấy trong môi trường lỏng tĩnh, chúng sẽ
hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng BC. Ngược lại trong điều

Trần Thị Mai

6

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích thước không đều
nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo ra những đặc tính hình thái
khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh [11], [13], [18], [20].
Đặc điểm sinh lý, sinh hoá
ặc điểm sinh lý: chủng Gluconacetobacter có thể phát triển ở pH: 4-6,
nhiệt độ 25 - 350C. Nhiệt độ, pH tối ưu tuỳ thuộc chủng. Ở 370C, tế bào sẽ suy
thoái ngay cả trong môi trường tối ưu. Chủng Gluconacetobacter chịu được
pH thấp, bổ sung acid acetic vào môi trường nuôi cấy để giảm sự nhiễm
khuẩn lạ [23], [25].
ặc điểm sinh hoá: năm 1950, Frateur đ chính thức đưa ra một khóa
phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuẩn: Khả năng oxy hóa acid acetic thành
CO2 và H2O; hoạt tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer…
ặc điểm phân biệt của chủng Gluconacetobacter với các chủng khác trong
một chi được trình bày bảng 1.2:
Bảng 1.2. Đặc điểm sinh hoá của chủng Gluconacetobacter

STT

Đặc điểm

1

Oxy hoá ethanol thành
acid acetic

2
3
4
5
6
7

Hiện tượng
Kết quả
Chuyển hoá môi trường chứa
Bromphenol Blue 0,04% từ màu
+
xanh sang màu vàng
Hiện tượng sủi bọt khí
+

Hoạt tính catalase
Sinh trưởng trên môi
Sinh khối không phát triển
trường Hoyer
Chuyển hoá glycerol Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch
thành dihydroxyaceton sau lên men
Vòng sáng xuất hiện xung quanh

Chuyển hoá glucose
khuẩn lạc trên môi trường chứa
thành acid
CaCO3
Kiểm tra khả năng sinh
Không hình thành sắc tố nâu
sắc tố nâu
Kiểm tra khả năng Váng vi khuẩn xuất hiện màu
tổng hợp cellulose
lam

Trần Thị Mai

7

_
+
+
_
+

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.2. hu cầu dinh dưỡng của chủng Gluconacetobacter
ể đảm bảo hoạt động sống bình thường của vi khuẩn, môi trường thức

ăn ngoài rượu, nước còn phải cung cấp thêm muối khoáng, nguồn cacbon,
nguồn nitơ dễ hấp thụ như: CaHPO4, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, MgSO4.
7H2O, KH2PO4,… tùy thuộc nhu cầu cụ thể của từng loài [3], [4],[17].
1.2.1. Nhu cầu nguồn cacbon
Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong các phân tử enzim,
acid nucleic và sản phẩm trao đổi chất. Vì vậy, hợp chất hữu cơ chứa cacbon
có ý nghĩa quan trọng trong đời sống vi sinh vật. Người ta dùng đường làm
nguồn cung cấp cacbon cho phần lớn vi sinh vật dị dưỡng

ể tránh hiện

tượng ở nhiệt độ cao và trong môi trường kiềm đường bị chuyển hóa khi khử
trùng môi trường có chứa đường người ta chỉ hấp ở áp lực 0,5 atm, 1100 trong
30 phút

ể nuôi cấy vi khuẩn thường dùng 0,2 – 0,5% đường [3], [5].

1.2.2. Nhu cầu nguồn nitơ
(NH4)2SO4 là nguồn cung cấp nitơ cần thiết cho sự sinh trưởng và phát
triển của chủng Gluconacetobacter. Khi nuôi cấy chủng Gluconacetobacter
trong môi trường có sử dụng NH4+ sau khi đồng hóa NH4+ trong môi trường
sẽ tích lũy anion vô cơ (SO42-, Cl-…) làm giảm pH môi trường. Chủng
Gluconacetobacter có khả năng đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu
cơ, không có khả năng hấp thụ các protein cao phân tử, chỉ các polypeptid
không chứa quá 5 gốc acid amin mới có thể di chuyển qua màng tế bào chất.
Hàm lượng nitơ quá cao hay quá thấp sẽ ảnh hưởng đến tính chất lý hoá môi
trường, vì vậy ảnh hưởng tới quá trình tạo thành cellulose của chủng
Gluconacetobacter [6], [7].
Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon cả nitơ (pepton, nước thịt, nước
chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch...) có thể vừa sử dụng

làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật.

