Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của trypanosomaevansi và ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở gia súc

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HOÀNG THỊ HỒNG HẠNH

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN
BỀ MẶT CỦA TRYPANOSOMA EVANSI VÀ ỨNG DỤNG
KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ĐỂ SẢN XUẤT KÍT
CHẨN ĐOÁN BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở GIA SÚC

Chuyên ngành: Thú y
Mã số: 60.64.01.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. TS. Phan Thị Hồng Phúc
2. TS. Phạm Thị Tâm

Thái Nguyên, năm 2013

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn này
là của chúng tôi.
Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này chưa từng được công bố

trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Hồng Hạnh

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

ii

LỜI CẢM ƠN
Nhân dịp hoàn thành luận văn Thạc sĩ khoa học nông nghiệp chuyên ngành
Thú y tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. TS. Nguyễn Thị Kim Lan, TS.
Phan Thị Hồng Phúc Khoa Chăn nuôi Thú y Trường Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên, TS. Phạm Thị Tâm Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội,
đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học.
Tôi xin trân trọng cảm ơn:
- Các thầy cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y, đã giúp tôi hoàn thành khóa học
và nâng cao chất lượng luận văn.
- Khoa Đào tạo sau đại học đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học
tập tại trường.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân, gia đình đã động
viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Xin trân trọng cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 10 năm 2013
Tác giả luận văn

Hoàng Thị Hồng Hạnh

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

iii

CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

CATT

Card Agglutination Test for Trypanosomiasis

ADN

Deoxyribo Nucleic Acid

dNTP

Deoxynucleotid triphotphat

EDTA

Ethylen Diamin Tetra Acetic

IFAT

Indirect Fluorescent Antibody Test

IPTG

Isopropyl β – D – thiogalactoside

PBS

Phosphat Buffered Saline

PCR

Polymerase Chain Reaction

ARN

Ribonucleic acid

SDS

Sodium Dodecyl Sulfat

SDS – PAGE

Sodium Dodecyl Sulfat Poly Acrylamide

TEA

Tris – axit acetic – EDTA

T. evansi

Trypanosoma evansi

VAT

Variant Antigen Tupe

VSG

Variant Surface Glucoprotein

v/p

Vòng/phút

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

iv

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
1. Tính cấp thiết của của đề tài ................................................................................ 1
2. Mục tiêu của đề tài .............................................................................................. 2
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài. ................................................ 2
3.1. Ý nghĩa khoa học .............................................................................................. 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................................. 3
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 4
1.1. TIÊN MAO TRÙNG VÀ BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở GIA SÚC ................ 4
1.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng ....................... 4

1.1.2. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng ............................................................ 8
1.1.3. Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng của bệnh .............................................. 11
1.1.4. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ........................................................... 14
1.1.5. Phương pháp phát hiện ADN của tiên mao trùng bằng phản ứng PCR
(Polymerase Chain Reaction) ............................................................. 20
1.1.6. Phòng trị bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò, ngựa ................................. 21
1.2. VECTOR TÁCH DÒNG .......................................................................... 24
1.2.1. Khái niệm ............................................................................................ 24
1.2.2. Các loại vector tách dòng .................................................................... 25
1.2.3. Plasmid pCR 2.1.................................................................................. 26
1.3. VECTOR BIỂU HIỆN.................................................................................... 28
1.3.1. Khái niệm ............................................................................................ 28
1.3.2. Các hệ thống biểu hiện gen .................................................................. 29
Chƣơng 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 31
2.1. Đối tượng ....................................................................................................... 31
2.2 Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu .................................................. 31
2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid ................................................................. 31
2.1.2. Các bộ sinh phẩm, thang chuẩn ........................................................... 31
2.1.3. Hóa chất, máy móc và thiết bị ............................................................. 31
Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

v
2.1.4. Môi trường và đệm .............................................................................. 33
2.1.5. Cặp mồi sử dụng ................................................................................. 33
2.2. NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ............................ 34
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 34
2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................. 34
2.3.2. Các phương pháp nghiên cứu .............................................................. 35

2.3.3. Phương pháp biểu hiện ........................................................................ 39
2.3.4. Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+.............. 39
2.3.5 Phương pháp điện di protein (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) ................. 42
2.3.6 Phản ứng ELISA gián tiếp (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) .................... 42
2.3.7 Phản ứng Western blot (Yoshihito Kihiwaraki, 2002).......................... 43
2.3.8 Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ELISA ....................... 44
2.3.9 Xác định độ lặp lại của kết quả phản ứng ELISA ................................. 44
Chƣơng 3: KẾT

........................................................... 46

3.1. Xác định các điều kiện nuôi cấy chủng E. coli BL21/pET-RoTAT 1.2.................... 46
3.2. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 ............................ 48
3.3. Nghiên cứu xác định các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT
1.2 trong E.coli............................................................................................... 50
3.3.1. Nghiên cứu xác định thời gian tăng sinh chủng biểu hiện............................. 50
3.3.2. Nghiên cứu xác định nhiệt độ tăng sinh chủng biểu hiện .............................. 51
3.3.3. Nghiên cứu xác định mối tương quan giữa mật độ vi khuẩn và mức độ
biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 ........................................... 51
3.3.4. Nghiên cứu xác định độ pH phù hợp để sinh tổng hợp protein tái tổ hợp
RoTAT 1.2......................................................................................... 53
3.3.5. Nghiên cứu xác định nồng độ kháng sinh phù hợp cho sự tổng hợp
kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 .................................................. 54
3.3.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của IPTG đến sự tổng hợp kháng nguyên tái tổ
hợp RoTAT 1.2 .................................................................................. 55
3.4. Biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2............................ 56

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

vi

3.5. Nghiên cứu sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 xây dựng quy trình phản
ứng ELISA phát hiện bệnh tiên mao trùng ......................................................... 58
3.5.1 Kết quả xác định hàm lượng kháng nguyên và độ pha loãng kháng thể
thích hợp cho phản ứng ELISA .......................................................... 59
3.5.2. Khảo sát tác nhân block giếng ............................................................. 60
3.5.3 Kết quả xác định thời gian ủ đĩa ELISA với kháng thể đặc hiệu của
T.evansi và anti-bovine IgG:HRPO .................................................... 61
3.6. Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng ELISA .......................... 62
3.7. Xác định mức độ lặp lại của kết quả phản ứng ................................................ 63
3.7.1. Đánh giá khả năng phát hiện của bệnh của phản ứng ELISA trên mẫu
máu trâu bò nghi nhiễm tiên mao trùng .............................................. 64
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................. 66
1. Kết luận ............................................................................................................. 66
2. Đề nghị .............................................................................................................. 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 68

