điều tra nghiên cứu bệnh vi rút hại cà chua ở hà nội và các vùng phụ cận

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

phần 1 mở đầu
1.1 Đặt vấn đề.
Cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill), thuộc họ cà (Solanaceae)
có nguồn gốc ở Trung Mỹ và Nam Châu Mỹ. Cây cà chua đợc phát hiện vào
thế kỷ VXI [18]. Cà chua là loại rau ăn quả đợc trồng phổ biến trên thế
giới.Về sản lợng, cà chua chiếm 1/6 sản lợng rau hàng năm trên thế giới [17].
Diện tích trồng cà chua hàng năm trên thế giới trung bình 2,5 triệu ha/năm, ở
vị trí thứ hai sau khoai tây [18]. Châu á đứng đầu về sản lợng cà chua, sau đó
là Châu Âu, riêng ở Mỹ đứng đầu về cả năng suất và sản lợng. Hy Lạp là nớc
đứng thứ hai về năng suất, Itali đứng ở vị trí thứ ba [5]. ở Việt Nam cà chua đợc trồng cách đây trên một trăm năm, diện tích trồng cà chua biến động từ 12
đến 13 ngàn ha. ở Miền Bắc, cà chua đợc trồng phổ biến ở các tỉnh thành phố
thuộc vùng Đồng Bằng Sông Hồng [5], các tỉnh Đồng Bằng Bắc Bộ hình thành
ba vụ trồng cà chua, bao gồm các vụ: Hè thu, Đông xuân, Xuân hè.[5]. Trong
đó vụ Đông Xuân đợc chia làm các thời vụ khác nhau: Thời vụ sớm (trà sớm),
chính vụ (trà chính), thời vụ muộn (trà muộn).
Cà chua là loại rau có giá trị dinh dỡng cao. Trong quả chín chứa nhiều
dinh dỡng: Đờng, vitamin A, vitamin C và nhiều khoáng chất quan trọng khác.
Theo tác giả ED.War D.C, Tigche LAAR (1989), thành phần hoá học trong cà
chua chín nh sau:
- Nớc: 94-95%, vật chất còn lại chiếm: 5-6 % gồm các chất sau:
+ Đờng : 55% ( Fructozo, glucozo, saccarozo).
+ Các chất không hoà tan trong rợu : 21% (protein, xenllulozo, pectin,
polysaccarit).
+ Axit hữu cơ: 12% (Xitric, malic,galacturonic,pyrolidon, cacboxilic).
+ Chất vô cơ : 7%.
+ Các chất khác: 5% (carotenoit, ascobic axit, chất dễ bay hơi,
aminoaxit) [5].

Ngoài giá trị về dinh dỡng cà chua còn có giá trị về kinh tế và giá trị sử
dụng cao so với nhiều loại rau : Xu hào, bắp cải, các loại rau họ thập tự khác.
Bình quân thu nhập ở Mỹ La Tinh trên 1 ha trồng trọt là 4610 USD riêng đối
với cà chua, đối với cây rau khác là 2537 USD, lúa nớc 1027 USSD Khu vực
Đồng Bằng Sông Hồng ở Việt Nam sản xuất cà chua cho thu nhập bình quân
42,0 - 68,4 triệu đồng trên một vụ, lãi thuần đạt 15 đến 26 triệu đồng cao hơn
hẳn trồng lúa [18]. Đặc biệt trong mấy năm gần đây, nhu cầu rau quả cho tiêu

1


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

dùng và xuất khẩu ngày một gia tăng. Chỉ tính từ năm 1996 đến 2001 Việt
nam đạt tốc độ tăng trởng tới 30%. Năm 2001 đạt 330 triệu USD gấp 3,6 lần
so với năm 1996. Mục tiêu kim ngạch xuất khẩu rau quả của Việt Nam đạt 1
tỷ USD vào năm 2010, một trong các trọng trâm xuất khẩu là rau quả, trong
đó có cà chua [6]. Chính vì vậy mà cà chua là loại rau rất đợc a chuộng, đợc
trồng rộng rãi khắp các châu lục và đã trở thành món ăn thông dụng của nhiều
nớc. Quả cà chua đợc sử dụng dới nhiều hình thức khác nhau nh: ăn sống, nấu
chín, chế biến nguyên quả, tơng cà chua, mứt cà chua và sản lợng cà chua
không ngừng tăng cao.
Tuy nhiên trên cà chua bệnh hại là một trong yếu tố hạn lớn trong sản
xuất Nông nghiệp, đặc biệt là trong điều kiện tự nhiên nh ở nớc ta. Thành
phần sâu bệnh hại trên cà chua tơng đối đa dạng. Bệnh do sâu hại: sâu xanh (
helicoveepa armigera Hubner), bọ phấn (Bemisia tabasi), Bệnh hại: Bệnh
do virus, bệnh héo xanh (Ralstonia Solanacearum Smith), bệnh mốc sơng
(Phytophthora infestans) Trong các loại sâu bệnh kể trên thì bệnh virus hại

cà chua rất nguy hiểm. Bệnh do virus gây ra không những tổn thất năng suất,
phẩm chất của nông sản thu hoạch mà nguy hiểm hơn chúng còn làm thoái
hoá giống. Do khả năng phát tán nhanh qua con đờng trao đổi giống và sự
truyền lan của côn trùng môi giới bệnh virus có mức độ phát triển mạnh, dễ
gây thành dịch. Đây là một trong những loại bệnh rất khó phòng trừ.
Theo Broadbent (1976), bệnh virus hại cà chua làm giảm năng suất từ
15%-20%. Nếu cây cà chua bị nhiễm từ giai đoạn cây con có thể gây thiệt hại
năng suất từ 80-100% (Direck thongrit supat Attatham and Sutabutta, 1986),
còn nếu cây đã ra quả, ảnh hởng tới quả là rất nghiêm trọng. Quả của cây
bệnh chín sớm hơn so với đối chứng nhng không sử dụng đợc do quả nhỏ, vỏ
cứng, chất lợng kém (Gamal Mchamed Fadl và Heiz Burgstaller 1986).
Bệnh virus hại cà chua bao gồm một tập đoàn nhiều bệnh hại: Bệnh
xoăn lá (TYLCV), bệnh khảm vàng (ToMV), bệnh khảm lá dơng xỉ (CMV)
.Để tăng năng suất phẩm chất và mở rộng diện tích gieo trồng cà chua đáp
ứng đòi hỏi ngày một cao của ngời tiêu dùng thì việc đánh giá chính xác tình
hình bệnh virus trên đồng ruộng đã và đang trở thành vấn đề quan tâm nhất
hiện nay. Xuất phát từ thực tế trên, đợc sự phân công của khoa Nông học Trờng đại học Nông nghiệp I Hà Nội, dới sự giúp đỡ của GS.TS Vũ Triệu
Mân tại Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây Nhiệt đới và K.S Nguyễn Viết Hải tại
Trung Tâm Kiểm Dịch Sau Nhập Khẩu I Từ Liêm Hà Nội chúng tôi tiến

2


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

hành thực hiện đề tài: " Điều tra, nghiên cứu bệnh virus hại cà chua ở Hà
Nội và các vùng phụ cận vụ xuân hè 2007".
1.2 Mục đích, yêu cầu của đề tài.

1.2.1 Mục đích.
Nghiên cứu đánh giá thực trạng bệnh virus hại cà chua ở Hà Nội và các
vùng phụ cận vụ xuân hè 2007.
1.2.2 Yêu cầu.
- Xác định thành phần virus hại trên một số gióng cà chua.
- Điều tra diễn biến triệu chứng bệnh virus hại cà chua vụ xuân hè 2007
ở các vùng trồng rau ở Hà Nội và các vùng phụ cận.
- Kiểm tra virus hại cà chua bằng phơng pháp ELISA và phơng pháp
cây chỉ thị.

Phần ii
tổng quan tài liệu
2.1. Những nghiên cứu ở nớc ngoài.
Hiện nay, trên thế giới ngời ta đã phát hiện ra trên 650 loại bệnh hại
thực vật do virus gây ra (L. Bos, 1983), con số này đã tăng lên không ngừng
[22,24] virus thực vật đợc định loại có khoảng 14 họ trong đó: 13 họ đã đợc
xác định, 1 họ cha đợc xác định. Hầu hết các virus thuộc 70 giống khác nhau.
Virus gây triệu chứng khảm lá chiếm khoảng 27%. Trên cây c chua có tới 40
loại virus phát sinh phát triển và gây hại bao gồm nhiều chủng khác nhau nh:
CMV, TLCV, ToMV, TYLCV, TRCV, PVX, PVY,Virus S
Theo EPPO ( Tổ chức bảo vệ Thực vật châu âu), có nhiều virus mới
xuất hiện gây thiệt hại nghiêm trọng trên cây c chua và một số giống cây
trồng khác và là đối tợng kiểm dịch của nhiều nớc trên thế giới.
2.1.1. Những nghiên cứu về CMV (Cucumber mosaic virus).
Bệnh đợc phát hiện đầu tiên bởi Doolittle và Jagger năm 1916 ở Mỹ.
Trong những năm gần đây CMV đợc công bố là tác nhân gây bệnh nguy hiểm
trên 1 số cây trồng chủ yếu trên Thế giới, đặc biệt là các nớc nhiệt đới.
Bệnh có các tên gọi khác: Cucumis virus 1, Marrow Cucumis Blight
virus , Tomato fern leaf virus . Tên thờng sử dụng phổ biến là Cucumber
mosaic virus (CMV).

