Nghiên cứu chế tạo chitosan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính kháng khuẩn

Tóm tắt:

Trong nghiên cứu này, chitosan đƣợc cắt mạch ở trạng thái trƣơng trong
dung dịch hydro peoxit và chiếu xạ bằng tia gamma Co-60. Khối lƣợng phân tử
của chitosan cắt mạch đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc kí gel thấm qua
(GPC). Phổ hồng ngoại (FT-IR) và tử ngoại – khả kiến (UV-vis) cũng đã đƣợc sử
dụng để nghiên cứu cấu trúc của chitosan cắt mạch. Kết quả cho thấy chitosan khối
lƣợng phân tử thấp Mw ~ 30 - 45 kDa đƣợc chế tạo rất hiệu quả bằng phƣơng pháp
chiếu xạ chitosan trƣơng trong dung dich hydro peoxit ở liều xạ thấp hơn 20 kGy.
Cấu trúc chính cũng nhƣ độ đề axetyl của chitosan cắt mạch hầu nhƣ không thay
đổi so với chitosan ban đầu. Hiệu suất cắt mạch bức xạ (Gs) đƣợc gia tăng đáng kể
khi có mặt H2O2. Chitosan khối lƣợng phân tử thấp thu đƣợc có hoạt tính kháng
khuẩn tốt, có thể sử dụng để bảo quản thực phẩm và các mục đích kháng khuẩn
khác.
Abstract:

In this study, degradation of chitosan in swollen state with hydrogen
peroxide solution by γ-irradiation was investigated. Molecular weight (Mw) of
irradiated chitosan was determined by gel permeation chromatography (GPC).
Fourier transform infrared (FT-IR) and ultraviolet-visible (UV-vis) spectra were
analyzed to study the structure changes of degraded chitosan. The results showed
that the chitosan of low Mw ~ 30 - 45 kDa was efficiently prepared by γ-irradiation
of chitosan swollen in hydrogen peroxide solution at low dose less than 20 kGy.
The main structure as well as the degree of deacetylation of the degraded chitosan
was almost no significant change. Furthermore, the radiation degradation yield (Gs)
was remarkably enhanced by the presence of H2O2. The obtained low Mw chitosan
revealed high antimicrobial activity for E. coli that can be used for food
preservation and other purposes as well.


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CTS

Chitosan

CTSM91

Chitosan có khối lƣợng phân tử 91 kDa

CTSM60

Chitosan có khối lƣợng phân tử 60 kDa

CTSM45

Chitosan có khối lƣợng phân tử 45 kDa

CTSM30

Chitosan có khối lƣợng phân tử 30 kDa

ĐĐA

Độ đề axetyl

E. coli

Vi khuẩn Escherichia coli

FT-IR

Phƣơng pháp Phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier (Fourier
transform infrared)

GPC

Phƣơng pháp sắc kí gel thấm qua (Gel Permeation
Chromatography)

Gs

Kí hiệu hiệu suất cắt mạch bức xạ

HSCMBX,

Hiệu suất cắt mạch bức xạ

HSTĐPƢ

Hằng số tốc độ phản ứng

kGy

Đơn vị iều hấp thụ bức xạ

KLPT

Khối lƣợng phân tử

Mn

Kí hiệu khối lƣợng phân tử trung bình số lƣợng

Mw

Kí hiệu khối lƣợng phân tử trung bình khối lƣợng

UV-vis

Phƣơng pháp phổ tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet - visible
spectroscopy)

XRD

Phƣơng pháp nhiễu xạ tia X (X–ray diffraction)

γCo60

Bức xạ gamma Co – 60

w/v

Khối lƣợng/thể tích

α

Mức thống kê


DANH MỤC BẢNG
Trang

Bảng 1.1. Một số thông số đặc trƣng của chitin, CTS

4

Bảng 1.2. Nồng độ tối thiểu của CTS để ức chế các loài vi khuẩn khác

11

nhau
Bảng 2.1. KLPT và thời gian lƣu của các mẫu chuẩn Pullulan

18

Bảng 3.1. Sự thay đổi ĐĐA của CTS theo thời gian phản ứng

22

Bảng 3.2. KLPT của CTS cắt mạch theo liều xạ với nồng độ H2O2 khác

25

nhau
Bảng 3.3. HSCMBX Gs theo liều xạ ở những nồng độ H2O2 khác nhau

27

Bảng 3.4. ĐĐA của CTS chiếu xạ ở 10 kGy với nồng độ H2O2 khác nhau

29

Bảng 3.5. KLPT và PI của CTS cắt mạch dạng trƣơng trong H2O2 5% ở

32

liều xạ 10 kGy với suất liều khác nhau
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của H2O2 đến KLPT và ĐĐA của CTS ở liều xạ

33

10,5 kGy
Bảng 3.7. Hiệu suất kháng khuẩn của CTS có KLPT Mw (kDa) khác

35

nhau đối với E. coli
Bảng 3.8. Hiệu suất kháng khuẩn E. Coli của CTSM60 có nồng độ khác

36

nhau
Bảng 3.9. Hiệu suất kháng khuẩn E. Coli của CTS KLPT thấp theo thời
gian khuấy tiếp xúc

37


DANH MỤC HÌNH VẼ
Trang
Hình 1.1.

Cấu tạo phân tử chitin

3

Hình 1.2.

Công thức cấu tạo của CTS

3

Hình 1.3.

Công thức cấu tạo chính xác của CTS

4

Hình 2.3.

Đƣờng chuẩn tƣơng quan giữa KLPT và thời gian lƣu của

18

Pullulan
Hình 2.4.