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

vii

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Các hóa chất chính ....................................................................... 32
Bảng 2.2. Các máy và thiết bị chính ............................................................. 33
Bảng 2.3. Công thức pha gel tách (12%) ...................................................... 40
Bảng 2.4. Công thức pha gel co (5%) ........................................................... 40

Bảng 3.1. Xác định hiệu giá huyết thanh và nồng độ kháng nguyên tối ưu
cho phản ứng ELISA (S/N) ............................................................. 59
Bảng 3.2. Giá trị OD của phản ứng ELISA với các tác nhân block ............. 60
Bảng 3.3. Kết quả phản ứng ELISA để xác định độ nhạy và đặc hiệu .......... 63
Bảng 3.4. Kết quả xác định mức độ lặp lại kết quả phản ứng ELISA ........... 63
Bảng 3.5. Kết quả xác định trâu, bò nhiễm bệnh tiên mao trùng bằng
phương pháp ELISA và PCR .......................................................... 64

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Kích thước các thang chuẩn .................................................................... 31
Hình 3.1 Trình tự gen và trình tự axit amin suy diễn của RoTAT 1.2..................... 46
Hình 3.2. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli BL21 ............................ 47
Hình 3.3 Kết quả điện di protein tổng số của trên gel SDS-PAGE ......................... 48
Hình 3.4 Kết quả Western blot kiểm tra tính đặc hiệu của protein tái tổ hợp RoTAT
1.2 với kháng thể đặc hiệu của Trypanosoma evansi ............................. 49
Hình 3.5. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 theo thời gian cảm ứng .................. 50
Hình 3.6. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nhiệt độ nuôi cấy .................. 51
Hình 3.7. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các giá trị OD khác nhau................. 52
Hình 3.8 Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các giá trị pH khác nhau .............. 53
Hình 3.9. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nồng độ kháng sinh
ampicillin bổ sung vào môi trường ....................................................... 54
Hình 3.10. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nồng độ IPTG cảm
ứng .................................................................................................... 55

Hình 3.11. Protein thu được từ dịch nuôi cấy chủng E.coli BL21- pET32/
RoTAT1.2 ........................................................................................ 56
Hình 3.12. Điện di protein RoTAT 1.2 tinh sạch trên gel SDS-PAGE .................. 57
Hình 3.13. Phản ứng western blot kiểm tra tính đặc hiệu của protein RoTAT 1.2 ................ 58
Hình 3.14. Ảnh hưởng của thời gian ủ huyết thanh đến kết quả phản ứng ELISA ............... 61
Hình 3.15. Ảnh hưởng của thời gian ủ anti-bovine IgG:HRPO đến kết quả phản ứng
ELISA .................................................................................................... 62

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Tính cấp thiết của của đề tài
Bệnh tiên mao trùng là bệnh ký sinh trùng đường máu phổ biến và gây tác hại
lớn cho trâu, bò và nhiều loài động vật khác do Trypanosoma evansi (T. evansi) gây
ra. Theo Phan Địch Lân và cs (2004) [9], Phan Văn Chinh (2006) [3], bệnh tiên mao
trùng xuất hiện ở nhiều vùng trên cả nước, với tỷ lệ mắc khá cao: trên trâu là 13 –
30%, trên bò là 7 – 14%, trong đó tỷ lệ gia súc chết/gia súc mắc lên tới 6,3 – 20%.
Bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi do ảnh hưởng đến sản lượng thịt, sữa và
sức kéo.
Trong các phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng hiện nay ở nước ta
như: phương pháp chẩn đoán truyền thống, phương pháp chẩn đoán huyết thanh
học, phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử thì phương pháp chẩn đoán huyết
thanh học được đánh giá là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả nhanh
và có khả năng chẩn đoán với số lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn.
Tuy nhiên, hiện tại nước ta vẫn phải sử dụng Kít nhập ngoại nên giá thành cao,
chưa có khả năng sử dụng rộng rãi để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.
Ở Việt Nam, vấn đề sản xuất Kít huyết thanh học chẩn đoán bệnh tiên mao

trùng còn là vấn đề rất mới. Các công trình nghiên cứu hầu như chỉ tập chung vào
xác định đặc điểm dịch tễ, hiệu quả chẩn đoán của một số phương pháp phát hiện
tiên mao trùng và phương pháp phát hiện kháng thể, chưa có công trình nào nghiên
cứu chế tạo Kít chẩn đoán bệnh.
Để sản xuất Kít chẩn đoán, cần phải có một lượng lớn kháng nguyên RoTAT
1.2, nguồn kháng nguyên này có thể được sản xuất bởi 2 phương pháp: tự nhiên và
tái tổ hợp.
Kháng nguyên tự nhiên được tách từ ký sinh trùng sau khi tăng sinh trên động
vật thí nghiệm. Ưu điểm của phương pháp này là có thể đồng thời tạo ra một lượng
lớn kháng nguyên. Tuy nhiên, kháng nguyên này không tinh khiết, thành phần đa
dạng, vì vậy có khả năng gây phản ứng dương tính giả với các kháng thể khác.
Trong khi kháng nguyên tái tổ hợp có thể khắc phục được những hạn chế trên.