3


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

Triệu chứng bệnh: CMV xâm nhiễm hệ thống, gây triệu chứng khảm thờng, khảm biến vàng, cành lá mọc thành búi rậm rạp cây còi cọc, lá có vết
vằn, lá chét biến dạng cong vặn vẹo, bản lá hẹp, kéo dài dạng dơng xỉ (Zitter
I.A, 1993) [51].
Phân bố địa lý: Phân bố rộng khắp Thế giới, đặc biệt là các vùng nhiệt
đới nóng ẩm.
Các chủng của virus:
- Chủng of price (1934): Gây khảm thờng trên cây thuốc lá (Nicotinana
Spp), và chết hoại cục bộ trên cây Zinnia elegans.
- Chủng Y of price (1934): Triệu chứng trên cây thuốc lá (Nicotinana
Spp) giống chủng Yellow nhng cờng độ yếu hơn. Nhiễm hệ thống trên Vigna
Sinensis.
- Chủng Spinash của bhargara (1951):Gây chết hoại cục bộ trên cây
thuốc lá (Nicotinana Tabacum), khảm thờng xanh hệ thống, đốm hình nhẫn
và biến dạng.
Các chủng khác nhau của CMV có thể tạo thành tập hợp phổ triệu
chứng và còn phụ thuộc vào ký chủ mà nó gây hại.
Hình thái và cấu trúc:
- Hình thái: Cucumber mosaic virus thuộc nhóm Cucumo virus là loại virus
có dạng hình cầu, đờng kính vào khoảng 28 29nm, không có màng bao.
- Cấu trúc:
+ Axit nucleic: RNA sợi đơn với 3 phần có chức năng riêng biệt xoắn
vào nhau có vỏ protein bao bọc bên ngoài tạo thành hình cầu. Quan sát dới

kính hiển virus điện tử gồm 3 lớp phân tử RNA đồng xoắn. Ba lớp này là 3 gen
RNA1, RNA2, RNA3, có độ lắng đọng khác nhau. Trọng lợng phân tử là 106
chiếm 18% trọng lợng phân tử CMV [28].
+ Protein: Trọng lợng phân tử 3,2 x !04 chiếm 82% trọng lợng phân tử
CMV [28 ].
Cây chỉ thị chủ yếu gồm:
- Cây rau muối (Chenopodium amaranticole và C. quinoa) lá cây bệnh
biểu hiện triệu chứng là những vết chết cục bộ.
- Đậu (Vigena unguiculata): Nhiễm cục bộ với những đốm màu nâu nhỏ
trên lá, một vài chủng gây ảnh hởng toàn cây.

4


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

- Thuốc lá (Nicotiana tabacum, N. glutinosa, N. clevelandii) biến vàng,
chết hoại cục bộ, khảm thờng xcanh hoặc khảm thờng vàng hệ thống, đốm
hình nhẫn, không có chết hoại.
- Cà chua (Lycopersycon esculentum) lá bị khảm nặng, thuỳ lá co lại,
biến dạng, kéo dài dạng dơng xỉ.
Truyền lan:
- Truyền qua côn trùng môi giới: Theo Quiot et al (1982) và Palukaitis
et al (1992) thì có trên 75 loài rệp có thể truyền CMV bằng phơng thức không
bền vững. Môi giới truyền chủ yếu là rệp đào (Myzes persicae), rệp bông
(Aphis gossypii). Virus sống trong tuyến nớc bọt của rệp và tuỳ các tuổi của
rệp mà có thể liên quan đến hiệu quả truyền lan của môi giới truyền. Đặc tính
truyền lan của CMV đợc quyết định bởi lớp vỏ protein của nó (Chen và

Franki, 1990) [28]. Rệp chích nạp virus trong thời gian 5 10 giây, khả năng
truyền chúng yếu dần sau 2 phút và thờng mất hẳn sau 2 giờ (Watson và
Roberts, 1939).
- Virus có thể đợc truyền bởi 10 loại dây tơ hồng Cuscuta Spp.
- Theo Green 1991 [15]. CMV dễ dàng truyền bằng phơng pháp tiếp
xúc cơ học, truyền qua hạt của 19 loại cây, rất nhiều cây CMV không dẫn
truyền qua hạt hoặc múc độ nhiễm rất thấp: Cucumis melon, C. Sativus,
Cucurbita pepo.
Phạm vi kí chủ: CMV có phạm vi kí chủ rộng 30 40 họ thực vật
(Attathom T.S và ctv, 1986), gây bệnh trên 800 loài thực vật thuộc cả lớp 1 lá
mầm và 2 lá mầm. kí chủ ban đầu là cây họ bầu bí, họ cà, họ ráy, cây ớt
(Capsicumannum), da chuột (Cucumis sativus), cây cà chua (Lycopersicon
esculentum) [28].
Đặc tính của virus gây hại:
- Ngỡng nhiệt độ mất hoạt tính: Q10= 700C.
- Thời gian tồn tại ở dung dịch: Sau một vài ngày ở nhiệt độ phòng
(Smith, 1972).
- Ngỡng pha loãng: 10-5.
2.1.2. Những nghiên cứu về ToMV.
Tên thờng gọi: Tomato mosaic virus tên viết tắt là ToMV. Các tên gọi
khác: Lycopersicum virus 1 (Rev. appl. Mycol. 36 : 303). Ngoài ra, còn có
nhiều tên gọi khác dựa vào các chủng của ToMV.

5


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

Virus khảm lá cà chua ToMV đợc phát hiện và mô tả lần đầu tiên bởi
Clinton (1909) ở trên cay cà chua trồng ở bang Conecticut (Mỹ) [32,35,48],
Wwetrdijk (1910), Allard (1916) (Bang Conecticut, Mỹ).
Vị trí phân loại [32]: ToMV thuộc nhóm Tobamovirrus. Nhóm này có
một số đặc điểm chính nh sau:
- Hầu hết các virus thuộc nhóm này có hình gậy thẳng, kích thớc
300x18nm (Chiều dài x đờng kính chiều rộng), hệ số lắng đọng 190S, mỗi sợi
virus đợc cấu tạo bởi 2000 tiểu đơn vị sắp xếp theo hình sợi xoắn ốc bao
quanh genom có chứa phân tử đơn của sợi RNA, chiếm 5% trọng lợng virus.
RNA có trọng lợng phân tử là 2 x 106Da. Các virus thuộc nhóm này có ngỡng
nhiệt độ mất hoạt tính (TIP) là 900C, trong nhựa cây virus có thể tồn tại nhiều
năm liền, mật độ tập trung cao nhất lên tới 10g/l.
- Nhóm virus này thờng gây ra triệu chứng đốm chết và khảm lá, con đờng lan truyền chủ yếu qua tiếp xúc giọt dịch, tiếp xúc cơ giới giữa cây khoẻ
và cây bệnh, đôi khi truyền qua hạt giốn. Sợi virus đợc tìm thấy trong tế bào
chất, trong lục lạp và không bào.
-ToMV còn đợc phát hiện ở Đài Loan, có 3 chủng virus gây hại trên cà
chua gồm: ToMV1, ToMV2, ToMV3, (S.K Green, L.H. Wang, 1980, 1982), ba
chủng này mang gen khác nhau, ToMV gây hại hầu hết trên các giống cà chua
thơng mại [31]. Theo Smith (1975) ToMV có hai chủng quan trọng là Tomato
aucuba mosaic và Tomato enation mottle [46]
Tomato mosaic virus có thể gây hại ở hầu hết các cây họ cà. Triệu
chứng do ToMV gây ra trên cây cà chua chịu ảnh hởng lớn về nhiệt độ, độ dài
ngày, tuổi cây, độ độc của virus và phơng thức trồng (Holling S. M.,
Huttingga, 1976) [35]. Triệu chứng xuất hiện phổ biến trên cây cà chua vào vụ
hè khi cây cà chua đợc trồng trong nhà kính, cây cà chua bị nhiễm bệnh xuất
hiện những đốm trên lá và trên quả, cũng có thể tạo ra các vết sọc chết hoại
trên thân , lá và quả. Vào mùa đông, quả thờng bị thối, mùa hè quả thờng bị
khô ở giai đoạn quả đang phát triển [20,35]. Mùa đông ngày ngắn, cờng độ
ánh sáng yếu, nhiệt độ thấp khoảng 200C, cây thờng còi cọc, lá dơng xỉ hoặc
dạng sợi chỉ, trên lá có các đốm sáng. Thiệt hại về năng suất có thể lên tới 3

23%, (Broadbent, 1964; Rast, 1975). Theo Simth (1957) [46] khi cây cà
chua bị nhiễm đồng thời virus ToMV và PVX gây lên khảm sọc đôi. ToMV
gây hại trên thân cây, làm cây còi cọc, lá dơng xỉ hoặc hình sợi chỉ có kèm
theo các vết đốm sáng [47] cuống quả khi bị bệnh phát triển gây ra các vết