Phổ đồ GPC thời gian lƣu của mẫu chuẩn Pullulan với

19

KLPT a) 380.000, b) 23.700 và c) 738

Hình 3.1.

Ảnh hƣởng của thời gian đề axetyl đến ĐĐA của CTS

22

Hình 3.2.

CTS có ĐĐA ~67% (a) ; 91% (b) chế tạo từ chitin

23

Hình 3.3.

Sự suy giảm KLPT của CTS trƣơng trong nƣớc và trong

25

dung dịch H2O2 theo liều xạ
Hình 3.4.

Sự phụ thuộc (1/Mw –1/Mw0) của CTS ( ĐĐA ~ 91,3%) cắt

28

mạch ở dạng trƣơng nƣớc theo liều xạ
Hình 3.5.

Phổ FT-IR của CTS ban đầu (a) và sản phẩm cắt mạch CTS

29

ở dạng trƣơng với H2O2 nồng độ 1% (b), 3% (c), 5% (d) tại
liều xạ 10 kGy
Hình 3.6.

Giản đồ XRD của CTS ban đầu (a) và sản phẩm cắt mạch

30

CTS ở dạng trƣơng với H2O2 nồng độ 1% (b), 3% (c), 5%
(d) tại liều xạ 10 kGy
Hình 3.7.

Phổ UV-vis của dung dịch CTS 0,1% có KLPT khác nhau

31

trong dung dịch axit axetic 0,05%
Hình 3.8.

CTS ban đầu – dạng bột (a), CTS trƣơng trong dung dịch

32

H2O2 5% (b) và CTS sau chiếu xạ (c)
Hình 3.9.

Phổ FT-IR của sản phẩm cắt mạch CTS ở dạng trƣơng với

34


H2O2 nồng độ 0% (5ml H2O/1g CTS, a); 5% (b); 7,5% (c); 10%
(d) tại liều xạ 10,5 kGy
Hình 3.10. Sự phát triển của E.coli sau 24h cấy vào môi trƣờng

35

CTSM60 (b) so với môi trƣờng đối chứng (a)
Hình 3.11. Sự phát triển của E.Coli sau 24h cấy vào môi trƣờng đối
chứng (a) và môi trƣờng chứa CTSM60 ở nồng độ 25 ppm
(b) và 50 ppm (c)

36


MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................. i
DANH MỤC HÌNH VẼ ..................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................... iii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3
1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ CHITIN, CHITOSAN ................................................. 3
1.1.1. Cấu trúc phân tử......................................................................................... 3
1.1.2. Các phản ứng hóa học của chitin, chitosan ............................................... 5
1.1.3. Một số dẫn xuất của chitin ......................................................................... 8
1.1.4. Các ứng dụng của chitosan ........................................................................ 8
1.2. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN KHỐI LƢỢNG

PHÂN TỬ THẤP ............................................................................................... 10
1.2.1. Chitosan khối lƣợng phân tử thấp ............................................................ 10
1.2.2. Hoạt tính của chitosan khối lƣợng phân tử thấp ....................................... 10
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 15
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT............................................................. 15
2.2. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ .......................................................................... 15
2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÖC VÀ THÔNG SỐ
ĐẶC TRƢNG CỦA CHITOSAN ..................................................................... 16
2.3.1. Đo phổ IR ................................................................................................. 16
2.3.2. Đo phổ UV-vis........................................................................................... 17
2.3.3. Đo XRD .................................................................................................... 17
2.3.4. Xác định độ đề axetyl ................................................................................ 17
2.3.5. Xác định khối lƣợng phân tử ..................................................................... 17


2.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẾ TẠO VÀ BIẾN TÍNH CHITOSAN ....... 20
2.4.1. Phƣơng pháp đề axetyl chitin chế tạo chitosan ......................................... 20
2.4.2. Phƣơng pháp biến tích cắt mạch chitosan ................................................. 20
2.5. PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT HIỆU ỨNG KHÁNG KHUẨN ............. 20
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 22
3.1. CHẾ TẠO CTS CÓ ĐĐA TỪ 70% ĐẾN 90% ....................................... 22
3.2. CHẾ TẠO CHITOSAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP .................. 24
3.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ/ liều xạ đến sự suy giảm khối lƣợng phân tử..... 25
3.2.2 Ảnh hƣởng của nồng độ/ liều xạ đến độ đề axetyl ..................................... 29
3.3. KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN KHỐI LƢỢNG
PHÂN TỬ THẤP ............................................................................................... 34
3.3.1. Ảnh hƣởng của khối lƣợng phân tử chitosan ............................................ 34
3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ chitosan .............................................................. 36
3.3.3. Ảnh hƣởng của thời gian khuấy tiếp xúc...................................................
KẾT LUẬN.........................................................................................................

Tài liệu tham khảo .............................................................................................


