Nghiên cứu bào chế niosome và liposome đàn hồi acyclovir bằng phương pháp hydrat hóa màng

ầ.
Nghiên cứu bào chẽ niosome và
liposome đàn hồi acyclovir bằng
phương pháp hydrat hóa màng
VŨ Thị Thu Giang*, Nguyễn Thị Hà*, Trần Thị Oanh**
"'Trường Đợi học Dược Hà Nội
** CụcKhoa học Công nghệ &Đào tạo, Bộ Ytế

SUMMARY
The study was designed to develop aq^clovir containing elastic liposomes and niosomes by the conventional thin film hydration
method. The effort was made to study whether acyclovir-haded vesicles could enhance the in vitro permeability o f the drug by using
artificol membrane. Vesicular size distributions were good in both cases o f the niosomes and the elastic liposomes with PDI < 0.3.
The percentage o f drug boding varied and the niosomal vesicles contained less drug but showed better stability than those o f elastic
liposomes. The results also showed that prepared liposomes could enhance acyclovir permeability through artifical membrance from
2.84 to 4.78 times compare to the free drug solution. So the liposomal formulation could be a promising delivery system for acyclovir
with improved permeability.
Từ khóa: acyclovir, niosome, liposome đàn hổi, hydrat hóa màng.

Đặt vấn đề
Cho đến nay, liposome thường được các nhà bào
chế nghiên cứu như một chất mang thuốc với mục
đích bảo vệ dược chất, kéo dài tác dụng, đưa thuốc
tới đích hay cải thiện tính thấm của dược chất qua
màng sinh học...
Để cải thiện thấm acyclovir (AG/) qua màng
sinh học, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên
cứu bào chế các loại liposome ACV khác nhau
như liposome qui ước [5], [6], [7], ethosome [3],
liposome đàn hồi [4] và niosome [2]. Liposome đàn
hổi trong thành phẩn có thêm các chất diện hoạt
không ion hóa nên màng lipid có khả năng đàn

hổi cao. Các nghiên cứu cho thấy liposome đàn hồi
có hiệu suất chế tạo cao hơn và cải thiện đáng kể
khả năng thấm thuốc so với liposome qui ước [4],

Niosome có cấu trúc tưđng tự liposome (các phân tử
chất diện hoạt không ion hóa được dùng thay thế các
phospholipid) được nghiên cứu rộng rãi do có đắy đủ
ưu điểm của liposome, chi phí bào chế thấp và độ ổn
định cao hơn. Xu hướng nghiên cứu hiện nay tập
trung vào các dạng niosome, ethosome, liposome
đàn hồi.
Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu bào
chế liposome đàn hổi và niosome chứa ACV bằng
phương pháp hydrat hóa màng, đánh giá được khả
năng cải thiện thấm và độ ổn định của liposome bào
chế.
Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp nghiên
cứu
Nguyên vật liệu

So 2/20131 Nghiên Cứu duộclhông tin th uõ c 43


Acyclovir (Trung Quốc - BP), lecithin (Trung
Quốc - BP), phosphatidylcholin (PC, Mỹ - USP), Span
80 (TrungQuốc - BP), cholesterol, n-octanol, kali,
dihydrophosphat, natri hydroxyd (Trung Quốc TKHH), ethanol 96% (Việt Nam - TKHH), nước cất
(DĐVN), Triton X I00 (Mỹ - TKHH) túi thẩm tích
Spectra/Por 4 MWC012 -14 kD (Spectrum iabrotory
- Mỹ), màng cellulose acetat 0,2 ụnn (Sartorius)...