6


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

lõm sâu và khảm dạng sọc đơn (Jarset, 1930). Điểm chung là các cây con trở
nên căn cỗi và kèm theo sự vặn vẹo méo mó dạng dơng xỉ biểu hiện ra ngoài
các lá cây, các lá yếu ớt. Virus là nguyên nhân gây đốm vằn, đốm sọc và hoại
tử trên cà chua. Bệnh không làm chết cây nhng chúng có thể làm kém chất lợng và sản lợng quả. Cây ớt (Capisicum anauum) có sức đề kháng với ToMV.
Tuy nhiên, trong những điều kiện canh tác chật hẹp, trồng ớt sau khi trồng cà
chua bị nhiễm thì cây ớt vẫn bị nhiễm. Trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum)
cây khoai tây (Solanum turberosum) ToMV gây đốm lá, rụng lá thối thân và
còi cọc, trên cây rau muối (Chenopodium murale) ToMV là nguyên nhân của
sự rụng lá, còi cọc và chết hoại (Bad and Paulus, 1963) [35].
Các tác giả cũng phân nhóm:
- Nhóm 1: Lá cây cà chua bị khảm đốm tạo thành các vùng xanh nhạt,
xanh đậm, đôi khi gây biến dạng lá non. Đây là triệu chứng chung của cà chua
trong nhà kính phản ứng lại trong điều kiện nhiệt độ thấp.
- Nhóm 2: Triệu chứng đốm vàng trên lá và trên quả (Bewley, 1923;
Smith, 1957)
- Nhóm 3: Triệu chứng đốm chết hoại trên thân lá, cuống quả hoặc trên
quả. Một số chủng của virus gây ra các triệu chứng sọc đơn hay sọc nhà kính
(Glasshouse Streak) trên thân cây, cuống lá, đôi khi gây chết cây. Quả nhiễm

bệnh tạo ra các vùng chết hoại cục bộ lõm lại trên bề mặt quả. Một vài chủng
của virus gây ra triệu chứng đốm sọc ở nhiệt độ 26 0C hoặc thấp hơn (Komuno
et al, 1996). Một số chủng của ToMV kết hợp với PVX cùng lây nhiễm tạo ra
triệu chứng dạng sọc đôi. Quả bị nhiễm bệnh bị chết hoại cục bộ, sau đó lõm
lại (Vallean and Jonhon, 1930; Wharton, 1957) một số chủng khác gây chết
hoại trên quả và làm vỏ quả cứng giòn (Rast, 1957) [35].
Theo các nghiên cứu gần đây đã đợc công bố thì ToMV còn gây hại
trên một số loài hoa và cây cảnh. Đã có báo có đầu tiên về ToMV gây hại trên
cây hoa Râm Bụt (Hibiscus rosa sinenis): Gây khảm hệ thống ở lá non gây
nhăn và biến dạng ở lá già hơn và gây lùn cây. Triệu chứng xuất hiện hay
không xuất hiện, rõ ràng hay không rõ ràng còn phụ thuộc vào điều kiện ngoại
cảnh nh: Mùa vụ, ánh sáng, nhiệt độ, sinh trởng và phát triển của cây cà chua.
Từ các nhận xét trên, chúng tôi thấy: Phải có những phơng pháp hỗ trợ
khi cần xác định chính xác nguyên nhân gây bệnh của một loại virus hại cà
chua nh phơng phá ELISA, phơng pháp dùng cây chỉ thị, phơng pháp PCR
(Polymerase Chain Reaction).

7


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

Phân bố địa lý: ToMV phân bố trên toàn thế giới, đăc biệt ở các vùng
trồng họ cà.
Phạm vi ký chủ: ToMV có phạm vi ký chủ rộng, có tơi 127 loài thuộc
23 họ thực vật nhiễm ToMV (Edwards and Christie, 1997) [22]. Theo Maitlin
(1984) có trên 9 họ thực vật mẫn cảm với ToMV [28].Năm 1909, Clinton đã
tiến hành lây nhiễm thực nghiệm ToMV trên nhiều loại cây và xác định nhiều

cây mẫn cảm với ToMV:
- Capsicum annuum, Caosicum
frustescens, Chenopodium
amaranticolor, Chenopodium murale, Nicotiana benhamiana.
Cây ký chủ mẫn cảm của ToMV:
- Cây cà độc đợc (Solanum giganteum): gây khảm hệ thống
- Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum cv. White Burley): Gây vết chết cục bộ.
- Cây rau muối (Chenopodium murale): Gây ra sự rụng lá, cây còi cọc
và chết hoại (Bald and Paulus, 1963) [24].
Cây ký chủ duy trì và nhân giống:
- Cà chua (Lycopersicon esculentum)
- Thuốc lá (Nicotiana tabacum cv Samsun)
Cây ký chủ kiểm tra:
- Nicotiana benthamiana, Nicotiana glutinosa, Nicotiana tabacum cv
Samsun.
Nhiều tác giả cho rằng: ToMV có thể tấn công nhiều loai ký chủ khác
nhau kể cả cà chua, hồ tiêu, thuốc lá, cây rau bina, cây thuốc lá cảnh và cây
cúc vạn thọ. Trên cây cà chua, virus lây nhiễm và gây ra những vết đốm sáng
xanh tối xen kẽ trên bề mạt lá [20, 35].
Đặc tính vật lý và hoá học:
- Điểm đẳng điện (Isoelestric point): ph từ 4,5 4,64.
- Nhiệt độ giới hạn mất hoạt tính TIP (Thermal Inactivaytion Point):
Q10= 850C- 900C.
- Ngỡng pha loãng (Dilution End Point): DEP 10-5 10-7.
- Thời gian sống và gây hại trong dịch cây (Longetivy In Vitro): LIV là 500
ngày. Trong tàn d cây cà chua, ToMV có thể tồn tại 24 năm, ở nhiệt độ trong
phòng là 200C. ToMV có khả năng sống và gây bệnh sau vài tháng ngay cả khi
nhiệt độ xuống thấp 0 20C ToMV vẫn có khả năng sống (Rast, 1975) [23.45].
Hình thái và cấu trúc của ToMV.

8


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

- Hình thái: ToMV có hình gậy, chiều dài 300nm, đờng kính chiều rộng
18nm. Bộ genom là RNA, sợi đơn, dạng hình xoắn ốc.
- Cấu trúc:
+ Nucleic Acid: 5%, hạt hình virus sợi RNA, thành phần RNA gồm:
23%G, 28%A, 19%C, 305U (Maldeles, 1968) [35].
+ Vỏ protein (CP): 95%, kích cỡ 17600Da (Fralk Kel and Conrat,
1957), (Wiltmann and Liebold 1967).
Truyền lan:
- Truyền lan qua hạt giống: Theo David G. A. Walkey (1985) có 1
chủng 17 loại virus truyền qua hạt giống. ToMV là một trong những loại virus
truyền lan qua hạt giống. Hạt của các loại giống khác nhau thì mức độ xâm
nhiễm khác nhau và có sự biến đổi lớn, khoảng 50% số hạt thờng xuyên bị
nhiễm có khi lên tới 94% (Van Winkel, 1965). ToMV chủ yếu tồn tại trên vỏ
hạt, theo Taylor Wind Colaborater (1996), Broadbent (1965) đôi khi cũng có
trong nội nhũ, ToMV không nằm trong phôi của những mầm hạt bị bệnh,
ToMV có thể nhiễm nhẹ trong vài tháng trên các mẫu hạt thu từ cây mẹ bị
nhiễm sự lan truyền cơ học sang cây con [20,23,35].
- Sự lan truyền qua vectơ.: ToMV không lan truyền qua con đờng côn
trùng môi giới mà chủ yếu qua con đờng tiếp xúc cơ học từ cây, đất, gốc ghép,
cành ghép. Dụng cụ gieo trồng bị nhiễm ToMV (Broadley, 1972). Virus tồn tại
trong dịch cây, trên tàn d thực vật. Cây trồng khoẻ có thể bị nhiễm qua các vết
thơng cơ giới [47]. Nguồn nớc tới bị nhiễm ToMV cũng mở rộng phạm vi lan
truyền. Các chủng ToMV có thể truyền nhờ cây tơ hồng. Vào mùa đông chủng

"yellow" và "green" dễ bị lây nhiễm còn mùa hè thì ít hơn ( Schmelzer, 1956)
[35].
Trên thế giới thiệt hại do ToMV gây ra trên cây cà chua khoảng 20%,
khi sản xuất cà chua trong nhà kính là khoảng 25% sản lợng [29,35].