Trần Thị Mai

8

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.2.3. Nhu cầu nguồn phospho
Phospho chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào
vi sinh vật

ể đảm bảo nguồn dinh dưỡng phospho, người ta dùng các loại

phospho vô cơ: KH2PO4, K2HPO4, KNO3

Bổ sung phosphat các môi trường

dinh dưỡng còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường
Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng có vai trò ảnh hưởng đến
sinh trưởng của chủng Gluconacetobacter và quá trình hình thành màng BC
như Mg, Fe, S, Ca, Mn, Na, Cl… Nếu thiếu một trong số các nguyên tố này
thì chủng Gluconacetobacter không sinh trưởng và phát triển bình thường
1.2.4. Các chất kích thích sinh trưởng
Các vitamin pyridoxine, acid nicotinic, p–aminobenzoic acid (pABA),

biotin là cần thiết cho sự tăng trưởng tế bào và tổng hợp cellulose, trong khi
pantothenate và riboflavin cho kết quả ngược lại [16], [20], [23].
Nước dừa già là nguồn nguyên liệu chủ yếu được sử dụng để nuôi cấy
Gluconacetobacter thu màng BC. Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà
các thành phần hoá học trong nước dừa có khác nhau Lượng đường khử tổng
và protein trong nước dừa tăng lên khi dừa càng chín (cao nhất là vào tháng
thứ 9, sau đó giảm dần)

ường ở đây có thể là glucose, fructose, sucrose hay

sorbitol Ngoài ra, nước dừa có nhiều khoáng chất, vitamin, acid amin… phù
hợp cho quá trình sinh trưởng và hình thành màng BC của vi khuẩn
Gluconacetobacter [8], [14].

Trần Thị Mai

9

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Bảng 1.3. Thành phần hóa học của nước dừa
STT
1
2
3

4
5
6
7

Thành phần
Chất khô
ường tổng số
Tro
K
Na
Ca
Mg

Khối lượng
4.71
2.08
0.02
3.12

STT
8
9
10
11

1.5
2.9
3.0

12
13
14

Thành phần
Fe
Cu
P
S

Khối lượng
0.01
0.04
3.7
3.4

Protein
Dầu béo
Tỉ trọng

0.55
0.74
1.02

Bảng 1.4. Các vitamin có trong nước dừa
STT
1
2
3
4

5

Hàm lượng (g/l)
3
0.052
0.064
0.03
0.00001

Vitamin
Acid ascorbic
Penthothennic
Acid nicotinic
Acid folic
Riboflavin

Bảng 1.5. Các acid amin có trong nước dừa
STT Acid amin

Acid glutamic
Arginine
Leucine
Lysine
Proline
Aspartic

Hàm lượng(% STT
khối lượng/
amin tổng số)
14.5

12.75
4.18
4.51
4.12
3.6

Acid amin

Tyrosine
Alamine
Histidine
Phenyl alanin
Senine
Cystein

Hàm lượng(%
khối lượng/
amin tổng số)
2.83
2.41
2.05
1.23
0.91
1.17

1.3. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng BC
1.3.1. Đặc điểm cấu trúc của cenllulose và màng BC
. . . . Đặc điểm cấu trúc của cellulose
Cellulose là một polisaccarit có phân tử lượng: 8.105 – 22,68.105 đvC
Có công thức chung của tinh bột (C6H10O5)n trong đó n có thể nằm trong

khoảng 5000 – 14000. Mỗi phân tử cellulose gồm những đường đa được cấu
tạo từ các liên kết glucose. Các phân tử glucose nối với nhau ở vị trí β-1,4