Thiết bị
Máy cat quay ROTAVAPO R210 BUCHI; Hanson
Research; UV-Vis Hitachi U-1800; Hệ thống sắc ký
lỏng hiệu năng cao Shimadzu; Ultrasonic LC 60H;
Kính hiển vi điện tửtruyển qua JEOL 1010; Zetasizer
Nanoseries ZS90, pH Inolab...
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp bào chế liposome
Hòa tan phospholipid và Span 80 tỷ lệ 85:15
(% kl/kl) trong hỗn hợp dung môi cloroform methanol (2/1, tt/tt). cất quay dưới áp suất giảm ở
nhiệt độ 40°c trong 12 giờ cho dung môi bay hơi
hoàn toàn. Lớp film lipid mỏng tạo thành bám đểu
trên bình cẩu được hydrat hóa bằng dung dịch đệm
phosphat 0,1 M; pH 6,5 chứa ACV 1 mg/ml ở nhiệt
độ 50°c trong 60 phút. Hỗn dịch liposome đàn hồi
ACV tiếp tục được siêu âm bằng thiết bị Ultrasonic
LC 60H với tẩn số 35 kHz trong 8 phút ở 5°c để giảm
kích thước tiểu phân. Niosome ACV được bào chế
tương tự nhưng thay phosphatidylcholin bằng
cholesterol: Span 80 tỷ lệ 1:1 (|jmol/|amol).
Phương pháp phân tích
Định lượng dược chất
Acyclovir trong liposome được định lượng bằng
phương pháp HPLC pha đảo. Điểu kiện sắc ký: Cột
ZORBAX SB C18 (4,6 X 150 mm, 5 |jm), bảo vệ cột
ZORBAX 300 SB C18 (4,6 X 12,5 mm, 5 |jm), nhiệt độ
phòng. Pha động: hỗn hợp dung dịch acid acetic
0,02 M và methanol tỷ lệ 90:10. Detectơ uv, đo ở
bước sóng 252 nm. Tốc độ dòng 1 ml/phút. Thể tích
tiêm mẫu 100^1.

Xử lý mẫu: lấy chính xác 1 ml liposome ACV trộn
với 1 ml Triton X I00, để yên trong 10 phút. Pha loãng
tới nồng độ khoảng 10 ụg/ml bằng dung dịch đệm
phosphat 0,1 M; pH 6,5. Lọc qua màng 0,45 |jm.
Xác định tỷ lệ liposome hóa

H% =

1

-

m

.100

H : tỷ lệ liposome hoá (%)
khối lượng ACV tự do
: khối lượng ACV toàn phẩn
Tách ACV tự do khỏi liposome ACV bằng phương
pháp thẩm tách với túi thẩm tích trong 16 giờ. Lượng
ACV tự do được xác định bằng phương pháp đo
quang phổ hấp thụ tại bước sóng 252 nm.
Đánh giá kích thước tiểu phân
Kích thước và phân bố kích thước tiểu phân được
xác định bằng thiết bị Zetasizer nanoseries ZS90.
Mẳu liposome được pha loãng 80 lần trước khi đo.
Đánh giá cấu trúc liposome
Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
JEOL 1010 để nghiên cứu cấu trúc của liposome

bằng kỹ thuật chụp nhuộm soi âm bản.
Phương pháp đánh giá tính thấm
Dùng thiết bị Hanson Research:
- Ngăn cho: 1 ml hỗn dịch liposome.
- Ngăn nhận: 7 ml dung dịch đệm phosphat
0,1 M;pH 6,5.
- Thiết bị được điều nhiệt ở 37 ± 0,5°c trong thời
gian thí nghiệm.
- Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút.
- Màng thử tính thấm: ngâm màng cellulose
acetat0,2 |jm 1 giờ trong pha dắu (1,5%lecithin-1%
Cholesterol - 97,5% n-octanol), sau đó đặt vào giữa 2
tờ giấy thấm để loại phẩn dẩu thừa [1].
- Tiến hành định lượng ACV khuếch tán qua
màng bằng phương pháp HPLC pha đảo (điều kiện
sắc ký như phương pháp định lượng dược chất). Mỗi
thí nghiệm được làm 3 lẩn và lấy kết quả trung bình.
Đánh giá độ ổn định liposome
Các mẫu liposome bào chế được bảo quản ở
nhiệt độ 4-8°C và định kỳ đánh giá các chỉ tiêu: phân
bố kích thước, hàm lượng ACV còn trong liposome.
Kết quả và bàn luận
Nghiên cứu bào chếniosome ACVbằng kỹ thuật
bỵdrat hóa màng
Chọn tỷ lệ cholesterol/Span 80
Bào chế 3 mẫu niosome với tỷ lệ cholesterol/Span