MỞ ĐẦU
Chitosan là polyme có nguồn gốc tự nhiên đƣợc sản xuất từ chitin bằng cách
loại các nhóm axetyl. Chitosan tự phân hủy sinh học, độc tính thấp, hoạt tính sinh
học cao và đa dạng. Chúng có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, tăng sinh tế bào,
tăng cƣờng miễn dịch của cơ thể với các tác dụng kích thích sản sinh bạch cầu,
giảm cholesterol trong máu, hạn chế sự phát triển của khối u, có tác dụng tốt trên
các vết thƣơng, vết bỏng [41]. Do có nhiều hoạt tính sinh học độc đáo, chitiosan
đƣợc ứng dụng khá đa dạng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống. Chitosan
dùng để sản xuất glucosamin; vải; sơn trong công nghiệp, làm chỉ khâu phẫu thuật
trong y tế, làm chất bảo vệ hoa quả trong nông nghiệp, chất hấp phụ kim loại nặng
trong bảo vệ môi trƣờng... [2].
Chitosan thông thƣờng có khối lƣợng phân tử rất cao, chỉ tan trong môi
trƣờng axit. Điều này đã làm hạn chế khả năng ứng dụng của loại polyme này
trong nhiều trƣờng hợp. Các phƣơng pháp cắt mạch chitosan để giảm khối lƣợng
phân tử, nhằm mở rộng khả năng ứng dụng của loại polyme này, vì thế cũng đƣợc
tập trung nghiên cứu trong vài năm gần đây. Trong đó, những phƣơng pháp phổ
biến bao gồm: phƣơng pháp hóa học sử dụng các tác nhân oxy hóa, phƣơng pháp
enzym và phƣơng pháp chiếu xạ. Phƣơng pháp enzyme cắt mạch chitosan cho hiệu
suất cao tuy nhiên giá thành đắt hơn rất nhiều so với phƣơng pháp hóa học.
Phƣơng pháp chiếu xạ gamma Co – 60 và phƣơng pháp hóa học sử dụng H2O2
đƣợc cho là kỹ thuật cắt mạch khá hiệu quả và thân thiện với môi trƣờng ở thời
điểm hiện tại.
Vấn đề chế tạo chitosan có hoạt tính kháng khuẩn đã đƣợc nghiên cứu từ lâu. Kết
quả cho thấy khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc khá phức tạp vào khối
lƣợng phân tử, độ đề axetyl, sự phân bố khối lƣợng phân tử và nguồn gốc của chitin.
Những nghiên cứu gần cho thấy chitosan có khối lƣợng phân tử trung bình có khả

1


năng kháng khuẩn tốt. Tuy vậy, hiệu quả kháng khuẩn còn phụ thuộc vào độ đề
axetyl và vấn đề này vẫn chƣa đƣợc làm rõ.
Từ những thông tin trên chúng tôi chọn và thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chế
tạo chitosan khối lƣợng phân tử thấp có hoạt tính kháng khuẩn”
Trong khuôn khổ của công trình khoa học cấp cơ sở, đề tài này không đi sâu
nghiên cứu cấu trúc chi tiết của sản phẩm vì vấn đề này đã đƣợc thực hiện một
phần trong các đề tài có liên quan trƣớc đó. Đề tài này chỉ xem xét chế tạo chitosan
có hoạt tính kháng khuẩn và làm rõ mối quan hệ giữa khối lƣợng phân tử và độ đề
axetyl đến hoạt tính kháng khuẩn của chitosan với các nội dung nghiên cứu cụ thể
nhƣ sau:
a) Nội dung 1: Chế tạo chitosan có độ đề axetyl khoảng 70 – 90 % ở nhiệt độ
phòng.
- Khảo sát thời gian phản ứng
- Độ đề axetyl theo thời gian phản ứng
b) Nội dung 2: Chế tạo chitosan có hoạt tính kháng khuẩn bằng cắt mạch sử dụng
H2O2/ tia γ
- Ảnh hƣởng của nồng độ/liều xạ đến sự suy giảm khối lƣợng phân tử
- Ảnh hƣởng của nồng độ/liều xạ đến độ đề axetyl
c) Nội dung 3: Khảo sát khả năng kháng khuẩn của chitosan chế tạo đƣợc lên vi
khuẩn Ecoli
- Ảnh hƣởng của khối lƣợng phân tử chitosan
- Ảnh hƣởng của nồng độ chitosan

2


Chƣơng 1

TỔNG QUAN
1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ CHITIN, CHITOSAN
1.1.1. Cấu trúc phân tử
- Công thức cấu tạo của chitin [32]:
OH
OH

O
O
OH
NHCOCH3

OH

O
O
OH
NHCOCH3

OH

O

OH

O
OH
NHCOCH3

O
O
NHCOCH3

Hình 1.1. Cấu tạo phân tử chitin

- Công thức cấu tạo của chitosan (CTS) [29], [33]:

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của CTS
- Công thức nguyên: (C6H11NO4)n
- Khối lƣợng phân tử (KLPT) trung bình: Mn = (161,157)n
- Thành phần nguyên tố: %C = 44,72%, %H = 6,88%, %O = 39,71% và
%N = 8,69%
Nhƣ vậy, CTS là dẫn xuất của chitin thu đƣợc từ phản ứng đề axetyl hoá, tách
gốc axetyl khỏi nhóm amino ở vị trí C2. Đơn vị cấu tạo trong phân tử CTS là
D - glucosamin, các mắt xích đƣợc liên kết với nhau bằng những liên kết sau [32]:

3


- Liên kết 1,4-glycosit, mỗi mắt xích nằm lệch nhau một góc 180 ○ tạo nên mạch
xoắn.
- Tƣơng tác Van der Waals (d = 0,3  0,6 µm).
- Khi khoảng cách giữa các mắt xích quá nhỏ (< 0,3 µm) giữa chúng xuất hiện liên
kết hydro do tƣơng tác giữa nhóm -OH, -NH2 trong phân tử.
Cấu trúc chitin, CTS ở trên chỉ là lý thuyết, thực tế mạch phân tử CTS vẫn còn
tồn tại nhóm axetyl đan xen do sự đề axetyl hóa chƣa hoàn toàn. Do đó công thức
hóa học chính xác của mạch CTS có thể biểu diễn nhƣ sau [4], [37]:

Hình 1.3. Công thức cấu tạo chính xác của CTS

Bảng 1.1. Một số thông số đặc trưng của chitin, CTS [1]
Thông số

Chitin

CTS

Công thức

(C8H13NO5)n

(C6H11NO4)n

Khối lƣợng phân tử của một mắt xích

203

161

Hàm lƣợng Nitơ lý thuyết

6,7%

8,7%

Hàm lƣợng Nitơ thực tế

6 - 7%

7,0 - 8,4%

Khối lƣợng phân tử trung bình

3 - 5×105

1 - 3×105

Mức độ đề axetyl hoá (ĐĐA)