9


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

2.1.3. Những nghiên cứu về virus xoăn lá cà chua (Tomato yellow leaf curl
virus: TYLCV)
TYLCV thuộc nhóm Gemini virus.
Triệu chứng cây bệnh: Cà chua bị bệnh thờng sinh trởng chậm, thấp
cây, cành và cuống lá thẳng đứng, lá bệnh cong lõm hình thìa, lá non của cây
bệnh nhỏ hơn lá non của cây khoẻ, có màu vàng. cây bệnh chậm ra hoa, quả
nhỏ.Tuỳ thuộc vào giai đoạn mà cây bị virus xâm nhiễm [34] sản lợng cà chua
thờng thiệt hại từ 50 75% (Yassin và Nour, 1965),[47], có khi lên tới 100%
[37a].
Phân bố địa lí: Vào năm 1960 bệnh xoăn vàng lá lần dầu tiên đợc báo
cáo là bệnh hại chủ yếu cho sản xuất cà chua ở Near East (Cohen và Harpez,
1964, Cohen và Nitzany,1966) [36], bệnh này cũng phát hiện thấy ở Thổ nhĩ
Kì (Abaketal, 1991), bán đảo ả Rập (Mazyad và CTV, 1979) [20]. Phía đông
và Tây Châu Mỹ (Defraneqd Hondt và Russo , 1985; Cozeck và CTV,1991,
Dembcle, 1993) [26,25,27].
Hình thái và cấu trúc của virus: Tomato yellow leaf curl virus
(TYLCV), thuộc nhóm Gemini virus, có kích thớc 20x30 nm [34], có hai đầu
lớn ở giữa thót lại hình quả tạ.

Tại Isarel, qua nhân dòng vô tính đã tìm đợc bộ genom DNA sợi đơn
vòng của TYLCV gồm 2787 nucleotit (Cozeck. H và CTV, 1988) [24].
Truyền lan: Theo Green S.K và Kalloo, 1994 [37], thì TYLCV đợc lan
truyền trong tự nhiên nhờ bọ phấn (Bemisia tabasi) theo kiểu bền vững, thời
gian bọ phấn chích nạp virus tối thiểu 15 30 phút. Sau khi chích nạp, virus
không tồn tại đợc trong suốt vòng đời của côn trùng mà chỉ tồn tại đợc trong
20 ngày (Cohen và Nitazy,1966) [34]. Thời gian bọ phấn truyền virus là 15
phút, thời kỳ tiềm dục là 20 giờ (Green S.K, 1991) [33]. Virus TYLCV không
thể lan truyền qua tiếp xúc cơ học và cha có một báo cáo nào nói về sự lây
truyền của virus qua hạt giống.
Phạm vi kí chủ: TYLCV có phổ kí chủ rộng, chủ yếu nhiễm trên cây họ
cà (Solanaceae), họ caprifoliaceae và họ Composite.
2.1.4. Những nghiên cứu về virrus cuốn lá khoai tây (Potato laef roll virus:
PLRV)
Virus cuốn lá khoai tây còn có tên gọi khác là: Potato phloem
necrovirus (Quanger 1913), Solanum virus I4 (Smith). Ngoài ra PLRV còn đợc gọi là virus L hay virus E khoai tây.

10


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

Kí chủ của PLRV: Chủ yếu là cây họ cà Solanaceae nhng có một vài
cây không thuộc họ cà cũng có thể là kí chủ của virus nh:Amaranthus
Caudatus, Celosia argentra, Gomphera globosa...
Cây chỉ thị chủ yếu lcủa virus là: Physalis Floridana, Datura
Stramodium, Solanum tuberosum...
Hình thái và cấu trúc: Có dạng hình cầu, đờng kính là 24nm theo Zkin

A.G (1976) cho biết trong cơ thể côn trùng kích thớc virus đo đợc là 23nm
còn ở trong tế bào cây là 24 - 25 nm.
Các chủng virus cuốn lá: Ngời ta phân chủng virus cuốn lá theo phản
ứng của cây Physalis Floridana với virus. Các tác giả Webb, Larson, Walker
(1951) và Webb (1955) đã chia virus thành 5 chủng khác nhau, Rozendaal
(1952) chia virus thành 3 chủng.
Triệu chứng virus cuốn lá: Các tác giả đều cho nhận xét là thờng thì lá
gốc bị cuốn, toàn cây hơi vàng, lá cứng và giòn, ở một số giống mẫn cảm lá
cây bị cuốn tròn hẳn lại, đôi khi có hiện tợng lá ngọn cuón trớc rồi mới cuốn
lá gốc, có thể thấy những vết chết ở mạch libe và sự tích luỹ Cacbohydrat ở lá
cây
Phơng thức truyền bệnh: Theo Kenedy, Day, Esatop 1962 xác định thấy
virus cuốn lá truyền bệnh đợc nhờ 10 loại rệp thuộc họ Aphididae. Rober Y và
Mary Y (1970) cho rằng: Myzus persicae, Aulacorthum Solani,
Maccrosiphum euphorbiac là 3 loài chính. Cũng theo các giả này virus cuốn
lá không truyền nhờ tiếp xúc cơ học và cha có tài liệu nào nói đến virus truyền
qua hạt giống. Theo William (1957) cho biết virus cuốn lá có thể truyền qua
cây tơ hồng(Cuscuta Subinclusa).
PLRV: + mất hoạt tính (Q10) ở 70 - 800C.
+ Ngỡng pha loãng 10-4. Trong dịch cây ở 200C virus tồn tại đợc
1 ngày và ở trong côn trùng tách ra giữ đợc từ 12 - 24 giờ ở 250C.
2.1.5. Những nghiên cứu về virrus khảm lá khoai tây (PVX).
Potato virus X đợc phát hiện bởi Smith (1931). Họ Flexividae, Giống
Potex virus, loài Potato virus X (PVX) tên gọi là virus khảm lá khoai tây
[18,43.44].
PVX có nhiều tên gọi khác nhau:
- Potato latent virus (Rev. Appl. Mycol. 11:595).
- Potato mid mosaic virus (Rev. Appl. Mycol. 12:367).
- Solanum virus I (Rev. Appl. Mycol. 17:52).

11


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

- Tabaco ringspot virus (Johnson, 1972).
- Potato X potex virus (Smith, 1931) [18,25,43,44].
Triệu chứng: Trên cây cà chua PVX gây khảm lá và đốm sáng. Trên cây
ớt PVX gây đốm sáng trên lá và thân [18,44]. Khi PVX gây hại cùng với 1 số
virus khác nh: PVX + PVY + PVS hoặc PVX + PVM + PVS thì năng suất
khoai tây và cà chua có thể giảm tới 50% trở lên (A.L. Ambroshov, 1978), A.J.
Reetman (1970) cho biết PVX có thể làm giảm năng suất khoai tây tới 25%
khi bệnh nặng. Nếu khoai tây bị nhiễm đồng thời PVX + PVY thì gây hiện tợng khảm đỏ thì thiệt hại về năng suất nghiêm trọng nhất [18].
Phân bố địa lý: PVX phân bố ở các vùng trồng khoai tây trên thế giới và
lan truyền mạnh ở ấn Độ
Phạm vi kí chủ: PVX có phổ kí chủ rộng, trong tự nhiên PVX nhiễm ít
nhất trên 62 loài cây trồng và truyền qua 384 loài thuộc 33 họ cây trồng khác
nhau (Edwwardson and Christie, 1997) [22]
Hình thái và cấu trúc:
- Hình thái: Virus PVX có cấu tạo hình sợi dài xoắn và cong queo
(Berck R. 1970). Hạt virus có màng bao bọc dạng sợi dài, chiều dài 515nm, đờng kính chiều rộng 13nm (Brander, 1964) [17] khoảng cách giữa các vòng
xoắn 3,4nm, các vòng xoắn cơ bản rõ ràng (Varma et al., 1968)
- Cấu trúc: Trọng lợng phân tử 35x106 Da (Reimann, 1959). Hệ số lắng
đọng 17,7s. thể tích phân tử 0,73cm 3/g (Lauffer and Carturight). Nuceic acid
chiếm 6%, dạng sợi đơn độc thể RNA (Knight, 1963,Huiseman et al, 1988;
Tollin and Wilson,1988) [35]. Kích thớc của genom bằng 6,435kb, thành
phần cơ bản gồm: 32%A, 22%G, 22%, 24%C.
+ Protein chiếm 94% cấu trúc vỏ protein (Cp) có cỡ 30000 Da đợc tạo

thành bởi các aminoacid (Shaw and Larson, 1962, Shaw et al, 1962; Miki
anhd Kinght,1968) [35,61].
+ Lipit chiếm 0%. Tách Cp của virus PVX ra bằng men proteazase hoặc
bằng phenol thì virus vẫn giữ đợc khả năng lây nhiễm [19]. PVX có thể vùi
không có hình dạng nhất định.
Truyền bệnh của virus: PVX chủ yếu truyền bệnh qua tiếp xúc cơ giới.
Theo R.S Mehrotra (1989), virus PVX truyền qua dịch cây, có sự tiếp xúc với
cây khoẻ. ở 200C PVX vẫn giữu khả năng lây hiễm nhiều tuần (Bode, 1968).
PVX không lan truyền qua hạt giống, phấn hoa [33,37].
2.1.6. Những nghiên cứu về virrus Y khoai tây (PVY).

