Nghiên cứu định lượng serotonin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ huỳnh quang

Nghiên cứu định lương serotonin trong
huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng
cao với detectơ huỳnh quang
ChửThị Thanh Huyền*, Đặng Thị Ngọc Lan*, Nguyễn Thị Kiểu Anh*,
Tạ Mạnh Hùng**,
Kiều Công Thủy***, Vương Văn Tịnh***, Hoàng Thái Hòa****
*Trường Đại học Dược Hà Nội
**Viện Kiểmnghiệm thuốc Trung ương
***Bệnh viện Tâmthân Trung ương I
**** Bệnh viện Đa khoa Đức Giang - Hờ Nội
SUMMARY
A rapid, sensitive and accurate analytical method using HPLC-FLD has been validated for serotonin determination in human

c

plasma. The following conditions were used: Luna Gemini 18e column (250 x 4.6 mm; 5 ụm); mobile phase: methanol: 10 mM acetate
buffer solution pH 4.0 (6:94, v/v); flow rate: 1.5 ml/min; injection volumes: 100 ịÁÌ and 20 fjL; excitation and emission wavelengths were
set a t285 and345 nm, respectively. The linear ranges were 1.02-10.2 ng/ml and 10.2-510 ng/ml with good correlation (r>0.999). The
average recovery was 88 -100.4%. The precision o f the analytical method was satisfied with R5D less than Ỉ 5% at three levels ofLQC,
MQC and HOC. The method can be applied to measure serotonin concentration in plasma o f depressed patients in order to improve
therapeutic drug monitoring.
Từkhoá; serotonin, huyết tương, HPLC-FLD, nồng độ, bệnh nhân trâm cảm.

Đặt vấn đề
Serotonin là một trong những chất hóa học
trung gian nội sinh quan trọng của hệ thẩn kinh
trung ương, có vai trò quan trọng trong sinh bệnh
lý. Người ta đã chỉ ra rằng rối loạn trầm cảm là hậu
quả của giảm nồng độ serotonin ở khe synap, do
đó kiểm soát nổng độ serotonin trong dịch sinh học
là rất cẩn thiết [1]. Serotonin trong dịch sinh học

được định lượng bằng HPLC với các loại detectơ
huỳnh quang [2], điện hóa [3], khối phổ [5], trong đó
detectơ huỳnh quang hay được sử dụng do độ nhạy
cao, đơn giản và kinh tế.

Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu xây
dựng phương pháp định lượng serotonin trong
huyết tương (HT) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với
detectơ huỳnh quang (HPLC - FLD) và bước đẩu ứng
dụng xác định nồng độ serotonin trong HT bệnh
nhân trầm cảm, tiến tới phục vụ công tác điểu trị.
Nguyên vật liệu, thiết bị và phương pháp
nghiên cứu
Hóa chất - thuốc thử
Natri acetat; acid percloric; Đạt tiêu chuẩn tinh
khiết phân tích.


- Acid acetic; methanol (MeOH): Dùng cho HPLC
(Merck - Đức).
- Chất đối chiếu serotonin hydrochloric! hàm
lượng 98,0% (Sigma - Aldrich, Mỹ).
- HT trắng (lựa chọn mẫu HT trắng có nổng
độ serotonin thấp): Viện Huyết học - Truyền máu
Trung ương.
- Mẫu thử: HT của người tình nguyện (NTN) khỏe
mạnh và bệnh nhân (BN) mắc bệnh trầm cảm điểu trị
ở Bệnh viện Tâm thẩn Trung ương Itừtháng 11 năm
2009 đến tháng 1 năm 2010.
Thiết bị nghiên cứu

- Hệ thống HPLC Shimadzu với detectơ huỳnh
quang, phẩn mềm LC Solution 1.22 (Nhật).
- Máy ly tâm lạnh Sartorius Sigma 2 -16K (Đức).
- Tủ lạnh sâu MDF -192 (Đức).
- Máy lắc xoáy Labinco L46 (Hà Lan).
Phương pháp nghiên cứu
- Pha dung dịch chuẩn gốc serotonin: Cân chính
xác chất đối chiếu serotonin hydrochloric! hòa tan
trong hỗn hợp dung môi MeOH: nước (1:1) để được
dung dịch chuẩn gốc có nồng độ serotonin 255 |ig/
ml. Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng bằng MeOH
thành các dung dịch chuẩn thứ cấp có nổng độ từ
1,02 đến 510 ng/ml.
- Chuẩn bị mẫu để xây dựng phương pháp: Lấy 1
ml dung dịch serotonin chuẩn có nổng độ xác định,
cô dưới dòng khí N2, hòa tan cắn trong 1000 |jl HT
trắng. Lắc xoáy 5 phút.
- Xử lý mẫu: Lấy 1,00 ml HT (của NTN/ BN/ mẫu