10 - 15%

80 - 90%

Độ ẩm

< 10%

< 10%

Độ tro ở 900○C

< 2%

< 1%

Hàm lƣợng protein

< 0,5%

< 0,3%

4


1.1.2. Các phản ứng hóa học của chitin, chitosan
Hầu hết công việc nghiên cứu tính chất chitin đều quan tâm đến nhóm
amino, nhóm này có vai trò quan trọng trong đại phân tử. Trong chitin, nhóm
amino bị axetyl hóa. Vì vậy, chitin là một amit của axit axetic. CTS có cấu tạo
tƣơng tự chitin và chỉ khác nhóm amino tự do.
Phản ứng Van - Wisseleigh
Chitin, CTS phản ứng với dung dịch I2/KI cho màu nâu, màu này chuyển
thành đỏ tím khi có mặt axít H2SO4. Đây là phản ứng đặc trƣng của chitin, CTS do
các liên kết β (1,4) - glycosit gây ra [8]. Phản ứng này không xảy ra đối với các
polysaccharide có số phân tử đƣờng nhỏ hơn 6 nên đƣợc dùng để định tính chitin,
CTS và dùng để kiểm tra glucosamin.
Phản ứng đề axetyl hóa chuyển chitin thành CTS
Phản ứng đề axetyl hóa chitin là phản ứng tách nhóm axetyl ra khỏi nhóm
chức -NHCOCH3, thực hiện trong dung dịch NaOH 40  60% ở nhiệt độ 90 
100○C và trong khoảng thời gian từ 3  5 giờ [37].

Thực chất phản ứng trên là phản ứng thuỷ phân trong môi trƣờng kiềm. Các yếu
tố ảnh hƣởng đến phản ứng là: nồng độ, nhiệt độ và thời gian.
Phản ứng cắt mạch
Phản ứng cắt mạch là quá trình làm đứt liên kết β (1,4) - glycosit [4] gồm các
phƣơng pháp cắt mạch chủ yếu sau:
- Cắt mạch bằng enzym nhƣ chitosanase, papain.
- Cắt mạch bằng tác nhân hóa học: H2O2, các peaxit, HCl và NaNO2/ H+.
- Cắt mạch bằng chiếu xạ gamma Co – 60 (γCo60).

5

Giai đoạn đầu của quá trình ngắt mạch là CTS trƣơng nở và hoà tan trong môi
trƣờng axít loãng (pH ~ 6) tạo ra một dung dịch polyme không màu, trong suốt và
nhớt.
Chit-NH2 + CH3COOH

Chit-NH3+ + CH3COO-

Tiếp theo là quá trình cắt đứt liên kết 1,4-glycosit.

Do đó, dung dịch CTS càng để lâu, độ nhớt và KLPT càng giảm dần. CTS có
KLPT khác nhau sẽ cho các hoạt tính sinh học khác nhau.
Các phản ứng tạo dẫn xuất
Tùy thuộc tác nhân phản ứng vào nhóm chức -NH2, -OH hay cả 2 nhóm chức,
các dẫn xuất tạo thành là khác nhau [34]:
 Các phản ứng vào nhóm -NH2
Nhóm amin có khả năng nhận proton từ các axít loãng:
Chit-NH2 + CH3COOH

Chit-NH3+ + CH3COO-

Nhóm amin tự do của CTS tham gia phản ứng với axit. Đây là phản ứng thế
vào nguyên tử oxy của nhóm cacbonyl, ví dụ với axit glycolic:

Chit-NH2 + OHC-COOH



Chit-N=CH-COOH + H 2O

Chit-N=CH-COOH+Na+



Chit-N=CH-COONa + H+

Với sự có mặt của tác nhân khử NaBH4, cho sản phẩm là dẫn xuất
N-Carboxylmetyl CTS tan trong nƣớc.
NaBH 4 ,t 0

Chit-N=CH-COONa 
 Chit-NH-CH3 (tan)

Nhóm amin phản ứng dễ dàng với các halogen axít, ví dụ nhƣ axit monoclo
axetic cũng tạo dẫn xuất N- Carboxyl CTS.

6


Phản ứng với các anhydrit axit tạo ra dẫn xuất N- acyl CTS.

Chit-NH2 + R-CO-O-CO-R  Chit-NH-CO-R + RCOOH
 Phản ứng vào nhóm chức -OH
Các nhóm chức -OH trong mỗi mắt xích cũng thể hiện khả năng phản ứng
khác nhau. Ở vị trí C3 là nhóm -OH bậc 2, còn ở vị trí C5 là nhóm -OH bậc 1. Nói
chung, phản ứng thế dễ dàng xảy ra hơn ở nhóm -OH bậc 1.