2

Theo nghiên cứu của Urakawa và cs (2001) [30], kháng nguyên tái tổ hợp
RoTAT 1.2 được sản xuất dựa trên chức năng biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên
vào tế bào côn trùng dòng Sf 9. Dòng tế bào tái tổ hợp có khả năng tổng hợp và tiết
kháng nguyên vào dịch nuôi cấy tế bào. Khi ứng dụng kháng nguyên RoTAT 1.2
vào sản xuất Kít chẩn đoán, kháng nguyên tái tổ hợp có độ nhạy tương tự như với
kháng nguyên RoTAT 1.2 tự nhiên, nhưng có độ đặc hiệu cao hơn tương ứng là
99% và 89,3%. Kết quả này cho thấy khả năng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2
phát hiện được kháng thể đặc hiệu của Trypanosoma evansi.
Như vậy, để chủ động nguồn kháng nguyên tinh khiết để sản xuất Kít chẩn
đoán nhanh và chính xác, từ đó có biện pháp điều trị kịp thời và hiệu quả bệnh tiên
mao trùng cho gia súc ở Việt Nam thì vấn đề nghiên cứu chế tạo kháng nguyên tái
tổ hợp sản xuất Kít phát hiện kí sinh trùng Trypanosoma evansi gây bệnh trên gia
súc và đề xuất biện pháp phòng bệnh hiệu quả là vấn đề cấp thiết.
Với mục tiêu sản xuất được Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trong

nước, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã
hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi và ứng dụng kháng
nguyên tái tổ hợp để sản xuất Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở gia súc”.
2. Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu chung
-

Sản xuất được Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng tại Việt Nam có độ nhạy và
độ đặc hiệu cao.

Mục tiêu cụ thể
- Sản xuất được kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của loài tiên mao trùng
Trypanosoma evansi
- Chế tạo được bộ Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho gia súc ở Việt Nam.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài.
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của đề tài là những thông tin khoa học về biểu hiện gen mã hóa
kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi và ứng dụng để sản xuất Kít chẩn
đoán bệnh tiên mao trùng.


3
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài chế tạo được kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất Kít chẩn đoán bệnh
tiên mao trùng cho gia súc tại Việt Nam, nhằm phục vụ cho việc chẩn đoán nhanh
và hiệu quả bệnh tiên mao trùng cho gia súc.


4
Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TIÊN MAO TRÙNG VÀ BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở GIA SÚC
Bệnh tiên mao trùng được Blanchard (1888) phát hiện đầu tiên ở Việt Nam.
Sau đó, bệnh được xác định là phổ biến ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước.
Bệnh do loài tiên mao trùng Trypanosoma evansi gây ra. Trâu, bò, ngựa mắc bệnh
dễ chết hoặc thiếu máu, suy nhược, giảm hoặc mất khả năng sinh sản và sức sản
xuất.
1.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng
1.1.1.1. Vị trí của tiên mao trùng Trypanosoma trong hệ thống phân loại động vật
nguyên sinh
Theo Levine và cs (1980) (dẫn theo Lương Văn Huấn và cs, 1997 [5]), vị trí của
tiên mao trùng trong hệ thống phân loại nguyên bào (Protozoa) như sau:
Ngành Sarcomastigophora
Phân ngành Mastigophora
Lớp Zoomastigophorasida
Bộ Kinetoplastorida
Phân bộ Trypanosomatorida
Họ Trypanosomatidae Donein, 1901
Giống Trypanosoma Gruby, 1843
Giống phụ Megatrypanum Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (M) theileria
Giống phụ Herpetosoma Donein, 1901
Loài Trypanosoma (H) leisi
Giống phụ Schizotrypanum Chagas, 1909
Loài Trypanosoma (S) cruzi
Giống phụ Duttonella Chalmers, 1918
Loài Trypanosoma (D) vivax
Loài Trvpanosoma (D) uniform

5

Giống phụ Nalmomonas Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (N) congolense
Loài Trypanosoma (N) siminae
Loài Trypanosoma (N) vanhogi
Giống phụ Trypanozoon Liihe, 1906
Loài Trypanosoma (T) brucei
Loài Trypanosoma (T) gambience
Loài Trypanosoma (T) rhodesiense
Loài Trypanosoma (T) equiperdum
Giống phụ Pycnomonas Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (P) suis
Giống phụ Trypanosoma Gruby, 1843
Loài Trypanosoma evansi (Steel, 1885)
Trong các loài tiên mao trùng trên, có 7 loài được tổ chức dịch tễ quốc tế
(OIE) thông báo là có khả năng gây bệnh cho người và động vật có vú, đó là: T.
brucei, T. congolense, T. cruzi, T. evansi, T. gambiense, T. siminae, T. vivax.
1.1.1.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của tiên mao trùng
Tiên mao trùng T. evansi được xếp vào loại đơn hình thái, cơ thể chỉ là một
tế bào, có kích thước nhỏ, chiều dài 18 - 34 μm (trung bình là 25 μm), chiều rộng
1,5 – 2 μm. Cơ thể có hình suốt chỉ mảnh hoặc hình thoi, cuối thân nhọn. Nhìn
chung, cấu trúc cơ bản của T. evansi cũng giống như cấu trúc của các loài tiên mao
trùng khác thuộc họ Trypanosomatidae. Cấu trúc từ ngoài vào trong được chia
thành 3 phần chính:
- Vỏ: ngoài cùng là lớp vỏ dày 10 - 15 nm, vỏ được chia làm 3 lớp (lớp ngoài
và lớp trong cùng tiếp giáp với nguyên sinh chất dầy hơn lớp giữa). Lớp vỏ ngoài
cùng được cấu tạo từ các phân tử glycoprotein luôn biến đổi (Vanant Glycoprotein
Surface -VGS). Tiếp giáp với lớp trong cùng là 9 cặp vi ống xếp song song dọc theo

chiều dài thân tiên mao trùng. Chính nhờ sự sắp xếp của các cặp vi ống nên tiên
mao trùng có dạng hình suốt chỉ mảnh (Hoare, 1972 [26]; Phạm Sỹ Lăng, 1982 [7];
Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [4]).