để xây dựng phương pháp), thêm 300 ^1 dung dịch
acid percloric 14%. Lắc xoáy 3 phút, ly tâm 10000
vòng/phút trong 5 phút. Lấy dịch nổi đem sắc ký.
- Điều kiện sắc ký: Cột sắc kí Luna Gemini C18e
(250 X 4,6 mm, 5 |am ); nhiệt độ cột: 40°C; pha
động: MeOH - dung dịch đệm acetat 10 mM pH
4,0 (6 : 94); tốc độ dòng : 1,5 ml/phút; thể tích
tiêm mẫu: 100 |jl hoặc 20 |jl; phát hiện bằng
detectơ huỳnh quang với bước sóng kích thích
và phát xạ lẩn lượt là 285 nm và 345 nm.
Kết quả và bàn luận

Thẩm định phương pháp phân tích
- Tính chọn lọc: Phân tích các mẫu sau:
Mẫu chuẩn; Dung dịch serotonin chuẩn nồng độ
51 ng/ml trong pha động.
Mẫu HT trắng, mẫu HT trắng thêm serotonin
chuẩn: Xử lý mẫu theo qui trình trên.
Tiến hành sắc ký. Kết quả được trình bày ở hình 1.
Nhận xét: Kết quả ở hình 1 cho thấy, pic của
serotonin có thời gian lưu khoảng 4,6 phút, pic
gọn, cân đối, không bị xen phủ với các pic khác
(A). Trên sắc đổ của mẫu HT trắng có một pic nhỏ
tại vị trí tương ứng với thời gian lưu của serotonin
vì serotonin là chất nội sinh luôn có trong HT (trong
khoảng 4 - 5 phút) (B). Khi thêm chuẩn serotonin vào
mẫu HT trắng pic ứng với thời gian lưu của serotonin
tăng lên (C). Do vậy, phương pháp phân tích có tính
chon loc đối với serotonin.

mV(x100)
jDetectorA:Bc285tím,Bn:345nm

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

(A)

5.0

s.o

í

2!s

5.0

(B)

7.5

10.0

min

m

(C)

a

0.0

(D)

Hình V. Sẵc kí đỗ (A) mẫu serotonin chuẩn nóng độ 51 ng/iĩìL: (B) mâu huyễt tương trổng: (Q mõu huỵét tương trổng thêm chuổn; (D) máu Hĩ bệnh nhân 6 SŨU điểu trị


Khoảng nồng độ tuyến tính: Trong mẫu
Chuẩn bị hai dãy chuẩn trong HT trắng với
HT trắng có một lượng serotonin ban đẩu nên
nổng độ thêm serotonin lẩn lượt là 1,02 -10,2 ng/
chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp
ml (đường chuẩn 1 - thể tích tiêm mẫu 100 |jl) và
định lượng serotonin trong HT theo kỹ thuật
10.2 - 510 ng/ml (đường chuẩn 2 -thể tích tiêm mẫu
thêm đường chuẩn.
20 |jl). Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký. Kết quả được
Do nổng độ serotonin trong các mẫu thực (HT NTN
trình bày ở bảng 1.
khỏe mạnh ở nhóm đối chứng và HT BN mắc bệnh
Nhận xét: Kết quả ở bảng 1 cho thấy có sự phụ
trẩm cảm trước và sau điều trị) có sự khác biệt rất lớn.
thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng
Để đáp ứng yêu cẩu thẩm (í nh phương pháp phân tích
độ serotonin trong khoảng nổng độ khảo sát (1,02 thuốc trong dịch sinh học (r > 0,99), chúng tôi tiến hành
10.2 ng/ml và 10,2 - 510 ng/ml) với hệ số tương quan
xây dựng 2 đường chuẩn để đảm bảo phân tích được
r đểu lớn hơn 0,99 đáp ứng yêu cẩu qui định phân
nồng độ serotonin trong tất cả các mẫu thực.
tích thuốc trong dịch sinh học [4], Khoảng nồng độ
Bảng 1: Kă quò kháo sát Iđioỏng nông độ tuyến tính của serotonin trong huỵét tương
Đường chuẩn 1

Đường chuẩn 2

Nồng độ
(ng/mlj

Diên tích pic
(mv.giây)

Nồng độ
(ng/mlj

Diện tích pỉc
(mV.glây)