Đối với chitin, phản ứng thƣờng xảy ra với các nhóm -OH vì nhóm
-NHCOCH3 tƣơng đối kém hoạt động:

Nhóm -OH tham gia phản ứng thế với axit monoclo axetic:
Chit-NH2 + Cl-CH2-COOH

Chit-NH-CH2COOH + HCl

Tiến hành phản ứng đề axetyl cho O - Carboxylmetyl CTS

 Phản ứng vào cả hai nhóm -OH và -NH2
Phản ứng thế với axit monoclo axetic:

7


Phản ứng thế với ankyl halogen và tạo ra dẫn xuất bậc 4:

Ngoài ra, CTS còn là một polyamin, nó đƣợc xem nhƣ một polyme cationit có
khả năng bám dính vào các bề mặt tích điện âm và có khả năng tạo phức với nhiều
ion kim loại [53].
1.1.3. Một số dẫn xuất của chitin
Chitin có cấu trúc bền vững, không tan trong các dung môi thông thƣờng, ít có
ứng dụng trong thực tế. Chính vì thế, chitin đƣợc xem nhƣ nguyên liệu đầu để điều
chế các dẫn xuất của nó [1]. Có nhiều cách để phân loại các dẫn xuất của chitin.
Thông thƣờng có thể chia dẫn xuất của chitin thành 2 loại [33]: dẫn xuất tan trong
nƣớc và dẫn xuất tan trong dung môi.
Khi đề cập đến các dẫn xuất tan, chitin tan thƣờng đƣợc kể đến đầu tiên. Điều
đặc biệt ở sản phẩm này là chitin với ĐĐA khoảng 45  50% lại tan tốt trong nƣớc.
Chitin tan trong nƣớc thƣờng đƣợc chế tạo bằng cách axetyl hóa CTS từ ĐĐA cao
 90% xuống còn  50%. Ngoài ra, một số dẫn xuất tan trong nƣớc có nhiều ứng
dụng có thể kể đến bao gồm: O-Carboxymetyl CTS, O-Carboxymetyl Chitin,
Quartanize và N-Carboxymetyl CTS [30].

Dẫn xuất tan trong dung môi quan trọng của chitin là CTS. CTS có hoạt tính
sinh học cao hơn hẳn chitin do có hai nhóm chức hoạt động mạnh là -OH và -NH2.
Nhóm -NH2 thƣờng bị proton hóa vì vậy CTS tan đƣợc trong môi trƣờng axit. Điều
này khác hẳn với chitin.
1.1.4. Các ứng dụng của CTS
Trong ngành dƣợc, CTS dùng làm chất phụ gia tốt cho kỹ thuật bào chế dƣợc
phẩm (keo kết dính viên, chất tạo màng ...). CTS dùng làm chất mang sinh học để
gắn các thuốc bằng liên kết cơ học hoặc hoá học nhằm tạo ra thuốc polyme có
8


nhiều tác dụng mới. CTS đƣợc xem nhƣ là một hệ thống vận tải thuốc khá lý tƣởng
[25]. Ngoài ra, CTS và các dẫn xuất của nó còn đƣợc dùng làm thuốc chữa bệnh:
thuốc hạ lipit trong máu, thuốc chữa bệnh đau dạ dày, thuốc chống đông tụ máu,
thuốc kháng nấm, kháng khuẩn, tác dụng tăng cƣờng miễn dịch cơ thể… CTS có
tác dụng tốt trong điều trị vết thƣơng bỏng: làm mau lành vết thƣơng, giảm đau,
kích thích hệ thống dịch da và không làm biến dạng bề mặt da [49].
Trong mỹ phẩm, CTS đƣợc dùng làm chất phụ gia để tăng độ bám dính, làm
kem bôi mặt, thuốc làm mềm da, làm tăng khả năng hoà hợp sinh học giữa kem
thuốc và da, chống tia cực tím [33].
Trong công nghiệp giấy, CTS là một thành phần phụ gia rất tốt trong quy trình
sản xuất giấy cao cấp.
Trong công nghiệp gia dụng, CTS dùng làm mực in cao cấp, làm chất gia tăng
độ bền của gỗ, làm màng bọc lót các linh kiện điện tử [29].
Trong công nghệ hoá học, CTS dùng để xử lý nƣớc thải công nghiệp do có khả
năng tạo phức với những ion kim loại nặng độc hại [32], làm chất mang trong sắc
ký chọn lọc [29].
Trong công nghiệp thực phẩm, CTS chống lại các vi khuẩn gây bệnh trong
môi trƣờng để bảo vệ thực vật, hoa quả và sữa. Ngoài ra, CTS còn là thành phần
trong các sản phẩm chế biến từ sữa và hoa quả. Hơn nữa, CTS còn đƣợc dùng nhƣ

là chất lọc trong các loại nƣớc ép hoa quả, bia, rƣợu và nƣớc ngọt [17].
Trong nông nghiệp, CTS đƣợc dùng nhƣ một thành phần chính trong thuốc
phòng trừ nấm bệnh (đạo ôn, khô vằn ...) và dùng làm thuốc kích thích sinh trƣởng
thực vật, tăng khả năng miễn dịch cho động vật [18].

9


1.2. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN KHỐI LƢỢNG
PHÂN TỬ THẤP
1.2.1. Chitosan khối lƣợng phân tử thấp
Về cơ bản chitosan khối lƣợng phân tử thấp có cấu tạo nhƣ CTS nhƣng KLPT
nhỏ hơn 100 kDa. CTS KLPT thấp đƣợc chế tạo bằng cách cắt mạch CTS ban đầu
theo những phƣơng pháp khác nhau [28].
1.2.2. Hoạt tính của chitosan khối lƣợng phân tử thấp
Hoạt tính sinh học của CTS KLPT thấp khá đa dạng, bao gồm: tính kháng
nấm [19], kháng khuẩn [26], [27], chống khối u [23], hiệu ứng tăng cƣờng miễn
dịch [42], và các hiệu ứng bảo vệ chống lại nhiễm trùng [22]. Các tính chất của
CTS nhƣ ĐĐA, sự phân bố điện tích và tính chất hoá học… chi phối mạnh mẽ các
hoạt tính sinh học của nó [16]. Không giống nhƣ CTS KLPT cao, CTS KLPT thấp
dễ hấp thu qua ruột, nhanh chóng đi vào máu và gây các hiệu ứng sinh học có hệ
thống. Trong công nghiệp thực phẩm, CTS KLPT thấp thu hút sự quan tâm trong
nghiên cứu ứng dụng nhờ khả năng kháng khuẩn và chống oxi hoá. Từ các tính
chất này, CTS KLPT thấp đƣợc xem nhƣ là chất nâng cao chất lƣợng dinh dƣỡng
của thực phẩm [24]. KLPT thấp của CTS đƣợc coi là một đặc tính quan trọng liên
quan nhiều đến hoạt tính sinh học của nó.
Hoạt tính kháng khuẩn của CTS và các dẫn xuất đối với một số loài vi khuẩn
đã đƣợc công nhận và đƣợc xem là một trong những tính chất quan trọng nhất liên
quan trực tiếp đến các ứng dụng sinh học có thể có của chúng [31]. Hoạt tính
kháng vi khuẩn của các hợp chất này chịu ảnh hƣởng của một số yếu tố nhƣ KLPT