6

- Nguyên sinh chất: gồm lớp trong và lớp ngoài. Trong nguyên sinh chất
có chứa các nội quan: ribosome có màu thẫm xen kẽ vùng không bào màu sáng,
kinetoplast (thể cơ động), mitochrondno, reticulum (lưới nội bào) và mạng lưới
golgi.
- Nhân: nhân tiên mao trùng có chứa ADN, hình bầu dục hoặc hình trứng.
Nhân thường nằm ở vị trí trung tâm hoặc gần vị trí trung tâm cơ thể. Ngoài nhân, về
phía cuối thân còn có thể kinetoplast chứa ADN (KADN). Từ kinetoplast có một roi
chạy vòng quanh thân lên đầu và ra phía ngoài cơ thể thành một roi tự do. Roi của tiên
mao trùng có lớp vỏ ngoài cùng giống lớp vỏ của thân. Trong roi có 9 cặp vi ống ở
xung quanh và một cặp ở trung tâm, xếp song song dọc chiều dài roi (Hoare, 1972 [26];
Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [4]).
1.1.1.3. Cấu trúc kháng nguyên của tiên mao trùng Trypanosoma evansi
Kháng nguyên của T. evansi gồm hai loại: kháng nguyên ổn định (kháng
nguyên không biến đổi) và kháng nguyên biến đổi
* Kháng nguyên ổn định (kháng nguyên không biến đổi)
Phần lớn các thành phần kháng nguyên tiên mao trùng không biến đổi trong
quá trình sống ký sinh. Bằng phương pháp điện di miễn dịch huyết thanh thỏ tối
miễn dịch với T. evansi, Kageruka (1982) đã phát hiện tới 30 thành phần kháng
nguyên khác nhau. Có ba loại kháng nguyên không biến đổi ở màng nguyên sinh
chất tế bào (ISG: Invanant Surface Glycoprotein): ISG 65, ISG 75 và ISG 100. Do
cấu trúc không gian ba chiều và đặc tính ưa nước, các loại này không kết hợp với
kháng thể của vật chủ.
-

Gen RoTAT 1.2 của tiên mao trùng
Theo Urakawa và cs, (2001) [30] dựa trên trình tự mã hóa gen của T. evansi

thì kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 không tương đồng với các kháng nguyên bề
mặt khác trong 39 mẫu Trypanosoma khác nhau và có kích thước khoảng 215 bp.
Kháng nguyên RoTAT 1.2 không xuất hiện ở các chủng T. brucei, T.
gambiense, T. congolense, T. Vivax.
Theo Ventura và cs 2004 [31] khi làm phản ứng PCR trên 9 mẫu T. evansi, 1
mẫu T. equiperdm, 2 mẫu T. gambiense và một mẫu T. rhodesiense. Cho thấy các


7
epitope RoTAT 1.2 có mặt ở tất cả các mẫu T. evansi nhưng không có mặt ở các
chủng khác.
Như vậy kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 chỉ được tìm thấy ở T. evansi
* Kháng nguyên biến đổi
Về kháng nguyên biến đổi, cần đề cập đến sự biến đổi lớp vỏ bề mặt VSG (Variant
Surface Glycoprotein), những quan điểm mới về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của
tiên mao trùng và cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi.
Nhờ kháng thể đặc hiệu được đánh dấu mà Vickerman và Luckins (1969) đã
phát hiện ra sự biến đổi của lớp kháng nguyên bề mặt. Cross (1975) đã mô tả lớp áo
bề mặt của tiên mao trùng có thành phần là glycoprotein bao phủ toàn bộ bề mặt tế
bào bằngmột lớp phân tử giống nhau (mỗi tiên mao trùng có 107 phân tử). Lớp áo
bề mặt này kích thích cơ thể vật chủ tạo ra kháng thể đặc hiệu với từng type kháng
nguyên biến đổi VAT (Variable Antigen Type). Chỉ có kháng nguyên biến đổi mới
có khả năng kích thích vật chủ tạo miền dịch chủ động. Người ta ước lượng rằng,
một con tiên mao trùng có ít nhất vài trăm hoặc vài nghìn VSG, nghĩa là 5 - 10% số
gen của tiên mao trùng cung cấp cho kháng nguyên bề mặt này.
Nhiều tác giả nghiên cứu về miễn dịch học cho rằng, tiên mao trùng biến đổi

kháng nguyên bề mặt để né tránh miễn dịch đặc hiệu của vật chủ. Tuy nhiên, Van
Meirvenne (1975) cho biết, sự biến đổi kháng nguyên bề mặt của ký sinh trùng đã
có ngay ở pha đầu tiên của quá trình nhiễm (trước khi xuất hiện đáp ứng miễn dịch
của cơ thể vật chủ). Theo Hajduc và Vickernlan (1981), hiện tượng biến đổi kháng
nguyên bề mặt của tiên mao trùng còn thấy ở gia súc đã bị tiêm thuốc làm suy giảm
miễn dịch. Những quan điểm này là hoàn toàn mới để lý luận về sự xuất hiện kháng
nguyên biến đổi của tiên mao trùng. Như vậy, quan điểm về sự biến đổi kháng
nguyên lớp vỏ của tiên mao trùng cho đến nay vẫn chưa thống nhất.
* Cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi
Khi kháng thể đặc hiệu kết hợp với phân tử của kháng nguyên bề mặt (VSG),
làm tiêu tan tiên mao trùng thì đó cũng là nguyên nhân chính thúc đẩy sự hoạt hoá
của gen. Kết quả là các phân tử kháng nguyên VSG được thay đổi hoàn toàn bằng


8
các phân tử VSG mới. Lúc này, kháng thể đặc hiệu lúc trước đã không còn tác dụng
đối với kháng nguyên mới này.
Theo Barry và Tumer (1991) [22], các VSG được mã hoá nhờ các gen
chuyên biệt. Từ kho chứa hàng nghìn đến khác nhau, một gen VSG được hoạt hoá
một cách chọn lọc, dẫn đến tổng hợp ra một loại kháng nguyên VSG. Mỗi bên VSG
mới tạo ra một loại kháng nguyên VSG mới. Trong bộ gen của tiên mao trùng tồn
tại một số lớn gen VSG, các gen này sử dụng nhiều cơ chế sắp xếp khác nhau, do
vậy tiên mao trùng đã tạo ra nhiều VSG khác nhau ở gia súc bị bệnh mãn tính. Cơ
chế biến đổi kháng nguyên theo 2 cách: cách thứ nhất là, sử dụng lần lượt các điểm
biểu hiện trên (expression side) khác nhau, không có sự sắp xếp của ADN. Các
điểm biểu hiện khác nhau sẽ mang các gen VSG khác nhau, sự luân phiên này dẫn
đến sự thay đổi type kháng nguyên. Cơ chế này quan sát được chủ yếu ở giai đoạn
đầu của quá trình cảm nhiễm. Có lẽ ở giai đoạn đầu này chưa có đáp ứng miễn dịch
của vật chủ đối với VSG, chính điều này không gây ra một cản trở hoạt hoá tự nhiên
của các điểm biểu hiện gen này. Cách thứ hai là, tập hợp lại các đoạn ADN khác