10,2

421127

1,02

559663

2,04

623480

51

1193975

3,06

668517

102

2067587

5,10

790573

204

3914091

7J4

919152

306

5647099

10,2

1088118

510

9431754

Hệ số tương quan: r = 0,9996
Phương trình hổi quy:
y = 57842 x + 499589

Hệ sổ tương quan: r = 0,9999
Phương trình hổi qui:
y= 17936 x + 242377

lựa chọn khảo sát ứng với khoảng nồng độ serotonin
trong HT NTN khỏe mạnh và bệnh nhân mắc bệnh
trầm cảm.
Độ đúng, độ chính xác: Tiến hành xác định
ở 3 mức nồng độ (LQC, MQC, HQC) đối với mỗi
khoảng nồng độ tuyến tính. Xác định độ chính
xác và độ đúng bằng cách thêm chính xác
serotonin vào HT trắng ở các mức nổng độ 2,04;
4,59 và 8,16 ng/ml (đối với đường chuẩn 1) và
25,5; 255; 357 ng/ml (đối với đường chuẩn 2).
Mỗi nổng độ làm song song 6 mẫu. Kết quả được
trình bày ở bảng 2.

Bảng 2: Két quà kháo sát độ đúng, độ chính xác
Đường chuẩn 1
Mẫu

LQC
(2,04ng/ml)

MQC
(4,59ng/ml)

HQC
(8,16ng/ml)

Nồng độ
(ng/mlj

Độ đúng (%)

Đường chuẩn 2
Trung bình
(%)

RSD(%)

Mẫu

Nồng đô (ng/
mlj

Độ đúng (%)

2,02

99,0

23,0

90,2

2,14

104,9

22,1

86,7

1,97

96,6

23,4

91,8

2,06

101,0

24,4

95,7

2,14

104,9

22,8

89,4

100,4

3,89

LQC2
(25,5 ng/ml)

1,96

96,1

23,7

92,9

3,97

86,5

234,0

91,8

4,49

97,8

234,8

92,1

4,07

88,7

237,7

93,2

4,25

92,6

232,7

91,3
100,1

92,2

5,24

MQC2
(255ng/ml)

4,50

98,0

255,2

4,12

89,8

244,9

96,0

7,19

88,1

361,6

101,3

7,17

87,9

358,1

100,3

7,05

86,4

7,16

87,7

6,98
7,53

351,5

98,5

361,1

101,1

85,5

356,1

99,7

92,3

355,6

99,6

88,0

2,64

HQC2
(357ng/ml)

Trung bình
(%)

RSD(%)

91,1

3,41

94,1

3,62

100,1

1,06


Nhận xét: Độ chính xác với giá trị độ lệch chuẩn
tương đối từ 1,06 đến 5,24% (<15%), độ đúng trung
bình nằm trong khoảng 88,0 -100,4% cho thấy phép
thử đạt yêu cẩu vể độ đúng, độ chính xác theo qui
định vể phân tích thuốc trong dịch sinh học [4].

Giới hạn định lượng dưới (LLOQ): Chuẩn bị 6 mẫu
chuẩn có nổng độ thấp nhất trong khoảng nồng độ
tuyến tính (1,02 ng/ml - đường chuẩn 1 và 10,2 ng/
ml - đường chuẩn 2). Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký.
Tính kết quả dựa vào đường chuẩn xây dựng trong
cùng ngày phân tích. Xác định độ đúng và độ chính
xác tại các nổng độ. Kết quả được trình bày ở bảng 3.
Bỏng3:KétquàkhỏosàLLOQ(n=6)

Kết quả
thống kê

10,2 ng/ml
(thể tích tiêm 20 |jl)

1,02 ng/ml
(thểtích tiêm 100 |iỉ)
Nồng độ
serotonin
(ng/ml)

Đô đúng
(%)

Nồng độ
serotonin
(ng/ml)

Trung bình

0,895

87,82

11,12

RSD(%)

19,1

ĐÔ đúng
(%)
109,0

9,4

Kết quả ở bảng 3 cho thấy, tại 2 nồng độ 1,02 ng/
mi và 10,2 ng/ml, độ đúng so với nồng độ thực có
trong mẫu chuẩn nồm trong khoảng 80 -120%, độ
lặp lại sau 6 lẩn phân tích có RSD < 20%. Như vậy,

LLOQ của phương pháp là 1,02 ng/ml (đường chuẩn
1) và 10,2 ng/ml (đường chuẩn 2).
Nhận xét chung: Từ những kết quả thẩm định về
tính chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ
chính xác, giới hạn HPLC định lượng serotonin trong HT thu được ở trên,
chúng tôi cho rằng phương pháp này có thể dùng để
đnh lượng serotonin trong HT nhằm ứng dụng để
đánh giá nổng độ serotonin trong HTcủa các mẫu thực.