4 .
80 (Ch/Sp) khác nhau. Kết quả nghiên cứu được trình

bày trong bảng 1.
Bỏng l Hiệusuất niosome hóo, kích thướcniosome khi thoỵ đổi tỷlệ Ch/Sp

Mẫu

Ch:Sp
(|jmol)

1:1

Hiệu
suằt

17,89

PDI

0,180

KTTB trong % theo Độ rộng
mỗi peak cường pedk
(d.nm)
(d.nm)
độ

KTTB
(d.nm)
124,6

151,2

100

67,43

N2

2:1

12,45

0,224

120,2

170,2

100

20,78

N3

3:1

10,34

0,267

142,3

157,9

97,8

11,09

Khỉ tăng lượng cholesterol hiệu suất niosome
hóa giảm từ 17,89% xuống còn 1034 %. ở tỷ lệ 1/1
theo ịimol đạt được hiệu suất niosome hóa cao nhất.
Đồng thời hệ số phân tán tăng dần, kích thước tiểu
phân trung bình (KTTB) cũng tăng. Vậy tỷ lệ Ch:Sp
được chọn là 1:1 (|imol/ịamol) để tiếp tục nghiên cứu.
Chọn tỷ lệ dược chât
Cổ định tỷ lệ các lỉpid, 3 công thức N4, N5, N6
được bào chế với nồng độ ACV khác nhau trong
dung dịch đệm phosphat 0,1 M; pH 6,5. Kết quả thu
được thể hiện trong bảng 2.
Bỏng2. Hiệusuẫtíìiosome hóa VQkích thướcniosomekhi thoỵđổi nôngđộẢCV

Mẫu

N4

Nồng
độACV
(mg/
ml)
1

N5

1,66

N6

2

Hiệu
suằt
(%)

PDI

18,56 0,211

KTTB
(d.nm)

KTTB
% theo Độ rộng
trong
cường
peak
mỗi peak
(d.nm)
độ
(d.nm)

139,98

148,09

100

Mẫu

PC/Sp
(kl/kÌ)

Hiệu
suằt
(%)

PDI

KTTB
(d.nm)

LI

95:5

33,21

0,127

140,3

L2

90:10

37,90

0,104

L3

85:15

38,98

0,099

L4

80:20

34,09

L5

75:25

32,21

143,2

159,24

100

19,1

8,92

131,87

142,76

100

39,08

Hiệu suất niosome hóa của mẫu N4 lớn nhất là
18,56% khi càng tăng lượng ACV thì hiệu suất càng
giảm do khi ACV đã niosome hóa một cách tối đa và
đạt trạng thái bão hòa thì dù có tăng thêm dược chất
cũng không gắn vào liposome được nên hiệu suất lại
giảm đi. Tỷ lệ dược chất nhìn chung ít ảnh hưởng tới
phân bố kích thước niosome.
Bào chế liposome đàn hổi
Chọn tỷ lệ phosphatidylcholin/SpanSO
Các mẫu liposome đàn hổi được bào chế với tỷ lệ
phosphatidylcholin/ SpanSO (PC/Sp) khác nhau. Kết
quả đánh giá hiệu suất và kích thước liposome được
trình bày trong bảng 3.

KTTB trong % theo Độ rộng

peak
mỗi peak cường
(nm)
(d.nm)
độ
179,4

88,09

13,09

88,27

11,91

191

139,3

147,34

100

33,21

121,6

140,09

100

27,43

0,116

120,2

138,15

100

12,01

0,152

105,3

129,65

100

323,19

Khi tăng Span 80 từ 5% lên 15% hiệu suất
liposome hóa cũng tăng từ 33% lên 39% do tăng
tính đàn hổi, linh hoạt của lớp màng liposome.
Nhưng tiếp tục tăng Span 80 lên 25%, hiệu suất
bào chế giảm xuống 32%. Nguyên nhân có thể do
nồng độ chất diện hoạt cao hơn nổng độ mixen tới
hạn đã hình thành các mixen trong hỗn hợp dung

môi làm giảm hiệu suất bào chê' liposome. Vì vậy,
tỷ lệ PC/Sp là 85/15 (% kl/kl) được chọn để tiếp tục
nghiên cứu.
Ảnh hưởng của loại lipid
Mẫu liposome L6, L7 được bào chế với nguyên
liệu lipid lẩn lưcrt là PC, lecithin (cùng tỷ lệ). Kết quả
nghiên cứu thể hiện trong bảng 4.
Bâng4. Hiệusuấtlipome hóa, kíchthướclipome bào chévới cáclipidkhácnhau