nhau để tái tổ hợp gen, mà việc tái tổ hợp này cho phép thay thế hoàn toàn hoặc
từng phần gen; hoặc việc thay thế diễn ra dựa vào sự chuyển đổi gen chứ không
phải dựa vào tái tổ hợp gen. Trường hợp này được diễn giải như sau: một gen hoạt
hoá được thay thế bằng bản sao chép của một gen khác. Do có sự thay thế một phần
của gen nên đã tạo ra loại gen phức hợp và đặc trưng.
1.1.2. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng
1.1.2.1. Phân bố của bệnh
Bệnh tiên mao trùng phân bố rất rộng, từ phía Tây sang phía Đông bán cầu.
Phía Tây bán cầu thuộc châu Mỹ, phía Đông bán cầu trải dài từ châu Phi cho đến
Philippine.
Bệnh tiên mao trùng phổ biến ở trâu, bò, ngựa các nước nhiệt đới ở châu
Phi,châu Á và Nam Mỹ.
Ở châu Phi, bệnh trải dài từ Tây sang Đông, phía Bắc qua vùng sa mạc
Sahara, dọc theo bờ biển Atlantique Địa trung hải.


9
Bệnh tiên mao trùng xảy ra với tên gọi "bệnh Surra” ở Ả rập Saudi, Yêmen,
Sultanate, Ả Rập thống nhất, Thổ Nhĩ Kỳ, Israel, Syrie, Afganistan, Pakistan.
Ở châu Á, bệnh xuất hiện ở Trung Á (thuộc Liên Xô cũ), Ấn Độ, Malaysia,
bán đảo Đông Dương, Trung Quốc, Indonexia, Philippine.
Ở châu Âu, bệnh xuất hiện ở Bungaria (nay đã được thanh toán), hiện chỉ
còn ở vùng Volga và Nam Capcase (Liên Xô cũ).
Ở châu Mỹ, bệnh xuất hiện ở Trung Mỹ, Nam Mỹ, đặc biệt phổ biến ở Brazil,
Mexico, Venezuela, Colombia.
Châu Úc cũng đã được xác định là có bệnh tiên mao trùng (Reid, 2002) cho
rằng, bệnh tiên mao trùng phổ biến nhất ở châu Á và châu Phi, từ Ấn Độ đến
Srilanca, Trung Quốc, Indonexia, Thái Lan, Lào, Camphuchia, Iran, Philippine.
Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng thấy ở hầu hết các vùng sinh thái khác
nhau: miền núi, trung du, đồng bằng, ven biển. Theo Phạm Sỹ Lăng (1982) [7],

bệnh tiên mao trùng có ở tất cả các tỉnh miền Bắc (Bắc Kạn, Lạng Sơn, Tuyên
Quang, Thái Nguyên, Ninh Bình, Hà Tây). Trâu, bò nhiễm bệnh với tỷ lệ cao và
thay đổi giữa các vùng khác nhau (trâu, bò ở đồng bằng nhiễm tiên mao trùng cao
hơn vùng trung du và miền núi, đặc biệt ở trâu, bò có nguồn gốc từ miền núi chuyển
xuống vùng đồng bằng).
Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [11] đã điều tra tình hình nhiễm tiên mao trùng ở
trâu bò Việt Nam. Kết quả cho thấy, trâu bò nhiễm tiên mao trùng với tỷ lệ cao
(21,27%), trong đó trâu bò nuôi ở các tỉnh miền núi phía Bắc nhiễm T. evansi cao
hơn ở đồng bằng.
Theo Lê Đức Quyết và cs (1995) [16], Phạm Chiến và cs (1999) [2], trâu ở
một số tỉnh miền Nam và Tây Nguyên nhiễm tiên mao trùng là 22,12%; bò là 6,6 10,3%.
1.1.2.2. Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng
Trong tự nhiên, tiên mao trùng ký sinh ở hầu hết các loài thú nuôi và thú
hoang, thấy nhiều hơn ở trâu, bò, ngựa, trâu bò rừng, hươu, nai, hổ, báo, sư tử,
chó, mèo, lạc đà, voi thỏ, chuột cống, chuột lang, chuột bạch..., nhưng không ký
sinh ở người.


10
Sự lây truyền tiên mao trùng từ trâu, bò ốm sang trâu, bò khoẻ là nhờ các loài
ruồi hút máu (thuộc họ phụ Stomoxydinae) và các loài mòng hút máu (thuộc họ
Tabanidae). Ruồi và mòng hút máu của gia súc bị bệnh, hút luôn cả tiên mao trùng
vào vòi hút, sau đó lại hút máu gia súc khoẻ, trong khi hút máu sẽ truyền tiên mao
trùng từ vòi hút vào máu con vật khoẻ. Sự lây truyền này mang tính chất cơ học.
Như vậy, ruồi và mòng hút máu là những vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng
quan trọng.
Theo Phan Địch Lân (1974) [8], Phan Địch Lân (2004) [9], phần lớn các loài
mòng tập trung ở khu vực miền núi và trung du. Trong 53 loài mòng thì có tới 44
loài phân bố ở vùng rừng núi có độ cao dưới 1.000 mét so với mặt nước biển, càng
lên cao số loài càng ít dần (độ cao trên 1 .000 mét chỉ có 26 loài). Ở vùng trung du