ứng dụng phân tích serotonin trong mẫu thực
Lấy khoảng 3 tnl máu của NTN khỏe mạnh hoặc
BN vào ống nghiệm có chứa chất chống đông EDTA,
lắc nhẹ, ly tâm lấy HT và bảo quản ở - 80°c tới khi
phân tích. Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký. Hình 1 (D)
là sắc ký đổ mẫu HT bệnh nhân trẩm cảm sau khi
điểu trị, pic serotonin được tách rõ ràng. Dựa vào
đáp ứng phân tích của mẫu thử, lựa chọn một trong
hai đường chuẩn đã xây dựng sao cho đáp ứng phân
tích của mẫu thử nằm trong khoảng tuyến tính khảo
sát của đường chuẩn. Từ đó, tính kết quả nổng độ
serotonin trong mẫu thử dựa vào đường chuẩn xây
dựng trong từng ngày phân tích với hệ số tương
quan không nhỏ hơn 0,99. Kết quả được trình bày ở
hình 2 và bảng 4.

Bòng 4: Kồ quả định lượng serotonin trong h ẹ â tương cácmău thực
Bệnh nhân

NTN khỏe mạnh
STT

Nồng độ
(ng/ml)

N1

Trước điểu trị

Sau điều trị

STT

Nồng độ
(ng/ml)

STT

Nồng độ
(ng/mlj

284,2

B1

5,62

BI

39,8

N2

315,0

B2

5,29

B2

48,4

N3

409,3

B3

3,24

B3

17,3

N4

127,4

B4

2,44

B4

15,2

N5

347,7

B5

9,46

B5

19,6

6

94,69

B6

5,84

B6

28,2

N7

163,6

B7

7,28

B7

12,1

N8

205,9

B8

6,15

B8

13,4

N9

72,62

B9

5,38

B9

50,5

N10

119,0

B10

8,57

B10

28,8

(ngTml)
(ng7ml)
Trung vị
(ng/mlj

409,3
72,62
184,7

(ngTml)
(n§fml)
Trung vi
(ng/mlj

9,46
2,44
5,73

(ngTml)
(ng?ml)
Trung vị

(ng/mlj

50,5

Đồ thị blều (liễn nồng độ serotonin trong huyết twcác mẫu thục
♦NTN

■BN tiirớc điài tiị

ABNsau điềiitiị

450
400
350
300
250
I 200

I

1 ) 100
50

I

▲

.ầấM m M .■
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920

___________________________ M ấ i tìtực ____________________
12,1

Hình 2: Đổ thị biểu diễn nông độ serotonin ĩrong huyết tương NTN vò bệnh nhân

23,9

Số 2/20131NghỉêncứuduợữThốngtlnthuõc Ị 67

\


Tiến hành đánh giá nổng độ serotonin của
bệnh nhân trước và sau điểu trị dựa trên phân tích
so sánh cặp test t (paired t test). Kết quả cho thấy
có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa nồng độ
serotonin của bệnh nhân trước và sau điểu trị với
p = 0,0013 (The two-tailed p value). Như vậy, bệnh
nhân có đáp ứng khả quan với phác đổ điểu trị .Tuy
nhiên, nồng độ serotonin vẫn còn ở mức thấp hơn
so với của người bình thường cần duy trì tiếp quá
trình điểu trị.

Kết luận
Phương pháp định lượng serotonin trong HT
bằng HPLC đả xây dựng có độ chính xác cao, độ
đúng đảm bảo, khoảng tuyến tính khá rộng và tính
chọn lọc đảm bảo. Quy trình xử lý mẫu đơn giản, chỉ
cần dùng dung dịch acid percloric để kết tủa protein.

Do đó, khả năng ứng dụng vào thực tế là rất khả thi.
Phương pháp phân tích này có thể ứng dụng
để xác định nồng độ serotonin trong HT bệnh nhân
mắc bệnh trầm cảm trước và sau điểu trị, tiến tới
phục vụ công tác điều trị bệnh

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bùi Quang Huy (2008), Trầm cảm, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
2. George M. Anderson, Frederick C. Feibel, and Donald J. Cohen (1987), "Determination of serotonin in whole blood, platelet - rich
plasma, platelet - poor plasma and plasma ultrafiltrate", Joưmđ/ofL/feSc/ences, 40, pp. 1063 -1070.
3. Bianca Marasini, Maria Luisa Biondi, Piergiorgio Pietta, Angelo Agostoni (1985), "High - performance liquid chromatography assay of
serotonin in human plasma", La Ricerca Clin. Lab. 15,63, pp. 63*- 69.
4.

u.s Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evalution and Research (2001),

Guidance for Industry - Bioanalytical Method Validation.
5. Wilhelmina H. A. de Jong, Marianne H. L I. Wilkens, Elisabeth G. E. de Vries, Ido p. Kema (2010), "Automated mass spectrometric
analysis of urinary and plasma serotonin", Analytical and Bioanalytical Chemistry, 396(7), pp. 2609-2616.