trung bình (Mw) [21], ĐĐA [11], [9], loại vi sinh vật [17], [33], [44] và một số tính
chất hoá lý khác (bảng 1.2).

10


Bảng 1.2. Nồng độ tối thiểu của CTS để ức chế các loài vi khuẩn khác nhau
ĐĐA (%)

Mw (kDa)

MIC (%)a

Ref.

Escherichia coli

85

12

0,1

[16]

Escherichia coli

85

6

0,06

[16]

Escherichia coli O-157

90

5–10

0,12

[27]

Vibrio parahaemolyticus

75

1–10

0,4

[35]

Salmonella typhimurium

75–90

1–10

0,125

[35]

Pseudomonas aeruginosa

50–90

5–10

0,25

[35]

Micrococcus luteus

90

5–10

0,031

[26]

Streptococcus mutans

90

5–10

0,008

[26]

Streptococcus faecalis

90

5–10

0,03

[26]

Staphylococcus epidermis

75–90

5–10

0,063

[35]

Staphylococcus aureus

50–90

1–10

0,125

[35]

Bacillus subtilis

75–90

5–10

0,125

[35]

Bacillius cereus

75–90

1–10

0,125

[35]

Lactobacillus plantarum

85

12

0,06

[16]

Bifidobacterium bifidum

85

12

0,0005

[16]

Bacterial strain
Vi khuẩn Gram âm

Vi khuẩn Gram dƣơng

a

MIC là nồng độ thấp nhất của CTS có thể ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi

khuẩn.
 Các cơ chế kháng khuẩn của CTS KLPT thấp
Không giống nhƣ chitin, CTS KLPT thấp sở hữu các nhóm amino tự do
trong cấu trúc của nó. Số nhóm amino này thể hiện vai trò quan trọng trong hoạt
tính kháng khuẩn và một số cơ chế đã đƣợc đề nghị để mô tả hoạt tính này [9]. Cơ
11

chế đƣợc cho là phù hợp nhất giải thích là CTS KLPT thấp có thể làm thay đổi các
đặc tính thấm của màng tế bào vi khuẩn và ngăn cản sự tiếp nhận khoáng chất hoặc
gây rò rỉ các thành phần tế bào mà cuối cùng dẫn đến cái chết của vi khuẩn [43].
Một cơ chế khác đƣợc đề nghị để giải thích về hoạt tính kháng khuẩn của CTS
KLPT thấp là sự ngăn chặn việc sao chép RNA do sự hấp phụ của CTS KLPT thấp
thâm nhập vào DNA của vi khuẩn [29]. Để thỏa mãn cơ chế này, KLPT của CTS
phải nhỏ hơn một giá trị giới hạn, cho phép các phân tử xâm nhập vào trong tế bào
vi khuẩn. Tuy nhiên, các chứng cứ thu thập đƣợc chƣa đủ cập nhật củng cố giả
thuyết này. Ngoài ra, hoạt tính tạo chelat của CTS KLPT thấp cũng đã tƣớc đoạt
các kim loại, yếu tố vi lƣợng hoặc các chất dinh dƣỡng cần thiết cũng đƣợc đề xuất
nhƣ một yếu tố giới hạn sự tăng trƣởng của vi khuẩn [55].
 Hiệu ứng tích điện dương và KLPT của CTS lên hoạt tính kháng khuẩn
Bản chất tích điện dƣơng của CTS KLPT thấp đã tạo điều kiện cho chúng
liên kết với tế bào vi khuẩn dẫn tới ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn. Nhóm tích
điện dƣơng ở vị trí C-2 của monome glucosamine tƣơng tác với nhóm axit
cacboxylic tích điện âm của các đại phân tử trên bề mặt tế bào vi khuẩn tạo ra các
phức polyelectrolyte [10], [29]. Các phức polyelectrolyte có thể hoạt động nhƣ lớp
không thấm xung quanh tế bào và cản trở các hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn
bằng cách ngăn chặn các chất dinh dƣỡng thấm qua thành tế bào. Khi tạo phức
polyelectrolyte, CTS có số nhóm amino cao hơn sẽ tƣơng tác mạnh hơn với các tế
bào vi khuẩn [46]. Số lƣợng nhóm amin phụ thuộc vào ĐĐA của CTS và ngƣời ta
đã quan sát thấy tỷ lệ tử vong của tế bào vi khuẩn có chiều hƣớng tăng khi ĐĐA
của CTS tăng [46]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, CTS có ĐĐA khoảng 85 – 95% thể
hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất [11]. Xu hƣớng tăng hoạt tính kháng khuẩn của
CTS cùng với sự gia tăng KLPT cũng đã đƣợc công bố [35]. Trong nghiên cứu gần
đây, Ueno, Yamaguchi, Shakairi, Nishi, và Tukora [48] đã xác nhận CTS có KLPT
nhỏ hơn 2,2 kDa không có khả năng ngăn chặn sự phát triển vi khuẩn. Khi tăng
12