12


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

PVY có các tên goi khác nhau nh:
- Potato acropelal necrosis (Rev. Appl. Mycol. 10:745).
- Tabacco vein banding virus (Rev. Appl. Mycol.10:36).
- Tabacco veinal necrosis virus (Rev. Appl. Mycol.31:201).
- Marrmor upsilon (Rev. Appl. Mycol.28:514).
- Solanum virus 2 (Rev. Appl. Mycol.17:52).
Triệu chứng: Các chủng virus Y hại khoai tây: Bawden 1936 phát hiện ra
nhóm virus C khoai tây, sau này có tên là Yc. Từ 1940 1944 Smith K.M ,Y.
Dennis Nobrega và Silberchmidt phát hiện chủng virus Yn (gây chết thân thuốc
lá), chủng Yo đợc Kanhn và Monroe xác định và mô tả chính xác vào năm (1963)
tuy chủng này rất phổ biến trên thế giới và ngời ta đã gặp chúng từ lâu.
Hình thái và cấu trúc: Theo Smith (1931), virus Y thuộc nhóm poty

virus, có kích thớc 730-780x11nm. Sợi virus nhỏ cong queo, có cấu trúc xoắn.
Các sợi virus khi làm sạch (purification) có trờng hợp chỉ dài 684nm (theo
R.G. Gogan, 1970).
Lan truyền: Virus Y có thể lan truyền bệnh nhờ phơng pháp tiếp xúc
giọt dịch và côn trùng môi giới theo kiểu không bền vững qua một vài loài rệp
thuộc họ Aphididae, chủ yếu là rệp đào Myzus perjicae Sulz. Rệp chích hýt
dịch cây tối thiểu là 10-30 giây. VirusY không cần trải qua thời kì tiềm ẩn
trong cơ thể rệp mà có thể truyền ngay sau 15 giây vào cây khoẻ. Một vài trờng hợp, thời gian này có thể kéo dài. Virus Y có kgar năng tồn tại trong cơ
thể rệp tối đa là 2 giờ (A. Giib và B. Harrison, 1975) [32].
Phạm vi kí chủ: Kí chủ của PVY gồm khoảng 60 loài cây, chủ yếu là họ
cà (- Solanaceae) rồi đến họ rau muối (- Chenopodiaceae) và họ đậu (Fabaceae) (Thern berry, 1966).
Đặc tính của virus Y: Theo R.G Gogan (1970) PVY có:
- Nhiệt dộ mất hoạt tính: Q10 = 55 600C.
- Ngỡng pha loãng của dịch cây: 10-2 10-3.
- Thời gian tồn tại trong giọt dịch là: 48 72 tiếng.
Nhng theo Zukin A.G 1976. cho biết:
- Nhiệt dộ mất hoạt tính: Q10 =56 600C.
- Ngỡng pha loãng của dịch cây: Q10 = 10-5.
- Hoạt tính của virus tròn lá tơi giữ đợc khoảng 6 ngày ở 40C , lá khô và
lạnh tới 11 tháng.

13


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

2.2. Những nghiên cứu trong nớc.
Bệnh virus đầu tiên đợc ghi nhận ở Việt Nam là bệnh lúa vàng lụi ở Tây Bắc hại

trên lúa nếp vào năm 1910 và Lạng Sơn năm 1920 [9,11]. Đến nay bệnh virus hại thực
vật đã đợc chú trọng nghiên cứu từ nhiều tác giả: Nguyễn Thơ, Nguyễn Hữu Thuỵ, Vũ
Triệu Mân, Hà Minh Trung, Ngô Bích Hảo.
- Năm 1967 Nguyễn Hữu Thuỵ đã xác định sự có mặt của virus X khoai tây.
- Năm 1972 Nguyễn Thơ xác định virus X và một số virus khác xuất
hiện ở Gia Lâm.
- Vũ Triệu Mân (1981): Virus khoai tây hại trên cà chua với tỷ lệ 20%
trong vụ đông xuân và trong vụ xuân hè gần 25% tổng số cây bệnh. Các
chủng virus PVX1, PVX2 đều có mặt trên cà chua. [7]
- Theo Nguyễn Thơ (1984). Khi mật độ bọ phấn (Bemisisa tabaci) từ
56-58 con/cây cà chua thì tỷ lệ bệnh xoăn vàng lên tới 99,44%. Khi ghép cây
mang mầm bệnh với gốc cây khoẻ thì tỷ lệ bệnh là 100% [14].
- Vũ Triệu Mân (1984) khi nghiên cứu bệnh virus hại khoai tây trên
giống Ackersegen trồng ở Miền bắc Việt Nam đã xác định đợc 2 chủng
PVX1, PVX2. Theo tác giả khi PVX + PVY làm cho cây khoai tây xoắn lùn
củ nhỏ hoặc không có củ. PVX còn gây hại trên các cây họ cà khác nh cà
chua, ớt, thuốc lá. Tác giả phân 5 loại triệu chứng cơ bản của virus khoai tây
trên cà chua là: Xoăn xanh ngọn, xoăn vàng ngọn, xoăn lùn, xoăn cuốn lá,
khảm lá [7].
Theo Vũ Triệu Mân (1984) trên cà chua ngoài bệnh xoăn vàng lá cà
chua (Tomato yellow leaf curl) còn có bệnh virus khác thờng gặp là : TMV,
CMV, ToMV. Trên ruộng cà chua thờng xuất hiện với những triệu chứng
hỗn hợp do nhiều virus gây ra thờng 1 cây có thể có tới 2 virus trở lên, có trờng hợp tới 4 5 virus [9]. Bệnh xoăn vàng lá thờng gặp ở cà chua. Các bệnh
khác cũng thờng gặp là virus X, virusY, virus TMV Việt Nam thờng thấy
triệu chứng hỗn hợp do nhiều loài virus gây ra nên rất khó tìm thấy ở 1 cây chỉ
nhiễm riêng 1 loại virus.
Các virus Tobacco mosaic virus (TMV), Cucumber mosaic (CMV), X,
Y, Papaya ring spot virus (PRSV), PMV đợc nghiên cứu và sản xuất thử
huyết thanh tại trờng Đại học Nông nghiệp I, kĩ thuật ELISA đợc sử dụng để
xác định các virus trên.

- Theo Nguyễn Văn Tuất (Viện Bảo Vệ Thực Vật, 2002 ), virus sau khi
xâm nhiễm vào cây gây ra nhiều triệu chứng khác nhau mà chúng ta có thể
quan sát đợc bằng mắt thờng. Tuy nhiên, cũng có trờng hợp không ghi nhận đợc bất cứ 1 biểu hiện nào khác bằng mắt thờng ngời ta gọi là "bệnh ẩn" [12].

14


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

- Theo Ngô Bích Hảo (2002) ngoài các bệnh virus trên, cây cà chua
còn bị các virus khác gây hại nh: CMV, ToMV, PVV [4].
- Ngô Bích Hảo và CTV (2003) đã điều tra nghiên cứu bệnh khảm vàng
lá ở vùng Hà Nội và phụ cận đã xác định ToMV gây hại khá phổ biến, bệnh
xuất hiện từ giai đoạn phân cành, gây hại mạnh vào giai đoạn ra hoa, hình
thành quả có xu hớng giảm vào giai đoạn thu hoạch. Theo tác giả, triệu chứng
do ToMV gây ra chủ yếu là loại hình khảm vàng, dạng dơng xỉ có xuất hiện
nhng ít và thờng xuất hiện vào giai đoạn phân cành đến thu hoạch. Cây cà
chua bị nhiễm triệu chứng khảm, khảm vàng, xoăn vàng, lá dơng xỉ, thì phát
triển kém, nếu bị nhiễm vào giai đoạn trớc ra hoa thì thờng không cho thu
hoạch. Trong ruộng sản xuất vào vụ xuân hè thì có tới 4/5 giống nhiễm ToMV,
bị nhiễm nặng nhất là giống Xanhpie (Pháp). Giống số 609 không thấy nhiễm
ToMV. Bằng phơng pháp cây chỉ thị, ELISA Ngô Bích Hảo đã xác định đợc 1
số cây kí chủ của ToMV là cà chua, cà độc dợc, cà pháo, cà bát, cà dại [5].
- Đoàn Thị ái Thuyền, Lu Việt Dũng, Vũ Triệu Mân (2003) đã phát
hiện tới 30,23% số mẫu nhiễm virus ToMV, PVX, PVY trong tổng 140 mẫu
thử của một số cây trồng thuộc họ cà (Solanaceae) trong đó có tới 23,25% số
cây trồng thuộc họ cà bị nhiễm ToMV, 36% mẫu bị nhiễm đồng thời cả 3 virus
ToMV, PVX, PVY. Tỷ lệ mẫu nhiễm cả 2 virus ToMV, PVY chiếm 18,02%

[14]. Từ đây tác giả khẳng định cần phải sản xuất thành công 1 số kit ELISA ở
Việt Nam để m chẩn đoán bệnh virus điều này góp phần giảm giá thành nhập
khẩu, nâng cao chất lợng nghiên cứu chẩn đoán và bảo vệ sản xuất Nông
nghiệp ở Việt Nam.