Trần Thị Mai

10

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

bằng cầu nối oxi, có thể được cấu tạo từ 200 đến 1000 phân tử glucose.
Cellulose có hình dạng sợi dài, nhiều sợi liên kết song song với nhau thành
chùm nhờ các liên kết hydro giữa các nhóm (-OH). Mạch cellulose xếp đối
song song tạo thành các sợi có đường kính 3,5 nm. Mỗi phân tử cellulose
chứa khoảng 8000 gốc momosaccharide. Cellulose có tính chất của 1 tinh thể
Crystal và có tính khúc xạ kép vì do cấu tạo mà phân tử cellulose có tính định
hướng không gian 3 chiều sắp xếp song song với nhau [26].
Cellulose là chất rắn dạng sợi, có màu trắng, không mùi, không vị. Tính
bền vững cơ học cao, chịu được nhiệt độ đến 200oC mà không bị phân hủy.
Tỷ trọng khô là 1,45. Khi khô cellulose dai và khi tẩm nước nó mềm đi
Cellulose không tan trong nước và các dung môi hữu cơ nhưng tan trong dung
môi như: HCl, HNO3… và một số dung dịch muối: ZnCl2, PbCl2…
Cellulose được cấu tạo bởi các mắt xích β-D glucose liên kết với nhau
bằng liên kết 1,4 glucorid, liên kết này thường không bền: un nóng cellulose
trong dung dịch acid vô cơ đặc thu được glucose.
(C6H10O5)n + nH2O -> nC6H12O6

un nóng cellulose trong hỗn hợp acid nitric đặc và acid sunfuric đặc
thu được cellulose nitrat.
[C6H7O2(OH)3]n + 3n HNO3 (đặc) ->[C6H7O2(ONO2)3]n + 3nH2O
. . . . Đặc điểm cấu trúc của m ng BC
Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi polyme β-1,4 glucopyranose mạch
thẳng. Chuỗi polyme β-1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo
sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối
cùng tạo dải lớn. Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với
những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc vandesvan tạo thành
dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng Kích thước bên của màng tăng lên khi
quần thể vi khuẩn sinh trưởng.

Trần Thị Mai

11

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Màng BC có cơ chế kết tinh khác hẳn cellulose của thực vật ở chỗ
chúng không có sự kết hợp hemixellulose, lignin hay những thành phần phụ
khác mà được cấu tạo từ các sợi microfibil tạo nên những bó sợi song song
cấu thành mạng lưới cellulose Do đó màng BC có độ bền cơ học, độ tinh
khiết cao, khả năng thấm nước lớn… hơn hẳn cellulose của thực vật [1], [26].
1.3.2. Cơ chế tổng hợp màng BC

Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được
điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều
loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà.

Hình 1.1. Sợi cellulose của màng BC

Hình 1.2. Sợi cellulose của thực vật

Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự có 4 enzyme tham gia xúc
tác tổng hợp cellulose ở chủng Gluconacetobacter: Glucokinase (GK),
Phosphoglucomutase

(PGM),

Glucose-1-phosphate

uridylyltransferase

(UDPG pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase (CS) Trong đó
UGP là enzyme có vai trò quan trọng nhất [27].

Trần Thị Mai

12

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở chủng Gluconacetobacter
1.4. Tình hình nghiên cứu màng BC
1.4.1. Tình hình nghiên cứu màng BC trên thế giới
Chủng Gluconacetobacter và màng BC đ thu hút sự chú ý của nhiều
nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Trong
công nghệ thực phẩm sử dụng chủng Gluconacetobacter tạo màng BC dày để
sản xuất thạch dừa, màng BC để bảo quản thực phẩm. Trong công nghiệp
giấy, màng BC được dùng để sản xuất giấy chất lượng cao, dùng để làm màng
lọc nước trong công nghệ môi trường, làm chất mang đặc biệt cho các pin và
tế bào năng lượng Trong lĩnh vực y học, màng BC bước đầu được nghiên cứu
làm màng trị bỏng, da nhân tạo thay thế da tạm thời, mạch máu nhân tạo… và
ngày nay tìm ra những ứng dụng mới của màng BC như làm vải may mặc thời
trang, bao bì bảo quản thực phẩm, túi tự hủy thay thế túi nilông đang được các
nước trên thế giới nghiên cứu.