(rừng thưa, độ cao không quá 500 mét so với mặt nước biển có 27 loài; vùng đồi
trọc chỉ có 9 - 11 loài; vùng rừng núi ven biển phát hiện chỉ có 8 loài. Những loài
mòng phổ biến ở tất cả các vùng là: Tabanus rubidus, T. striatus, Chrysops dispar,
Chrysozoma assamensis.
Phan Địch Lân (2004) [9] cho biết, kiểm tra ở nhiều địa điểm thấy hai loài
mòng T. rubidus và T. striatus mang tiên mao trùng với tỷ lệ 15,2% và 14,0%; ruồi
hút máu Stomoxys calcitrans mang tiên mao trùng với tỷ lệ 12,5%. Ở những vùng
đang có bệnh tiên mao trùng, kiểm tra ruồi và mòng hút máu dễ dàng tìm thấy tiên
mao trùng. Sau khi theo máu vào vòi hút ruồi và mòng, tiên mao trùng vẫn sống đến
giờ thứ 53, thời gian hoạt động mạnh nhất là từ giờ thứ nhất đến giờ thứ 34, trung
bình là 24 giờ. Sự hoạt động của tiên mao trùng yếu dần từ giờ thứ 35 đến 42. Từ 46 53 giờ thì tiên mao trùng ngừng hoạt động.
Hình thái tiên mao trùng khi ở trong vòi ruồi, mòng biến đổi theo thời gian: từ 1 34 giờ có hình thái, kích thước bình thường; 35 - 45 giờ: tiên mao trùng có hình dạng
thay đổi, tăng kích thước chiều rộng và thô dần; 46 - 53 giờ: tiên mao trùng trương to,
duỗi thẳng, mất khả năng di động và ngừng hẳn hoạt động.
Thực nghiệm đã chứng minh khả năng gây bệnh của tiên mao trùng sau khi
xâm nhập vào mòng Tabanus rubidus như sau: Thời gian từ giờ thứ 1 đến thứ 5,
tiên mao trùng có khả năng gây bệnh và làm chết chuột bạch tương tự như khi


11
truyền thẳng máu có tiên mao trùng cho chuột; từ giờ thứ 6 đến thứ 7 chỉ còn 30%
số chuột thí nghiệm phát bệnh, thời gian gây bệnh kéo dài và thời gian chết của
chuột cũng dài. Điều này có thể giải thích là do độc lực của tiên mao trùng giảm dần
và số lượng tiên mao trùng còn hoạt lực gây bệnh cũng giảm dần sau khi chúng xâm
nhập vào mòng Tabanus rubidus.
1.1.2.3. Tuổi vật chủ, mùa mắc bệnh
Trâu, bò và các loài gia súc khác ở mọi lứa tuổi đều nhiễm tiên mao trùng và
đều phát bệnh, có thể dẫn đến tử vong hoặc suy nhược, thiếu máu, giảm sức đề
kháng, giảm khả năng sinh đẻ và sức sản xuất.
Phan Địch Lân (2004) [9] đã tổng hợp kết quả điều tra 3.172 trâu ở các tỉnh

đồng bằng: trâu dưới 3 năm tuổi nhiễm thấp nhất (3,2 - 6,l%), trâu 3 - 5 tuổi nhiễm
cao hơn (lo 6 - 12,7%), trâu 6 - 8 tuổi nhiễm cao nhất (12,9 - 14,8%), trâu trên 9 năm
tuổi tỷ lệ nhiễm giảm thấp hơn trâu 3 - 8 năm tuổi.
Theo Phan Văn Chinh (2006) [3], tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng cao nhất ở 4 - 8
năm tuổi (trâu: 12,71%; bò: 5,77%), thấp nhất là trâu, bò dưới 3 năm tuổi (6,92%
và2,31%). Mùa lây lan bệnh thường xảy ra trong các tháng nóng ẩm, mưa nhiều (từ
tháng 4 đến tháng 9). Thời gian này điều kiện sinh thái thuận lợi cho các loài ruồi,
mòng phát triển, hoạt động mạnh chúng hút máu súc vật và truyền tiên mao trùng.
Sự xuất hiện lượng lớn ruồi, mòng trong mùa mưa nóng ẩm luôn có liên quan đến
tình hình dịch tễ bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò, dê, lạc đà. Từ cuối mùa thu, mùa
đông và đầu mùa xuân, trâu bò nhiễm tiên mao trùng phải sống trong điều kiện thời
tiết lạnh, thiếu thức ăn nên sức đề kháng giảm, bệnh thường phát ra vào thời gian
này và trâu, bò bị đổ ngã hàng loạt. Tiên mao trùng có sức đề kháng yếu, dễ chết
khi tiếp xúc với nước cất, cồn và thuốc sát trùng.
1.1.3. Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng của bệnh
1.1.3.1. Đặc điểm bệnh lý
Khi ruồi trâu, mòng đốt, hút máu và truyền tiên mao trùng vào trâu, bò, ngựa,
tiên mao trùng xâm nhập vào da, gây ra vết viêm trên mặt da. Theo có thể quan sát
được phản ứng viêm ở da của thỏ, cừu, dê và bò gây nhiễm thực nghiệm tiên mao


12
trùng, kích thước chỗ viêm phụ thuộc vào số lượng tiên mao trùng được tiêm truyền,
một số lượng lớn tiên mao trùng phát triển ở tại chỗ viêm này.
Vào máu, tiên mao trùng nhân lên theo cấp số nhân ở trong máu, trong bạch
huyết và ở trong các mô khác của cơ thể vật chủ theo cách phân chia theo chiều dọc.
Số lượng tiên mao trùng trong máu không phải lúc nào cũng như nhau. Mật độ tiên
mao trùng thay đổi theo ngày. Biểu đồ sóng tiên mao trùng cho thấy, xen kẽ giữa
những sóng tiên mao trùng mạnh là những đợt sóng yếu. Mỗi đợt sóng tiên mao
trùng bắt đầu bằng sự tăng số lượng tiên mao trùng trong máu, sau đó giảm và khó