Phần 3
Đối tợng, địa điểm, vật liệu, nội dung và phơng
pháp nghiên cứu
3.1 Đối tợng nghiên cứu
- Bệnh virus khảm lá cà chua (Tomato mosaic virus ToMV).
- Bệnh virus khảm lá dơng xỉ (Cucumber mosaic virus CMV).
- Bệnh virus cuốn lá khoai tây ( PLRV).
- Bệnh virus khảm lá khoai tây (PVX).
- Bệnh virus Y khoai tây (PVY).
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.
+ Thời gian thực hiện đề tài:
- Đề tài đợc thực hiện từ ngày 15/3/2007 30/6/2007.

15


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

+ Địa điểm thực hiện đề tài:
- Các nghiên cứu trong phòng đợc thực hiện tại Trung tâm Kiểm Dịch
Thực Vật Sau Nhập Khẩu I - Hà Nội.
- Điều tra thu thập mẫu tại 2 địa điểm:
* Hợp tác xã sản suất và tiêu thụ rau an toàn Đạo Đức - Xã Vân Nội Đông Anh - Hà Nội.

* Thôn Phơng Viên - Xã Song Phơng - Hoài Đức - Hà Tây.
3.3. Vật liệu nghiên cứu.
3.3.1 Thu thập mẫu.
Mẫu lá cà chua bị bệnh đợc thu thập trên những cây có triệu chứng
bệnh điển hình (thu thập những lá non, lá bánh tẻ), ngay trên ruộng sản xuất
cà chua tại điểm điều tra. Mỗi mẫu lá khi thu thập đợc bảo quản trong điều
kiện khô, mẫu đợc cho vào túi Polyethylen có đánh số thứ tự và kí hiệu. Sau
đó, toàn bộ mẫu đợc cho vào hộp xốp có lót những chai nớc đá lạnh. Đảm bảo
sao cho mẫu lá luôn tơi và đạt yêu cầu trớc khi kiểm tra ELISA. Trọng
lợng mỗi mẫu thu thập từ 15 - 20g.Trọng lợng mỗi mẫu đa vào kiểm tra
ELISA là 2g. Các mẫu đợc xác định virus cần kiểm tra đợc thu thập lại 10g lá
tơi bảo quản trong tủ lạnh - 200C để lây bệnh nhân tạo trên cây chỉ thị.
3.3.2. Thiết bị, dụng cụ và hoá chất nghiên cứu.
+ Thiết bị nghiên cứu:
- Máy đọc bản ELISA, tủ lạnh bảo quản mẫu, tủ định ôn, cân điện tử
+ Dụng cụ nghiên cứu:
- Pipet tự động 1 côn: 10 20àl, 100àl, 200à, 100 1000àl
- Pipet tự động 8 đầu côn.
- Đầu côn nhựa: của các pipet tự động kể trên.
- Túi PE đựng mẫu.
- ống đong 10 100ml.
- Bình thuỷ tinh loại: 50 100ml.
- Phễu lọc, vải lọc, giấy thấm.
- Hộp nhựa có nắp để đựng bản ELISA.
+ Hoá chất:
Các hoá chất thông dụng để pha dung dịch đệm, chất nền, các kháng
huyết thanh của PVX, PVY, PLRV của hãng Bioteck do Trung tâm Kiểm

16

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

Dịch Thực Vật Sau Nhập Khẩu I (TTKDTVSNKI) cung cấp, kháng huyết
thanh của virus ToMV và CMV do Trung tâm Bệnh Cây Nhiệt Đới cung cấp.
3.3.3. Nội dung nghiên cứu.
3.3.4. Phơng pháp nghiên cứu.
Điều tra diễn biến bênh virus trên đồng ruộng vụ xuân hè - 2007 ở Hà
Nội và vùng phụ cận.
Xác định bệnh virus ToMV, CMV, PVX, PVY, PLRV trong thời gian
thực tập.
Kiểm tra nguyên nhân gây bệnh virus bằng phơng pháp ELISA và phơng pháp cây chỉ thị.
Mô tả triệu chứng của ToMV, CMV, PVX, PVY, PLRV hại cà chua.
3.3.4. Phơng pháp điều tra.
3.3.4.1. Phơng pháp nghiên cứu ngoài đồng.
- Lựa chọn khu ruộng chuyên canh rau màu thuộc địa điểm nghiên cứu.
- Điều tra theo phơng pháp 5 điểm đờng chéo góc. Mỗi điểm điều tra từ
50 đến 100 cây đối với ruộng có diện tích lớn. Điều tra 100% số cây đối với
ruộng có diện tích nhỏ.
- Theo dõi các dạng triệu chứng gây ra trên cà chua.
- Thu thập mẫu bệnh để kiểm tra ToMV, CMV, PVX, PVY, PLRV trong
thực tiễn sản xuất ngoài đồng ruộng.
- Theo dõi định kì 7 ngày 1 lần. Thu thập số liệu và tính tỷ lệ bệnh,
quan sát và mô tả đặc điểm cây nhiễm bệnh.
3.3.4.2. Phơng pháp xác định bệnh trong phòng.
* Lây bênh nhân tạo.
Sử dụng các mẫu cà chua đã đợc xác định nhiễm virus ToMV, CMV,
PVX, PVY, PLRV thu từ các điểm điều tra. Bảo quả các mẫu trong điều kiện

nhiệt độ lạnh sâu 200C để làm nguồn lây bệnh khi tiến hành thí nghiệm lây
nhiễm nhân tạo.
Các cây chỉ thị sau khi gieo trồng đạt đến số lá nhất định thì tiến hành
lây nhiễm nhân tạo. Với cây thuốc lá đạt 4 6 lá thật, cây rau muối và các
cây khác có từ 8 10 lá thật [10].
Thành phần cây lây nhiễm:
- Các cây kí chủ thuộc họ cà: Nicotian benthamiana, N. glutinosa, N.
tabacum CV Samsum, N. tabacum CV White Burley, N. tabacum CV Xanthi nc.

17


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

- Các cây kí chủ hoang dại: Cây rau muối (Chenopodium quinoa,
Chenopodium amaranticolor), cúc bách nhật (Gomphrena globosa L), Cây
tầm bóp (Physalis angulata L), cây cà độc dợc (Datura strammonium L), cây
ớt (Capsicum annuum L), cây rau dền xanh (Amaranthus Viridis L).
Lây bệnh bằng phơng pháp tiếp xúc giọt dịch [10,12]: nghiền mẫu lá
bệnh trong dung dịch đệm Photphats (Na2HPO4 + K2HPO4) 0.1M, PH= 7 với
tỷ lệ 1 gam lá/2 4 ml dung dịch đệm. Nghiền mẫu bằng chày cối xứ để duy
trì hoạt tính của virus. Sau đó thổi nhẹ bột Cacborandum 600 Mesh lên lá cây
cần lây. Nhỏ 1 2 giọt dịch lá cây bệnh lên, dùng đũa thuỷ tinh cọ sát nhẹ
lên toàn bộ mặt lá sao cho mô tế bào tạo vết sát thơng nhẹ. Sau 30 phút, rửa lá
cây lây bắng nớc cất, để cây đã lây bệnh vào trong lồng lới cách ly. Theo dõi
hàng ngày sự xuất hiện triệu chứng bệnh trên cây lây, đặc biệt là thời gian sau
lây nhiễm từ 4 5 ngày [10,12].
*Kiểm tra virus bằng phơng pháp ELISA.

+ Sử dụng phơng pháp Indirect ELISA để xác định nguyên nhân gây
bệnh của ToMV, CMV.
- Bớc 1: Cân mẫu hạt (lá bệnh) cho vào túi ni lông, nghiền trong dung
dịch đệm PBS vớ tỷ lệ 1/20 1/100 (g/l). Nhỏ 100àl dịch nghiền/giếng trong
bản ELISA. Đặt bản ELISA trong hộp ẩm, ủ 1 giờ ở 370C hoặc qua đêm ở 50C.
- Bớc 2: Hấp phụ chéo
Chuẩn bị mẫu cây khoẻ nghiền trong dung dịch đệm huyết thanh tỷ lệ
1/30, lọc qua vải lọc hoặc ly tâm ở 3000 5000v/p trong 3 5 phút, lấy
dịch trong. Cho huyết thanh vào dung dịch trên theo độ pha loãng cần thiết.
Khuấy đều, ủ 45 phút ở 370C.
- Bớc 3: Rửa bản với đệm PBS T 3 lần mỗi lần cách nhau 3 phút.
Làm khô bản bằng cách úp ngợc bản trên giấy thấm.
- Bớc 4: Cố định huyết thanh vào bản ELISA
Nhỏ dịch huyết thanh đã pha loãng trong dịch cây khoẻ sau khi ủ vào mỗi
bản ELISA 100àl/giếng, đặt bản ELISA trong hộp ẩm, ủ 1 1,5 giờ ở 370C.
- Bớc 5: Rửa bản nh ở bớc 3.
- Bớc 6: Cố định huyết thanh bậc 2 vào bản ELISA.
Nhỏ huyết thanh bậc 2 (Conjugate AP) với độ pha loãng 1/1000 1/5000,
100àl/giếng, để trong hộp ẩm, ủ 1giờ 1 giờ 30 phút hoặc qua đêm ở 50C.
- Bớc 7: Rửa bản nh ở bớc 3, rửa thêm lần cuối với nớc cất.