Trần Thị Mai

13

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.4.2. Tình hình nghiên cứu màng BC ở Việt Nam
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ chủng

Gluconacetobacter BHN2 ngày càng được nhiều tác giả quan tâm Ngày càng
có nhiều các nghiên cứu, công bố liên quan đến chủng Gluconacetobacter
BHN2 sự hình thành màng BC và ứng dụng màng BC Các công trình mới chỉ
bước đầu nghiên cứu quá trình tạo màng BC, đặc tính cấu trúc màng làm cơ
sở sản xuất thạch dừa của Nguyễn Thúy Hương (Bộ môn Công nghệ sinh học,
trường ại học Bách Khoa TP HCM) PGS.TS. Nguyễn Văn Thanh (Trưởng
bộ môn Vi Sinh – Ký Sinh

H Y Dược TP. HCM) và nhóm nghiên cứu của

ông chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phương
pháp lên men. Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tưởng An, Trường
Bách khoa,

ại học

HQG - HCM đ bước đầu sử dụng màng mỏng cellulose vi

khuẩn (BC) hấp phụ bacteriocin để bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu. Gần
đây nhất có nhóm nghiên cứu của PGS TS

inh Thị Kim Nhung và cộng sự

đang nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter BHN2 bước đầu ứng dụng màng BC làm bao bì bảo quản
thực phẩm, túi thay thế túi nilông.

Trần Thị Mai

14

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

CHƯ
PHƯ

G2

G PHÁP GHIÊ CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu và hóa chất
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng Gluconacetobacter BHN2 được phân lập từ màng của các nguồn
nguyên liệu khác nhau nhờ quá trình lên men giấm từ bia, giấm lên men theo
phương pháp cổ truyền, chủng Gluconacetobacter BHN2 nhận từ phòng Vi
sinh, Khoa Sinh - KTNN, Trường ại học Sư Phạm Hà Nội 2.
2.1.2. Thiết bị và hóa chất
. . . . óa chất
Nguồn cacbon: glucose (công ty dược trung ương MEDI PTANTEX)
Nguồn nitơ: cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4 (Trung Quốc)
Các loại muối khoáng: KH2PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaOH, CuSO4
Thuốc thử: dung dịch fehling, dung dịch blue bromophenol
Thuốc nhuộm: tím gentian, fucshin, lugol (Việt Nam)…
. . . . Dụng cụ thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder ( ức), nồi hấp Tommy (Nhật), máy so màu UV –

vis (Nhật), máy đo pH (MP 200R - Thụy Sỹ), máy lắc Orbital
Shakergallenkump (Anh), máy li tâm Sorvall (Mỹ), Micropipet Jinson (Pháp),
các loại tử 200l – 1000 l, kính hiển vi quang học Labomed (Mỹ), cân
(Precisa XT 320M - Thụy sỹ), hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que
trang, đèn cồn,…

Trần Thị Mai

15

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

. . . . Môi trường nghiên cứu
Thành phần
1. Glucose
2. Agar
3. (NH4)2SO4
4. KH2PO4
5. MgSO4. 7H2O
6. Acid axetic
7 Rượu etylic
8. Pepton
9 Nước mía ép
10 Nước dừa
11 Nước máy

MT1
MT2
MT3
20 g
20 g
20 g
20 g
0
0
3g
3g
3g
2g
2g
2g
2g
2g
2g
2%
2%
2%
2%
2%
2%
0
5g
0
0
0

0
0
0
0
1000 ml 1000 ml 1000 ml

MT4
20 g
0
3g
2g
2g
2%
2%
5g
200 ml
0
800 ml

MT5
20 g
0
5g
2g
0
5 ml
0
0
0
0

1000 ml

MT6
20 g
0
3g
2g
2g
2,5 ml
2%
5g
0
1000 ml
0

Chú ý: Acid axetic và rượu etylic được bổ sung sau khi đ khử trùng môi trường
Trong đó:

MT1 là môi trường phân lập
MT2 là môi trường nhân giống cơ bản
MT3… MT6 là môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
. . . . Phương ph p phân biệt tế b o chủng Gluconacetobacter bằng
phương ph p nhuộm Gram
Chủng Gluconacetobacter là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thể phân
biệt với vi khuẩn Gram dương nhờ phương pháp nhuộm Gram. Tiến hành:
Lấy chủng Gluconacetobacter nhuộm tiêu bản theo phương pháp Gram Sau
đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi quang học Olympus với độ

phóng đại 1000 lần [4], [7], [13].
2.2.1.2. Phương ph p bảo quản chủng Gluconacetobacter trên môi trường
thạch nghiêng
Các chủng sau khi phân lập, sơ bộ xác định là chủng Gluconacetobacter
được cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4 - 5 ngày trong tủ ấm ở 300C. Sau đó giữ
lạnh trong tủ lạnh ở 40C dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Cấy truyền và giữ
giống trên thạch nghiêng khoảng 1 tháng một lần [3], [5], [7].