phát hiện thấy tiên mao trùng. Mỗi đợt tiên mao trùng tăng lên trong máu là biểu
hiện sự xuất hiện một quần thể tiên mao trùng có tính kháng nguyên bề mặt mới,
quần thể này có thể tiếp tục sinh sản và tồn tại một thời gian cho đến khi cơ thể xuất
hiện kháng thể đặc hiệu với chúng.
Tiên mao trùng phát triển nhanh trong máu, tiêu thụ Glucose và các chất đạm,
chất béo và khoáng chất trong máu ký chủ bằng phương thức thẩm thấu qua bề mặt cơ
thể để duy trì hoạt động và sinh sản. Ở súc vật bị bệnh, trong 1 ml máu có thể có
10.000 - 30.000 tiên mao trùng. Với số lượng nhiều như vậy, tiên mao trùng chiếm
đoạt dinh dưỡng nhiều, làm cho súc vật bệnh gây còm, thiếu máu và mất dần khả năng
sản xuất sữa, thịt, mất dần khả năng sinh sản và giảm sức đề kháng với các bệnh khác.
Sống trong máu vật chủ, tiên mao trùng còn tạo ra độc tố Trypanotoxin, độc tố
này gồm: độc tố do tiên mao trùng tiết ra qua màng thân trong quá trình sống và độc tố
do xác chết của tiên mao trùng phân huỷ trong máu sau 15 - 30 ngày. Độc tố của tiên
mao trùng tác động lên hệ thần kinh trung ương làm rối loạn trung khu điều hoà thân
nhiệt, gây sốt cao và gián đoạn (lúc sốt, lúc hết sốt xen kẽ nhau). Khi sốt thường có rối
loạn về thần kinh (kêu rống, run rẩy, ngã vật xuống). Độc tố cũng phá huỷ hồng cầu, ức
chế cơ quan tạo máu làm cho vật chủ thiếu máu và suy nhược dần. Độc tố còn tác động
tới bộ máy tiêu hoá, gây rối loạn tiêu hoá, làm con vật ỉa chảy. Hội chứng tiêu chảy
thường xảy ra khi xuất hiện tiên mao trùng trong máu con vật bệnh.
Khi tăng lên với số lượng lớn trong máu, tiên mao trùng còn làm tắc các mao
mạch, làm tăng tính thấm thành mạch, dần dần tạo ra các ổ thuỷ thũng chất keo
vàng dưới da.


13
1.1.3.2. Triệu chứng lâm sàng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò, ngựa
* Ở trâu, bò:
Trâu, bò bị bệnh thể hiện các triệu chứng lâm sàng chủ yếu như sau:
- Sốt cao và gián đoạn: sau 14 - 30 ngày bị ruồi, mòng hút máu truyền tiên
0

mao trùng, trâu bò thường đột ngột lên cơn sốt (40 - 41,7 C) kéo dài 2 - 4 ngày rồi
giảm, thời gian sau nhiệt độ lại tăng lên. Thời gian gián đoạn giữa hai cơn sốt dài
hay ngắn tuỳ theo thể trọng con vật. Khi sốt, kiểm tra máu thường thấy tiên mao
trùng.
- Hội chứng thần kinh: ở một số trâu, bò khi lên cơn sốt còn thể hiện hội
chứng thần kinh như điên loạn, mắt đỏ ngầu, húc đầu vào tường, chạy vòng quanh
kêu rống lên. Trường hợp nhẹ thấy run rẩy từng cơn, mắt trợn ngược rồi đổ ngã vật
xuống, sùi bọt mép giống như trâu bị cảm nắng. Sau 20 - 30 phút con vật lại đứng
dậy đi lại được. Những trâu bò mắc bệnh có triệu chứng lâm sàng như trên thường
là mắc bệnh ở thể cấp tính.
Trâu, bò bị bệnh mạn tính thường kéo dài, cơ thể suy yếu, liệt hai chân sau,
nằm tư thế quỳ và không đi lại được. Mặc dù nằm liệt nhưng vẫn ăn và nhai lại cho
đến khi sắp chết.
- Phù thũng dưới da: phù thũng thường thấy ở vùng thấp của cơ thể như ở
bốn chân (từ khớp khuỷu trở xuống), phần yếm, ngực, bộ phận sinh dục.
- Viêm giác mạc và kết mạc mắt: triệu chứng này thấy ở hầu hết trâu, bò
bệnh. Mắt có dử trắng hay vàng, chảy liên tục, nếu nặng thì mắt sưng đỏ ngầu. Khi
khỏi bệnh, mắt có màng trắng (cùi nhãn) kéo che kín giác mạc.
- Hội chứng tiêu hoá: một số trâu, bò bệnh bị ỉa chảy nặng, phân lỏng, màu
vàng, sau chuyển màu xám, có lẫn bọt và chất nhầy. Các đợt ỉa chảy tiếp theo
những cơn sốt cách quãng. Ỉa chảy trong bệnh tiên mao trùng thường dai dẳng và
con vật vẫn ăn được.
- Gầy yếu, suy nhược: ở thể bệnh cấp tính trâu, bò gầy sút nhanh, chỉ sau 7 –
14 ngày từ khi phát bệnh con vật đã gầy rộc, mắt trũng sâu. Nếu bệnh kéo dài thì
con vật gầy xơ xác, lông dựng ngược, da khô nhăn nheo, niêm mạc mắt nhợt nhạt,
lông dễ rụng, dần dần suy nhược cơ thể nặng, mất khả năng cày kéo và sinh sản.


14

Nếu gặp điều kiện bất lợi như thiếu ăn, rét mướt thì trâu, bò dễ chết. Trong thực tế,
có khoảng 3% trâu bệnh ở thể ẩn vẫn béo khoẻ, làm việc bình thường khi được
chăm sóc nuôi dưỡng tốt.
Tình trạng thiếu máu thể hiện rõ trong bệnh do T. evansi gây ra. Số lượng
hồng cầu và hàm lượng huyết sắc tố giảm, số lượng bạch cầu tăng, thành phần bạch
cầu thay đổi: bạch cầu lymphô, bạch cầu ái toan tăng nhưng bạch cầu trung tính
giảm, protein tổng số và Albumin giảm rõ rệt.
* Ở ngựa
Sau khi ruồi, mòng hút máu và truyền T. evansi, ngựa phát bệnh sau 1 - 2
0

tuần. Triệu chứng rõ nhất là ngựa sốt 40 - 41 C, sốt gián đoạn, khi sốt có tiên mao
trùng ở máu ngoại vi. Khi bị bệnh nặng, ngựa thường sốt cao đột ngột, các triệu
chứng khác chưa kịp thể hiện thì con vật đã lăn lộn điên cuồng rồi chết. Thể bệnh
cấp tính diễn ra khoảng 1 - 3 tuần, thể mãn tính kéo dài 2 - 4 tháng (tuy nhiên, thể
mãn tính thường ít gặp).
Hiện tượng thuỷ thũng xuất hiện ở vùng thấp của cơ thể (ngực, bụng, âm hộ,
vú) sau 1 - 2 tuần kể từ khi phát bệnh. Ngựa đi đứng xiêu vẹo, gầy sút rất nhanh, ăn
kém, da khô, lông dựng, bốn chân run rẩy, hay nằm, dần dần liệt chân, nằm một chỗ
rồi chết.
1.1.3.3. Bệnh tích của bệnh tiên mao trùng
Trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng khi chết gầy xơ xác, mổ khám thấy có những
biến đổi bệnh tích đại thể rõ rệt ở hệ tuần hoàn và hô hấp: tim nhão, xoang bao tim tích
nước vàng; phổi sung huyết và tụ máu từng đám nhỏ; gan sưng to, nhạt màu; lách sưng,
mềm nhũn và nhạt màu; hạch lâm ba sưng và có tụ máu trong hạch; cơ nhão, màu nhợt
nhạt, nhát cắt rỉ nước; xoang ngực và xoang bụng tích dịch màu vàng nhạt; có những
đám keo nhầy vàng dưới vùng da thuỷ thũng.
1.1.4. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
1.1.4.1. Chẩn đoán lâm sàng
Các biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò, ngựa