Mẫu

Hiệu
suất
(%)

PDI

KTTB
(d.nm)

KTTB
trong
mỗi peak
(d.nm)

%
theo
cường
độ

Độ rộng
peak
(d.nm)

L6

39,57

0,085

59,51

74,53

100

22,01

138,2

89,4

17

L7

16,90

0,256

137,7
1838

10,6

190,16

35,6

11,79 0,269
0,273

Bẳngì. Hiệusuất liposomehóo, kích thướcliposomekhi thúyđổi tỳlệPỮSp

Hiệu suất của liposome bào chế từ PC (mẫu L6)
là 39,57% cao hơn hẳn so với nguyên liệu là lecithin
(mẫu L7) chỉ đạt 16,9%. Mầu L7 có kích thước tiểu
phân lớn, phân bố kích thước rộng, PDI lớn (0,256),
số lượng peak nhiểu hơn so với mẫu L6. Nguyên
nhân do sự khác nhau vể mức độ tinh khiết của
lecithin và PC. Lecithin ngoài PC còn bao gồm cả
thành phẩn khác như acid phosphoric, acid béo,
glycerol... có thể ảnh hưởng tới cấu trúc của lớp
màng liposome dẫn đến ảnh hưởng tới hiệu suất
và phân bố kích thước. Vậy PC được chọn để tiếp
tục nghiên cứu.


Đánh giá hình thái và tính thấm của liposome
bào chế

Tiến hành bào chế hai mẫu liposome, niosome
theo các thông số kỹ thuật và thành phẩn đã chọn
sau đó đánh giá hình thái, phân bố kích thước và
khả năng cải thiện thấm ACV của liposome bào chế.
Kết quả thể hiện trong hình 1 và 2 cho thấy mẫu
liposome đàn hồi có kích thước nhỏ hơn và phân bố
kích thước tương đối đổng đểu so với mẫu niosome.
Mẫu niosome, tiểu phân tụ lại thành đám kích thước
lớn hơn.

Có thể nhận thấy do hiệu suất liposome hóa
cao hơn cùng với khả năng đàn hổi tốt nên lượng
ACV trong mẫu liposome thấm qua màng nhân
tạo nhiểu nhất (13,25% sau 8 giờ), tiếp đến là mẫu
niosome (7,89%) và thấp nhất là dung dịch ACV tự
do (2,78%). Như vậy liposome đàn hổi và niosome
làm tăng thấm AG/ qua màng nhân tạo lẩn lượt là
4,76 và 2,84 lẩn so với dung dịch ACV tự do. Kết quả
này mở ra triển vọng trong việc ứng dụng liposome
đàn hổi và niosome để cải thiện tính thấm của ACV
qua màng sinh học.
Độ ổn định của liposome bào chê'

* .005
? r in t M a g ; SOIOOx 9
ỉ:4 » :5 » p 0 4 ^ 1 7 ^ 1 2

10« |W
m ^ to .ak v
D irsct Mag; toooox

BMLab-Mll«

Hag: I(7«oex » Ỉ1 n

/. Ảnh chụp TEMỉĩĩỗu liposome đàn hổi (o) vòniosomeAữ (b)

liposome ACV
niosome ACV
ACV tự do

Các mẫu liposome đàn hồi và niosome bào chê
được theo dõi độ ổn định ở nhiệt độ 4 - 8“C. Kết quả
nghiên cứu được thể hiện trong bảng 5 và 6.
Sau 10 ngày, nổng độ ACV trong các mẫu hầu
như không thay đổi nhưng tỷ lệ ACV liposome hóa
trong mẫu liposome đàn hồi giảm từ 39 xuống
27,56% (giảm 30% so với ban đẩu). Mẫu niosome
có tỷ lệ ACV liposome hóa ổn định hơn: giảm từ 17
xuống 15,43% (giảm 10% so với ban đẩu). PDI trong
cả hai trường hợp đểu tăng nhưng vẫn duy trì ở mức
nhỏ hơn 0,3 cho thấy kích thước liposome vẫn phân
bố khá đồng đều. Kết quả nghiên cứu cho thấy trong
phạm vi nghiên cứu, niosome ACV ổn định hơn so
với liposome đàn hổi ACV.
Bàng5. Sựbiễnđổi tỷlệlipmme hóũkhi bảo quản Ởnhiệtđộ3-5ĩ(n=3)
% liposome hóa
Mẫu