KLPT lên khoảng 5,5 kDa, CTS đã thể hiện hoạt tính ngăn chặn sự phát triển của
vi khuẩn và hiệu quả kháng khuẩn tùy thuộc vào liều áp dụng. Một công bố khác
cũng cho thấy CTS có KLPT từ 5 - 27 kDa cho khả năng ngăn chặn sự phát triển vi
khuẩn khá hiệu quả[17].
Do điện tích dƣơng tạo thuận lợi cho hoạt động kháng khuẩn của CTS, nên
sự thay đổi các nhóm amin ở vị trí C-2 của glucosamine bằng các nhóm tích điện
dƣơng mạnh hơn nhằm tăng cƣờng hoạt tính kháng khuẩn của CTS đã đƣợc nghiên
cứu. Jeon và cộng sự [26] đã cố gắng cải thiện điện tích dƣơng của CTS bằng cách
đƣa asparagine vào ở vị trí C-2 của glucosamine thông qua liên kết –N. Asparagine
đƣợc dự kiến sẽ tăng cƣờng điện tích dƣơng do sự hiện diện của hai nhóm chức
amin vào xƣơng sống và chuỗi bên. Các dẫn xuất CTS kết hợp với asparagines
(Asn-CTS) đã cải thiện hoạt tính diệt khuẩn của CTS. Nồng độ ức chế tối thiểu
(MIC) của Asn-CTS trên E.coli là thấp hơn nhiều so với CTS. Asn-CTS với 0,01%
hoặc cao hơn MIC hoàn toàn ức chế sự tăng trƣởng của E.coli sau 3 ngày. Kim và
cộng sự [29] tổng hợp đƣợc một dẫn xuất CTS với chức năng amoni bậc bốn bằng
cách nối CTS với clorua trimethylammonium glycidyl (GTMAC), hoạt tính kháng
khuẩn đƣợc đánh giá trên vi khuẩn Streptococcus mutans. Kết quả cho thấy CTS
với chức năng amoni bậc bốn (CTS-GTMAC) ức chế đáng kể sự tăng trƣởng của
S.mutans so với CTS. Điều này cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đƣợc gia tăng đáng
kể khi CTS đƣợc gia tăng tích điện dƣơng. Những quan sát này là phù hợp với sự
hiểu biết chung về hoạt động kháng khuẩn của CTS và dẫn xuất của chúng. Vì vậy,
trên thực tế sự thay đổi cấu trúc của CTS bằng cách đƣa vào các nhóm tích điện
dƣơng để cải thiện hoạt tính kháng khuẩn, đảm bảo sự tƣơng tác tốt hơn với các
nhóm tích điện âm ở thành tế bào vi khuẩn là một hƣớng nghiên cứu đầy tiềm năng
[36].

13

 Các tính chất tích điện của thành tế bào vi khuẩn
Ngoài đặc điểm tích điện dƣơng của CTS, sự phân bố điện tích của thành tế
bào vi khuẩn đóng một vai trò đáng kể đối với các hoạt động kháng khuẩn của
CTS và dẫn xuất của chúng. Chung và cộng sự [11] nghiên cứu các đặc điểm bề
mặt tế bào của một số loài vi khuẩn gram dƣơng và gram âm đã xác nhận có một
mối quan hệ chặt chẽ giữa tính ƣa nƣớc và sự phân bố điện tích âm của bề mặt
thành tế bào vi khuẩn. Sự phân bố điện tích âm ở bề mặt tế bào vi khuẩn gram âm
là cao hơn so với vi khuẩn gram dƣơng, tính không ƣa nƣớc của vi khuẩn gram âm
theo đó cũng cao hơn so với vi khuẩn gram dƣơng. Hơn nữa, sự phân phối điện
tích âm trên bề mặt tế bào cũng thay đổi giữa các vi khuẩn gram âm và gram
dƣơng. Vì vậy, sự hấp phụ của CTS trên bề mặt tế bào là bình thƣờng theo thứ tự
vi khuẩn Gram âm tích điện tích âm cao hơn đến vi khuẩn gram dƣơng tích điện
âm ít hơn. Điều này giải thích lý do hầu hết vi khuẩn Gram âm nhạy cảm với CTS
và sự phân bố điện tích trên bề mặt tế bào dƣờng nhƣ là yếu tố quyết định hoạt tính
kháng khuẩn của CTS [20].

14


Chƣơng 2

VẬT LIỆU VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT
- Chitin đƣợc sản xuất theo quy trình ở Trung tâm VINAGAMMA Tp. HCM
- H2O2 dạng tinh khiết của Merck, Đức
- NaOH dạng tinh khiết của Trung Quốc.
- NH3 dạng tinh khiết của Trung Quốc.
- HCl dạng tinh khiết của Trung Quốc.
- Axit lactic dạng tinh khiết của Trung Quốc.