Trần Thị Mai

16

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

. . . . Phương ph p hoạt ho giống
Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử
dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật
cho quá trình lên men Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu
chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1100 trong 20 phút Sau đó
đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy truyền giống từ ống thạch nghiêng vào
và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [5], [10], [14].
2.2.1.4. Phương ph p lên men tạo màng BC
Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 1100C
trong 20 phút để tránh phân r đường Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím trong
15 phút. Bổ sung vào môi trường 10% giống hoạt hoá. Nuôi cấy ở điều kiện

tĩnh trong 4 - 8 ngày [1], [2], [9].
2.2.1.5. Phương ph p nghiên cứu tìm tỷ lệ diện tích thiết bị lên m ng đến khả
n ng tạo m ng BC tốt nhất từ chủng Gluconacetobacter
. . .6. Phương ph p xử lý m ng BC sinh từ vi khuẩn Gluconacetobacter
2.2.2. Phương pháp vật lý
. . . . Phương ph p x c định dai (độ bền cơ học) của m ng BC
ộ chịu kéo (tensile strenght): lực kéo lớn nhất mà mẫu thử chịu được
trước khi đứt trong điều kiện xác định của phương pháp thử tiêu chuẩn.
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng chịu lực theo chiều dọc và
chiều ngang của màng BC bằng cách chọn ngẫu nhiên 5 màng, thử độ chịu
kéo theo phương pháp thử ASTM D828 – 93 (American society for testing
and materials) TCVN 1862 – 2: 2011 tại Viện Công nghiệp giấy và xenlulô.
2.2.3. Phương pháp hóa học
2. . . . Phương ph p l m trắng sạch chất dư thừa trong qu trình nuôi cấ
Phương pháp được giới thiệu bởi John Mercer (1850) phương pháp
Mercer

ây là phương pháp cổ điển biến tính sợi cellulose, trong đó có bước

Trần Thị Mai

17

Khoa Sinh – KTNN


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

sử dụng ngâm kiềm. Hiệu quả làm trắng của nó phụ thuộc vào loại, nồng độ
dung dịch, thời gian và nhiệt độ xử lý.
Chúng tôi sử dụng kiềm là NaOH, thay đổi nồng độ, nhiệt độ và thời
gian xử lý, từ đó tìm ra các yếu tố thích hợp nhất cho quá trình xử lý màng.
. . . . Phương ph p l m sạch tế b o trên m ng BC
Màng BC cần được làm sạch vi khuẩn nhằm tránh nhiễm khuẩn vào vết
bỏng Phương pháp chúng tôi lựa chọn để làm sạch vi khuẩn là: làm sạch tế
bào vi khuẩn bằng dung dịch kiềm NaOH [1].
2.2. . . Phương ph p chuẩn độ p của m ng
Màng BC sau khi được làm sạch các tế bào vi khuẩn, làm trắng thường
có pH kiềm. Vì vậy, cần sử dụng acid giúp trung hòa lượng kiềm dư trong quá
trình xử lý trước đó để đưa pH màng về trung tính. Acid mà chúng tôi lựa
chọn sử dụng là acid citric [9], [10].
2.2.4. Phương pháp bảo quản, ứng dụng
. . . . Phương ph p bảo quản m ng BC sinh từ vi khuẩn Gluconacetobacter
Màng BC sau khi được xử lý cần được bảo quản để dùng cho các
nghiên cứu tiếp theo và sử dụng cho điều trị bỏng trong thời gian dài mà
không mất đi các đặc tính sinh học của màng. Chúng tôi lựa chọn phương
pháp sấy khô màng BC. Màng BC sau khi sấy khô chỉ mỏng như tờ giấy, nhẹ,
dễ dàng bảo quản và sử dụng tiện lợi [1], [14].
2.2.4.2. Phương ph p ứng dụng l m bao bì bảo quản thực phẩm
Ứng dụng làm bao bì bảo quản thực phẩm: dùng màng BC sau xử lý
bao kín một số loại quả: táo, cà chua… để bảo quản ngoài môi trường bình
thường xem thời gian bảo quản được bao lâu [2].
2.2.5. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp
trong cuốn “Ứng dụng tin học trong sinh học” và “Thống kê và ứng dụng”

Trần Thị Mai

18

Khoa Sinh – KTNN