H'inh1 TỷlệACVthấíĩì quamàngnhân tọo từcócmẫunghiên cứu (n=3)

Ban đẩu

Sau 3 ngày

Sau 5 ngày

Sau 10 ngày

Liposome

39,06

33,41

31,14

27,56

Niosome

17,00

16,59

16,09

15,43

Bảng 6. Phân bốkích thướcliposome ĩíong quá trình báo quỏn
Nỉosome

Liposome
Thời gian

KTTB
(d.nm)

PDI

KTTB trong mỗi peak
(d.nm)

% theo cường
độ

KTTB
(d.nm)

PDI

KTTB trong mỗi peak
(d.nm)

%theo
cường độ

Sau khỉ BC

53,19

0,101

59,71

100

106,4

0,116

122,4

100

Sau 3 ngày

58,31

0,146

65,94

100

107,0

0,135

115,8

100

Sau 5 ngày

59,37

0,236

81,98

100

109,7

0,135

122,2

100

Sau 10 ngày

65,49

0,292

170

90,8

124,6

0,180

151,2

100

1979

9,2


Kết luận
Chúng tôi đã nghiên cứu khảo sát và xây dựng
được công thức liposome đàn hổi và niosome bào
chế bằng phương pháp hydrat hóa màng.
Kết quả nghiên cứu cho thấy lỉposome đàn hổi và
nỉosome có khả năng cải thiện thấm AG/ rất tốt qua
màng nhân tạo mô phỏng cấu trúc màng sinh học.

Trong đó liposome đàn hổi làm tăng khả năng thấm
dược chất lên 4,78 lần và niosome làm tăng 2,84 lẩn
so với dung dịch ACV tự do.
Kết quả sơ bộ nghiên cứu độ ổn định còn cho thấy
mẫu niosome có độ ổn định cao hơn liposome đàn
hổi. Kết quả thu được là tiền để để tiếp tục nghiên
cứu ứng dụng liposome ACV trong các dạng bào chế
nhằm cải thiện sinh khả dụng của chế phẩm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Vũ Thị Thu Giang, Đỗ Thu Hằng, Phạm Thị Minh Huệ, Võ Xuân Minh (2008), "Nghiên cứu biện pháp làm tăng tính thấm của acyclovir",
ĩạọ chí Dược học, 390, tr. 9-14.
2. Attia lA , El-Gizawy S A , etal. (2007), "Influence of a niosomal formulation on the oral bioavailability of acyclovir in rabbits", AAPS
PhơrmSciTech, 8(4), p. E l06.
3. Horwitz E., PIsanty s., e t al. (1999), "A clinical evaluation of a novel liposomal carrier for acyclovir in the topical treatment of recurrent
herpes labialis", Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol Endod., 87(6), pp. 700-705.
4. Jain S.K., Gupta Y., etal. (2008), "Enhanced transdermal delivery of acyclovir sodium via elastic liposomes". Drug Del., 15(3), pp. 141-147.
5. Jain S.K., Jain R.K., etal. (2005), "Design and development of multivesicular liposomal depot delivery system for controlled systemic
delivery of acyclovir sodium", AAPS PharmSciTech, 6(1), pp. E35-41.
6. Law S. L., Huang K. J., etol. (2000), "Acyclovir-containing liposomes for potential ocular delivery. Corneal penetration and absorption",
1 ControL ReL, 63(1-2), pp. 135-140.
7. Mukherjee B., Patra B., etal. (2007), "Sustained release of acyclovir from nano-liposomes and nano-niosomes: An in vitro study", In tJ.
Nanomed.,2{2), pp. 213-225.

So 2/2013 1Nghiên cứuduợcThông tin thuõc

47