18


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

- Bớc 8: Cố định chất nền và đánh giá kết quả
Pha 0,25 0,3mg NPP/ml đệm Substrate, hoà tan. Cho 100àl đệm

Substrate đã pha loãng NPP/giếng, để trong hộp ẩm, ủ 60 phút ở nhiệt độ
phòng 200C. Đọc bản.
+ Sử dụng phơng pháp DAS ELISA để xác định nguyên nhân gây
bệnh virus PVX, PVY, PLRV.
- Bớc 1: Cố định IgG đặc hiệu virus.
IgG đợc hoà trong dung dịch đệm phủ vad đợc cho vào giếng với lợng
100àl/giếng. Bản ELISA đợc ủ trong họp ẩm ở 370C khoảng 2 4 giờ. Bản
ELISA có khả năng liên kết không đặc hiệu với protein do vậy sẽ liên kết với
các phân tử IgG (là protein miễn dịch).
- Bớc 2: Rửa bản ELISA với đệm PBS T 3 lần mỗi lần cách nhau 3
phút. Làm khô bản bằng cách úp ngợc bản trên giấy thấm.
- Bớc 3: Cố định dịch cây vào bản
Nghiền mẫu cây bệnh trong đệm chiết mẫu (PBS-T + 2% PVP với độ
pha loãng 1/10 1/20). Dịch cây đợc cho vào giếng với lợng 100àl/giếng.
Bản ELISA đợc để trong hộp ẩm và ủ ở 370C khoảng 2 4 giờ hoặc để qua
đêm ở 4 60C. Nếu trong dịch cây có chứa virus thì virus sẽ liên kết đặc hiệu
với IgG có sẵn trong giếng còn protein của cây hoặc các virus khác sẽ không
liên kết. Sau khi ủ bản ELISA đợc rửa nh bớc 2.
-Bớc 4: Cố định IgG Liên kết Enzym.
Hoà IgG liên kết enzym (IgG - E) trong đệm liên kết (PBS-T + 2%
PVP+ 0,2% ovabumin) cho vào giếng với lợng100àl/giếng. IgG này giống với
IgG ở bớc 1 nhng chỉ khác là nó đợc liên kết từ trớc với 1 enzym là Alkaline
Photphatase (AP). Bản ELISA đợc để trong hộp ẩm và ủ ở 370C từ 2 4 giờ
và rửa nh bớc 1.
- Bớc 5: Cố định chất nền và đánh giá kết quả.
Hoà chất nền trong đệm chất nền (Satsrat) theo tỷ lệ 0,6mg/ml cho vào
giếng với lợng 100àl/giếng. Chất nền ở đây là Nitrophenyl Photphatase (NPP).
Bản ELISA đợc ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 200C trong hộp ẩm trong tối 60
phút. Phản ứng hoá học ở đây là NPP sẽ bị thuỷ phân thành Nitrophenol
photphatase là chất có màu vàng dới sự xúc tác của enzym AP. Do vậy có thể

nhận biết bằng mắt thờng hoặc bằng máy đọc ELISA (máy so màu). Giếng

19


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

nào có màu vàng đậm chứng tỏ nồng độ enzym càng cao tức là nồng độ virus
trong mẫu thử càng cao. Có thể ngừng phản ứng thuỷ phân bằng cách bổ sung
dung dịch NaOH 3M với lợng 25 - 50àl. Đọc phản ứng ELISA bằng mắt hoặc
bằng máy đọc ELISA ở bớc sóng 405nm.
3.3.4.3. Phơng pháp xử lý số liệu.
- Tỷ lệ bệnh: TLB (%) = A/Bx100%
Trong đó: TLB (%): Tỷ lệ bệnh đợc tính bằng %
A
: Số cây có triệu chứng nhiễm bệnh virus.
B
: Tổng số cây điều tra.
- Tỷ lệ phát bệnh: TLPB (%) = A1/B1x100%
Trong đó TLPB (%) : Tỷ lệ cây phát bệnh sau lây nhiễm (%)
A1
: Số cây biểu hiện triệu chứng nhiễm bệnh sau lây nhiễm.
B1
: Số cây đợc đem lây nhiễm của công thức thí nghiệm.

20

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

Phần IV
kết quả nghiên cứu và thảo luận
4.1. Triệu chứng.
Theo kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả thì trên cây cà chua có rất
nhiều virus gây hại. Một virus gây bệnh có thể sinh ra nhiều triệu chứng. Mặt
khác trong cùng 1 cây có thể bị nhiễm hỗn hợp nhiều loại virus khác nhau mà
các virus này biểu hiện triệu chứng tơng đối giống nhau. Do vậy, việc xác định
tác nhân gây hại theo triệu chứng là khó chính xác trên thực tế. Qua quá trình
điều tra theo dõi diễn biến bệnh virus trên cây cà chua, chúng tôi đẫ phân
thành 1 số nhóm virus chính nh sau:
- Nhóm triệu chứng đốm hoại.
- Nhóm triệu chứng hoa lá.
- Nhóm triệu chứng xoăn lá.
- Nhóm triệu chứng biến vàng.
Các triệu chứng cơ bản của bệnh virus gây ra trên cà chua đợc các tác
giả quan sát và mô tả nh sau:
+ Triệu chứng xoăn vàng.
Bệnh xuất hiện và gây hại ngay từ giai đoạn cây còn non cho đến khi
kết thúc quá trình sinh trởng và phát triển. Cây bệnh sinh trởng, phát triển
kém, đỉnh sinh trởng ngọn bị nhăn nheo ngọn thờng chùn lại, các lá xoăn lại
cong lõm hình thìa, hai mép lá biến vàng từ ngoài vào trong phiến lá, làm cho
lá có màu vàng. Mùa đông khi thời tiết lạnh lá có màu tím.đặc biệt, triệu
chứng rất điển hình trên lá non và lá gần ngọn. Các lá non xoăn mạnh có màu
vàng, kích thớc nhỏ hơn so với lá cây khoẻ do đó làm ảnh hởng đến sinh
trởng và phát triển của cây c chua. Cây chậm ra hoa, quả nhỏ, tuỳ thuộc vào
giai đoạn cây bị nhiễm bệnh. Những cây nhiễm vào giai đoạn ra hoa đậu quả

thì ra hoa rất ít, quả nhỏ, múi khô, năng suất và phẩm chất kém. Cây bị bệnh
vào giai đoạn đã kết quả hoặc muộn thì phẩm chất kém và quả thờng bị dị
dạng [17].
+ Triệu chứng cuốn lá.
Phiến lá của cây bị bệnh nhỏ hơn bình thờng hoặc không đổi, có thể
kèm theo khảm, mép lá có xu hớng cuốn lại thành hình ống, thuỳ lá mất đi.
cây bị bệnh thờng thấp hơn cây bình thờng.
+ Triệu chứng lá dơng xỉ.

21


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

Cây còi cọc lá thờng mọc thành búi rậm rạp. Lá chét bị biến dạng mất
thuỳ, phiến lá co lại gần gân chính. Màu sắc lá xanh xỉn kéo dài dạng cây dơng xỉ. Cây bệnh ra hoa đậu quả kém.
+ Triệu chứng khảm biến vàng.
Trên Triệu chứng khảm xuất hiện những vết khảm xanh vàng xen kẽ
khi mới bị bệnh, bệnh nhẹ vết bệnh mờ. Khi cây bị nặng lá thờng nhỏ và bị
biến dạng, biến vàng, cây còi cọc,ra hoa nhng không đậu quả hoặc ít quả. Quả
nhỏ và xuất hiện gân mạng lới.
+ Triệu chứng khảm lồi lõm.
Lá cây bệnh có những vết đốm lồi lõm. Khi cây bị bệnh nhẹ sinh trởng và
phát triển của cây không bị ảnh hởng nhiều. Cây bị bệnh làm cho lá biến dạng.
Theo R.S Mehrotra (1989), triệu chứng dạng khảm do virus X hay
Solanum I, bao gồm nhiều chủng gây ra trên khoai tây. trong điều kiện khoai
tây sinh trởng thích hợp, triệu chứng không xuất hiện khiến cho khó nhận ra
bệnh. Triệu chứng hoa lá hầu nh biến mất ở nhiệt độ cao trên 21oC. Nhận định

này rất quan trọng cho các nghiên cứu về sau. Nếu cần nghiên cứu 1 loại virus
hại c chua nào đó thì việc tiến hành đầu tiên là phải nghiên cứu những vấn đề
chung trên tất cả các dạng triệu chứng bệnh virus hại cây trồng xuất hiện trên
đồng ruộng. Triệu chứng khảm xoăn lá làm cây bệnh khi bị nặng không có vết
đốm nhng bị nhăn nhúm nhỏ bé rõ rệt, lá ngọn cuốn cong xuống, toàn thân
thấp lùn, các lá phía dới gân lá có biểu hiện biến đen. Các vết đốm không xuất
hiện ở nhiệt độ cao, bệnh do phối hợp của 2 loại virus X và Virus Y [ 20,28].
Bệnh xoăn lá cà chua có quan hệ mật thiết với bệnh đốm xoăn, bệnh do virus
x và virus A gây ra [53]. Có khoảng 40 loại virus gây hại trên cây c chua
trên các vùng trồng c chua trên thế giới, làm giảm năng suất từ 15 25%
[22,39].