- CH3COOH dạng tinh khiết của Trung Quốc.
- CH3COONa dạng tinh khiết của Trung Quốc.
- Etanol tuyệt đối của công ty Trƣờng Thịnh, Việt Nam.
- Nƣớc cất tại Trung tâm VINAGAMMA, Tp. HCM.
2.2. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ
- Máy đo quang phổ hồng ngoại FT- IR 8400s, Shimadzu, Nhật, tại Trung tâm
VINAGAMMA, Tp. HCM.
- Máy đo quang phổ UV-Vis, Jasco V630, Nhật, tại Trung tâm
VINAGAMMA, Tp. HCM.
- Máy sắc ký gel thấm qua (GPC) LC-20AB Shimadzu, Nhật, sử dụng
detector RID - 10A và cột Ultrahydrogel 250, 500 của hãng Waters, Mỹ, tại
Trung tâm VINAGAMMA, Tp. HCM và Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại
học Quốc gia Tp. HCM.
- Máy nghiền bi Fritsch, Đức, tại Trung tâm VINAGAMMA, Tp. HCM
- Tủ sấy quạt gió, DNF 410, Yamaro, Nhật, tại Trung tâm VINAGAMMA,
Tp. HCM.
15


- Tủ sấy Memmert, Đức, tại Trung tâm VINAGAMMA, Tp. HCM.
- Một số trang thiết bị khác dùng cho thí nghiệm nhƣ: máy li tâm, cân phân
tích,.. tại Phòng thí nghiệm Hóa học, Trƣờng Đại học Sài Gòn.
2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÖC VÀ THÔNG SỐ ĐẶC
TRƢNG CỦA CHITOSAN
CTS và dẫn xuất của nó đƣợc đặc trƣng phổ biến bằng phƣơng pháp phổ IR,
UV-vis và nhiễu xạ tia X (XRD) [28]. Trƣớc khi ghi phổ, CTS đƣợc tinh chế theo
quy trình sau:
1(g) mẫu CTS đƣợc ngâm trƣơng trong nƣớc 2 giờ, thêm axit lactic 3% tỉ lệ
20/1 (ml/g), khuấy tan trong 5 giờ. Tủa dung dịch bằng etanol tuyệt đối với tỉ lệ 1/5
(20 ml dung dịch/100 ml etanol tuyệt đối), trợ kết tủa bằng NH4OH 2,5%. Lọc và

rửa kết tủa 3 lần bằng etanol tuyệt đối cùng tỉ lệ trên [5]. Mẫu đƣợc sấy khô ở 60°C
trong tủ sấy quạt gió DNF 410, Yamaro, Nhật, sau đó đƣợc nghiền mịn bằng máy
nghiền bi Fritsch, Đức. Mẫu sau khi tinh chế ở dạng bột mịn đƣợc bảo quản trong
túi PE để ghi phổ.
2.3.1. Đo phổ IR
Phổ IR đƣợc ghi trên máy FT-IR 8400S, Shimadzu, Nhật. Bƣớc sóng ghi phổ
tử 400 - 4000 cm-1. Thứ tự tiến hành nhƣ sau:
Mẫu CTS đƣợc nghiền nhỏ bằng cối nghiền bi Fritsch, Đức, rây qua rây 200
mesh. Cân khoảng 3 - 5 mg mẫu bột CTS trộn cùng với 100 mg KBr trong cối mã
não, ép viên trên máy ép chuyên dụng trong thời gian khoảng 10 phút, sau đó tiến
hành đo phổ IR.

16


2.3.2. Đo phổ UV-vis
Phổ UV-vis đƣợc đo trên máy UV-vis V630, Jasco, Nhật. Bƣớc sóng hấp
thụ từ 200 - 600 nm, nồng độ dung dịch đo là CTS 0,1%, dung dịch so sánh là axit
axetic 0,05% [6].
2.3.3. Đo XRD
Giản đồ XRD của các mẫu CTS đƣợc đo trên máy XRD Siemens D5000, Đức,
sử dụng ống phát tia CuKα (1,54 Å), điện áp 40 kV, cƣờng độ dòng ống phát 40
mA, góc quét 2θ thay đổi từ 0-70 độ, tốc độ quét 0,2 độ/phút.
2.3.4. Xác định độ đề axetyl
Độ đề axetyl của CTS đƣợc xác định bằng phƣơng pháp phổ hồng ngoại
(IR) và đƣợc tính theo công thức:
ĐĐA, % = 100  ([31,92  (A1320/A1420)]  12,20) [3]
Với A1320 và A1420 là độ hấp thụ quang ở số sóng tƣơng ứng là 1320 và 1420 cm-1.
2.3.5. Xác định khối lƣợng phân tử
Khối lƣợng phân tử trung bình khối đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký

gel thấm qua (Gel Permeation Chromatography - GPC). Phƣơng pháp lập đƣờng
chuẩn và đo mẫu đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Lập đường chuẩn thời gian lưu và KLPT của mẫu chuẩn Pullulan
Hòa tan 0,03 gam các mẫu chuẩn Pullulan có KLPT là 380000, 100000,
48000, 23700, 12200 và 738 Da vào trong 1ml dung môi CH3COOH
0,25M/CH3COONa 0,25M. Xác định thời gian lƣu của các mẫu dung dịch pullulan
trên máy LC-20AB, Shimadzu, detector RID-10A, sử dụng cột Ultrahydrogel 250
và 500 của hãng Waters, nhiệt độ cột là 40 ○C, pha động là dung môi CH3COOH
0,25M/CH3COONa 0,25M với tốc độ chảy là 1ml/phút. Thể tích mẫu tiêm vào cột
khoảng 50 μl. Xác định thời gian lƣu từ phổ đồ GPC (bảng 2,2). Thiết lập đƣờng
chuẩn về mối tƣơng quan KLPT và thời gian lƣu (hình 2.3).
17


Hình 2.3. Đường chuẩn tương quan giữa KLPT và thời gian lưu của
Pullulan
Bảng 2.1. KLPT và thời gian lưu của các mẫu chuẩn Pullulan
Số TT mẫu
Thời gian lƣu, Phút
KLPT  103

1

2

6,060 6,601
380

100

3

4

5

6

7,117

7,690

8,177 9,946

48

23,7

12,2

0,738

18