không phải lúc nào cũng phát hiện được. Rất nhiều gia súc mang bệnh nhưng khó
phát hiện các triệu chứng đặc trưng, nhất là đối với những gia súc mắc bệnh tiên


15
mao trùng mãn tính. Đối với gia súc mắc bệnh ở thể cấp tính, các biểu hiện bệnh
đặc trưng là sốt cao, bỏ ăn, có triệu chứng thần kinh (điên loạn) và chết nhanh. Trâu
bị bệnh mãn tính có thể thấy triệu chứng: sốt gián đoạn, gầy còm, thiếu máu kéo dài,
viêm giác mạc, phù thũng ở bụng và chân sau, chết do kiệt sức (Phạm Sỹ Lăng,
1982 [7]). Triệu chứng sảy thai có thể thấy ở trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng
(Nguyễn Đăng Khải, 1995 [6]).
1.1.4.2. Chẩn đoán thí nghiệm
Có nhiều phương pháp chẩn đoán tiên mao trùng trong phòng thí nghiệm,
mục đích là phát hiện tiên mao trùng trong máu gia súc. Tùy từng trường hợp bệnh,
tuỳ điều kiện mà có thể làm cùng lúc một số phương pháp hoặc lựa chọn một
phương pháp phù hợp và có độ chính xác cao.
* Phương pháp phát hiện tiên mao trùng trực tiếp:
Muốn phát hiện tiên mao trùng trực tiếp, có thể áp dụng những phương
pháp sau:
- Phương pháp xem tươi (Direct smear)
Khi bệnh súc sốt, T. evansi thường xuất hiện trong mao quản ngoại vi; vì vậy,
nên lấy máu vùng ngoại vi để xem tươi. Cho 1 giọt máu nhỏ lên phiến kính đã có
sẵn 1 giọt EDTA 1%; dùng góc của la men khuấy đều, đậy la men lên để máu dàn
theo la men thành một lớp mỏng. Soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 10 và 10
x 20) để phát hiện tiên mao trùng sống.
- Phương pháp nhuộm Giemsa tiêu bản máu khô (Romanovsky)
+ Phương pháp giọt dầy: Đặt 1 giọt máu to vào giữa phiến kính, dùng một
góc của đầu một phiến kính khác ria tròn giọt máu với đường kính khoảng 1 - 1,25
cm. Để khô tự nhiên trong khoảng 1 giờ, rồi cố định bằng cồn Methanol, nhuộm
Giemsa [1 giọt Giemsa + 1 ml dung dịch PBS (Phosphat Buffered Saline) pH = 7,2]

trong 25 phút. Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy mạnh, để khô rồi soi dưới kính hiển
vi (độ phóng đại 10 x 100 hoặc 10 x 90).
Phương pháp này có nhược điểm là dễ làm tổn thương tiên mao trùng, do đó
khó phân biệt được các loài khác nhau trong trường hợp nhiễm nhiều loài tiên mao
trùng cùng một lúc.


16
+ Phương pháp giọt mỏng: Đặt 1 giọt máu cách 1 đầu phiến kính 2 cm, dùng
la men ria máu thành một lớp mỏng. Để khô, cố định bằng cồn Methanol trong 2
phút. Nhuộm Giemsa trong 25 phút (l giọt Giemsa + 1 ml dung dịch PBS pH = 7,2).
Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ, để khô, soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại
10 x 100 hoặc 10 x 90).
Ưu điểm của phương pháp giọt mỏng là có thể phân biệt được hình thái các
loài tiên mao trùng khác nhau.
+ Phương pháp làm tan hồng cầu: dung dịch SDS (Sodium Dodecyl Sulfat)
là chất làm tan hồng cầu. Nhờ dung dịch SDS, tiên mao trùng dễ dàng được phát
hiện trong máu. Dung dịch SDS rất độc nên tránh tiếp xúc với da và tránh hút bằng
pipet. Dung dịch SDS dễ bảo quản ở nhiệt độ thường trong nhiều tháng (Van
Meirvenne, 1989).
* Phương pháp tập trung tiên mao trùng:
Người ta đã sử dụng phương pháp ly tâm tập trung tiên mao trùng bằng ống
Haematocrit hoặc tách tiên mao trùng bằng gen DEAE - cellulose.
- Phương pháp ly tâm tập trung bằng ống Haematocrit (WOO, 1971): cho
máu động vật nghi mắc bệnh vào ống Haematocrit, một đầu ống được bịt kín bằng
chất dẻo matit, một đầu ống để hở. Ly âm với tốc độ 14.000 vòng/phút trong 5 phút.
Sau đó kiểm tra sự tập trung của tiên mao trùng tại vị trí tiếp giáp giữa huyết tương
và hồng cầu (độ phóng đại 10 x 10).
Phương pháp này đơn giản, phát hiện tiên mao trùng tốt hơn phương pháp
xem tươi và nhuộm Giemsa. Song, tỷ lệ phát hiện chưa cao.

Với ống Haematocrit trên, có thể thực hiện phương pháp Darkground: dùng
cưa y tế cắt ống ở vị trí tiên mao trùng tập trung (ranh giới giữa huyết tương và
hồng cầu), nhỏ 1 giọt huyết tương lên phiến kính, đậy la men và kiểm tra dưới kính
hiển vi (độ phóng đại 10 x 40).
* Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm:
Đây là phương pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác và thường được ứng dụng
nhiều để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở Việt Nam. Phương pháp này có ưu điểm
là chính xác, do trực tiếp phát hiện thấy tiên mao trùng sau khi nhân chúng lên trong