4.2. Điều tra diễn biến bệnh virus hại cà chua trên đồng ruộng.
Để đánh giá mức độ thiệt hại do bệnh virus gây ra trên đồng ruộng đối
với cà chua, chúng tôi tiến hành điều tra bệnh virus trên 2 địa bàn: Xã Song
Phơng Hoài Đức Hà Tây và HTX sản xuất và tiêu thụ rau an toàn Đạo
Đức Xã Vân Nội - Đông Anh Hà Nội.
4.2.1. Diễn biến bệnh virus trên giống cà chua Mỹ 902 tại Xã Song Phơng
Hoài Đức Hà Tây.
Trên cơ sở đánh giá chung về mức độ phát sinh, phát triển và gây hại
của virus trên cà chua. để xác định nguyên nhân gây bệnh do virus gây ra

22


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

chúng tôi tiến hành theo dõi diễn biến các dạng triệu chứng bệnh virus xuất

hiện trên đồng ruộng. Thực tế, trên các ruộng sản xuất cà chua chúng tôi khó
tìm đợc cây chỉ có một dạng triệu chứng, điều này phù hợp với kết luận của
Vũ Triệu Mân (1984). để có cơ sở đánh giá kỹ lỡng và tránh đợc các yếu tố
khác ảnh hởng đến kết quả nghiên cứu, chúng tôi chọn giống Mỹ 902, giống
này đợc trồng phổ biến ở Song Phơng Hoài Đức Hà Tây. Kết quả đợc
trình bày ở bảng 1 và đồ thị 1.

Bảng 1: Diễn biến bệnh virus trên giống cà chua Mỹ tại Xã Song
Phơng Hoài Đức Hà Tây.
Ngày
điều tra

TLB(%)
Khảm Khảm
vàng lồi lõm
lá
1,6
0,013
2,67
0,053
5,47
0,067
8,73
0,073
11,27
0,073
12,7
0,073

TLB

tổng
số
6,27
12,38
33,0
39,2
45,03
46,49

19/3/2007
25/3/2007
3/4/2007
13/3/2007
20/4/2007
4/5/2007

Xoăn
lá
3,06
6,33
18,27
20,0
20,0
20,0

Lá dơng xỉ
1,6
3,33
9,2
10,4

13,67
13,67

14/5/2007

20,0

13,86

13,0

0,073

46,95

25/5/2007
3/6/2007
11/6/2007

20,0
20,0
20,0

14,2
14,2
14,4

15,8
16,2
16,67

0,073
0,073
0,073

50,09
50,49
51,16

23

Giai đoạn sinh
trởng
8 12 lá thật
Ra hoa
Đậu quả - hoa
Quả nhỏ - hoa
Quả lớn - hoa
Quả xanh già
Quả bắt đầu
chín
Quả chín rộ
Thu hoạch
Thu hoạch


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

Đồ thị 1: Diễn biến bệnh virus trên giống cà chua Mỹ 902 tại Xã
Song Phơng Hoài Đức Hà Tây.
Qua bảng 1 và đồ thị 1, chúng tôi nhận thấy bệnh virus xuất hiện từ rất
sớm. Ngay từ đợt điều tra ngày 19/3 khi cây ở giai đoạn 8 12 lá thật bệnh
virus tổng số đã đạt tới 6,27% trong đó dạng triệu chứng xoăn lá chiếm tỷ lệ
cao nhất 3,06%. Đến giai đoạn ra hoa tỷ lệ bệnh tăng lên gấp đôi so với giai
đoạn 8 12 lá thật là 12,38%. Nguyên nhân là do nguồn giống không đảm
bảo, bệnh virus xuất hiện ở các cây con đã không đợc nhổ bỏ làm tăng nguồn
bệnh trên đồng ruộng. Mặt khác thời kì này thích hợp cho sự phát triển của
bệnh virus: CMV, ToMV, TYLCV Kết hợp với sự chăm sóc của chủ hộ nh
làm cỏ, xới xáo, làm giàn, bấm tỉa nhánh, lá gốc. đã làm tăng sự lan truyền
của virus.
ở các đợt điều tra tiếp theo, tỷ lệ bệnh tiếp tục tăng nhanh do đây là
thời kì cây đã lớn, tán lá phát triển rộng, mật độ trồng lại dày: 30 40cm/cây
làm lá cây bệnh và lá cây khoẻ chạm nhau, gây lây lan bệnh làm bệnh virus
tiếp tục tăng cao. ở đợt điều tra ngày 13/4 tỷ lệ bệnh tổng số đã lên tới 39,2%
tăng gấp 6 lần so với đợt điều tra ngày 19/3, trong đó dạng triệu chứng xoăn lá
vẫn chiếm tỷ lệ cao nhất là 20%, tỷ lệ lá dơng xỉ chiém tỷ lệ thấp hơn 10,4%,
rồi đến khảm vàng lá chiếm tỷ lệ 8,73%, tỷ lệ khảm lòi lõm thấp nhất 0,073%.
Nh vậy sự tăng tỷ lệ bệnh ở dạng triệu chứng dơng xỉ và xoăn lá đã quyết định
sự tăng tỷ lệ bệnh tổng số. Tỷ lệ bệnh xoăn lá ở thời kì này tăng lên rát cao và
hầu nh 100% số cây đã bị nhiễm bệnh do ở vụ xuân hè nhiệt độ không khí
cao, ít ma thuận lợi cho sự phát triển của bọ phấn Besimia tabaci môi giới
truyền bệnh xoăn lá cà chua.

24


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Duyên CNSH K1

ở đợt điều tra 25, 03,11/6 tỷ lệ bệnh tiếp tục tổng số tăng. Do lúc này
cây vào giai đoạn quả chín rộ, cho thu lứa quả đầu, ngời chủ hộ có thói quen
bấm tỉa ngọn khi cây có chùm quả bắt đầu chín để tập trung ding dỡng về nuôi
quả. Chính thói quen này đã làm lây lan nguồn bệnh khiến tỷ lệ bệnh tăng, đạt
tối đa vào thời kì thu hoạch :51,16% (11/6). Việc bấm tỉa, xới xáo, làm giàn,
bấm tỉa ngọnlà những khâu chăm sóc quan trọng quyết định việc tăng năng
suất cà chua, đây cũng là khâu làm tăng sự truyền lan của virus có khả năng
lây truyền qua tiếp xúc. Chính vì vậy việc chọn nguồn giống sạch bệnh để
trồng,phòng chống bệnh ngay từ giai đoạn đầu (nhổ bỏ cây bệnh, tiêu diệt bọ
phấn) là công việc hết sức càn thiết để hạn chế nguồn bệnh và sự lây lan
nguồn bệnh trên đồng ruộng.

4.3. Diễn biến bệnh virus trên giống cà chua savior tại Hợp tác xã sản
suất và tiêu thụ rau an toàn đạo đức - Đông Anh Hà Nội.
Các tác giả trong và ngoài nớc nghiên cứu về virus trớc đây đã ghi nhận
và khẳng định về sự xuất hiện và hiện tợng bệnh ẩn, hiện tợng mất triệu
chứng và sự tồn tại của nhiều virus có trong cùng một cây cà chua bị bệnh.
Thời vụ và giống cũng là những yếu tố ảnh hởng quan trọng đến bệnh. để có
những đánh giá chung về mức độ gây hại của virus và xác định sự có hay
không có sự xuất hiện của virus. Chúng tôi tiến hành điều tra diễn biến triệu
chứng bệnh virus tại 2 thời vụ trên giống cà chua savior tại HTXSX và tiêu thụ
rau an toàn Đạo Đức- Đông Anh Hà Nội. Kết quả đợc trình bày ở bảng 2
và đồ thị 2.
Với kết quả ở bảng 2 và đồ thị 2 chúng tôi nhận thấy: trên giống cà
chua Savior có sự khác nhau rệt về sự phát sinh, phát triển của bệnh virus cả 2
mùa vụ tại điểm điều tra. Sự khác biệt này có thể do ở 2 mùa vụ trên cùng 1
chân đất nhng chịu sự tác động khác nhau của các yếu tố nh nhiệt độ, ẩm độ,
độ dài chiếu sáng, côn trùng môi giớiở vụ muộn bệnh virus ở đợt điều tra

ngày (15/3) đã chiếm tỷ lệ khá cao (19,006%) ở giai đoạn quả non hoa sau đó
tỷ lệ bệnh tăng dần và đạt tối đa vào cuối thời kì sinh trởng của cây là 45,79%.
Trong khi đó ở vụ xuân hè bệnh virus xuất hiện rất sớm ngay từ giai đoạn 5
7 lá thật (20/3) thì tỷ lệ bệnh tổng số chiếm 0,2% ở các đợt điều tra tiếp theo
tỷ lệ bệnh tăng nhanh và đạt tối đa vào cuối thời kì sinh trởng là 50,872%.
Bảng 2: Diễn biến bệnh virus trên giống cà chua Savior tại HTXSX và
tiêu thụ rau an toàn Đạo Đức - đông Anh Hà Nội.

25